Xác định tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii) và vị trí nhiễm của mầm bệnh

Thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện bằng phương pháp ngâm, ấu trùng thí nghiệm cũng xuất hiện các dấu hiệu bị đục thân, tỉ lệ tử vong sau 22 ngày là 63%.. Vì vậy, khi có những dấu hiệu n

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

NGUYỄN DOÃN DUẨN

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU

TRÙNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii)

VÀ VỊ TRÍ NHIỄM CỦA MẦM BỆNH

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS LÝ THỊ THANH LOAN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Tp HCM, ngày tháng năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Doãn Duẩn Phái: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 18/08/1981 Nơi sinh: Hà Tĩnh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106667

I- TÊN ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU

TRÙNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) VÀ VỊ TRÍ NHIỄM

CỦA MẦM BỆNH

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

– Xác định tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng TCX

– Xác định vị trí có sự hiện diện của mầm bệnh trên ấu trùng TCX bị bệnh đục thân

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 21/01/2008

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 15/10/2008

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS LÝ THỊ THANH LOAN

LỜI CẢM ƠN

Trân trọng cảm ơn các thầy cô trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Chân thành cảm ơn TS Lý Thị Thanh Loan đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành luận văn

Xin cảm ơn anh Đoàn Văn Cường và các anh chị trong Trung tâm Quốc gia quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản Nam Bộ, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cảm ơn các anh chị và các bạn học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm và kiến thức trong thời gian học tập

TÓM TẮT

Nghề nuôi TCX đang phải đối mặt với những thiệt hại kinh tế do bệnh đục thân gây ra trên các giai đoạn ấu trùng Ấu trùng bị bệnh có hiện tượng cơ bị trắng đục như sữa, tỉ lệ chết có thể đến 100% Tác nhân gây bệnh được xác định là do

Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) Các

phương pháp mô bệnh học, RT-PCR và kỹ thuật lai tại chỗ (In situ hybridization)

được sử dụng trong nghiên cứu Thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện bằng phương pháp ngâm, ấu trùng thí nghiệm cũng xuất hiện các dấu hiệu bị đục thân, tỉ

lệ tử vong sau 22 ngày là 63% Kết quả kiểm tra bằng phương pháp RT-PCR đã

phát hiện đồng thời cả MrNV và XSV trên ấu trùng bị đục thân Nghiên cứu bằng

kỹ thuật lai tại chỗ ghi nhận vị trí nhiễm của MrNV và XSV trên mô cơ, chân bơi và

cơ quan gan tụy Kết quả nghiên cứu của đề tài đã xác định MrNV và XSV là tác

nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng TCX

ABSTRACT

Giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) culture is facing

important economic losses attributed to white tail disease which affects larvae and post-larvae The clinical sign of this disease is an opaquewhitish appearance of the muscles The mortality may reach 100% in some hatcheries The causative agents

have been identified as Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) by previous studies Histopathology, RT-PCR and in situ hybridization were used for studying The experimental pathogenicity of MrNV và XSV to healthy post-larvae of M rosenbergii was carried out by immersion

challange, the viral inoculum caused 63% mortality at 22 days post-infection, opaque whitish muscle was observed in experimental post-larvae RT-PCR assay ravealed the presence of both viruses in opaque whitish post-larvae The non-

radioactive DNA probes were used to successfully detect MrNV and XSV infection

in the muscle tissues, pleopods and hepatopancreas by in situ hybridization The results of study confirm the causative agents of this disease are MrNV and XSV

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

ABSTRACT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

Phần 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về tôm càng xanh 3

1.1.1 Phân loại và hình thái 3

1.1.2 Vòng đời của tôm càng xanh 4

1.1.3 Sự phân bố 4

1.1.4 Đặc điểm phát triển của ấu trùng 4

1.2 Một số bệnh trên tôm càng xanh 5

1.2.1 Các bệnh do virus 5

1.2.2 Các bệnh do vi khuẩn 5

1.2.3 Bệnh do Ricketsia 7

1.2.4 Bệnh do nấm 7

1.2.5 Bệnh do động vật nguyên sinh 7

1.2.6 Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh 8

1.3 Bệnh đục thân trên tôm càng xanh 8

1.3.1 Lịch sử phát hiện bệnh 8

1.3.2 Dấu hiệu của bệnh đục thân 9

1.3.3 Tác nhân gây bệnh 9

1.4 Các phương pháp nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh 10

1.4.1 Phương pháp nghiên cứu mô bệnh học 11

1.4.2 Phương pháp RT-PCR 13

1.4.3 Phương pháp lai Dot-blot 15

1.4.4 Phương pháp ELISA 16

1.4.5 Phương pháp lai tại chỗ 17

1.5 Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước 21

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước 21

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước 21

Phần 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Mẫu tôm 24

2.1.2 Thang DNA 24

2.1.3 Mồi 25

2.1.4 Bộ kit tổng hợp và đánh dấu mẫu dò 25

2.1.5 Bộ kit tách chiết và tinh sạch DNA từ gel agarose 26

2.2 Phương pháp 26

2.2.1 Thu và bảo quản mẫu 27

2.2.2 Tách chiết RNA tổng số 28

2.2.3 Phương pháp tách chiết dịch virus MrNV và XSV 29

2.2.4 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm 30

2.2.5 Phương pháp mô bệnh học 32

2.2.6 Phương pháp RT-PCR và điện di trên gel agarose 34

2.2.7 Phương pháp tổng hợp và đánh dấu mẫu dò 36

2.2.8 Phương pháp tinh sạch mẫu dò từ gel agarose 38

2.2.9 Phương pháp lai tại chỗ 39

Phần 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Kết quả kiểm tra MrNV với kỹ thuật RT-PCR 43

3.2 Kết quả khảo sát mô bệnh học 46

3.3 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm 49

3.4 Kết quả phát hiện mầm bệnh với kỹ thuật lai tại chỗ 54

3.4.1 Kết quả tổng hợp và đánh dấu mẫu dò cho MrNV và XSV 54

3.4.2 Kết quả phát hiện MrNV và XSV bằng phương pháp lai tại chỗ 56

Phần 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62

4.1 KẾT LUẬN 62

4.2 ĐỀ NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

Phần tiếng Việt 63

Phần tiếng Anh 64

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các cặp mồi được sử dụng để phát hiện MrNV bằng RT-PCR 25 Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra MrNV và XSV trên 36 mẫu TCX bằng RT-PCR 45

Bảng 3.2: So sánh kết quả khảo sát bằng phương pháp mô bệnh học trên ấu trùng

TCX bị đục thân với các tác giả khác 48

Bảng 3.3: Bảng theo dõi kết quả thí nghiệm cảm nhiễm. 52

Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra MrNV và XSV bằng kỹ thuật RT-PCR trên ấu trùng

TCX trong thí nghiệm cảm nhiễm 54

Bảng 3.5: So sánh kết quả xác định vị trí lây nhiễm của MrNV trên ấu trùng TCX

với các tác giả khác 59

Bảng 3.6: So sánh kết quả lai tại chỗ giữa MrNV và XSV 61

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu tạo ngoài của M rosenbergii 3

Hình 1.2: Tôm càng xanh có dấu hiệu bị bệnh đục thân 9

Hình 1.3: Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử của MrNV và XSV 10

