Enrichment of anammox bacterial from anerobic sludge of feedfish wastewater treatment system

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT SS Suspended solit Chất rắn lơ lửng BOD Biodenmical Oxygen Demand Nhu cầu Oxy sinh hóa COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu Oxy hóa học MPN Most Protable Number Số lượng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN

NHÀ MÁY SẢN XUẤT THỨC ĂN CÁ

Enrichment of Anammox bacterial from anerobic sludge of feedfish

wastewater treatment system

Chuyên Ngành: Kỹ Thuật Môi Trường

Mã số: 60520320

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tp Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

NGUYỄN THỊ HỒNG DIỆU

LÀM GIÀU VI KHUẨN ANAMMOX TỪ BÙN KỴ KHÍ

HỆ THỐNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SẢN XUẤT

THỨC ĂN CÁ

Enrichment of Anammox bacterial from anerobic sludge of feedfish

wastewater treatment system

Chuyên ngành: Kỹ thuật Môi trường

Mã số: 60 52 03 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2018

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG - HCM

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 PGS TS Bùi Xuân Thành

2 TS Nguyễn Xuân Dương

3 PGS TS Lê Hùng Anh

4 TS Nguyễn Trung Thành

5 TS Võ Nguyễn Xuân Quế

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Hồng Diệu MSHV:1570448 Ngày, tháng, năm sinh: 02/12/1988 Nơi sinh: Cần Thơ Chuyên ngành: Kỹ Thuật Môi Trường Mã số : 60520320

TÊN ĐỀ TÀI: Làm giàu vi khuẩn Anammox từ bùn kỵ khí hệ thống xử lý nước thải nhà máy sản xuất thức ăn cá (Enrichment of Anammox bacterial from anaerobic sludge of feedfish waswater treatment system)

I NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Thiết kế, lắp đặt mô hình làm giàu Anammox từ kỵ khí hệ thống xử lý nước thải nhà máy sản xuất thức ăn cá

- Chạy thích nghi sinh khối trên môi trường nước thải nhân tạo

- Định danh xác định sự có mặt của vi khuẩn Anammox trong bùn của hệ thống

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/2017

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2018

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô ở Khoa Môi trường và Tài nguyên, Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô PGS.TS Đặng Vũ Bích Hạnh, cô đã luôn tận tình hướng dẫn chỉ bảo cho em trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp Nếu không có sự hướng dẫn nhiệt tình của cô em sẽ rất khó để hoàn thành được đề tài luận văn

Đồng thời em cũng cám ơn thầy TS Kim Lavane, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho em các trang thiết bị trong phòng thí nghiệm, hóa chất, phương pháp,… trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Cám ơn các bạn sinh viên Trường Đại học Cần Thơ luôn nhiệt huyết với đề tài, giúp đỡ em trong thời gian vận hành mô hình

Trong quá trình làm đề tài không thể tránh khỏi những sai sótrất mong các thầy,

cô bỏ qua Đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp thầy, cô để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và kiến thức trong lĩnh vực này

TP HCM, ngày 18 tháng 01 năm 2019

Nguyễn Thị Hồng Diệu

Quá trình làm giàu vi khuẩn Anammox từ bùn kỵ khí đƣợc thực hiện trong

mô hình SBR kỵ khí Nghiên cứu đƣợc thực hiện trong 11 tháng Thí nghiệm 1 vận hành khởi động nuôi cấy với nồng độ 70 mgN/L ở tải trọng 0.058 kg N/m3.ngày Hiệu suất loại bỏ ammoni cao nhất đạt 29%, SS trong bể đạt 1.866 mg/L Đến giai đoạn thí nghiệm 2, vi sinh vật bắt đầu thích nghi và phát triển, hiệu suất ổn định, tiếp tục tăng nồng độ lên 150 mgN/L với tải trọng 0,25 kgN/m3.ngày để tích lũy và làm giàu sinh khối Hiệu suất loại bỏ ammoni cao nhất đƣợc 64%, SS trong bể đạt 2.967 mg/L Đến giai đoạn thí nghiệm 3 nồng độ đƣợc tăng lên 200 mgN/L với tải trọng 0,33 kg/m3.ngày, hiệu suất loại bỏ ammoni cao nhất đạt 88%, SS trong bể đạt 3.781 mg/L

Màu sắc của bùn chuyển từ màu đen sang sắc nâu đỏ sau 11 tháng vận hành

Để định danh xác định vi khuẩn Anammox, nhóm nghiên cứu đã tiến hành tách chiết DNA bộ gen của mẫu bùn hoạt tính và PCR với primers chọn lọc (Ana_5’ primer: 5’-TAGAGGGGTTTTGATTAT-3’, Tm = 44,3 oC và Ana_3’ primer: 5'-GGACTGGATACCGATCGT-3 , Tm = 53,3 oC) để tìm kiếm các chủng Anammox Sản phẩm điện di sau khi PCR đoạn 16S rDNA khoảng 100-150 bp Kết quả cho

thấy sự xuất hiện của vi khuẩn Anammox trong bùn thuộc loài Candidatus

brocadia

ABSTRACT

This study was conducted by using anaerobic sludge in place of aquatic food processing plant to cultivate Anammox microbial biomass Anaerobic sludge is taken from the anaerobic contact tank of the waste water treatment system of C.P

Viet Nam Joint Stock Company in Can Tho

Anammox enrichment process from anaerobic sludge was performed in anaerobic SBR set-up The set-up was conducted in 11 months Experiment 1 operated the culture start with concentration of 70 mg N/L at loading of 0.058 kg N/m3.day The highest ammonium removal efficiency reached 29%, SS in the tank reached 1,866 mg/L Experiment 2, microorganisms began to adapt and develop, stable performance, continued concentration increased to 150 mg N/L with a loading of 0.25 kgN/m3.day to accumulate and enrich biomass The highest ammoni removal efficiency was 64%, SS in the tank reached 2,967 mg/L Experiment 3, the concentration was increased to 200 mg N/L with a loading of 0.33 kgN/m3.day, the highest ammoni removal efficiency reached 88%, SS in the tank reached 3,781

mg/L

The color of the mud changes from black to reddish brown after 11 months

of operation

Biomass was extracted DNA genome and PCR with selective primers

(Ana_5 'primer: 5'-TAGAGGGGTTTTGATTAT-3', Tm = 44,3 C and Ana_3 'primer: 5'-GGACTGGATACCGATCGT-3, Tm = 53,3 C) to measure Anammox strains Electrophoresis product after PCR of 16S rDNA segment is about 100-150

bp The results showed the appearance of Anammox bacteria in the mud was

Candidatus brocadia

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, những kết quả, số liệu của luận văn này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác.Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này

TP.HCM, ngày 18 tháng 01 năm 2019

Nguyễn Thị Hồng Diệu

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG xi

DANH MỤC HÌNH xi

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT xiii

MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Đối tượng nghiên cứu 2

1.5 Phương pháp nghiên cứu 2

1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.6.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

1.7 Tính mới của đề tài 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tính chất nước thải ngành sản xuất thức ăn thủy sản 4

1.2 Công nghệ xử lý nước thải ngành sản xuất thức ăn thủy sản 4

1.3 Quá trình Anammox 7

1.3.1 Giới thiệu 7

1.3.2 Lịch sử phát hiện và bản chất quá trình Anammox 7

1.3.3 Hóa sinh học của quá trình Anammox 8

1.3.4 Đặc điểm vi sinh học 11

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình Anammox 14

1.4 Tình hình nghiên cứu Anammox trên thế giới 15

1.5 Tình hình nghiên cứu Anammox trong nước 21

1.6 Các phương pháp phân lập nuôi cấy từ môi trường 22

1.6.1 Các phương pháp phân lập 22

1.6.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 23

1.6.3 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Nội dung nghiên cứu 28

2.2 Thiết kế lắp đặt mô hình 29

2.2.1 Mô hình làm giàu vi khuẩn Anammox 29

2.2.2 Vật liệu thí nghiệm 32

2.2.3 Quy trình vận hành chung 33

2.3 Thử nghiệm thăm dò xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình loại bỏ NH4+ - N 34

2.4 Các nghiệm thức ở ba tải trọng: 0,053 kgN/m3.ngày, 0,25 kgN/m3.ngày, 0,33 kgN/m3.ngày 35

2.4.1 Vật liệu thí nghiệm 35

2.4.2 Điều kiện vận hành 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả chạy thử nghiệm thăm dò 38