Hình 1.4: Đặc điểm mô học của TCX bị nhiễm bệnh đục thân .13

Hình 1.5: Phát hiện MrNV bằng kỹ thuật lai Dot-blot 16

Hình 1.6: Kết quả lai tại chỗ trên mô của TCX bị nhiễm MrNV 20

Hình 2.1: Thang DNA 100 trên gel agarose 2% 24

Hình 3.1: Kết quả kiểm tra MrNV và XSV bằng RT-PCR 43

Hình 3.2: Các thay đổi về mô bệnh học trên mô cơ của ấu trùng TCX bị đục thân 46

Hình 3.3: Đặc điểm mô bệnh học cơ quan gan tụy của ấu trùng TCX 47

Hình 3.4: Ấu trùng TCX bị bệnh đục thân trong thí nghiệm cảm nhiễm 50

Hình 3.5: Tỉ lệ PL chết trong thí nghiệm cảm nhiễm MrNV và XSV 51

Hình 3.6: Kết quả RT-PCR MrNV và XSV trên PL cảm nhiễm 53

Hình 3.7: Kết quả đánh dấu mẫu dò cho MrNV và XSV 55

Hình 3.8: Phản ứng oxi hóa-khử tạo kết tủa màu xanh dương trong phương pháp lai tại chỗ 56

Hình 3.9: Kết quả lai tại chỗ với mẫu dò đặc hiệu cho MrNV trong gan tụy 57

Hình 3.10: Lai tại chỗ với mẫu dò đặc hiệu cho MrNV trên mô cơ và chân bơi 58

Hình 3.11: Kết quả lai tại chỗ với mẫu dò đặc hiệu cho XSV 60

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ các phương pháp nghiên cứu 27

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phương pháp tách chiết dịch virus MrNV và XSV 30

Sơ đồ 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm cảm nhiễm MrNV và XSV trên PL 31

Sơ đồ 2.4: Quy trình xử lý mẫu mô bệnh học 33

Sơ đồ 2.5: Quy trình nhuộm mẫu mô bệnh học 34

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AG: An Giang

bp: Base pair

cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid

DEPC: Diethyl Prycacbonat

DIG: Digoxigenin

DNA: Deoxyribonucleic Acid

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long

MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus

PCR: Polymerase Chain Reaction

PL: Postlarvae

RNA: Ribonucleic Acid

RT-PCR: Reverse – transcriptase polymerase chain reaction

S - ELISA: Sandwich-Enzyme linked immunosorbent assay STT: Số thứ tự

TCX: Tôm càng xanh

Tm: Melting Temperature

XSV: Extra small virus

MỞ ĐẦU

Tôm càng xanh (TCX) được xem là một trong những loài có giá trị kinh tế cao trong các đối tượng nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam, đặc biệt là ở vùng Đồng bằng Sông Cửu Long Từ năm 2000, sản lượng TCX hàng năm đều tăng và đạt 10000 tấn trong năm 2002 (Bộ Thủy sản, 2003)

Tuy nhiên, những năm gần đây nghề nuôi TCX ở nước ta và một số nước trên thế giới bị thiệt hại lớn, nguyên nhân gây ra là do bệnh đục thân Từ khi được phát hiện đến nay, bệnh đục thân đã xuất hiện ở Đài Loan (Tung và cộng sự, 1999), Trung Quốc (Qian và cộng sự, 2003), Ấn Độ (Sahul và cộng sự, 2004), Thái Lan (Yoganandhan và cộng sự, 2006) và ở Việt Nam (AGDAFF-NACA, 2007) Tác

nhân gây bệnh được xác định là do Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV)

và Extra small virus (XSV) (Qian và cộng sự, 2003)

Bệnh đục thân gây ảnh đến giai đoạn ấu trùng và tôm giống Dấu hiệu nhiễm của bệnh là xuất hiện những vùng cơ bị trắng đục ở phần đầu ngực, bụng và đuôi; khả năng bơi và bắt mồi giảm sút Tỉ lệ chết có thể đến 100% (Qian và cộng sự, 2003) Song đây không phải là những dấu hiệu đặc trưng cho bệnh đục thân (Romestand và Bonami, 2003; Widada và cộng sự, 2004) Vì vậy, khi có những dấu hiệu nhiễm của bệnh đục thân, tôm cần phải được kiểm tra bằng các phương pháp

có độ chính xác cao như kỹ thuật RT-PCR, lai tại chỗ, lai Dot-blot,…

Từ thực tế đó, cần phải có những nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, cơ chế phát sinh của bệnh đục thân trên TCX nuôi ở Việt Nam Những nghiên cứu này sẽ là cơ

sở cho các phương pháp chẩn đoán bệnh nhanh chóng, chính xác Từ đó áp dụng các biện pháp phòng và trị bệnh có hiệu quả để hạn chế đến mức thấp nhất những thiệt hại về kinh tế do bệnh đục thân gây ra Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài:

“XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU TRÙNG TÔM

CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) VÀ VỊ TRÍ NHIỄM CỦA MẦM

BỆNH”

Mục tiêu nghiên cứu

− Xác định tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng TCX do virus gây ra

− Xác định vị trí có sự hiện diện của mầm bệnh trên ấu trùng TCX bị bệnh đục thân

Nội dung nghiên cứu

− Phát hiện mầm bệnh trên ấu trùng TCX bị bệnh đục thân bằng kỹ thuật PCR

RT-− Xác định tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng TCX

− Xác định vị trí nhiễm của tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật lai tại chỗ (In situ

hybridization)

Phạm vi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu trên đối tượng ấu trùng TCX bị bệnh đục thân

Phần 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về tôm càng xanh

1.1.1 Phân loại và hình thái

Theo hệ thống phân loại của Holthuis (1950), tôm càng xanh được xác định với

vị trí phân loại như sau (dẫn theo Nguyễn Việt Thắng, 1993) [7]:

Ngành chân khớp : Arthropoda

Lớp giáp xác : Crustacea

Lớp phụ giáp xác bậc cao : Malacostraca

Bộ mười chân : Decapoda

Bộ phụ chân bơi : Natantia

Loài : M rosenbergii De Man 1879

Hình 1.1: Cấu tạo ngoài của M rosenbergii (Lương Đình Trung, 1999)

Tôm càng xanh có cơ thể thon dài, đối xứng hai bên Cơ thể gồm có 2 phần là phần đầu ngực phía trước và phần bụng phía sau Phần đầu ngực lớn, có dạng hơi

giống hình trụ, gồm phần đầu với 5 đốt gần nhau, mang 5 đôi phụ bộ và phần ngực với 8 đốt liền nhau mang 8 đôi phụ bộ Phần đầu ngực được bao dưới tấm vỏ dày gọi là giáp đầu ngực Phần bụng gồm có 6 đốt có thể cử động và 1 đốt đuôi Mỗi đốt mang một đôi phụ bộ gọi là chân bơi Mỗi đốt bụng có tấm vỏ bao Tấm vỏ phía trước xếp chồng lên tấm vỏ phía sau Các đốt bụng hơi tròn trên mặt lưng và dẹp hai bên Cơ thể có dạng hơi cong như hình dấu phẩy, to ở phần đầu và thon nhỏ về phía sau [4]

1.1.2 Vòng đời của tôm càng xanh

Vòng đời của tôm càng xanh có 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu ấu trùng và tôm trưởng thành [4] Khi tôm đã trưởng thành, chúng thường sống ở vùng nước ngọt như: sông, rạch, ao hồ,… Cũng chính nơi này sẽ xảy ra quá trình thành thục, phát dục và giao vĩ đẻ trứng Nhưng khi ôm trứng chúng có xu thế bơi ra vùng nước

lợ từ 6-18 ‰, ở đó ấu trùng được nở ra và sống trôi nổi theo kiểu phù du Sau 11 lần lột xác với 12 giai đoạn biến thái, ấu trùng (Nauplii) biến thành hậu ấu trùng (Post larvae) lúc này tôm con di cư về vùng nước ngọt, sống và lớn lên ở đây [4], [7]

1.1.3 Sự phân bố

Trong tự nhiên tôm càng xanh phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới tập trung ở khu vực Ấn Độ Dương và Tây Nam Thái Bình Dương, chủ yếu ở khu vực từ Châu Úc đến New Guinea, Trung Quốc và Ấn Độ Tôm phân bố ở hầu hết các thủy vực nước ngọt trong nội địa như sông, hồ, ruộng, đầm hay cả các thủy vực nước lợ khu vực cửa sông [4]

Ở Việt Nam, tôm càng xanh phân bố tự nhiên chủ yếu các tỉnh Nam Bộ, đặc biệt

là vùng ĐBSCL Ở các thủy vực độ mặn 18 ‰ hay đôi khi cả 25 ‰ vẫn có thể thấy tôm xuất hiện Tùy từng thủy vực với các đặc điểm môi trường khác nhau và tùy mùa vụ khác nhau mà tôm càng xanh xuất hiện với kích cỡ, giai đoạn thành thục và mức độ phong phú khác nhau [4]

1.1.4 Đặc điểm phát triển của ấu trùng

Ấu trùng mới nở ra sống phù du và cần nước lợ (6-16 ‰) để sống và phát triển

Ấu trùng sẽ chết sau 3-4 ngày nếu không được sống trong nước lợ Ấu trùng bơi lội chủ động, bụng ngửa và đuôi ở phía trước Ấu trùng có tính hướng quang mạnh, chúng bơi lội gần sát mặt nước thành từng đám Thức ăn của ấu trùng bao gồm các loại động vật phù du, giun nhỏ, ấu trùng các động vật thủy sinh Ấu trùng trải qua

11 lần lột xác và biến thái để trở thành hậu ấu trùng [4]

1.2 Một số bệnh trên tôm càng xanh

1.2.1 Các bệnh do virus

1.2.1.1 MHPV (Macrobrachium hepatopancreatic parvo-like virus)

Loại virus này được ghi nhận nhận gây bệnh trên tôm càng xanh nhưng không gây thiệt hại nghiêm trọng Kết quả nghiên cứu bằng phương pháp mô học trên tôm

bị nhiễm MHPV cho thấy có sự xuất hiện các thể vùi đặc trưng ở trong nhân của các tế bào biểu mô cơ quan gan tụy Những dấu hiệu này rất giống với các đặc điểm của bệnh do HPV (hepatopancreatic parvovirus) gây ra trên tôm thẻ chân trắng Tuy nhiên có thể phân biệt hai bệnh này bằng phương pháp lai tại chỗ [27]

1.2.1.2 MMV ( Macrobrachium muscle virus)

Loại virus này lần đầu tiên được phát hiện ở Đài Loan [51] MMV chỉ gây nhiễm trên cơ, các mô cơ bị nhiễm virus trở nên trắng đục, sau đó dẫn đến hoại tử Các thể vùi ưa kiềm cũng có thể xuất hiện trong tế bào chất của các tế bào cơ Bệnh thường bùng phát trong vòng 10 ngày sau khi chuyển PL sang ao nuôi, tỉ lệ chết có thể trên 50% [27]

1.2.1.3 WSBV (White spot syndrome baculovirus)

Nhiều nghiên cứu đã ghi nhận sự lây nhiễm và gây bệnh của WSBV trên tôm càng xanh Kết quả nghiên cứu bằng phương pháp lai tại chỗ xác định vị trí có sự hiện diện của WSBV bao gồm: dạ dày, mang và cơ quan gan tụy [27]

1.2.2 Các bệnh do vi khuẩn

1.2.2.1 Bệnh đốm nâu (Brown spot)

Bệnh này còn được gọi là bệnh đốm đen (Black spot) hay bệnh trên vỏ (Shell

disease) [27] Bệnh đốm nâu xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm càng xanh, nhất là khi tôm phải sống trong môi trường nước bị nhiễm bẩn và thiếu dinh dưỡng [13], [27] Bệnh đốm nâu gây thiệt kinh tế lớn, năng suất có thể giảm đến 30% [5], [13]

Tôm bị bệnh đốm nâu thường xuất hiện những đốm có màu nâu, sau đó chuyển dần sang màu đen Các vết này bị viêm tấy dẫn đến lở loét và xuất hiện bất kì chỗ nào trên cơ thể và phần phụ [5], [13] Các tổn thương này là cửa ngõ xâm nhiễm của các mầm bệnh cơ hội khác [27] Những tôm bị bệnh nặng thường kém ăn, gầy yếu, ít hoạt động; râu, chân, đuôi bị ăn cụt và chết rải rác [5], [13]

Tác nhân gây bệnh có thể do các nhóm vi khuẩn như Aeromonas và

Pseudomonas [5], [13], [27] Ngoài ra, các yếu tố ngoại cảnh gây sốc cho tôm, môi

trường nước bị nhiễm bẩn, mật độ nuôi dày, quản lý và chăm sóc kém cũng tạo điều kiện cho bệnh phát triển nhanh, tỉ lệ tôm chết cao hơn [13], [27]

1.2.2.2 Bệnh hoại tử do vi khuẩn

Bệnh thường xảy ra ở giai đoạn ấu trùng, đặc biệt ở giai đoạn IV-V thì bệnh càng nghiêm trọng Dấu hiệu của bệnh là xuất hiện các đốm nâu và hoại tử trên các phụ bộ Các điểm hoại tử phát triển rất nhanh, nếu không được xử lý kịp thời thì tỉ

lệ chết rất cao Ấu trùng bị bệnh có dạ dày rỗng, màu xanh nhạt, yếu dần và chìm xuống đáy bể [4], [27]

Tác nhân gây bệnh là các nhóm vi khuẩn Pseudomonas và vi khuẩn dạng sợi

Leucothrix Ngoài ra, các yếu tố như nhiệt độ thay đổi đột ngột, mật độ ấu trùng

cao, sự chăm sóc quản lý không tốt sẽ làm giảm sức đề kháng của tôm và làm cho bệnh trở nên trầm trọng hơn [4], [27]

1.2.2.3 Bệnh phát sáng

Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn phát sáng Vibrio harveyi Biểu hiện cấp tính của

bệnh là sự phát sáng của những ấu trùng nhiễm bệnh hoặc đã chết và có thể quan sát

dễ dàng lúc ban đêm [4], [27]

Bệnh do Ricketsia gây ra xuất hiện khá phổ biến trên các loài giáp xác, tuy nhiên việc nghiên cứu bằng phương pháp mô bệnh học gặp nhiều khó khăn vì chúng có kích thước nhỏ và thiếu các phương pháp nhuộm tiêu bản phù hợp [27]

1.2.4 Bệnh do nấm

Tôm càng xanh thường bị nhiễm các loài nấm như Lagenidium, Fusarium

solani, Saprolegnia sp., Dabaryomyces hansenii và Metschnikowia bicuspidata

[27] Khi tôm bị nhiễm nấm, cơ có màu vàng hoặc xám, sức đề kháng giảm, dễ bị nhiễm các mầm bệnh cơ hội khác Sự phát triển và gây bệnh của nấm là do sự tồn

dư nhiều chất hữu cơ, công tác vệ sinh và chăm sóc kém [27]