3.2 Kết quả chạy thích nghi sinh khối trên môi trường nuôi cấy là nước thải nhân tạo 38

3.2.1 Thí nghiệm 1: Khởi động nuôi cấy ở tải trọng 0,053 kgN/m3.ngày 38

3.2.2 Thí nghiệm 2: Tích lũy và làm giàu bùn ở tải trọng 0,25 kgN/m3.ngày 40

3.2.3 Thí nghiệm 3: Tích lũy và làm giàu bùn ở tải trọng 0,33 kgN/m3.ngày 41

3.2.4 Tốc độ loại bỏ Tổng Nitơ 42

3.3 Định danh xác định sự có mặt của vi khuẩn Anammox trong bùn hệ thống nuôi

cấy 43

3.4 Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình loại bỏ NH4+-N trong giai đoạn vận hành làm giàu bùn Anammox 47

3.4.1 pH và độ kiềm 47

3.4.2 DO 47

3.4.3 Xây dựng phương trình hồi quy 48

3.5 Đặc điểm sinh khối Anammox 48

3.5.1 Sự phát triển của vi khuẩn Anammox 48

3.5.2 Màu sắc của bùn 49

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

4.1 Kết luận 50

4.2 Kiến nghị: 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Kết quả phân tích nước thải đầu vào công ty cổ phần chăn nuôi C.P Việt

Nam 4

Bảng 1.2 So sánh định tính một vài công nghệ Anammox và các công nghệ truyền thống 6

Bảng 1.3 Danh sách các vi khuẩn Anammox được phát hiện 11

Bảng 1.4 Bảng một số đặc trưng sinh lý của vi khuẩn và phản ứng Anammox 13

Bảng 2.1 Thông số kỹ thuật vật liệu bông lọc 31

Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy 32

Bảng 2.3 Điều kiện vận hành thử nghiệm thăm dò 35

Bảng 2.4 Điều kiện vận hành các nghiệm thức 36

Bảng 2.5 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 36

Bảng 3.1 Kết quả BLAST trên genbank 45

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Chu trình nitơ mới bổ sung thêm mắt xích Anammox 8

Hình 1.2 Cơ chế sinh hóa của quá trình Anammox 9

Hình 1.3 Sơ đồ phân khoang tế bào Anammox 10

Hình 1.4 Cây phát sinh loài của bộ Planctomycetales 12

Hình 2.1 Sơ đồ tổng thể mô hình nuôi cấy Anammox 29

Hình 2.2 Tổng thể mô hình nuôi cấy Anammox thực tế 30

Hình 2.3 Bể gia nhiệt 30

Hình 2.4 Bể nuôi cấy 31

Hình 2.5 Giá thể 32

Hình 2.6 Quy trình vận hành mô hình 33

Hình 3.1 Kết quả chạy thử nghiệm thăm dò 38

Hình 3.2 Sự biến thiên của Ammonium và Nitrite trong thí nghiệm 1 39

Hình 3.3 Sự biến thiên của Ammoni và Nitrite trong thí nghiệm 2 40

Hình 3.4 Sự biến thiên của Ammonium và Nitrite trong thí nghiệm 3 41

Hình 3.5 Tốc độ loại bỏ Tổng Nitơ 42

Hình 3.6 Kết quả giải trình tự DNA đoạn gen sau khi đã PCR 45

Hình 3.7 Cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum Likelihood 46

Hình 3.8 Sự biến thiên của DO và ammoni, nitrite đầu ra 47

Hình 3.9 Màu sắc của bùn qua các giai đoạn nuôi cấy 49

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

SS Suspended solit (Chất rắn lơ lửng)

BOD Biodenmical Oxygen Demand (Nhu cầu Oxy sinh hóa)

COD Chemical Oxygen Demand (Nhu cầu Oxy hóa học)

MPN Most Protable Number (Số lượng chắc chắn nhất có thể)

SBR Sequencing Batch Reactor (Bể phản ứngtheo mẻ)

RBC Rotating Biological Contactor (Đĩa quay sinh học)

DO Dissolved Oxygen (Oxy hòa tan)

OLAND Oxygen Limited Autotrophic Nitrification Denitrification (Hệ thống nitrate

hóa và khử nitrate với lượng oxy giới hạn)

AOB Amonia Oxydizing Bacteria (Vi khuẩn Oxy hóa Amoni)

FISH Florescence In Situ Hybridization (Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ)

VSS Volatile Suspended Solid (Chất rắn lơ lửng bay hơi)

TSS Tatol Suspended Solid (Tổng chất rắn lơ lửng)

CANON Complete Autotrophic Nitrogen Removal Over Nitrite (Sự kết hợp giữa

nitrite hóa bán phần và Anammox trong cùng một thiết bị xử lý nitơ)

SNAP

Single stage Nitrogen removal using Anamox Partial nitritation (Quá trình loại bỏ nitơ kết hợp nitrate hóa bán phần và Anammox trong một bể phản ứng)

DEAMOX Denitrifying Ammonia Oxidation (Quá trình khử nitrate và oxy hóa

ammonia)

SHARON Single reactor System for Hight Acticity Ammonia Removal Over Nitrite

(Nitrate hóa cục bộ ammonium thành nitrite)

NOB Amonia oxidizing bacteria (Vi khuẩn oxy hóa ammonia)

SRT Sludge Retention Time (Thời gian lưu bùn)

UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket (Bể kỵ khí dòng chảy ngược)

MBR Membrance Bio Reator (Bể lọc sinh học bằng màng)

UF Ultra Filtration (Màng Lọc UF)

TNRR Total Nitrogen Removal Rate (Tốc độ loại bỏ nitơ tổng)

PN-SBR Partial Nitrification – SBR (Bể kết hợp nitrite hóa bán phần và bể phản ứng

theo mẻ)

HAR Hybrid Anammox Reactor (Phản ứng kết hợp Anammox)

NLR Nitrogen Loading Rate (Tải trọng nitơ)

TAN Total Ammonia (Tổng ammoni nitơ)

NRR Nitrogen Removal Rate (Tốc độ loại bỏ nitơ)

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Khi dân số ngày càng gia tăng thì việc nuôi trồng thủy sản cũng tăng nhanh và ra đời các trung tâm sản xuất thức ăn thủy sản Khi các doanh nghiệp sản xuất thức ăn tăng lên thì mối quan tâm lớn nhất sẽ là vấn đề xả thải Nước thải các nhà máy chế biến thức

ăn thủy sản luôn chứa nhiều chất hữu cơ, cặn lơ lửng, hàm lượng N, P cao Vấn đề chính của việc xử lý nước thải ngành sản xuất thức ăn thủy sản là việc xử lý N, P

Hiện nay có nhiều phương pháp xử lý nước thải chứa Nitơ cao như CANON, SHARON, OLAND, SNAP,A2O, Anammox nhưng Jetten và cộng sự (2012) [1] đã chứng minh rằng công nghệ Anammox có thể giải quyết tốt vấn đề xử lý N, P trong nước thải có hàm lượng chất dinh dưỡng cao do đòi hỏi nhu cầu về oxy ít hơn, không cần bổ sung nguồn Cacbon hữu cơ từ bên ngoài, nó đem lại lợi ích về kinh tế

Với việc nuôi cấy Anammox bằng chính nguồn vi khuẩn bản địa có thể giúp cho

vi sinh vật xử lý nước thải có khả năng thích nghi cao với môi trường hơn so với nguồn

vi khuẩn được thu thập từ nhiều nguồn phải trải qua quá trình thích nghi lâu dài Kocamemi BA và cộng sự (2018) [2] đã nghiên cứu nhằm đánh giá tác động của kỹ thuậtsử dụng seed trong giai đoạn khởi động và làm giàu của các hệ thống Anammox bằng cách theo dõi cả hiệu suất của quá trình và động lực học của vi sinh vật Hai kỹ thuậtseeding khác nhau, sử dụng nuôi cấy bùn hoạt tính hỗn hợp từ nguồn bùn địa phương và sử dụng nuôi cấy Anammox được làm giàu từ nước ngoài, được nghiên cứu tương đối trong các hệ thống SBR hoạt động trong 410 ngày Seed Anammox được làm giàu từ nước ngoài bị ức chế nghiêm trọng trong quá trình vận chuyển Hoạt động Anammox bắt đầu lại sau thời gian phục hồi 195 ngày Hoạt tính Anammox đã được làm giàu thành công trong vòng 95 ngày từ nguồn bùn hoạt tính cục bộ mà không cần seeding Anammox Vi khuẩn Anammox đạt mức 1.011 bản/ng vào cuối thời gian làm giàu 410

ngày Kết quả FISH cho thấy, Ca Brocadia anammoxidans và Ca Scalindua chiếm ưu

thế trong môi trường làm giàu TNRR tối đa được quan sát là 430 mg N/ngày Các phân tích DGGE cho thấy một sự thay đổi mạnh mẽ trong cộng đồng vi sinh vật (56%) với sự làm giàu Anammox

Vì vậy, đề tài ―LÀM GIÀU VI KHUẨN ANAMMOX TỪ BÙN KỴ KHÍ HỆ THỐNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SẢN XUẤT THỨC ĂN CÁ‖được chọn

để tiến hành nghiên cứu

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nuôi cấy làm giàu vi khuẩn Anammox từ bùn kỵ khí hệ thống xử lý nước thải nhà máy sản xuất thức ăn cá

1.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài bao gồm các nội dung như sau:

(i) Thiết kế, lắp đặt mô hình làm giàu Anammox từ bùn kỵ khí hệ thống xử lý nước thải nhà máy sản xuất thức ăn cá

(ii) Chạy thích nghi, tích lũy và làm giàu sinh khối trên môi trường nước thải nhân tạo

(iii) Định danh xác định sự có mặt của vi khuẩn Anammox trong bùn của hệ thống

(iv) Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố bao gồm pH, nhiệt độ, độ kiềm,…đến quá trình khử Ammoni

1.4 Đối tượng nghiên cứu

Nhóm nghiên cứu sử dụng mô hình có thể tích hiệu dụng 9 lít để thực hiện thí nghiệm nuôi cấy làm giàu vi khuẩn Anammox từ bùn kỵ khí nhà máy sản xuất thức ăn cá Công ty Cổ phần Chăn Nuôi C.P Việt Nam tại Cần Thơ

1.5 Phương pháp nghiên cứu

* Phương pháp tổng quan tài liệu, tham khảo, tìm hiểu các nghiên cứu đã được thực hiện ứng dụng công nghệ Anammox từ các bài báo đã được công bố Tìm hiểu các

cơ chế xảy ra trong quá trình Anammox, tham khảo các tài liệu về vận hành, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

- Thí nghiệm 1: Khởi động nuôi cấy làm giàu bùn ở tải trọng 0,058 kgN/m3.ngày

- Thí nghiệm 2: Giai đoạn tích lũy và làm giàu vi khuẩn Anammox ở tải trọng 0,25 kgN/m3.ngày

- Thí nghiệm 3: Giai đoạn tích lũy và làm giàu vi khuẩn Anammox ở tải trọng 0,33 kgN/m3.ngày

* Phương pháp lấy mẫu và phân tích, đánh giá số liệu thực nghiệm của thí nghiệm, hàng ngày theo dõi chỉ tiêu pH, DO, nhiệt độ; hàng tuần theo dõi các chỉ tiêu, NH4+ - N,

NO3- -N, NO4 - - N

* Phương pháp lấy mẫu chạy PCR giải trình tự DNA

* Phương pháp phân tích và xử lý số liệu thực nghiệm được nhập vào phần mềm Excel (version 2010) hàng ngày và xử lý số liệu trên phần mềm Excel (version 2010) và SPSS (version 23)

1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.6.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu cung cấp bổ sung nguồn gen Anammox từ bùn kỵ khí nhà máy sản xuất thức ăn cá

1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu góp phần thực tế xử lý nước thải giàu nitơ của các hệ thống xử

lý nước thải thủy sản ở phía Nam

1.7 Tính mới của đề tài

Thu nhận và làm giàu nguồn gen Anammox tại chỗ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tính chất nước thải ngành sản xuất thức ăn thủy sản

Do đặc trưng của ngành nghề sản xuất thức ăn cá là không sử dụng nước trong quá trình sản xuất nên không phát sinh nước thải (lượng nước sử dụng cho hoạt động lò hơi

sẽ hóa hơi và không phát sinh nước thải) Lượng nước thải phát sinh chủ yếu là nước từ việc vệ sinh hệ thống chứa cám bụi, vệ sinh bồn dầu cá, mắm tôm, và nước thải sinh hoạt Nước thải chứa nhiều bột cám nổi Lượng nước thải này chứa hàm lượng cao SS, BOD, COD các chất dinh dưỡng

Bảng 1.1 Kết quả phân tích nước thải đầu vào công ty cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam

(Nguồn: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng Cần Thơ, 2016)

1.2 Công nghệ xử lý nước thải ngành sản xuất thức ăn thủy sản

Hiện nay có nhiều nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn để xử lý nitơ trong nước thải thủy sản

A.E Ghaly và cộng sự (2004) [3] đã thực hiện năm ô đất đã được kiểm tra khả năng loại bỏ chất dinh dưỡng từ nước thải nuôi trồng thủy sản và sự phù hợp như thức ăn cho cá: cỏ linh lăng, cỏ ba lá trắng, yến mạch, lúa mạch đen, lúa mạch Những hạt giống đầu tiên được nảy mầm trong nước trong một hệ thống thủy canh, và các ô đất được cho

ăn nước thải từ cá rô phi cơ sở sản xuất Hạt cỏ ba lá và cỏ linh lăng đã bị nhiễm nấm ngay sau khi nảy mầm, và rễ của chúng đã bị phá hủy hoàn toàn ở ngày 14 Yến mạch, lúa mạch đen và lúa mạch có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất và cho thấy khả năng chịu

bệnh nấm cao hơn so với cỏ linh lăng và cỏ ba lá Mặc dầumột lượng đáng kể các chất hòa tan và không hòa tan được giải phóng bởi hạt trong thời kỳ nảy mầm, cây có thểloại

bỏ tất cả các chất ô nhiễm trong nước thải và các phần quan trọng của các chất được giải phóng Tổng mức giảm trong tổng chất rắn, COD, NO3- - N, NO2- - N, P và K dao động

từ 54,7-91,0%; 56-91,5%; 82,9-98,1%; 95,9-99,5%; 54,5-93,6% và 99,6-99,8%, tương ứng Yến mạch, lúa mạch và lúa mạch đen phát triển tốt trong loại hệ thống thủy canh này và có thể được sử dụng làm thức ăn cho cá sau khi đượcbổ sung chất béo, Ca, Na,

Mn và Fe Dầu và clorua của các nguyên tố này có thể được thêm vào các nhà máy này khi xây dựng cho cá ăn Đối với hoạt động liên tục, một hệ thống hai đơn vị có thể được cấu hình để cho phép nảy mầm một tuần và làm sạch một tuần vàkhởi động trong một đơn vị trong khi đơn vị khác đang hoạt động

Tim L.G và cộng sự (2014) [4], đã làm giàu Anammox trong dòng nước của nhà máy xử lý nước thải (WWTP) tiết kiệm năng lượng cho sục khí và cho phép thu hồi khí sinh học từ vật liệu hữu cơ Những thách thức chính khi áp dụng quy trình Anammox trong dòng nước có liên quan đến nhiệt độ thấp < 20 C, làm giảm đáng kể độ đặc hiệu hoạt động Anammox Mục đích của nghiên cứu này là làm phong phú thêm một loài Anammox thích nghi lạnh, với mức cao hoạt động cụ thể Điều này đã đạt được trong một lò phản ứng 4,2 L hoạt động ở 10 C, được nuôi dưỡng với 61 mgN/L (NH4+, NO2-)

và được cấy với bùn hoạt tính từ hai WWTP thành phố được chọn Candidatus brocadia

fulgida là loài chiếm ưu thế trong sinh khối được làm giàu, với một hoạt động cụ thể là

30 –44 mg N/(gVSd) Điều này cao gấp hai lần so với báo cáo trước đây ở 10 C, có lợi cho ứng dụng toàn diện Năng suất khối lượng sinh học là 0,046 g sinh khối/g N được chuyển đổi, tương tự như ở nhiệt độ cao hơn

Apipong và cộng sự (2008) [35] đã sử dụng quá trình bùn hoạt tính với quá trình nitrat hóa bán phần (AS/PN) kết hợp với quá trình oxy hóa amoni kỵ khí (Anammox) xử

lý nước thải chế biến thủy sản Điều kiện hoạt động của quá trình AS/PN để ghép nối với quá trình Anammox được xác định là pH trong khoảng 7,7 - 8,2 và DO là 0,5 - 0,9 mg/L