1.2.5 Bệnh do động vật nguyên sinh

Các động vật nguyên sinh thường được tìm thấy trên tôm càng xanh như:

Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Opercularia, Vaginicola, Cothurnia, Lagenophrys, Acineta, Podophria, Tokophrya và Ephelota [27] Chúng thường sống

ngoại sinh trên thân, các phần phụ và mang của tôm Tất cả các giai đoạn phát triển của tôm đều có thể mắc bệnh [1] Ấu trùng bị nhiễm động vật nguyên sinh có màu hơi mờ đục Nếu nhiễm nhẹ bệnh có thể hết sau khi lột xác, nếu bị nhiễm nặng sẽ ảnh hưởng đến quá trình lột xác tăng trưởng, ấu trùng không bơi lội được, chìm dần xuống đáy và chết [4], [1] Tác hại của bệnh không chỉ làm tôm chậm lớn, mà còn tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh [13]

1.2.6 Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh

1.2.6.1 Bệnh giữa chu kì ấu trùng (Larval Mid Cycle Disease- MCD)

MCD là một bệnh gây thiệt hại lớn cho nghề ương giống tôm càng xanh [27] Nguyên nhân gây bệnh vẫn chưa được xác định [4], [27], có lẽ là do nhiễm khuẩn tự

nhiên nhất là vi khuẩn Enterobacter aerogenes [4] MCD cũng có thể là một loại

bệnh phát sinh bởi nhiều nguyên nhân khác nhau [27]

Bệnh bùng phát vào các giai đoạn giữa chu kì phát triển của ấu trùng, thường là giai đoạn IV-XI [4], hay giai đoạn VI-VII [27] Dấu hiệu của bệnh thường là ấu trùng bỏ ăn và những cá thể bị bệnh sẽ bị các con khỏe hơn ăn thịt Ấu trùng nhiễm bệnh thường có màu xám lơ, bơi lội yếu ớt và thường bơi theo hình xoắn ốc [4]

1.2.6.2 Bệnh lột xác dính vỏ

Bệnh lột xác dính vỏ (Exuvia entrapment diease-EED) chủ yếu xảy ra ở giai đoạn ấu trùng, đặc biệt là sự lột xác biến thái sang giai đoạn PL [27] Dấu hiệu của bệnh là ấu trùng không thể rút các phụ bộ, mắt hoặc chủy ra khỏi vỏ lột Số khác đã thoát ra được các vỏ lột thì bị dị tật các phụ bộ và chết [4], tỉ lệ chết có thể tới 80% [27]

Nguyên nhân gây bệnh vẫn chưa được xác định [27] Có thể là do chất lượng nước kém hoặc dinh dưỡng không tốt, nhất là thiếu lecithin [4] Có giả thuyết cho rằng bệnh do nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra [27]

1.3 Bệnh đục thân trên tôm càng xanh

1.3.1 Lịch sử phát hiện bệnh

Bệnh đục thân trên tôm càng xanh còn được gọi là bệnh đục cơ (Whitish muscle disease) hay bệnh đuôi trắng (White tail disease) [32] Bệnh này lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1994 trong các trại ương giống ở đảo Guadeloupe [15] Sau đó bệnh xuất hiện ở Đài Loan [51], Trung Quốc [31], Ấn Độ [36] và Thái Lan [59] Bệnh gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho các trại ương giống và các trại nuôi tôm càng xanh [42], [36] Khi có dấu hiệu của bệnh đục thân, ấu trùng bị chết nhiều, tỉ lệ tử vong 95% [14], có thể tới 100% [31], [42], [36]

1.3.2 Dấu hiệu của bệnh đục thân

Trong các bể ương, ấu trùng bị nhiễm bệnh có dấu hiệu lờ đờ, biếng ăn và có màu trắng đục ở phần đuôi, sau đó lan dần về phía đầu, cuối cùng là toàn bộ cơ của phần đầu ngực và phần đuôi đều có màu trắng đục như sữa [14], [36]

Hình 1.2: Tôm càng xanh có dấu hiệu bị bệnh đục thân (Hsieh và cộng sự, 2006a)

Ấu trùng bị nhiễm bệnh có màu trắng đục khác hẳn so với ấu trùng bình thường Các mô bị nhiễm bệnh là cơ ở phần đuôi và đầu ngực, mô liên kết giữa các vi quản của cơ quan gan tụy [15], [14], [23] Điều đáng lưu ý là ấu trùng bị bệnh có thể chỉ biểu hiện một số trong tất cả các dấu hiệu trên, thậm chí tác nhân gây bệnh vẫn hiện diện ngay cả khi ấu trùng không có các biểu hiện của bệnh [14]

Mặc dù dấu hiệu chính để chẩn đoán bệnh đục thân là cơ có màu trắng đục, nhưng đây không phải là các dấu hiệu đặc trưng của bệnh Vì vậy cần sử dụng những phương pháp chẩn đoán bệnh đục thân chính xác và có độ tin cậy cao hơn [36], [58]

1.3.3 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh lần đầu tiên được xác định là Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) [15] Sau đó Qian và cộng sự (2003) công bố thêm một loại virus có tên là Extra small virus (XSV) XSV được phát hiện cùng với MrNV trên

tôm bị bệnh đục thân thu từ Trung Quốc [31]

MrNV là một virus có dạng hình cầu đa diện 20 mặt, không có màng bao, đường

kính khoảng 26-27 nm Bộ gen của MrNV bao gồm 2 sợi đơn RNA có kích thước lần lượt là 2,9kb và 1,3kb [18] Vỏ capsid của MrNV là một chuỗi polypeptide có khối lượng 43 kDa [18] Với những đặc điểm này, MrNV được xếp vào họ

Nodaviridae [34], [18]

XSV cũng là một virus có dạng đa diện 20 mặt, không có màng bao, kích thước khoảng 15-16 nm; vật chất di truyền là một sợi đơn RNA, kích thước khoảng 0,8-0,9 kb [31] Kết quả giải trình tự cho thấy RNA này gồm có 796 nucleotide và một đoạn poly(A) khoảng 15-20 nucleotide ở đầu 3’ [43] Vỏ capsid của XSV gồm 2 sợi polypeptide có khối lượng lần lượt là 16 và 17 kDa [18]

Hình 1.3: Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử của MrNV (trái) và XSV (phải)

(Bonami và cộng sự, 2005)

Vai trò và mối quan hệ giữa MrNV và XSV vẫn chưa được sáng tỏ Vì kích

thước nhỏ và không có gen mã hóa enzyme cần thiết cho sự tái bản nên có giả thiết

cho rằng XSV là một satellite virus và MrNV đóng vai trò như là một virus trợ giúp

(helper virus) [31], [43] Tuy nhiên, một số nghiên cứu chỉ phát hiện XSV mà

không có MrNV trên mẫu TCX bị bệnh đục thân [36], [44]

1.4 Các phương pháp nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh

Nhiều phương pháp nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh đã được sử dụng như: phương pháp mô bệnh học [15], [23]; kỹ thuật RT-PCR [18], [31, [36], [40], [42], [50], [53], [59]; kỹ thuật lai Northern blot [31]; lai Dot-blot [42]; kỹ

thuật S-ELISA [34]; phương pháp lai tại chỗ [23], [42], [54]