để đạt được loại bỏ hơn 85% COD cũng như quá trình nitrat hóa một phần Quá trình AS/PN được phát triển có thể tạo ra nồng độ gần như bằng nhau nitơ amoni và nitrit trong nước thải rất phù hợp cho quá trình Anammox Loại bỏ gần hoàn toàn ammonium

và nitrite đã đạt được trong quá trình vận hành Anammox ở trạng thái ổn định Tốc độ loại bỏ nitơ tối đa cho quá trình Anammox được tìm thấy là 0,6 kgN/m3.ngày Các vi sinh vật tham gia vào cả quá trình AS/PN và Anammox được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật phản ứng lai tại chỗ và chuỗi polymerase Kết quả 16S rDNA tiết lộ 94% tương

đồng với Candidatus “Brocadia Fulgida”

Jetten và cộng sự (2012) [1] đã so sánh định tính một số công nghệ xử lý dinh dưỡng và quá trình Anammox như sau:

Bảng 1.2 So sánh định tính một vài công nghệ Anammox và các công nghệ truyền thống

Quá trình Nitrat hóa/khử Nitrat truyền thống

Nguyên liệu Nước thải Hỗn hợp

Amôni – Nitrit Nước thải Nước thải Sản phẩm NH4+, NO2- N2, NO3- N2, NO3- N2, N2O, NO3-

Điều kiện hoạt

động Có oxy Thiếu khí Hạn chế oxy Có oxy, Thiếu khí

Các loài dị dưỡng và khử Nitrat

1.3.2 Lịch sử phát hiện và bản chất quá trình Anammox

Sự phát hiện phản ứng Anammox đã mở ra các hướng phát triển kỹ thuật xử lý nitơ mới, đặc biệt là đối với nước thải có hàm lượng nitơ cao Những năm trở lại đây, đã bùng nổ các nghiên cứu có liên quan đến Anammox và ứng dụng của nó Trên bình diện

lý thuyết, chu trình nitơ tự nhiên trong sách giáo khoa đã được bổ sung mắt xích mới, còn trên bình diện công nghệ, đã có nhà máy xử lý nitơ phi truyền thống được xây dựng và vận hành

Thật ra phản ứng Anammox đã được dự báo trước khi được phát hiện (Broda, 1997) Trên cơ sở tính toán nhiệt động học Broda đã dự báo sự tồn tại của các vi khuẩn tự dưỡng hóa năng có khả năng oxy hóa Ammonia bởi nitrate và về mặt năng lượng không khó xảy ra hơn oxy phân tử:

Trong một vài năm tiếp theo nhóm Đại học kỹ thuật Delft (TU – Delft) đã lần lượt công bố và mô tả ban đầu về Anammox theo đó Anammox được xác nhận là có bản chất của quá trình sinh học, Ammonia được oxy hóa ở điều kiện kỵ khí với nitrite là phần tử nhận điện tử tạo thành nitơ phân tử theo phản ứng sau:

NH4+ + NO2- N2 + 2 H2O

Tiếp theo đó phản ứng Anammox cũng đã lần lượt được phát hiện và nhận dạng tại các hệ thống xử lý nước thải bởi các nhà khoa học Đức (Schmid và Nnk, 2000), Nhật Bản (Furukawa và Nnk, 2000), Thụy Sĩ (Egli và Nnk, 2001), Bỉ (Pynaert và Nnk, 2002),

và Anh (Schmid và Nnk, 2003)

Từ sự phát hiện trên (trong các hệ thống xử lý nước thải) các nhà khoa học đi đến việc tìm kiếm vi khuẩn Anammox tại các hệ sinh thái tự nhiên Thực vậy, đã chứng minh được rằng phản ứng Anammox giữ 50% vai trò tạo khí nitơ trong trầm tích biển Baltic (Thamdrup và Dalsgaard, 2002), trong vùng nước thiếu khí dưới đáy Đại Dương ở Costa Rica (Dalsgaard và Nnk, 2003) Các vi khuẩn Anammox thuộc một chi mới cũng phát hiện được trong vùng nước gần đáy Biển Đen (Kuypers và Nnk, 2003)

Trên cơ sở các phát hiện mới về phản ứng Anammox và các vi khuẩn tham gia mà chu trình chuyển hóa nitơ tự nhiên ghi nhận trong các sách khoa trước đây nay đã được

bổ sung một mắt xích mới

Hình 1.1Chu trình nitơ mới bổ sung thêm mắt xích Anammox

1.3.3 Hóa sinh học của quá trình Anammox

Cố định N Khử nitrate

Nitrite hóa

Trong đó có một lượng nhỏ nitrate tạo thành từ nitrite được giả thiết là để tham gia đồng hóa CO2 Phương trình này đã được chấp nhận rộng rãi như là đại diện cho khi tính toán và giải thích về phản ứng Anammox

* Cơ chế hóa sinh

Dựa vào kết quả khảo sát bằng việc sử dụng phương pháp đồng vị 15N đã đề xuất một cơ chế hóa sinh của quá trình Anammox:

Hình 1.2 Cơ chế sinh hóa của quá trình Anammox -NR: Enzyme khử nitrite (sản phẩm giả thiết là NH2OH)

-HH: Hydrazine hydrolase (xúc tác tạo hydrazyne từ ammonium và hydroxylamine)

-HZO: Enzyme oxy hóa hydrazine

Theo đó, quá trình đi qua sản phẩm trung gian là hydrazine (N2H4) với sự tham gia của enzym HZO tương tự như enzym HAO tham gia oxi hóa hiếu khí ammonium, HZO xúc tác phản ứng oxy hóa hydrazine thành ni tơ phân tử (G0 = - 288 kJ/mol) Các điện tử

từ quá trình oxy hóa này (4e-) giúp khử nitrite thành hydroxylamine với sự xúc tác của một enzym tạm gọi là NR (G0 = - 22,5 kJ/mol) Hydroxylamine tạo ra sẽ phản ứng kết hợp với ammonium để tạo ra hydrazine mới xúc tác bởi enzym HH, (G0 = - 46 kJ/mol) Chu trình xúc tác cứ vậy lặp lại nhiều lần

Một điểm thú vị liên quan đến enzym HZO của vi khuẩn Anammox là có cấu trúc tương tự HAO ở vi khuẩn Nitrosomonas, tức là chứa các cytochrome C (cyt C) với nhân

haem C hấp thu ánh sáng mạnh ở bước sóng 1468 nm (tương tự P460 của HAO) Vì ion trung tâm của các haem này là ion sắt (FeII và FeIII), nên vi khuẩn Anammox có màu đỏ đặc trưng khi quần tụ ở mật độ lớn Xuất hiện màu đỏ trong bùn hoạt tính là một chỉ thị tốt về sự hiện diện của vi khuẩn Anammox

Các nghiên cứu ban đầu về nhóm vi khuẩn Anammox cho thấy phản ứng kết hợp ammonium với hydroxylamine và oxy hóa hydrazine xảy ra bên trong một “thể” gọi là Anammoxosome Anammoxosome nằm trong tế bào chất, bao bọc bởi màng lipid ladderane, và có thể tách nguyên vẹn từ tế bào Anammox Tính chất và chức năng của Anammoxosome vẫn đang được tiếp tục nghiên cứ và được coi là một trong những vấn

đề thú vị của sinh học tế bào (Hình 1.3 là sơ đồ khoang ở tế bào Anammox, trong đó thấy rõ vị trí của Anammoxosome)

Hình 1.3 Sơ đồ phân khoang tế bào Anammox Hoạt động xúc tác cho phản ứng của quá trình Anammox bởi vi khuẩn đã được dự đoán vào năm 1977, trên cơ sở tính toán nhiệt động học Những nghiên cứu sâu hơn đã cho thấy quá trình Anammox được thực hiện bởi các vi khuẩn hóa tự dưỡng, gần đây cho

thấy thuộc về bộ Plantomycetales và được đặt tên là Candidatus Brocadia

Anammoxidans, Candidatus Brocadia Anammoxidans phát triển chậm và thời gian

chuyển tiếp gấp đôi khoảng 11 ngày ở pH bằng 8 và nhiệt độ 40 C

Nhưng để hiểu biết sâu về vi khuẩn Anammox và chủng Candidatus Brocadia

Anammoxidans nói riêng Vì nhóm vi khuẩn Anammox rất khó phân lập Ở đây, các nhà

Thành tế bào

Màng trong tế bào chất

Màng tế bào

khoa học đã nghiên cứu việc làm giàu nhóm vi khuẩn Anammox với môi trường nhân tạo cho phản ứng Anammox trong thiết bị RBC (Hà Lan) hoặc trên chất mang (Nhật), với thời gian rất dài, đây là vấn đề cần phải nghiên cứu khắc phục

1.3.4 Đặc điểm vi sinh học

* Định danh và phân loại nhóm vi khuẩn Anammox

Hiện nay, đã có 5 chi và 13 loài vi khuẩn Anammox được phát hiện từ các nguồn khác nhau Danh sách các loài vi khuẩn Anammox đã phát hiện được đưa ra tại bảng 1.3

Bảng 1.3 Danh sách các vi khuẩn Anammox được phát hiện

Brocadia fulgida Brocadia sinica

2 Kuenenia Kuenenia stuttgartiensis

Scalindua brodae Scalindua wagneri Scalindua sorokinii Scalindua arabica Scalindua sinooilfield Scalindua zhenghei

4 Jettenia Candidatus jettenia asiatica

globus

Anammoxoglobus propionicus Anammoxoglobus sulfate

Về mặt phân loại, các vi khuẩn Anammox là những thành viên mới tạo thành phân

nhánh sâu của ngành Planctomycetes, bộ Planctomycetales Cây phát sinh loài của bộ

Planctomycetales được đưa ra ở hình 1.4

Hình 1.4 Cây phát sinh loài của bộ Planctomycetales

Ở trường hợp phát hiện đầu tiên, bùn kỵ khí được nuôi cấy làm giàu bằng phương pháp mẻ liên tục (SBR), vi khuẩn được tách bằng phương pháp gradient tỷ trọng, chiết xuất AND, khuếch đại 16S rDNA rồi tiến hành phân tích trình tự Kết quả cho thấy vi

khuẩn thuộc vào phân nhánh Planctomycete sâu và vi khuẩn đã được đặt tên là

Candidatus brocadia anammoxidans

Trên cơ sở phân tích 16S rDNA, năm 2000 vi khuẩn Anammox được phát hiện ở các hệ thống xử lý RBC ở Stuttgart (Đức) được xác định là loài mới và được đặt tên là

Candidatus Kuenenia Stuttgartiensis Sau đó vi khuẩn Anammox được phát hiện ở Thụy

Sỹ, Bỉ cũng được phát hiện chính là Canditatus kuenenia stuttgartiensis

Ở phòng thí nghiệm thuộc đại học Kumamoto (Nhật Bản), trong quá trình làm giàu trên vật liệu bám là một dạng sợi polyester được thiết kế đặc biệt (non-woven), phản ứng Anammox và vi khuẩn Anammox màu đỏ đặc trưng đã được phát hiện Kết quả phân tích 16S rDNA sau đó đã phát hiện các vi khuẩn chỉ có độ tương tự là 92,2% với Ca

Brocadia với Anammoxidan và tương tự rất thấp với các nhóm khác đã biết trước đó

Trên cơ sở mới một chủng vi khuẩn Anammox mới, ký hiệu là KUS-1 đã được xác lập

* Một số đặc điểm sinh lý của vi khuẩn Anammox

Anammox được biết đến là có hoạt động trong vùng nước có nhiệt độ 20 – 40 C (tối ưu 40 C), pH 6,4 - 8,3 (tối ưu 8,0) Ở điều kiện tối ưu, tốc độ tiêu thụ cơ chất riêng cực đại là 55 µmol NH4-N/g protein/phút Ái lực với cơ chất Ammonia và nitrite rất cao

Ở nồng độ 100 mM, Ammoniac và nitrate không ức chế Anammox, nhưng quá trình lại

bị ức chế bởi nitrite ở nồng độ mM Khi tiếp xúc với nồng độ nitrite trên 5 mM trong thời gian dài (12 giờ), hoạt tính Anammox được phục hồi khi thêm lượng vết (50 µM) một trong các sản phẩm trung gian của phản ứng Anammox là hydrazin và hydroxylamin Hoạt tính Anammox bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ oxi trên 0,5% bão hòa không khí Bảng 1.4 Bảng một số đặc trưng sinh lý của vi khuẩn và phản ứng Anammox

qmax hiếu khí nmol/min/mg protein 0 200-600

qmax kỵ khí nmol/min/mg protein 60 2

Chú thích:

G0: năng lượng tự do DT: thời gian nhân đôi

Y: hiệu suất tạo sinh khối Ks: hệ số ái lực

qmax: hoạt tính cực đại K.A: không áp dụng

max: tốc độ sinh trưởng cực đại

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình Anammox

* Nhiệt độ:

Như các vi khuẩn dị dưỡng khác, hoạt động xử lý ammonia của vi khuẩn Anammox cũng bị ảnh hưởng của nhiệt độ Cho đến nay, chưa có một nghiên cứu nào đầy đủ về ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của sinh khối vi khuẩn Anammox Strous

và cộng sự [28] cho rằng sinh khối vi khuẩn Anammox hoạt động xử lý nước thải ở 403C, và có thể không hoạt động ở 10 C, chúng hoạt động xử lý hiệu quả ở nhiệt độ khoảng 20 – 37 C Tiếp đó, kết quả khảo sát của Egli và cộng sự [30] cho thấy ở 37 C thì sự tăng trưởng và hoạt động xử lý ammonia của vi khuẩn Anammox đạt hiệu quả cao nhất

* pH:

Strous [28] khi khảo sát ảnh hưởng của pH (từ 7,5 – 8,0) lên quá trình làm giàu sinh khối vi khuẩn Anammox ở nhiệt độ 30 C và sự thay đổi giá trị pH (từ 6,7 – 8,3) lên hoạt tính sinh khối vi khuẩn Anammox nhiệt độ 33 C, cho thấy môi trường pH đã xử lý ammonia không hẳn phụ thuộc vào pH mà ngược lại pH của môi trường phụ thuộc vào các ion hòa tan trong môi trường Theo nghiên cứu của Strous và cộng sự thì hoạt tính của vi khuẩn Anammox chỉ phụ thuộc vào pH môi trường đầu vào mà không ảnh hưởng nhiều trong thời gian diễn ra phản ứng của quá trình xử lý ammonia, do đó pH đầu ra cũng không thay đổi nhiều so với pH đầu vào

* DO

Van de Graaf và cộng sự [31] cho thấy hoạt động hiệu quả của vi khuẩn Anammox trên mô hình thiết bị dạng mẻ khi DO dao động trong khoảng 0 – 0,01 mg/l Trái lại, Strous và cộng sự [28] lại cho rằng vi khuẩn Anammox hoạt động xử lý ammonia có thể thực hiện được trong môi trường không kỵ khí hoàn toàn, vì khi ghép hai quá trình trong một thiết bị như nitrite hóa – Anammox hay SNAP thì DO trong thiết bị

phản ứng loại ammonia sẽ lớn hơn 1 mg O2/L Jenten và cộng sự [33] nghiên cứu sự thay đổi DO của môi trường với các điều kiện 0 mg O2/L; 0,5  0,2 mg O2/L thì hoạt động xử

lý ammonia của vi khuẩn Anammox không còn hiệu quả

*COD

Trên lý thuyết thì vi khuẩn Anammox thuộc nhóm vi khuẩn tự dưỡng, nên chúng không dùng nguồn cacbon hữu cơ để phát triển Nhưng trong thực tế thì các nguồn nước thải luôn luôn tồn tại hàm lượng ô nhiễm là cacbon hữu cơ được thể hiện theo chỉ số ô nhiễm COD Do đó, khi nghiên cứu môi trường tổng hợp thì có điều chỉnh đươc nguồn cacbon hữu cơ để tiến hành thí nghiệm Ngoài ra, Chamchoi và cộng sự [5] khi khảo sát

tỷ lệ COD/N thay đổi từ 0,6-1,3 cho thấy hiệu quả loại ammonia đạt tương ứng từ 84% - 60% và cũng loại được 82% COD

*Tỷ lệ N-NH 4 /N-NO 2

Theo phương trình phản ứng (1) ở trên thì tỷ lệ N-NH4/N-NO2 phải là 1/1.32 nhưng theo các nghiên cứu của Van Hulle và cộng sự [17] thì tỷ lệ này có thể thay đổi từ 0,5-1,5 Theo Van Hulle, khi trong môi trường chỉ có N-NH4 với nồng độ 1.000 mg/l hoặc N-NO3 thì quá trình Anammox không thể diễn ra Hơn nữa, Strous [28] báo cáo quá trình Anammox không thể hoạt động khi nồng độ N-NO2 lớn hơn 182 mg/L

1.4 Tình hình nghiên cứu Anammox trên thế giới

N Chamchoi, S Nitisoravut (2006) [5] nghiên cứu làm giàu Anammox từ các loại bùn truyền thống: bùn bể UASB, bùn hoạt tính, bùn phân hủy kỵ khí Sau bốn tháng hoạt động, các hoạt động Anammox xảy ra trong tất cả bể cho phép loại bỏ Ammonia và nitrite liên tục Các hình thái của bùn Anammox nuôi cấy đã được quan sát bằng kính hiển vi điện tử Các bức ảnh cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn Anammox