1.4.1 Phương pháp nghiên cứu mô bệnh học

1.4.1.1 Nguyên tắc

Mô học nói chung được tạo nên bởi các tế bào và chất nền, giữa chúng có mối quan hệ tác động qua lai lẫn nhau Tế bào và các phân tử của chất nền có kích thước rất nhỏ nên phải được khảo sát ở mức độ vi thể và siêu vi thể [8] Phương pháp khảo sát vi thể phổ biến nhất là thực hiện và khảo sát tiêu bản mô học dưới kính hiển vi (KHV) quang học Vì vậy, các cấu trúc và các cơ quan cần được cắt mỏng

và làm sạch Hầu hết các mô đều được cắt mỏng và gắn vào phiến kính trước khi quan sát bằng KHV quang học [8] Kỹ thuật này gồm một số giai đoạn chính như sau:

Cố định

Khâu cố định giúp mẫu bền vững, bảo quản được lâu ngày Để cho mẫu không

bị tiêu hủy bởi các enzyme có sẵn bên trong các tế bào hay bởi các vi khuẩn và bảo

vệ các cấu trúc nguyên vẹn ở mức độ phân tử, cần xử lý các mẫu với dung dịch cố định [8]

Chất cố định thường dùng là formaldehyde 4%-10%; cơ chế tác động của formaldehyde chưa được hiểu rõ đầy đủ, người ta thấy rằng nó có tác động với các gốc amin (NH2) của protein [8]

Vùi

Trước khi cắt mỏng, mẫu được vùi vào một chất liệu cứng vừa phải để có thể cho lát cắt mô thật mỏng Chất liệu dùng vùi mẫu là sáp paraffin và nhựa resin Sáp paraffin được dùng phổ biến trong khảo sát với KHV quang học [8]

Quy trình vùi mẫu với paraffin có hai khâu chính là khử nước và làm sạch Đầu tiên, nước được rút ra bằng cách ngâm mẫu trong một loạt các dung dịch hỗn hợp ethanol và nước (với nồng độ tăng dần từ 70%-100% ethanol) Ethanol sau đó được thay thế bằng một dung môi có tính hòa tan chất liệu dùng vùi mẫu Đối với chất

vùi mẫu là paraffin, dung môi thường dùng là xylene Khi đã ngấm đầy xylene, mẫu được vùi vào paraffin lỏng ở nhiệt độ 58-60oC Nhiệt độ này làm cho xylene bốc hơi và khoảng trống còn lại được lấp đầy bởi paraffin Mẫu ngấm paraffin trở nên cứng sau khi được lấy ra khỏi tủ ấm [8] Sau khi vùi, khối mô được gắn vào máy cắt mỏng (microtome) với độ cắt mỏng 1-10 µm Lát mô cắt mỏng được để nổi trên mặt nước và chuyển sang phiến kính trước khi nhuộm [8], [26]

Nhuộm

Khâu nhuộm cho phép khảo sát mô dưới KHV quang học Hầu hết các mô đều không màu và việc khảo sát mô không màu dưới KHV quang học là không hiệu quả Vì vậy, nhuộm mẫu giúp làm rõ và phân biệt các thành phần cấu trúc của mô [8]

Có nhiều loại thuốc nhuộm, hầu hết ở dạng hợp chất có tính acid và tính bazơ,

có xu hướng kết gắn bền vững (ở dạng muối) Cấu trúc ăn thuốc nhuộm tính bazơ được gọi là có tính ưa bazơ (basophilic); cấu trúc ăn thuốc nhuộm có tính acid thì được gọi là có tính ưa acid (acidophilic) [8]

Trong số tất cả các loại thuốc nhuộm, hợp chất hematoxylin và eosin (H & E) được dùng phổ biến Hematoxylin có tính bazơ, nó nhuộm được các cấu trúc có tính

ưa bazơ như nhân tế bào cho màu xanh dương Eosin là thuốc nhuộm có tính acid, nhuộm bào tương và các sợi collagen, cho màu hồng [8]

Toàn bộ quy trình thực hiện tiêu bản mô học từ khâu cố định đến lúc quan sát tiêu bản dưới KHV quang học có thể tiến hành trong vòng 12 giờ đến 2,5 ngày tùy theo kích cỡ mẫu, chất cố định và chất vùi mẫu [8]

1.4.1.2 Các nghiên cứu về bệnh đục thân trên tôm càng xanh bằng phương

pháp mô bệnh học

Một số tác giả đã sử dụng phương pháp mô bệnh học để nghiên cứu bệnh đục thân trên TCX như Arcier và cộng sự (1999); Tung và cộng sự (1999); Hsieh và cộng sự (2006) (Hình 1.4) Kết quả công bố đều cho thấy có sự hoại tử cơ, xuất hiện các thể vùi ưa kiềm trong cơ quan gan tụy và trên cơ

Hình 1.4: Đặc điểm mô học của TCX bị nhiễm bệnh đục thân

(Hsieh và cộng sự 2006a)

1.4.2 Phương pháp RT-PCR

1.4.2.1 Nguyên tắc

Vật chất di truyền của MrNV và XSV đều là RNA [18], [31] và do enzyme Taq

polymerase không hoạt động trên RNA [2], [6] nên không thể sử dụng trực tiếp kỹ thuật PCR để nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh Do đó người ta phải sử dụng phối hợp kỹ thuật PCR với enzyme phiên mã ngược là reverse transcriptase, gọi là kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR được ứng dụng trong việc khuyếch đại các cDNA, là sản phẩm của sự phiên mã ngược trước đó từ mRNA hoặc RNA của virus có vật chất di truyền là RNA [11]

Kỹ thuật RT-PCR gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phiên mã ngược và giai đoạn khuyếch đại cDNA [11]

Giai đoạn phiên mã ngược (reverse transcription): Giai đoạn này là quá trình

tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ sợi khuôn RNA nhờ enzyme reverse

transcriptase

Trong nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh, giai đoạn RT thường được tiến hành ở nhiệt độ 42-55oC trong thời gian 45-60 phút [18], [31], [36], [40], [42], [50], [53], [59]

Giai đoạn khuyếch đại cDNA: Giai đoạn này thực hiện phản ứng PCR thông thường để tạo nên số lượng bản sao DNA cần thiết

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 [2], được sử dụng để khuyếch đại DNA Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA [2] Trên cơ sở trình tự DNA khuôn, cùng với sự hiện diện của các cặp mồi đặc hiệu, các nucleotide tự do, enzyme DNA polymerase và điều kiện thích hợp người ta có thể tổng hợp được đoạn DNA giới hạn bởi các cặp mồi trong điều kiện

in vitro [6] PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn biến tính (denaturation): được tiến hành ở nhiệt độ cao 90-95oC trong thời gian 30 giây-60 giây Các liên kết hidro bị phá vỡ, sợi DNA xoắn kép trở thành sợi đơn [2], [6]

Giai đoạn bắt cặp (annealing): khi nhiệt độ được hạ xuống thì các đoạn mồi sẽ

bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên tắc bổ sung Nhiệt

độ của giai đoạn này tùy thuộc vào Tm của các cặp mồi được sử dụng, thông thường từ 40-70oC trong 30 giây-60 giây [2], [6]

Giai đoạn tổng hợp (elongation): khi nhiệt độ tăng lên 70-72oC thì các enzyme DNA polymerase sẽ hoạt động gắn thêm các nucleotide vào cuối các đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với sợi DNA khuôn và kéo dài theo chiều 5’-3’ Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA cần khuyếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài chục phút [6]

Một chu kỳ bao gồm 3 bước như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi số lượng các bản sao trước đó, nghĩa là số lượng các bản sao được tăng lên theo cấp số nhân [2]