Zang và Zhou (2006) [6] sử dụng mô hình kỵ khí dòng chảy ngược (UASB) sử dụng vi khuẩn Anammox với nguồn nguyên liệu đầu vào là hỗn hợp nước rỉ rác (gồm nước rỉ thô và nước rỉ rác sau xử lý SBR Hiệu quả xử lý ammonia đạt 87,51% trong 222 ngày

Liang và Liu (2008) [7] đã kết hợp quá trình nitrate hóa bán phần và Anammox để

xử lý nước rỉ rác cũ Nước rỉ rác sau quá trình nitrate hóa bán phần sẽ vào bể Anammox dạng màng sinh học giá thể cố định ngập nước Hiệu quả loại bỏ ammonia, nitrite và

lượng nitrate sinh ra 1 : 0,75 : 0,26 khi kiểm soát tốt nhiệt độ và tính chất nước thải đầu vào

Tao Wang và cộng sự (2012) [8] so sánh sự khác nhau giữa quá trình khởi động Anammox từ bùn hoạt tính bằng 2 mô hình MBR và SBR Khả năng khử nitơ từ bể MBR (345,2 mgN/l/ngày) cũng cao hơn so với SBR (292,0 mgN/l/ngày) Kết quả phân tích FISH cho thấy vi khuẩn Anammox chiếm ưu thế trong cả 2 bể Bể MBR nhìn chung có hiệu quả tốt hơn so với bể SBR MBR tiết kiệm 41, 6% thời gian khởi động so với SBR,

và thu được NRR tối đa (NH4+

, NO2-) (345,2 mgN/L.ngày), cao hơn đáng kể so với SBR (292,0 mgN/L.ngày) Phân tích chỉ ra rằng vi khuẩn Anammox chiếm ưu thế ở cả hai bể phản ứng Phân tích Phylogenetic cho thấy rằng MBR có đa dạng sinh học tốt hơn, được

ổn định hơn về mặt sinh thái Vì vậy, MBR là một bể phản ứng hứa hẹn hơn cho khởi động Anammox

Mike S M Jetten và các cộng sự (2013) [9] làm giàu vi khuẩn Anammox từ đất ngập nước Nghiên cứu này mô tả sự làm giàu vi khuẩn Anammox trong một cột mô phỏng oxy giới hạn đất trồng lúa ngập nước Trên 50 cm đất trồng lúa, chứa một lượng lớn amoni [1,6 – 10,4 mmol N kg (trọng lượng khô)], được chọn là môi trường nuôi cấy

để làm giàu Anammox Sau 18 thángủ bằng nước ngọt từ đất lúa hệ sinh thái, môi trường làm giàu tiêu thụ khoảng 4 mmol amoni l-1 ngày-1 và 5 mmol nitrit l-1 ngày-1 Hoạt tính Anammox của môi trường nuôi cấy là 35,7 mmol N g (trọng lượng khô)-1 h-1 Kết quả 16S rRNA và hzsA cho thấy rằng có hai loài Anammox chiếm ưu thế được làm giàu từ

đất trồng lúa Kết quả 16S rRNA cho thấy sự tương đồng 97,5 – 99,2% với Candidatus

Anammoxoglobus propionicus và 92,1-93,1% gen Candidatus Jettenia asiatica Kết quả

PCR định lượnggene hzsA cho thấy có tới 1010

bản sao g (trọng lượng khô)-1 vi khuẩn Anammox có mặt trong môi trường làm giàu

C.Trigo và cộng sự (2006) [10] đã khởi động quá trình Anammox trong bể MSBR, trong đó có mô-đun màng sợi rỗng được sử dụng để giữ lại sinh khối Bể phản ứng phản ứng có sinh khối Anammox và sử dụng môi trường nuôi như của Van de Graaf Trong giai đoạn vận hành đầu tiên, lượng muối đã được quan sát và can thiệp vào hoạt động của

vi sinh vật và gây ra giảm tỷ lệ loại bỏ nitơ của bể từ 100 - 10 mg/L mỗi ngày Lượng muối đã được xử lý bằng cách giảm đáng kể nồng độ Ca và P của môi trường Van de

Graaf trong giai đoạn vận hành cuối cùng Hành động này tăng nhanh chóng hoạt động của hệ thống, và tỷ lệ loại bỏ nitơ đạt tới 710 mg/L mỗi ngày với sự loại bỏ nitrit gần nhưhoàn toàn Bùn nổi được quan sát thấy trong MSBR Việc sử dụng màng tránh rửa trôi sinh khối từ hệ thống Hơn nữa, một thực tế đáng ngạc nhiên là sinh khối Anammox

đã không phát triển trong flocs của bể MSBR, nhưng mà phát triển trong bùn hạt Điều nàythực tế cho thấy rằng loại vi sinh vật này có xu hướng phát triển trong tập hợp Kết quả chỉ ra rằng việc sử dụng MSBR có thể là một hệ thống thích hợp để loại bỏ nitơ bằng cách sử dụng phản ứng Anammox

Yu Tao và các cộng sự (2012) [11] đã so sánh quá trình khởi động làm giàu Anammox bằng bể MBR và SBR Nghiên cứu này đã nghiên cứu sự khởi đầu của quá trình Anammox bằngbể SBR trong phòng thí nghiệm trong 218 ngày và sau đó chuyển thành bể màng MBR trong 178 ngày Việc điều chỉnh SBR thành MBR khi lắp đặt mô-đun màng bên ngoài dẫn đến tăng tốc hoạt động Anammox cụ thể lên 19 lần Sự tăng tốc của hoạt động Anammox cụ thể với MBR được xác nhận thêm bằng cách khởi động một MBR khác trong khoảng thời gian 242 ngày Phân tích vi sinh vật phân tử cho thấy

Candidatus ‘‘Brocadia anammoxidans’’ và Candidatus ‘‘Kuenenia stuttgartiensis’’ là

những loài ưu thế trong nội tiết và sinh khối được phát triển trong bể Khởi đầu với MBR

có vẻ hiệu quả hơn SBR để làm giàu vi khuẩn Anammox do tính chất giữ bùn cao của cấu hình MBR

Huichen và cộng sự (2016) [12] đã khởi động thành công quá trình oxy hóa Anammox trong phản ứng màng bùn chảy được thực hiện bằng cách hạt giống khử nitơ (R0) hoặc bùn hạt anitox hỗn hợp khử nitơ với tỷ lệ khối lượng 3:1 (R1) Kết quả cho thấy R1 đã được khởi động thành công vào ngày thứ 40 và có tỷ lệ loại bỏ nitơ (NRR) là 0,55 kg N m-3 d-1 Ngược lại, phải mất 98 ngày để khởi động R0 (0,54 kg N m-3 d-1) R0

và R1 đạt được NRR tối đa là 5,70 và 12,02 kg N m-3

d-1, tương ứng

PCR định lượng (qPCR) và kỹ thuật trình tự thông lượng cao được sử dụng để theo dõi sự tiến hóa của cộng đồng vi khuẩn Những kết quả này đã chứng minh tính khả thi của việc trộn lẫn hạt bùn Anammox khử nitơ để khởi động một bể phản ứng Anammox

Ryu Suto và cộng sự (2016) [13] đã nghiên cứu Anammox tập trung vào màng sinh học trong 10 nhà máy xử lý nước thải nước thải lợn Trong ba nhà máy, đã tìm thấy màng sinh học màu đỏ trong bể sục khí hoặc bể lắng cuối cùng Biofilm có số lượng gen ansoxox 16S rRNA cao hơn (lên tới 1,35 x 1012/gVSS) và hoạt tính Anammox cao hơn (lên tới 295 mmoL/g) so với chất rắn lơ lửng trong cùng một bể Phân tích phản ứng

Pyrosequencing cho thấy Planctomycetes chiếm tới 17,7% tổng số lần đọc trong màng sinh học Hầu hết trong số họ có liên quan đến Candidatus Brocadia hoặc Ca Jettenia

Các số lượng bản sao cao nhất và tỷ lệ Planctomycetes cao nhất có thể so sánh với số lượng bùn Anammox được làm giàu Do đó, sử dụng phương pháp xử lý bùn hoạt tính nước thải lợn, có thể phát hiện Anammox màu đỏ bằng cách tập trung vào màng sinh học