Kỹ thuật RT-PCR có thể được thực hiện cả 2 giai đoạn kế tiếp nhau trong cùng một ống eppendorf hoặc thực hiện gián đoạn: phiên mã ngược tạo cDNA trong một ống eppendorf, sau đó tiến hành phản ứng PCR trong một ống eppendorf khác [6]

1.4.2.2 Các nghiên cứu về bệnh đục thân trên tôm càng xanh bằng kỹ thuật

RT-PCR

Vì là kỹ thuật cho phép phát hiện nhanh, chính xác và có độ nhạy cao nên

RT-PCR được nhiều tác giả sử dụng để phát hiện MrNV và XSV trong nghiên cứu bệnh

đục thân Widada và cộng sự (2003) nghiên cứu bằng kỹ thuật RT-PCR, kết quả cho

thấy độ nhạy của phương pháp có thể phát hiện RNA virus MrNV và XSV ở mức

8pg Yoganandhan và cộng sự (2005) sử dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR cho phép

phát hiện đồng thời MrNV và XSV, mức độ phát hiện là 25 fg tổng RNA của virus

1.4.3 Phương pháp lai Dot-blot

1.4.3.1 Nguyên tắc

Kỹ thuật lai chuyển thẩm điểm nhỏ (Dot-blot hybridization) là một trong các kỹ thuật lai trên pha rắn, một trong hai trình tự acid nucleic bổ sung (thường là trình tự đích cần tìm) được cố định trên giá thể rắn, được gọi là màng lai Có hai loại màng lai thường được sử dụng: màng lai bằng nitrocellulose và màng lai bằng nilon Ngày nay người ta thường dùng loại màng lai bằng nilon vì có độ bền cơ học cao và có thể sử dụng nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau [2]

Kỹ thuật lai Dot-blot cho phép định lượng tương đối một RNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra Trong phương pháp này, người ta không cần chuyển acid nucleic từ gel lên màng lai mà đặt trực tiếp một lượng mẫu nhỏ lên màng lai tạo thành một điểm [2] Các RNA đích cố định trên màng này được đem lai với mẫu dò đã đánh dấu Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp đặc hiệu Cuối cùng, sử dụng các

phương pháp để phát hiện phân tử lai

1.4.3.2 Các nghiên cứu về bệnh đục thân trên tôm càng xanh bằng kỹ thuật lai

Dot-blot

J Sri Widada và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật lai Dot-blot để phát hiện virus MrNV (2003) và XSV (2004) trên tôm càng xanh Qúa trình lai sử dụng mẫu dò là một đoạn acid nucleic từ genome của virus được tạo dòng trong các vector như pBluescript, pCR2.1-TOBO Chúng được đánh dấu DIG bằng phương pháp PCR Các phân tử lai ở trên màng được phát hiện bằng kháng thể của DIG được gắn với enzyme alkaline phosphatase

Hình 1.5: Phát hiện MrNV bằng kỹ thuật lai Dot-blot

(Sri Widada và cộng sự 2003)

Ghi chú: (a) RNA của virus được pha loãng 10 lần, từ 80 ng đến 8 pg (1-6)

(b) Mẫu từ các giai đoạn ấu trùng không có dấu hiệu nhiễm virus 4); PL có biểu hiện bình thường (5); PL có dấu hiệu đục cơ (6,7); tôm lớn không có dấu hiệu nhiễm bệnh (8–10); mẫu chứng dương (C+)

(1-1.4.4 Phương pháp ELISA

1.4.4.1 Nguyên tắc

Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme (ELISA-Enzyme linked immuno- sorbent assay) là một trong các kỹ thuật phân tích miễn dịch, dùng để phát hiện các kháng nguyên một cách đặc hiệu Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng

thể phủ lên các đĩa giếng Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong dung dịch mẫu, kháng nguyên sẽ bị giữ lại trên bề mặt giếng bởi kháng thể Các kháng nguyên này sau đó sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxydase hay alkaline phosphatase Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, các enzyme này sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay tự phát sáng Dựa vào sự thay đổi màu sắc, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên [10]

1.4.4.2 Các nghiên cứu về bệnh đục thân trên tôm càng xanh bằng kỹ thuật

S-ELISA

Kỹ thuật S-ELISA (Sandwich-ELISA) được Romestand và Bonami (2003) sử dụng để chẩn đoán bệnh đục thân trên tôm càng xanh Các tác giả sử dụng kháng

thể của nodavirus, IgG (Immunoglobulin G) để phát hiện protein capsid của MrNV

Các kháng thể này được đánh dấu bằng biotin, sau đó sử dụng hệ thống peroxidase để phát hiện S-ELISA là một phương pháp nghiên cứu dịch tể học có hiệu quả tốt đối với bệnh đục thân trên tôm càng xanh, phương pháp này cho phép phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh với độ đặc hiệu và độ nhạy cao [34]

avidin-1.4.5 Phương pháp lai tại chỗ

Lai tại chỗ là một phương pháp lai phân tử trong đó trình tự acid nucleic cần tìm nằm ngay trong tế bào hoặc mô mà không cần qua giai đoạn tách chiết [2] Kỹ thuật này được hai nhóm nhà khoa học độc lập là Pardue và Gall; John và cộng sự đồng thời đề xuất vào năm 1969 [33] Trước đây, tác nhân dùng để đánh dấu mẫu dò là các chất đồng vị phóng xạ, sau đó sử dụng kỹ thuật phóng xạ tự ghi để phát hiện trình tự đích Mặc dù có độ nhạy cao và tính ứng dụng rộng rãi nhưng lại có hại cho sức khỏe con người, đòi hỏi nhiều biện pháp an toàn tốn kém, thời gian sử dụng mẫu dò bị giới hạn nên kỹ thuật này vẫn chỉ được sử dụng giới hạn trong các phòng thí nghiệm [33]

Ngày nay, với sự ra đời của phương pháp đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất đã khắc phục được những nhược điểm của phương pháp sử dụng các chất đồng vị

phóng xạ Cùng với việc tìm ra các kháng thể đặc hiệu, có độ nhạy cao đã làm cho

kỹ thuật lai tại chỗ phát triển không ngừng và có những ứng dụng to lớn trong nghiên cứu khoa học và đời sống [2]

1.4.5.1 Nguyên tắc

Kỹ thuật lai tại chỗ dựa trên cơ sở của sự lai đặc hiệu giữa mẫu dò được đánh dấu với trình tự đích cần tìm theo nguyên tắc bổ sung giữa các nucleotide Kỹ thuật này bao gồm các bước như sau:

Cố định và cắt mẫu

Qúa trình cố định và xử lý mô cũng giống như phương pháp mô học truyền thống, sau đó mô được cắt thành các lát siêu mỏng 5-7 µm Điểm khác nhau ở đây

là các lát cắt này sẽ được cố định trên lam kính đã được phủ một lớp silane giúp cho

mô không bị tách ra khỏi lam trong quá trình lai [39]

Xử lý tiêu bản mô

Bước này nhằm mục đích làm bất hoạt các enzyme nội bào, thủy phân protein, tăng cường khả năng tiếp xúc và lai giữa mẫu dò với trình tự đích, giảm hiện tượng lai và bắt màu không đặc hiệu

ƒ Bất hoạt các enzyme nội bào

Một số phương pháp sử dụng các enzyme như peroxidase, alkaline phosphatase trong quá trình phát hiện các mẫu dò được đánh dấu Tuy nhiên, các enzyme cũng

có sẵn trong các tế bào Do đó sẽ xảy ra hiện tượng bắt màu không đặc hiệu Vì vậy cần làm bất hoạt các enzyme nội sinh trước khi lai [33]

Để bất hoạt peroxidase, tiêu bản mô đươc xử lý khoảng 30 phút với H2O2 1% trong methanol Đối với alkaline phosphatase, có thể sử dụng levamisole, nhưng thông thường thì enzyme này bị mất hoạt tính trong quá trình lai [33]

ƒ Thủy phân protein

Xử lý mẫu với HCl, các chất tẩy và enzyme protease để thủy phân các protein có xung quanh trình tự đích do đó sự xâm nhập của mẫu dò vào bên trong tế bào thuận

lợi hơn, làm giảm sự bắt màu không đặc hiệu, tăng cường tín hiệu lai [33]

Tiền lai (prehybridization)

Tiêu bản được ủ với dung dịch lai nhưng không có mẫu dò trong 1-2 giờ để khóa các vị trí có thể gây ra hiện tượng gắn không đặc hiệu của mẫu dò Tuy nhiên, bước này có thể làm giảm cường độ của tín hiệu lai vì nó làm loãng nồng độ của mẫu dò [39]

Phát hiện phân tử lai

Trong kỹ thuật lai tại chỗ, trình tự đích được phát hiện thông qua các vị trí lai của mẫu dò được đánh dấu Mỗi loại tác nhân đánh dấu mẫu dò có phương pháp phát hiện khác nhau Nếu mẫu dò được đánh dấu bằng chất phóng xạ thì sử dụng kỹ thuật phóng xạ tự ghi để phát hiện phân tử lai [2] Nếu mẫu dò được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang như flourescein, cyanine, rhodamine,…thì vị trí lai được phát hiện trực tiếp thông qua sự phát huỳnh quang của các chất này trong những điều kiện thích hợp [39] Khi mẫu dò được đánh dấu bằng biotin thì người ta sử

1.4.5.2 Một số nghiên cứu về bệnh đục thân trên tôm càng xanh bằng kỹ thuật

lai tại chỗ

Sri Widada và cộng sự (2003) công bố kết quả nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh bằng phương pháp lai tại chỗ Sử dụng mẫu dò DNA được đánh dấu

DIG, các tác giả ghi nhận sự lây nhiễm của MrNV ở mô cơ của phần bụng, phần

đầu ngực, chân bơi và các phụ bộ

Hình 1.6: Kết quả lai tại chỗ trên mô của TCX bị nhiễm MrNV

(Hsieh và cộng sự 2007)

Ghi chú: các tín hiệu lai có màu nâu đậm trên cơ (a) và trong gan tụy (b)

Hsieh và cộng sự (2006) sử dụng phương pháp lai tại chỗ với mẫu dò DNA

được đánh dấu DIG để phát hiện MrNV Kết quả cho thấy sự lây nhiễm của virus

trong gan tụy; các tế bào cơ của phần bụng, đuôi, các chân bơi (Hình 1.6)

Một nghiên cứu gần đây về bệnh đục thân bằng phương pháp lai tại chỗ của Wang và cộng sự (2008) cũng sử dụng mẫu dò được đánh dấu với DIG Kết quả đã

khẳng định sự lây nhiễm của MrNV trên mô cơ của tôm càng xanh

1.5 Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước

Ở trong nước, các nhà nghiên cứu mới bắt đầu khảo sát bệnh đục thân trên ấu trùng TCX nên chưa có công trình nghiên cứu chính thức nào được công bố

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Bệnh đục thân trên TCX lần đầu tiên được quan sát ở Guadeloupe vào năm

1995, sau đó xuất hiện ở Martinique (French West Indies) [15] Từ khi được phát hiện đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh đục thân được công bố Tung và cộng sự (1999) sử dụng phương pháp mô bệnh học và KHV điện tử để nghiên cứu tác nhân gây bệnh đục thân trên TCX Các hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy có những virus hình đa diện (20 mặt), đồng thời xuất hiện các thể vùi ưa kiềm trong tế bào chất của tế bào ở vùng cơ bị nhiễm bệnh

Qian và cộng sự (2003) khảo sát bằng KHV điện tử và kỹ thuật lai Northern blot

đã khẳng định sự hiện diện của MrNV và XSV trong ấu trùng TCX bị bệnh đục thân, đồng thời xác định kích thước và vật chất di truyền của chúng (RNA) MrNV

có hình đa diện 20 mặt, đường kính 26-27nm; XSV cũng có hình đa diện 20 mặt,

đường kính 14-16 nm Bộ gen của MrNV gồm 2 sợi đơn RNA có kích 3 và 1,2 kb;

bộ gen của XSV là 1 sợi RNA đơn, kích thước khoảng 0,8-0,9 kb

Widada và cộng sự (2003) nghiên cứu dựa trên các phương pháp lai Dot-blot, lai tại chỗ và RT-PCR Kết quả cho thấy độ nhạy của kỹ thuật Dot-blot và RT-PCR lần lượt là 7 fg và 8 pg RNA của virus Bằng kỹ thuật lai tại chỗ, tác giả xác định vị trí

lây nhiễm của MrNV trên mô cơ của phần bụng, phần đầu ngực và các chân bơi

Romestand và cộng sự (2003) sử dụng phương pháp S-ELISA để phát hiện

MrNV Từ các kết quả thu được tác giả khẳng định đây là phương pháp có độ nhạy

và đặc hiệu cao, chi phí thấp, phù hợp cho các nghiên cứu dịch tể học

Widada và Bonami (2004) sử dụng các phương pháp giải trình tự đã công bố trình tự gene của XSV Theo các tác giả, hệ gene của XSV bao gồm 796 nucleotide

và ở đầu cuối có một đoạn poly(A) khoảng 15-20 nucleotide

Sahul Hameed và cộng sự (2004) cảm nhiễm MrNV và XSV trên TCX Tỉ lệ

chết trên PL thí nghiệm là 100%, trong khi đó không thấy có dấu hiệu bất thường nào trên TCX trưởng thành Kết quả kiểm tra bằng RT-PCR phát hiện cả hai virus trên PL và trong các cơ quan của tôm trưởng thành như mang, buồng trứng, cơ, dạ

dày, ruột, tim, chân bơi Các tác giả nhận định sự hiện diện MrNV và XSV trong

buồng trứng của tôm trưởng thành là bằng chứng cho sự lây truyền của chúng từ thế hệ bố mẹ sang các thế hệ sau qua con đường sinh sản

Yoganandhan và cộng sự (2005) phát triển và ứng dụng kỹ thuật multiplex

RT-PCR cho phép phát hiện đồng thời MrNV và XSV, mức độ phát hiện là 25 fg tổng

RNA của virus

Sudhakaran và cộng sự (2006) tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm MrNV và XSV

trên 3 loài tôm Penaeus indicus, Penaeus japonicus và Penaeus monodon Kết quả

cho thấy MrNV và XSV không gây bệnh cho các loài tôm này nhưng vẫn tồn tại

trong các mô và cơ quan như mang, cơ, dạ dày, ruột Độc lực của chúng vẫn không thay đổi khi được cảm nhiễm trở lại ấu trùng TCX Tác giả cho rằng 3 loài tôm này

có thể là vật mang MrNV và XSV và từ đó lây nhiễm sang TCX

Sudhakaran và cộng sự (2006) tiến hành cảm nhiễm MrNV và XSV trên

Artemia Kết quả kiểm tra bằng phương pháp nested RT-PCR cho thấy cả 5 giai

đoạn phát triển của Artemia đều dương tính với MrNV và XSV Khi cho PL bình

thường ăn các Artemia này, tỉ lệ chết của PL thí nghiệm là 100%, kết quả kiểm tra bằng RT-PCR dương tính với cả hai virus Các tác giả kết luận có thể Artemia là vật

chủ trung gian mang và truyền mầm bệnh MrNV và XSV cho ấu trùng TCX

Hsieh và cộng sự (2006) sử dụng kỹ thuật RT-PCR, mô bệnh học và lai tại chỗ

để phát hiện MrNV và XSV trên TCX Tác giả cho rằng MrNV không chỉ gây

nhiễm ở mô cơ hay chân bơi như các nghiên cứu trước đây công bố mà còn gây

nhiễm vào hệ gan tụy; kết quả mô bệnh học phát hiện hiện các thể vùi trên cơ và trong cơ quan gan tụy