Helio López và cộng sự (2008) [14] dựa trên sự gia tăng dần dần của tỉ lệ nitrit : amonium (từ 0,76 đến 1,32 mol NO2- -N mol-1 NH4+ -N) và sự gia tăng theo hàm mũ của tốc độ tải nitơ (NLR từ 0,01 đến 1,60 kg N m-3 d-1) 60 ngày sau khi khởi động, các sinh vật Anammox được xác định bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) như

Candidatus Brocadia Anammoxidans Sau một năm hoạt động, NLR đã đạt giá trị là 1,60

kg N m-3 d-1 với hiệu suất loại bỏ nitơ là 99,7%

Hoạt tính sinh khối nammox được xác định bằng số lượng khối lượng nitơ với 1,32 ± 0,05 mol nitrit được loại bỏ trên mỗi mol ammonium bị loại bỏ và 0,23 ± 0,05 mol nitrate được tạo ra cho mỗi mol amonium được loại bỏ

Ngoài ra, làm giàu của một vi khuẩn Anammox đã được định lượng bởi FISH là 85,0 ± 1,8%

Chong-jian Tang và cộng sự (2009) [15] khởi động và phân tích ức chế của một bể phản ứng sinh học Anammox có bùn hạt kỵ khí Kết quả cho thấy giai đoạn khởi động

có thể được chia thành giai đoạn tách bùn, pha trễ, pha nhân giống, pha tĩnh và pha ức chế Tối ưu hóa kiểm soát có thể được thực hiện tương ứng để tăng tốc độ khởi động của Anammox pH nước thải tăng lên 8,7 – 9,1 khi tỷ lệ loại bỏ nitơ cao hơn 1,200 mg/L/ngày Nồng độ amoniac tự do cao hơn 64 – 73 mg/L Tác dụng ức chế pH cao và amoniac tự do trên vi khuẩn Anammox góp phần vào sự bất ổn của phản ứng Anammox trong 125 ngày đầu với KHCO3 có ảnh hưởng 0,5 g/L Tăng sức chịu đựng trong đầu vào

bằng cách dùng 1,25 g KHCO3/L giảm pH và hiệu suất loại bỏ nitơ của phản ứng đã được phát triển hơn nữa

Shou-Qing Ni và cộng sự (2009) [16] làm giàu Anammox bằng cách kết nối một mô-đun màng không dệt với một bể phản ứng kỵ khí được phát triển trong nghiên cứu này Bể phản ứng màng không dệt Anammox (ANMR) cho thấy khả năng duy trì sinh khối cao thông qua sự hình thành chất liệu trong bể phản ứng và màng sinh học trên bề mặt bên trong của màng không dệt Không có vấn đề ô nhiễm xảy ra trên màng sau khi sự phát triển của màng sinh học trưởng thành Sau 8 tháng hoạt động, tỷ lệ tải nitơ (NLR) và

tỷ lệ loại bỏ nitơ (NRR) đạt 1.263 mgN/L.ngày và 1,047 mg N/L.ngày, với mức tiêu thụ ammonium tối đa (SAC) tối đa là 51 nmol/mg protein/phút Ở trạng thái ổn định, hiệu suất loại bỏ amoni và nitrit trung bình lần lượt là 90,9% và 95,0% Quan sát hình thái của

tổ hợp Anammox và màng sinh học cho thấy mức độ nhỏ gọn cao Ngoài ra, làm giàu vi khuẩn Anammox được định lượng bằng phân tích phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thời gian thực là 97,7%

Ana Dapena-Mora và cộng sự (2004) [17] đã làm giàu sinh khối Anammox từ bùn thu được tại một nhà máy xử lý nước thải đô thị, sử dụng bể SBR Sau 60 ngày hoạt động Anammox bắt đầu được phát hiện, bằng cách tiêu thụ lượng cân bằng NO2- và NH4+ trong

hệ thống Phân tích FISH xác nhận sự gia tăng nồng độ vi khuẩn Anammox theo thời gian Nồng độ cuối cùng của sinh khối giàu 3 - 3,5 gVSS dm3 thu được, cho thấy hoạt động Anammox cụ thể là 0,18 gNH 4 + -N gVSS-1

d-1 Bể phản ứng có thể xử lý tỷ lệ tải nitơ lên tới 1,4 kgN m-3 d-1, đạt hiệu quả loại bỏ 82% Mặt khác, sự khởi động và hoạt động của bể phản ứng Anammox SBR được mô phỏng theo mô hình bùn hoạt tính, được

mở rộng cho Anammox Ông mô phỏng dự đoán khá tốt các dữ liệu thực nghiệm liên quan đến nồng độ của các hợp chất nitơ và có thể được sử dụng để ước tính sự tiến hóa của Anammox và sinh khối dị dưỡng trong bể phản ứng Những mô phỏng này cho thấy rằng các chất dị dưỡng vẫn còn tồn tại trong hệ thống sau khi khởi động bể phản ứng và

có thể bảo vệ các vi sinh vật Anammox khỏi tác động tiêu cực của oxy

Egli và cộng sự (2001) [18] đã làm giàu vi khuẩn Anammox từ một vòng quay tiếp xúc đĩa (gần Kölliken, Thụy Sĩ) được sử dụng để xử lý nước rỉ rác giàu ammoni với hàm lượng carbon hữu cơ thấp Sự làm giàu này đã làm làm giàu được 88% vi khuẩn

Anammox Vi sinh vật thực hiện phản ứng Anammox đã được xác định bằng cách phân tích trình tự 16S rDNA và FISH với đầu dò 16S-rRNA Tỷ lệ nhận dạng chuỗi giữa trình

tự 16S rDNA của sinh vật Kammen Anammox và chủng vi khuẩn Candidatus brocadia

bnammoxidans là 90,9%, nhưng từ 98,5 - 98,9% với Candidatus kuenenia stuttgartiensis,

một sinh vậtxác định trong màng sinh học bằng phương pháp phân tử Cộng đồng vi sinh

vật Kölliken xúc tác quá trình oxy hóa kỵ khí của amoni với nitrit theo cách gần giống với

Candidatus B Anammoxidans, nhưng được dung nạp phosphate (lên đến 20 mM) và

nitrit (lên đến 13 mM) và hoạt động ở mật độ tế bào thấp hơn Anammox hoạt động chỉ được quan sát giữa pH 6,5 - 9 với tối ưu ở pH 8 và nhiệt độ tối ưu ở 37 °C

Hydroxylamine và hydrazin, là trung gian của phản ứng Anammox của Candidatus B

Anammoxidans, đã được sử dụng bởi các sinh vật Kölliken, và khoảng 15% nitrit được sử

dụng trong quá trình sinh trưởng tự dưỡng được chuyển thành nitrate Kính hiển vi điện

tử cho thấy một vùng giàu protein ở trung tâm của các tế bào được bao quanh bởi một khu vực hình bánh rán chứa ribosome và DNA Vùng hình bánh donut này đã được quan

sát FISH có cường độ huỳnh quang cao hơn Tương tự như Candidatus B

Anammoxidans, Kölliken sinh vật Anammox thường được hình thành đồng nhất các cụm

chứa tối đa vài trăm ô trong một ma trận ngoại bào

Kenji Furukawa và cộng sự (2002) [19] đã làm giàu Anammox trong các phòng thí nghiệm Sinh khối, với một màu đỏ chủ yếu, chứng minh việc loại bỏ đồng thời amoni

và nitrit trong điều kiện tự dưỡng và thiếu oxy, là đặc trưng của vi khuẩn Planctomyeetes

ammonium kỵ khí, được làm giàu và duy trì trên giá thể Polyester nonwoven Để nhận biết thành phần vi khuẩn của màng vi sinh vật trưởng thành, trình tự 16S rDNA được khuếch đại bằng PCR và các phân tích so sánh sử dụng cơ sở dữ liệu DNA đã được tiến hành Với PCR nhóm sử dụng hai cặp mồi 16S-1 (5'-t°~AGTGGCGAAAGGGTGAGT

AAI2°-3') và 16S-2 (5'-329TGTCTCAGTCCCAGTGTGGC31%3') Kết quả chỉ có một chuỗi có sự tương đồng đáng chú ý (92,2%) cho rằng planctomycete ammonium kỵ khí

đầu tiên được phát hiện và ít hơn, nhưng đáng kể, tương đồng với trình tự 16S rDNA của các chủng amoniac kỵ khí mới được báo cáo gần đây Các chủng mới được phát hiện (được chỉ định KSU-I) báo cáo ở đây là chiếm ưu thế trong số các thành viên có thể phát hiện được của vi sinh vật biofilm Bằng hình ảnh huỳnh quang, KSU-1 là được hiển thị

để tạo thành các cụm hình cầu được bọc trong một lớp mỏng của Zoogloeasp Các tương tác có thể có vàsự phụ thuộc lẫn nhau của hai loài này được thảo luận liên quan đến tính

không thể giải thích được của các Planctomyeetes ammonium kỵ khí

Mike S.M Jetten và cộng sự (2010) [20] đã nghiên cứu tám phản ứng cho việc nghiên cứu quá trình Anammox Sự đa dạng và phong phúvi khuẩn Anammox được xác định bằng phân tích gen 16S rRNA, FISH với đầu dò cụ thể và PCR định lượng theo thời gian thực (qPCR) Trong các phản ứng này, phát hiện ít nhất tám gen Anammox 16S

rRNA độc đáo gần đầy đủ đã được phát hiện,được phân bố trên hai chi; Candidatus

brocadia và kuenenia Kết quả FISH đã xác nhận rằng chỉ có một loại vi khuẩn

Anammox thống trị cộng đồng trong mỗi phản ứng trong tám phản ứng điều tra trong nghiên cứu này Phân tích qPCR cho thấy vi khuẩn Anammox có mặt trong bảy phản ứng theo thứ tự 109 tế bào/ml và 107 tế bào/ml trong bể phản ứng Ưu thế và kiểu dị hình Anammox giống Brocadia trong một bể phản ứng đại diện cho một loài mới mà nhóm đề

xuất tên Candidatus brocadia Sinica Những kết quả này chỉ ra rằng một nguồn giống

duy nhất có thể được sử dụng để hạt giống các phản ứng Anammox được thiết kế để xử

lý các loại nước thải khác nhau, điều này có thể dẫn đến việc khởi động phản ứng sinh học nhanh hơn

1.5 Tình hình nghiên cứu Anammox trong nước

Ở Việt Nam nghiên cứu bước đầu của Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh đã cho thấy có khả năng làm giàu vi khuẩn Anammox từ bùn của bể UASB của trạm xử lý nước thải chăn nuôi heo (Lê Công Nhất Phượng và Nnk, 2005) Kết quả phân tích 16S rDNA cho thấy trong bùn tích lũy có sự hiện diện của vi khuẩn Anammox tương

tự với dòng LOLL2a (phát hiện và công bố ở Thụy Sĩ) và vi khuẩn Candidatus kuenenia

stuttgartientis đã được xác định ở Châu Âu

Phương và cộng sự (2008) [21] cũng nghiên cứu ứng dụng nhóm vi khuẩn Anammox trong xử lý nước thải chăn nuôi heo Mô hình thí nghiệm có thể tích 10 lít, nồng độ Ammonia đầu vào thay đổi từ 290 – 424 mg/L N, kết quả thấy rằng vi khuẩn Anammox đã ổn định, hiệu suất loại Ammonia trong nước thải dao động từ 80 - 95%

Liệu và cộng sự (2008) [22] nghiên cứu Anammox sử dụng quá trình SNAP Kết quả nghiên cứu thấy rằng nước thải tổng hợp chứa hàm lượng Ammonia với nồng độ 240

mg/l ở tải trọng 0.6 kgN/m3/ngày có hiệu quả xử lý Ammonia trong khoảng 85-90% và hiệu quả loại bỏ nitơ là 75 - 80%

Một nhóm nghiên cứu trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu xử lý nước thải bãi chôn lấp cũ bằng sự kết hợp của nitrate hóa bán phần và Anammox sử dụng mô hình PN-SBR và HAR (Trần Phước Dân, Bùi Xuân Thành và cộng sự, 2014 [23]) Kết quả cho thấy chất lượng nước thải đã được đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng nước thải Việt Nam tại NLR 1,0 kg TAN/m3/ngày cho PN-SBR và 4,0 kg TN/m3.d cho HAR HAR thu được NRR cực cao 7,3 kg TN/m3

/ngày tại NLR 8,3 kg TN/m3/ngày

Trần Văn Vinh và cộng sự (2014) [24]sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định sự có mặt của vi khuẩn Anammox trong sinh khối của hệ thống làm giàu làm giàu Anammox bằng phương pháp tách dòng và giải trình tự gen 16S của vi khuẩn, nhân bản

và giải trình tự gen hzsA (hydrazine oxidoreductase subunit A) một gen đặc trưng của vi khuẩn Anammox Sinh khối kỵ khí gồm hai phần là phần giá thể và phần dịch nuôi cấy Kết quả là đã thành công nhân bản giải trình tự gen 16S và hzsA của vi khuẩn Anammox trong mẫu sinh khối Trình tự thu được cho thấy vi khuẩn Anammox trong mẫu là chi

Candidatus brocadia với độ tin cậy là 99% và là loài Candidatus brocadia fulgida với độ

tin cậy là 95%

1.6 Các phương pháp phân lập nuôi cấy từ môi trường

1.6.1 Các phương pháp phân lập

Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu

và đưa về dạng thuần khiết Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật

Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ 1 tế bào ban đầu

Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại

ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau

Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau

*Phân lập vi sinh vật thuần khiết:

Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau:

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu

- Phân lập vi sinh vật thuần khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc

*Phân lập bằng phương pháp cấy truyền:

Nguyên tắc: sau khi phân lập vài lần, từ khóm thuần cấy truyền sang ống môi trường thạch nghiêng hay ống nghiệm canh để gia tăng số lượng vi sinh vật

1.6.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

Quá trình nuôi cấy vi sinh vật gồm 2 khâu: nuôi và cấy

- Nuôi: là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động

và phát triển của vi sinh vật

- Cấy: là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng

Hai khâu này gắn bó với nhau trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật

Hiện nay có 2 phương pháp cấy phổ biến là cấy trên thạch và trên đĩa petri

+Cấy trên thạch gồm cấy trên thạch nghiêng và cấy trên thạch đứng Cấy trên thạch nghiêng dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí, cấy trên thạch đứng thì dùng để cấy các vi sinh vật kỵ khí

+Cấy trên đĩa petri: Cấy trên đĩa petri có thể sử dụng que cấy đầu tròn hoặc pipet để cấy, cấy trên đĩa petri dùng để cấy các vi sinh vật hiếu khí

* Kết quả của việc nuôi cấy:

Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thấy:

- Trong môi trường lỏng: Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường

- Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng:

+ Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục

+ Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy

- Trong môi trường thạch đứng: Các vi khuẩn kị khí phát triển ở đáy của cột môi trường

Vi khuẩn Anammox được xếp vào ngành Planctomycetes, lớp Planctomyces, bộ

Planctomycetales, họ Planctomycetaceae với 5 chi khác nhau là Brocadia, Kuenenia,

Anammoxoglobus, Jettenia, và Scalindua Hầu hết chúng được tìm thấy trong quá trình

xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học hoặc sống trong môi trường khoáng yếm khí Cho tới nay người ta vẫn chưa phân lập được chúng bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh [25, 26, 27]

Vi khuẩn anammox sinh trưởng rất chậm, chu kỳ nhân đôi tế bào của chúng kéo dài từ 11- 20 ngày có loài còn kéo dài hơn Trong tự nhiên, chúng là vi khuẩn yếm khí bắt buộc và bị ức chế sinh trưởng ở nồng độ oxy 2 µM Vì thế, cho tới nay chưa có bất

kỳ bằng chứng nào về việc nuôi cấy, phân lập được các vi khuẩn annamox trong phòng thí nghiệm [25, 26] Song có rất nhiều nghiên cứu về các đặc điểm sinh vật, hóa học của

vi khuẩn Anammox Hầu hết các nghiên cứu chứng minh cấu trúc tế bào, quá trình sinh trưởng, các cơ chế quan trọng và trình tự bộ gen của chúng [26]

1.6.3 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

*Tách chiết DNA:

Tách chiết DNA là kỹ thuật cơ bản trong hầu hết các phòng thí nghiệm phân tử, di truyền và sinh học nói chung Phân tử DNA sau tách chiết cần đảm bảo được số lượng và chất lượng để đáp ứng được các phân tích sau đó

Nguyên lý tách chiết DNA từ tế bào gồm các bước cơ bản sau:

Bước 1: Phá màng: nghiền tế bào, mô trong dung dịch chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA

Bước 2: Loại bỏ protein: Sau khi phá vỡ tế bào, DNA sẽ được trộn lẫn với các thành phần khác của tế bào chủ yếu là protein trong dung dịch Việc quan trọng lúc này là tách DNA ra khỏi thành phần protein của tế bào Để thực hiện bước này chủ yếu sử dụng hỗn hợp Phenol/Chloroform Phenol-Chloroform không tan trong nước nhưng có khả