Zhang và cộng sự (2006) tiến hành cảm nhiễm với tỉ lệ khác nhau giữa MrNV

và XSV trên ấu trùng TCX bình thường Dấu hiệu của bệnh đục thân xuất hiện rõ

trên hai nhóm được cảm nhiễm với tỉ lệ MrNV cao hơn so với XSV (nhóm 1 và 2);

ngược lại, dấu hiệu đục thân ít thấy trên nhóm thứ 3 được cảm nhiễm với tỉ lệ XSV cao hơn Kết quả kiểm tra bằng phương pháp real-time RT-PCR cho thấy số bản sao

bộ gen của cả hai virus trong nhóm 1 và 2 cao hơn so với nhóm 3 Các tác giả kết

luận MrNV đóng vai trò quyết định trong quá trình gây bệnh đục thân trên ấu trùng

TCX

Sudhakaran và cộng sự (2007) tiến hành thí nghiệm kiểm tra sự lây truyền

MrNV và XSV từ thế hệ bố mẹ sang thế hệ con trên TCX và Artermia Tôm bố mẹ

nhiễm MrNV và XSV không bị đục thân và các dấu hiệu bất thường khác Thế hệ

ấu trùng được ấp nở từ trứng của chúng bị chết 100% Kiểm tra bằng RT-PCR cho

kết quả dương tính với MrNV và XSV Trên Artermia, mặc dù dương tính với

MrNV và XSV nhưng cả thế hệ Artermia bố mẹ và con non đều bình thường Khi

cho ấu trùng TCX ăn các Artermia nhiễm MrNV và XSV, thì tỉ lệ chết đạt đến 100% sau 9 ngày Các tác giả nhận định rằng MrNV và XSV có thể lây nhiễm theo

cả hai con đường ngang và dọc; Artermia có thể là một tác nhân mang và lây nhiễm mầm bệnh trong các trại giống

− 15 mẫu ấu trùng thu từ Long Xuyên-An Giang

− 3 mẫu ấu trùng thu từ Lấp Vò-Đồng Tháp

− 3 mẫu tôm trưởng thành ở Châu Thành-An Giang

− 5 mẫu PL ở Châu Thành-An Giang

− 3 mẫu tôm giống ở Thoại Sơn-An Giang

Ngoài ra, mẫu tôm nhiễm MrNV và XSV được cung cấp bởi A.S Sahul

Hammeed (Khoa Động vật học, trường C Abdul Hakeem, Melvisharam, Ấn Độ) được sử dụng để kiểm tra kết quả RT-PCR

2.1.2 Thang DNA

Hình 2.1: Thang DNA 100 trên gel agarose 2% ( Promega)

Thang DNA 100 của công ty Promega (Promega Corporation, Madison, USA) được sử dụng để kiểm tra kích thước sản phẩm RT-PCR, các vạch kích thước của thang DNA 100 được trình bày trong Hình 2.1

XSV-F: 5’-GGAGAACCATGAGATCACG-3’

XSV-R: 5’-CTGCTCATTACTGTTCGGAGTC-3’

2.1.4 Bộ kit tổng hợp và đánh dấu mẫu dò

Bộ kit “ PCR DIG Probe Synthesis Kit ”, Cat No 11 636 090 910 của công ty Roche (Roche Diagnosticộng sự GmbH, Mannheim, Germany) được sử dụng để

tổng hợp và đánh dấu mẫu dò đặc hiệu cho MrNV và XSV

Bộ kit này được thiết kế để tổng hợp các mẫu dò có độ nhạy cao dùng cho các phương pháp lai như lai tại chỗ, Dot blot hybridization,…và phù hợp cho mục đích phát hiện các trình tự đích có số bản sao trong mẫu thấp Mẫu dò có thể được trực tiếp tổng hợp và đánh dấu từ một lượng nhỏ khuôn mẫu DNA (100 ng – 1 μg) Thành phần của bộ kit bao gồm:

− Hỗn hợp enzyme (Enzyme mix)

− Hỗn hợp tổng hợp mẫu dò (PCR DIG Probe Synthesis Mix)

− Dung dịch đệm PCR có MgCl2 (PCR buffer with MgCl2)

− Dung dịch gốc dNTP (dNTP stock solution)

− Khuôn mẫu kiểm tra đối chứng (Control template)

− Hỗn hợp mồi đối chứng (Control PCR primer mix)

Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất và có một số thay đổi phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu

2.1.5 Bộ kit tách chiết và tinh sạch DNA từ gel agarose

Bộ kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System của công ty Promega (Promega Corporation, Madison, USA) được thiết kế để tách chiết và tinh sạch các đoạn DNA có kích thước 100bp-10kb từ gel agarose trong dung dịch đệm TBE hoặc TAE Khả năng thu hồi DNA có thể đến 95%

Bộ kit có tác dụng tinh sạch sản phẩm PCR, giúp loại bỏ các nucleotide tự do còn dư, các đoạn mồi được sử dụng trong qúa trình PCR và một số DNA được tổng hợp và đánh dấu không đặc hiệu (nếu có) Thành phần của bộ kit bao gồm:

− Dung dịch Membrane Binding (Membrane Binding Solution)

− Dung dịch rửa màng (Membrane Wash Solution)

− Nước không có enzyme nuclease (nuclease-free water)

Thu mẫu kiểm tra

Thu mẫu bảo quản -80oC

Tách chiết thu dịch virus

Ấu trùng TCX có dấu hiệu bệnh đục thân

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu và bảo quản mẫu

xử lý cho các phương pháp khác nhau:

− Cố định trong dung dịch Davidson cho các phân tích mô bệnh học và lai tại chỗ

− Cố định trong cồn 95% để phân tích RT-PCR

− Vận chuyển trong bình đựng nitơ lỏng và bảo quản mẫu ở -80oC để tách

chiết thu dịch virus MrNV và XSV dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm

Ấu trùng khỏe mạnh cũng được thu từ các trại giống không có dấu hiệu bị bệnh đục thân và các bệnh thông thường khác để bố trí các thí nghiệm cảm nhiễm

2.2.2 Tách chiết RNA tổng số

2.2.2.1 Thiết bị và dụng cụ

− Tủ lạnh: 4oC và –21oC

− Máy ly tâm lạnh 15000 vòng/ phút

− Block nhiệt khô

− Máy Vortex (Zx3 Velp)

− Micropipette và đầu tip micropipette các loại 0,5 - 1000 μl

− Eppendorf các loại: 0,2 - 1,5 ml

− Tủ cấy vô trùng (Laminar-Box)

− Kéo, đèn, cồn, chày nhựa sử dụng một lần

− Hút 200 μl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf thứ 2

− Thêm 1 ml Trizol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút