Trích ly hoạt chất polysaccharide từ nấm linh chi bằng phương pháp enzyme có hỗ trợ siêu âm và khảo sát hoạt tính sinh học của cao trích

TÊN ĐỀ TÀI: Tên tiếng Việt: Trích ly hoạt chất polysaccharide từ nấm linh chi bằng phương pháp enzyme có hỗ trợ siêu âm và khảo sát hoạt tính sinh học của cao trích.. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN QUỐC HÒA

TRÍCH LY HOẠT CHẤT POLYSACCHARIDE TỪ NẤM LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME CÓ HỖ TRỢ SIÊU ÂM

(Extraction of polysaccharides from Ganoderma lucidum

by ultrasound- assisted enzymatic method and bioactivities examination of the extract)

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC

Mã số: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 01 NĂM 2019

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG - TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Minh Nam… ………

2 TS Huỳnh Ngọc Oanh – Ủy viên phản biện 1

3 PGS TS Phan Thị Phượng Trang – Ủy viên phản biện 2

4 TS Nguyễn Quốc Thắng – Ủy viên

5 TS Huỳnh Khánh Duy – Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Trần Quốc Hòa

Ngày, tháng, năm sinh: 08/02/1993

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

MSHV: 1670665Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh

Mã số: 60520301

I TÊN ĐỀ TÀI:

Tên tiếng Việt: Trích ly hoạt chất polysaccharide từ nấm linh chi bằng phương

pháp enzyme có hỗ trợ siêu âm và khảo sát hoạt tính sinh học của cao trích

Tên tiếng Anh: Extraction of polysaccharides from Ganoderma lucidum by

ultrasound-assisted enzymatic method and bioactivities examination of the extract

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

2.1.Tổng quan

Giới thiệu về nấm linh chi, polysaccharide trong nấm linh chi, hoạt tính sinh học của polysaccharide, phương pháp trích ly enzyme có hỗ trợ siêu âm

2.2.Thực nghiệm

- Khảo sát điều kiện trích ly polysaccharide từ nấm linh chi bằng phương pháp

enzyme có hỗ trợ siêu âm

- Khảo sát đặc tính hóa lý của cao trích

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn của cao trích

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/2018

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2018

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS HOÀNG MINH NAM

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và người thân đã luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tác giả trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn TS Hoàng Minh Nam và TS Nguyễn Hữu Hiếu, hai người Thầy đã hướng dẫn khoa học, định hướng nghiên cứu, và đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành

Xin chân thành cảm ơn các nghiên cứu viên, học viên, và sinh viên trong Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG – HCM Công nghệ Hóa học & Dầu khí (CEPP), Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP HCM đã giúp đỡ tác giả trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Tác giả

Trần Quốc Hòa

Đặc tính hóa lý của cao trích được khảo sát bằng các phương pháp: phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier, sắc ký thẩm thấu gel, và phương pháp thử Brookfield

Hoạt tính sinh học của cao trích được khảo sát thông qua: khả năng kháng oxy hóa

sử dụng phương pháp bắt gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl và năng lực khử kali ferricyanid; và khả năng kháng khuẩn được thử nghiệm bằng phương pháp đo mật

độ quang đối với ba loại vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus, Bacillus subtilis, và Staphylococcus aureus)

ABSTRACT

In this thesis, polysaccharides were extracted from Ganoderma lucidum by

ultrasound-assisted enzymatic method The effect of extraction conditions (including time, temperature, ultrasonic power, and pH on the content of polysaccharides) were investigated by single factor experiments The simultaneous effect of these factors were investigated by the Box-Behnken design of response surface methodology Hot water extraction and enzyme-assisted extraction method were compared The surfaces

of material before and after the extraction were investigated by scanning electron microscope

The physical-chemical characteristics of Ganoderma lucidum polysaccharides were

analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy, gel permeation chromatography, and Brookfield method

The bioactivities of the extract were investigated via: antioxidant activity by diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging capacity assay and potassium ferricyanide reducing power; and the antibacterial activity was tested against Gram-

2,2-positive (Bacillus cereus, Bacillus subtilis, and Staphylococcus aureus) bacteria by

optical density

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tác giả và được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Hoàng Minh Nam, Phòng TN Trọng điểm ĐHQG – HCM Công nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP), Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP HCM

Các số liệu, kết quả nghiên cứu, và kết luận trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, chưa từng được công bố trong bất cứ một công trình nào khác trước đây Tác giả xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Tác giả

Trần Quốc Hòa

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về nấm linh chi 2

1.1.1 Công dụng nấm linh chi 3

1.1.2 Thành phần cơ bản trong nấm linh chi 3

1.2 Polysaccharide 5

1.2.1 Khái niệm 5

1.2.2 Polysaccharide trong nấm linh chi 7

1.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của polysaccharide 8

1.3.1 Sự tạo thành gốc tự do và tác hại đối với cơ thể sinh vật 8

1.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide 9

1.4 Hoạt tính kháng khuẩn của polysaccharide 10

1.4.1 Khả năng kháng khuẩn của polysaccharide 10

1.4.2 Sơ lược về vi khuẩn 10

1.5 Phương pháp trích ly enzyme có hỗ trợ siêu âm 13

1.5.1 Phương pháp trích ly có hỗ trợ enzyme 14

1.5.2 Phương pháp trích ly enzyme có hỗ trợ siêu âm 15

1.6 Tình hình nghiên cứu trong/ngoài nước và tính cấp thiết đề tài 17

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong/ngoài nước 17

1.6.2 Tính cấp thiết đề tài 19

1.7 Mục tiêu, nội dung, và phương pháp nghiên cứu 19

1.7.1 Mục tiêu nghiên cứu 19

vi

1.7.2 Nội dung 20

1.7.3 Phương pháp nghiên cứu 20

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 27

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ, và địa điểm thí nghiệm 27

2.1.1 Nguyên liệu 27

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 28

2.1.4 Địa điểm thí nghiệm 29

2.2 Thí nghiệm 29

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố đến hàm lượng polysaccharide 30

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố đến hàm lượng polysaccharide33 2.2.3 Xác định hàm lượng polysaccharide 35

2.2.4 Phân tích cấu trúc nguyên liệu trích ly 35

2.2.5 Phân tích đặc tính hóa lý của cao trích 36

2.2.6 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của cao trích 36

2.2.7 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

3.1 Ảnh hưởng của từng yếu tố đến hàm lượng polysaccharide 40

3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian 40

3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 40

3.1.3 Ảnh hưởng của công suất siêu âm 41

3.1.4 Ảnh hưởng của pH 42

3.2 Ảnh hưởng đồng thời các yếu tố đến hàm lượng polysaccharide 43

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ 46

3.2.2 Ảnh hưởng của công suất siêu âm và thời gian 46

3.2.3 Ảnh hưởng của pH và thời gian 47

3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và công suất siêu âm 48

3.2.5 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ 48

3.2.6 Ảnh hưởng của pH và công suất siêu âm 49

3.2.7 Điều kiện tối ưu cho quá trình trích ly polysaccharide 49

3.2.8 So sánh hàm lượng polysaccharide của các phương pháp 50

3.2.9 Bề mặt nguyên liệu trước và sau khi trích ly 51

3.3 Đặc tính hóa lý của cao trích 52

3.3.1 Phổ FTIR 52

3.3.2 Khối lượng phân tử 53

3.3.3 Độ nhớt 54

3.4 Hoạt tính sinh học của cao trích 55

3.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 55

3.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn 57

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu tạo nấm linh chi 2

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của andenosine, triterpene, và PS 4

Hình 1.3: Cấu tạo PS thu được từ thực vật 5

Hình 1.4: Cấu tạo PS thu được từ vi khuẩn, động vật, và nấm 6

Hình 1.5: Liên kết glycoside trong PS 6

Hình 1.6: Công thức cấu tạo của PS từ quả thể loài Ganoderma sinense 7

Hình 1.7: Vi khuẩn S.aureus 11

Hình 1.8: Vi khuẩn B.subtilis 12

Hình 1.9: Vi khuẩn B.cereus 12

Hình 1.10: Cơ chế enzyme kết hợp với chất nền 15

Hình 1.11: Thiết kế thí nghiệm kiểu Box-Behnken 3 yếu tố 21

Hình 1.12: Phản ứng tạo furfural của D-Glucose 21

Hình 1.13: Các tín hiệu điện tử và sóng điện từ phát xạ từ mẫu do tán xạ 23

Hình 1.14: Nguyên lý hoạt động của máy đo FTIR 24

Hình 1.15: Cấu tạo máy đo độ nhớt trục quay 25

Hình 1.16: Cơ chế bắt gốc tự do DPPH 25

Hình 2.1: Nguyên liệu nấm linh chi 27

Hình 2.2: Enzyme pectinex ultra sp-l 27

Hình 2.3: Bể siêu âm 1200W 29

Hình 2.4: Máy ly tâm 29

Hình 2.5: Máy UV-VIS Dual-FL, Horiba 29

Hình 2.6: Quy trình trích ly bằng phương pháp enzyme có hỗ trợ siêu âm 30

Hình 2.7: Quy trình thử nghiệm DPPH 36

Hình 2.8: Quy trình khảo sát năng lực khử 37

Hình 2.9: Quy trình thử nghiệm kháng khuẩn 39

Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polysaccharide 40

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polysaccharide 41

Hình 3.3: Ảnh hưởng của công suất siêu ấm đến hàm lượng polysaccharide 42

Hình 3.4: Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hàm lượng polysaccharide 42

Hình 3.5: Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và thời gian 46

Hình 3.6: Ảnh hưởng đồng thời của công suất siêu âm và thời gian 47

Hình 3.7: Ảnh hưởng đồng thời của pH và thời gian 47

Hình 3.8: Ảnh hưởng đồng thời của công suất siêu âm và nhiệt độ 48

Hình 3.9: Ảnh hưởng đồng thời của pH và nhiệt độ 49

Hình 3.10: Ảnh hưởng đồng thời của pH và công suất siêu âm 49

Hình 3.11: Ảnh hưởng thời gian lên hàm lượng polysaccharide 50

Hình 3.12: Ảnh SEM cấu trúc nguyên liệu trước khi trích ly, sau khi trích ly 52

Hình 3.13: Phổ FTIR của polysaccharide 52

Hình 3.14: Đường phân bố khối lượng phân tử polysaccharide 53

Hình 3.15: Độ nhớt của dung dịch polysaccharide 54

Hình 3.16: Khả năng bắt gốc tự do của axit ascorbic và polysaccharide 55

Hình 3.17: Khả năng khử (PFRAP) của axit ascorbic và polysaccharide 56

Hình 3.18: Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn 57

x

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: So sánh các phương pháp trích ly 13

Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng 28

Bảng 2.2: Thành phần các chất sử dụng pha dung dịch đệm dùng điều chỉnh pH 32

Bảng 2.3: Khảo sát thời gian trích ly 32

Bảng 2.4: Khảo sát nhiệt độ 32

Bảng 2.5: Khảo sát công suất siêu âm 33

Bảng 2.6: Khảo sát pH 33

Bảng 2.7: Bảng mã hóa và mức độ của các yếu tố 34

Bảng 2.8: Bảng bố trí thí nghiệm 34

Bảng 2.9: Dãy chuẩn dung dịch D-glucose 35

Bảng 3.1: Kết quả thực nghiệm RSM – BBD 44

Bảng 3.2: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố 45

RSM Response surface methodology Phương pháp bề mặt đáp ứng

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

PFRAP Potassium ferricyanide reducing power Năng lực khử Kali

ferricyanide SEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét FTIR Fourier transform infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại chuyển hóa

Fourier GPC Gel permeation chromatography Sắc ký thẩm thấu gel

sự phát triển của vi khuẩn FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và

Dược phẩm Hoa Kỳ GRAS Generally Recognized As Safe An toàn tuyệt đối

MỞ ĐẦU

Nấm linh chi được biết đến là một trong những dược liệu quý, được trồng và nghiên cứu ở nhiều quốc gia trên thế giới Đặc biệt là các nước khu vực Châu Á như: Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, và Hàn Quốc Ở nước ta, linh chi được người dân biết đến và sử dụng ngày càng nhiều Trong những năm gần đây, việc trồng nấm linh chi được phát triển rộng khắp Việt Nam, không chỉ các doanh nghiệp, hộ gia đình mà các trường đại học cũng bắt đầu tiến hành nghiên cứu và trồng loại nấm này

Trong nấm linh chi có nhiều hoạt chất như terpenoid, steroid, phenol, nucleotide, các glycoprotein, polysaccharide,… Trong số đó, polysaccharide được xem là một trong những nhân tố chính góp phần tạo nên công dụng của nấm linh chi Theo nhiều nghiên cứu, polysaccharide có các công dụng như ức chế miễn dịch, chống ung thư, kháng viêm, phòng và điều trị các bệnh tim mạch, và kháng khuẩn Hoạt tính sinh học của polysaccharide phụ thuộc nhiều vào cấu trúc, việc ứng dụng polysaccharide trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm vẫn còn bị hạn chế do có khối lượng phân tử và độ nhớt cao

Hiện nay, polysaccharide từ nấm linh chi có thể được trích ly bằng nhiều phương pháp như ngâm dầm, ngấm kiệt, Soxhlet, siêu tới hạn, vi sóng, Tuy nhiên, các phương pháp này có nhược điểm tốn nhiều thời gian, dung môi, chi phí cao, và chưa được áp dụng rộng rãi ở quy mô công nghiệp Trích ly enzyme có hỗ trợ siêu âm (ultrasound-assisted enzymatic extraction – UAEE) là một phương pháp mới đang được quan tâm với nhiều ưu điểm nổi trội như năng suất trích ly cao, loại bỏ những chất không cần thiết từ vách tế bào, giữ được hoạt tính sinh học của hoạt chất, và thân thiện môi trường Việc sử dụng phương pháp UAEEđể trích ly polysaccharide có thể cho hàm lượng trích ly cao, đồng thời không làm mất đi hoạt tính sinh học của

polysaccharide Vì vậy, luận văn này được nghiên cứu với tên đề tài là: “Trích ly hoạt chất polysaccharide từ nấm linh chi bằng phương pháp enzyme có hỗ trợ siêu âm

và khảo sát hoạt tính sinh học của cao trích”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về nấm linh chi

Nấm linh chi tên khoa học là Ganoderma lucidum Nấm linh chi được phân loại như

− Loài: Ganoderma lucidum

Hình 1.1 thể hiện cấu tạo nấm linh chi: gồm hai phần cuống nấm và mũ nấm đính liền nhau, dưới mũ nấm là các phiến nấm nếu nấm sống càng lâu phiến nấm càng hóa

gỗ dày, mũ xòe tròn, hình quạt hoặc hình trái thận, rộng từ 2 – 20 cm, dày 4 – 8 cm Trên mặt mũ có vân gạch đồng, nhẵn, được phủ bởi lớp sắc tố bóng láng như vecni Màu sắc từ vàng nâu đến vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím, và nâu đen, mũ nấm sẫm dần theo tuổi Khi ở dạng tươi, thịt nấm mềm, mát, ẩm, hơi dai, khi già khô, chắc, cứng, và nhẹ

Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính từ 0,5 – 3 cm, cuống nấm ít phân nhánh

Hình 1.1: Cấu tạo nấm linh chi

Nấm linh chi phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, ôn đới bao gồm Bắc Mỹ, Nam Mỹ, châu Âu, và châu Á Loài nấm này sống hoại sinh trên vỏ cây đại thụ sần sùi hay trên thân cây gỗ đã chết, trong tự nhiên nấm linh chi sống trong các Cuống nấm

Mũ nấm

rừng có nhiều gỗ lớn, trên núi cao rừng rậm lâu năm [1] Là loài phân bố rộng, điều

kiện phát triển tốt nhất ở 28 đến 30 oC Quả thể gập rộ vào mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11 Nấm mọc tốt trong bóng rợp, có ánh sáng khuếch tán yếu, do có lớp vỏ bóng láng nên có thể chịu nắng rọi và chịu mưa liên tục

1.1.1 Công dụng nấm linh chi

Sách Bản thảo cương mục (1595) của Lý Thời Trân, đại danh y Trung Quốc đã phân loại linh chi theo màu sắc thành sáu loại, mỗi loại có công dụng chữa bệnh khác nhau:

− Thanh chi (xanh) vị toan bình, giúp cho sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái

− Xích chi hoặc Hồng chi (đỏ), có vị đắng, ích tâm khí, chủ vị, và tăng trí tuệ

− Hắc chi (đen) ích thận khí, khiến cho đầu óc sảng khoái, và tinh tường

− Bạch chi (trắng) ích phế khí, làm trí nhớ dai

− Hoàng chi (vàng) ích tì khí, trung hòa, và an thần

− Tử chi (tím đỏ) bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, và da tươi đẹp

Ngày nay, nấm linh chi được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và chứng minh có nhiều công dụng hữu ích với sức khỏe con người như: chống ung thư [2, 3], kháng viêm, kiểm soát nồng độ đường [4], tăng cường hệ miễn dịch [5], bảo vệ gan [6], suy nhược thần kinh [7]…

1.1.2 Thành phần cơ bản trong nấm linh chi

Ngoài một số vitamin và khoáng chất như kali, canxi, phốt pho, magie, selen, sắt, kẽm, và đồng [8], trong nấm có chứa nhiều loại phân tử sinh học như terpenoid, steroid, phenol, nucleotide, các glycoprotein, và polysaccharide (PS) Protein nấm chứa tất cả các axit amin thiết yếu, đặc biệt giàu lysine và leucin

PS, triterpene, và andenosine có cấu trúc thể hiện ở hình 1.2, là ba thành phần chủ yếu trong nấm linh chi, đóng góp quan trọng vào giá trị sức khoẻ

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của andenosine (A) [9], triterpene (B) [10], và PS (C) [11]

− Triterpene: Terpene là một loại hợp chất tự nhiên có bộ khung cacbon bao gồm một hoặc nhiều đơn vị isoprene, ví dụ như menthol (monoterpene) và β-carotene (tetraterpene) Terpene có hoạt tính kháng viêm, kháng nấm, và có khả năng hạ lipid Triterpene là một phân lớp của terpene và có một bộ khung cơ bản là C30 Triterpenoid có trọng lượng phân tử dao động từ 400 đến 600 kDa và cấu trúc hóa học rất phức tạp, dễ oxy hóa Triterpene thường được trích ly bằng metanol, etanol, axeton, cloroform, ete, hoặc hỗn hợp các dung môi này Ít nhất 140 triterpene

khác nhau đã được xác định có trong nấm linh chi [12 – 14] Axit ganoderic là chất tạo

vị đắng trong nấm linh chi [15] Một triterpenoid mới, được gọi là axit ganosporeric A,

gần đây đã được phân lập bằng etanol [2]

− Adenosine là một chất có hoạt tính dược lý mạnh, cấu tạo cơ bản gồm nucleoside và purine, là một trong những thành phần chủ yếu của nấm linh chi Adenosine có tác dụng ức chế sự ngưng tụ của tiểu cầu, truyền tải năng lượng trong

các tế bào, giúp cải thiện chức năng thần kinh và tuần hoàn máu [16].

− PS: Hơn 200 loại PS đã được phân lập từ quả thể, bào tử, và sợi nấm Các PS như β-D-glucan, heteropolysaccharide, và glycoprotein đã phân lập và được xem là những đóng góp chính cho hoạt tính sinh học của PS PS thường được trích ly bằng nước nóng, sau đó kết tủa với etanol hoặc metanol, ngoài ra cũng có thể được trích ly bằng kiềm PS đã được nhiều nghiên cứu chứng minh có nhiều công dụng như ức chế miễn dịch, chống ung thư, kháng viêm, phòng và điều trị các bệnh tim mạch, chống vi rút, kháng khuẩn,…

Với độ đa dạng và những công dụng như trên nên trong luận văn này đối tượng

được trích ly và thử nghiệm hoạt tính sinh học là PS

1.2 Polysaccharide

1.2.1 Khái niệm

Trong tự nhiên, PS có thể được tìm thấy ở thực vật, động vật, vi sinh vật, tảo, và nấm PS trích ly từ thực vật bao gồm: cellulose, guar, tinh bột, và xylan (hình 1.3) Hình 1.4 thể hiện cấu trúc của các PS được trích ly từ vi khuẩn (xanthan và axit hyaluronic), động vật (chitin, axit hyaluronic), và từ nấm (pullulan, chitosan)

Hình 1.3: Cấu tạo PS thu được từ thực vật

Hình 1.4: Cấu tạo PS thu được từ vi khuẩn (xanthan, axit hyaluronic), động vật (chitin,

axit hyaluronic), và nấm (chitosan, pullulan)

PS là cacbohydrat cao phân tử bao gồm chuỗi dài từ mười đơn vị monosaccharide liên kết với nhau bởi các liên kết glycoside, như thể hiện ở hình 1.5 PS có cấu trúc lập thể dạng xoắn ốc, phân tử lượng từ vài trăm đến vài ngàn Ngoài một số phân tử đa đường không tan trong nước (cellulose, chitin ) hoặc tan ít trong nước (amylose, xylan…), đại đa số tan trong nước nóng và không tan trong etanol ở nồng độ cao

Hình 1.5: Liên kết glycoside trong PS

glycoside

Các PS có cấu trúc từ mạch thẳng đến phân nhánh, chia làm hai nhóm:

− Homopolysaccharide (hoặc homoglycan): chỉ chứa một loại monomer duy nhất

− Heteropolysaccharide (hoặc heteroglycan) là những polymer phức tạp, được tạo ra từ nhiều loại monomer, dẫn xuất của các monomer, và các chất khác

1.2.2 Polysaccharide trong nấm linh chi

Các PS trong nấm linh chi được cấu tạo bởi các đơn vị glucose, mannose, galactose, fucose, xylose, và arabinose Những cacbohydrat đó đặc trưng bởi khối lượng phân tử, mức độ phân nhánh, cấu trúc bậc cao (bậc 3) bao gồm -glucan, hetero- -glucan, heteroglycan hoặc phức hợp -manno- -glucan Hình 1.6 thể hiện cấu tạo của một

loại PS từ quả thể Ganoderma sinense

Hình 1.6: Công thức cấu tạo của PS từ quả thể loài Ganoderma sinense [11]

Homoglucan là biopolymer mạch thẳng hoặc phân nhánh với mạch chính gồm các đơn vị glucose hoặc , liên kết ((1 3), (1 6)- -glucan và (1 3)- -glucan), và có thể chứa các mạch nhánh gắn ở các vị trí khác nhau Trong số các homoglucan, -glucan (thành phần chính tạo thành tế bào của nấm lớp cao) là các polymer glucose có mạch chính là (1 3)- không phân nhánh hoặc mạch chính (1 3)- với nhánh (1 6)- [17]

Glycan là một dạng của PS được tìm thấy trong nấm linh chi Thông thường các PS này gồm các đơn vị khác như galactan, fucan, xylan, và mannan [17] Mạch nhánh heteroglycan chứa arabinose, mannose, fucose, galactose, xylose, axit glucuronic, và glucose [17, 18]

PS cũng có thể liên kết cộng hóa trị với các protein hoặc các peptide như phức hợp PS-protein hoặc PS-peptide, các phức hợp này có khả năng kháng oxy hóa [19, 20] Glycoprotein là phức hợp PS-protein, bao gồm –glucan protein, -glucan protein và heteroglycan protein Mặt khác, glycopeptide là một nhóm cấu trúc tương tự như glycoprotein, nhưng với một chuỗi axit amin nhỏ hơn [19].

Như vậy, PS trong nấm linh chi rất đa dạng về cấu trúc và thành phần dẫn đến các hoạt tính sinh học khác nhau

Đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành với mục đích trích ly, khảo sát hoạt tính sinh học của PS trong nấm linh chi Kết quả cho thấy PS trong nấm linh chi

có nhiều tác dụng sinh học như ức chế miễn dịch [21], chống ung thư [22], kháng viêm [23], phòng và điều trị các bệnh tim mạch [24], chống vi rút, và kháng khuẩn [25] Gần đây, PS được xem là tác nhân kháng oxy hóa và kháng khuẩn hữu hiệu trong điều

kiện in vitro và in vivo bởi khả năng bắt gốc tự do, khả năng chelating với kim loại

chuyển tiếp, và kháng được nhiều loại vi khuẩn gây hại

1.3 Hoạt tính kháng oxy hóa của polysaccharide

1.3.1 Sự tạo thành gốc tự do và tác hại đối với cơ thể sinh vật

Trong cơ thể sống thường xuyên xảy ra các phản ứng oxy hóa – khử, gắn liền với quá trình trao đổi chất, trao đổi năng lượng của tế bào Chính nhờ phản ứng oxy hóa – khử này mà các dạng oxy hoạt động bao gồm gốc superoxide (O2●), hydro peroxid (H2O2), và gốc hydroxyl (HO●) được hình thành Sự tích lũy các sản phẩm oxy hóa này ở nồng độ cao là nguyên nhân dẫn đến các tổn thương oxy hóa của cơ thể sinh vật Ngoài ra, các gốc tự do còn có thể phát sinh bởi nguyên nhân bên ngoài như tia UV, chất kích thích sinh trưởng, chất bảo quản thực phẩm, chất thải công nghiệp…

Các ion kim loại chuyển tiếp (Cu2+, Fe2+…) có thể xúc tác cho phản ứng tạo gốc hydroxyl từ superoxide và hydro peroxide Phản ứng này gọi là phản ứng Fenton (1.1):

Các gốc tự do gây tác hại theo bốn cách:

− Tác động đến lipid: màng tế bào và chất hữu cơ (ví dụ: ty thể) chủ yếu gồm lipid, khi bị tác động bởi các gốc tự do thì chức năng sẽ bị suy giảm [26]

− Tác động đến protein: các gốc tự do tấn công các axit amin là thành phần chính tạo nên protein Oxy hóa protein ảnh hưởng đến sự thay đổi của cơ chế dẫn truyền tín hiệu, hoạt động của enzyme dẫn đến sự lão hóa [26]

− Tác động đến vật liệu di truyền: các gốc tự do tấn công axit nucleic (RNA và DNA), do đó ảnh hưởng đến chức năng, tăng trưởng của các tế bào Đây là bước đầu tiên trong sự phát triển của ung thư [26]

− Phá hủy lysosome: lysosome là một bào quan của các tế bào nhân thực, chứa các enzyme thủy phân các đại phân tử Khi lysosome bị phá hủy, các enzyme được giải phóng và tế bào phá hủy Tác động phá huỷ của các enzyme được truyền đến các

tế bào lân cận và tạo ra hiệu ứng lan rộng Dẫn đến một số bệnh lý như bệnh Sachs, hay rối loạn chuyển hóa thể tiêu bào [27]

Tay-1.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide

Trong một số nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của PS trích ly từ nấm linh chi cho thấy homoglucan và heteroglucan được phân lập từ loài này có khả năng kháng

oxy hóa thông qua các thử nghiệm trong môi trường in vitro như việc bắt các gốc tự do

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), hydroxyl, ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), hydro peroxid, khả năng khử, khả năng chelating, và giảm gốc hydroxyl [13, 20, 28] -1,3-glucan với trọng lượng phân tử thấp có thể tăng khả năng sống sót (từ 40 % đến 80 %) của dòng tế bào đại thực bào (RAW 264.7), giảm phản ứng với các gốc tự do chứa oxy [29] Homopolysaccharide

2,2’-azino-bis(3-tạo thành bởi mannose cũng có hoạt tính kháng oxy hoá dưới điều kiện in vitro PS này

thể hiện khả năng bắt các gốc tự do (O2-, OH-, DPPH) và có thể làm tăng hoạt tính của enzyme kháng oxy hóa, SOD (từ 67,4 đến 115,4 U/mL và 140 đến 230 U/mL), CAT (từ 7,82 đến 13,91 U/mL và 13,0 đến 22,0 U/mL), GSH-Px (từ 10,42 đến 26,39 U/mL

và 16,0 đến 36,0 U/mL), giảm mức MDA (từ 16,0 đến 8,0 mmol/mL) ở chuột bị ung thư cổ tử cung và buồng trứng [30, 31] Heteroglucan với liên kết chính -(1–3), (1–4)

và (1–6) glycoside cũng được phân lập từ nấm linh chi đã cho thấy khả năng kháng oxy hóa khi giảm tổn thương trên ty thể gây ra bởi quá trình oxy hóa bằng chiếu xạ , dẫn đến sự suy giảm MDA (1,24 xuống 0,55 nmol/mg protein), lipid hydroperoxides (1,09 xuống 0,04 nmol/mg protein), sự hình thành protein carbonyl (0,84 xuống 0,22 nmol/mg protein), protein thyol tăng (9,28 lên 13,42 nmol/mg protein) Heteroglucan này cũng làm tăng hoạt tính kháng oxy hóa của enzyme SOD (3,07 lên 6,11 U/mg

protein), CAT (3,25 lên 7,08 U/mg protein), GSH-Px (2,66 lên 4,77 U/mg protein)

[14] Trong một nghiên cứu, homoglucan và heteroglucan đã được cô lập, cả hai đều là

PS có trọng lượng phân tử thấp, hoạt tính kháng oxy hóa của homoglucan cao hơn do

có trọng lượng thấp hơn [20] Tuy nhiên, khi phân lập heteroglucan cho thấy PS có trọng lượng phân tử cao thì khả năng kháng oxy hóa cao [32]

Ngoài khả năng kháng oxy hóa, PS trong nấm linh chi còn được nghiên cứu là có

khả năng kháng một số loại vi khuẩn như Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Pseudomonas,…

1.4 Hoạt tính kháng khuẩn của polysaccharide

1.4.1 Khả năng kháng khuẩn của polysaccharide

Khả năng kháng khuẩn của PS sau khi trích ly bằng nước nóng được thử nghiệm

với 3 loại mầm bệnh thực vật (Erwinia carotovora, Penicillium digitatum, và Botrytis cinerea) và vi khuẩn có hại cho thực phẩm (Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Aspergillus niger, và Rhizopus nigricans) Kết quả cho thấy rằng, PS

ức chế mạnh ảnh hưởng trên Erwinia carotovora, tác động ức chế yếu đối với Penicillium digitatum và gần như không ảnh hưởng đối với Botrytis cinerea Đối với

vi sinh vật gây hại thực phẩm, PS có tác dụng ức chế mạnh đối với Bacillus subtilis và Bacillus cereus, ức chế yếu đối với Escherichia coli và Aspergillus niger, và gần như

không ức chế trên Rhizopus nigricans [33]

PS từ loài cổ linh chi đã được tìm thấy có hoạt tính chống lại Acitenobacter aerogenes, Acrobacter aerogenes, Arthrobacter citreus, Bacillus subtilis, Corynebacterium insidiosum, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Clostridium pasteurianum, Micrococcus roseus, Mycobacterium phlei, và Staphylococcus aureus

[34]

1.4.2 Sơ lược về vi khuẩn

Vi khuẩn là các sinh vật đơn bào có hình dạng và hoạt động đơn giản do chúng chưa có màng nhân Vi khuẩn có thể xuất hiện ở khắp mọi nơi, sống trong mọi khí hậu, và vị trí trên trái đất

Nhiều vi sinh vật gây hại cho sức khỏe, chúng là tác nhân gây nên các bệnh như viêm da, viêm màng não hay các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm Nhiều loại vi sinh vật hay vi khuẩn có hại cho con người nhưng một số lại có lợi như các loại vi khuẩn có trong đường tiêu hóa chúng giúp hỗ trợ quá trình hấp thu thức ăn, sản xuất vitamin, và tăng cường hệ miễn dịch

Trong luận văn này ba loại vi khuẩn được nghiên cứu bao gồm:

 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S.aureus) thuộc giống Staphylococcus, họ Micrococceae, lớp Firmibacteria, giới Prokaryote S.aureus là những vi khuẩn hình cầu, Gram dương,

đường kính 0,5 – 1,5 µm như hình 1.7

Hình 1.7: Vi khuẩn S.aureus S.aureus là loài phổ biến nhất trong Staphylococcus S.aureus phát triển tốt nhất ở

điều kiện hiếu khí, nhiệt độ phát triển tốt nhất là 35 oC, nhưng có thể phát triển trong khoảng từ 10 đến 45 oC, khoảng pH phát triển là 4,5 đến 9,3 và trong môi trường 15 %

NaCl Chính nhờ những đặc điểm này S.aureus có sự phân bố rộng và thường có mặt

trong không khí, bụi, và nước

S.aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm

họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng

 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis (B.subtilis) thuộc bộ Ecubacteriales, họ Bacillaceae, giống Bacillus, loài Bacillus subtilis Là một vi khuẩn Gram dương, có hình que, kích thước 0,5 – 0,8

µm × 1,5 – 3 µm, thường đứng đơn lẽ hoặc chuỗi ngắn như hình 1.8 B.subtilis phát

triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển được trong môi trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu là 37 oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4 [37] Vi khuẩn này thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc của đường ruột, phân bố hầu hết trong tự nhiên: cỏ khô, bụi, đất, và nước

Hình 1.8: Vi khuẩn B.subtilis B.subtilis sinh bào tử, thường không gây bệnh Tuy nhiên B.subtilis cũng sản sinh ra

một chất độc gọi là subtilisin có thể gây ra phản ứng dị ứng nếu có tiếp xúc lặp đi lặp lại ở nồng độ cao [37]

 Vi khuẩn Bacillus cereus

Bacillus cereus (B.cereus) là trực khuẩn Gram dương, thuộc giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae, chi Bacillus, loài B.cereus B.cereus là vi khuẩn hiếu khí, có hình que, gậy, đầu vuông Đứng riêng lẽ, xếp chuỗi

hoặc nhiều tế bào chụm lại thành chụm như hình 1.9 Có kích thước 3 – 5 µm, nhiệt độ phát triển từ 35 – 40 oC, pH phát triển từ 4,5 – 9,3 Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, và các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau, quả…)

Hình 1.9: Vi khuẩn B.cereus

B.cereus tiết ra loại độc tố gây nôn mửa [38], ngoài ra B.cereus còn có enzyme

hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người

PS của nấm linh chi chưa được nghiên cứu nhiều về đặc tính kháng khuẩn Nhiều nghiên cứu đã cho thấy PS của nấm linh chi có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh, kháng nấm tốt hơn cả ampicillin và streptomycin trong một số trường hợp Một số nghiên cứu khác lại cho rằng hoạt tính kháng khuẩn của dịch trích từ nấm linh chi không phải là do các PS trong nấm [35, 36] Như vậy, PS được trích ly từ nấm linh chi cần được nghiên cứu thêm và để thu được PS mà vẫn giữ được hoạt tính sinh học cần có phương pháp trích ly phù hợp

1.5 Phương pháp trích ly enzyme có hỗ trợ siêu âm (ultrasound-assisted

enzymatic extraction – UAEE)

Phương pháp trích ly là yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công trong các nghiên cứu về loại cây dược liệu nói chung và nấm Linh chi nói riêng Hiện nay có rất nhiều phương pháp trích ly khác nhau từ cổ điển đến hiện đại như ngâm trích ly bằng dung môi hữu cơ không dùng nhiệt và dùng nhiệt (trích ly Soxhlet), trích ly bằng nước nóng, siêu âm, vi sóng, enzym, chất lỏng siêu tới hạn…

Bảng 1.1: So sánh các phương pháp trích ly

Ngâm Công nghiệp/

phòng thí nghiệm Đơn giản, rẻ tiền

Thủ công, tốn thời gian, tốn dung môi, không trích kiệt

Ngấm kiệt Công nghiệp/

Tốn năng lượng, nhiệt

có thể phá hủy chất, quy mô nhỏ Siêu âm Phòng thí nghiệm Trích kiệt, tiết kiệm

thời gian Quy mô nhỏ, nhiều tạp

Vi sóng Phòng thí nghiệm Trích kiệt, nhanh

hơn siêu âm

Quy mô nhỏ, thiết bị phức tạp, dễ gây nổ Lỏng siêu tới

hạn

Công nghiêp/

phòng thí nghiệm

Trích chọn lọc, nhanh, thuận tiện

Thiết bị phức tạp, nhân công phải được đào tạo

1.5.1 Phương pháp trích ly có hỗ trợ enzyme (enzyme-assisted extraction – EAE)

Enzyme có thể được bắt nguồn từ vi khuẩn, nấm, các cơ quan động vật, hoặc chất trích ly từ thực vật Chúng được phân thành các loại sau:

− Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng oxy hoá – khử;

− Transferase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị;

− Hydrolase: các enzyme tham gia xúc tác cho các phản ứng thủy phân;

− Lyase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi hợp chất mà không có sự tham gia của nước;

− Isomerase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa giữa hai dạng đồng phân của một chất;

− Ligase (synthetase): các enzyme xúc tác cho các phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng của adenosine triphosphat (ATP).v.v để giải phóng adenosine monophosphate (AMP) hoặc adenosine diphosphate (ADP)

Enzyme là chất xúc tác lý tưởng có thể giúp tách các hợp chất hoạt tính sinh học phức tạp có nguồn gốc tự nhiên bằng cách làm phân hủy thành tế bào Do đó, enzyme

có thể giúp tăng tính thấm của vách tế bào và hiệu suất trích ly cao hơn

 Sự phá vỡ vách tế bào bằng enzyme

Sự phân hủy thành tế bào là bước quan trọng của quá trình trích ly nhiều hoạt chất sinh học tồn tại bên trong tế bào Phương pháp EAE được dựa trên khả năng của enzyme để thủy phân và phá vỡ cấu trúc thành tế bào thực vật trong điều kiện môi trường êm dịu do đó cho phép trích rút và giải phóng hiệu quả hoạt chất sinh học Khi enzyme và chất nền kết hợp với nhau, hình dạng của phân tử enzyme thay đổi phù hợp do sự tương tác giữa enzyme và chất nền Sự thay đổi có thể dẫn đến ứng suất biến dạng trên chất nền làm phá vỡ các liên kết do đó thúc đẩy phản ứng Khi nồng độ chất nền cao, sự bổ sung của enzyme có thể tăng tỷ lệ phản ứng, cho đến khi tỷ lệ nồng

độ chất nền và enzyme giảm xuống đến tỷ lệ nào đó Trong các nghiên cứu về trích ly

có hỗ trợ enzyme, đều quan tâm đến điều kiện hoạt động của enzyme như: nhiệt độ phản ứng, thời gian trích ly, pH, nồng độ enzyme, và kích thước hạt của cơ chất Các

quá trình trích ly có hỗ trợ enzyme cho thời gian trích ly ngắn, thể tích dung môi giảm, hàm lượng, và độ tinh sạch của các hoạt chất được trích ly tăng Hình 1.14 thể hiện cơ chế enzyme kết hợp với chất nền

Hình 1.10: Cơ chế enzyme kết hợp với chất nền Gần đây, enzyme được kết hợp với siêu âm, vi sóng, và chất lỏng siêu tới hạn để cải thiện quá trình trích ly Sự kết hợp của enzyme và siêu âm đã được nghiên cứu áp dụng trong nhiều nhà máy để trích ly các sản phẩm tự nhiên

1.5.2 Phương pháp trích ly enzyme có hỗ trợ siêu âm

Siêu âm là âm thanh có tần số cao hơn tần số tối đa mà tai người nghe thấy được Tần số tối đa này tùy vào từng người, nhưng thông thường vào cỡ 20000 Hz Trong quá trình siêu âm sẽ xảy ra hiện tượng xâm thực khí (cavitation) Theo Suslick và Doktycz các bong bóng khí có áp suất lên đến 1000 atm, nhiệt độ 5000 K và tốc độ hạ nhiệt là 1010 K/s [39] Khi số dao động sóng lớn, các bong bóng sát hoặc gần bề mặt nguyên liệu sẽ bị vỡ làm phá hủy vách tế bào [40]

Khi tần số siêu âm thấp, sóng siêu âm có thể cải thiện khả năng hoạt động của enzyme, đồng thời, làm cho enzyme lan rộng đều đặn Công suất siêu âm thấp sẽ không làm bất hoạt enzyme Tuy nhiên, công suất siêu âm cao và thời gian siêu âm dài

sẽ gây ra sự gia tăng số lượng bong bóng trong dung môi trong quá trình xâm thực khí,

có thể làm giảm hiệu quả năng lượng sóng siêu âm Đồng thời, siêu âm cường độ cao cũng gây ra sự phân hủy PS và giảm độ nhớt, dẫn đến giảm hiệu suất trích ly

Kết quả nghiên cứu ở Đại học Valencia (Tây Ban Nha) cho thấy hàm lượng protein thu được từ lá ô liu với sự hỗ trợ của enzyme và siêu âm tăng từ 1,87 đến 6,64 mg/g

[41] Bên cạnh đó, một nghiên cứu khác đã tiến hành trích ly PS từ loài Corbicula fluminea bằng phương pháp UAEE, kết quả cho thấy phương pháp UAEE cho thời

gian trích ly ngắn hơn phương pháp trích ly bằng enzyme từ 4 giờ xuống còn 32 phút,

đồng thời PS thu được bằng phương pháp UAEE có khối lượng phân tử thấp hơn, hàm lượng sunfat, và khả năng kháng gốc tự do cao hơn [42] Do đó, phương pháp trích ly bằng enzyme có hỗ trợ siêu âm đã cho thấy ưu thế so với các phương pháp khác như:

− Năng suất trích ly cao, theo đó các thành tế bào bị phá vỡ và các hoạt sinh học được giải phóng

− Loại bỏ những chất không cần thiết từ vách tế bào

− Hiệu quả xúc tác cao, bảo tồn được hoạt tính sinh học của hoạt chất

− Thân thiện môi trường

Với những ưu thế như trên nên trong luận văn này phương pháp UAEE được sử dụng trích ly PS từ nấm linh chi

Tuy nhiên, hiệu quả phương pháp UAEE phụ thuộc rất nhiều vào loại enzyme Nhiều nghiên cứu đã sử dụng nhiều enzyme khác nhau cho phương pháp UAEE như enzyme cellulose, pectase, amylase, papain, pectinex ultra sp-l… trong đó, enzyme pectinex ultra sp-l đang được sử dụng rộng rãi bởi độ an toàn khi sử dụng và có nhiều hoạt tính giúp phá hủy vách tế bào dễ dàng

 Enzyme Pectinex ultra sp-l

Một số loài nấm và vi khuẩn được biết đến có khả năng tiết ra một lượng lớn các enzyme ngoại bào làm suy giảm các PS và protein ở vách tế bào [43] Chính vì vậy enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng được sử dụng rộng rãi và đóng vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, đồ uống, dược phẩm, dệt may và da, lọc nước, quản lý chất thải, và sản xuất giấy [44]

Enzyme Pectinex (Pectinex Ultra SP-L) có nguồn gốc từ Aspergillus aculeatus đã

được nhiều nghiên cứu chứng minh có các hoạt tính như polygalacturonase, pectinase, arabanase, cellulase, hemiaellulase, β-glucanase, xylanase, fructosyltransferase và α-amylase protease [45 – 49] Pectinex được cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa

Kỳ (food and drug administration – FDA) cấp chứng nhận an toàn tuyệt đối (generally recognized as safe – GRAS) cho phép sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và đồ uống [46]

Với ưu thế và đặc tính như trên, enzyme Pectinex Ultra SP-L được chọn để trích ly

PS trong nấm linh chi trong luận văn này

1.6 Tình hình nghiên cứu trong/ngoài nước và tính cấp thiết đề tài

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong/ngoài nước

1.6.1.1 Ngoài nước

Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu trích ly PS bằng các phương pháp trích ly khác nhau PS từ nấm linh chi có các hoạt tính như kháng oxy hóa và kháng khuẩn

− Đại học California (Mỹ) tiến hành trích ly mẫu linh chi với etanol 95 % kết hợp siêu âm ở nhiệt độ phòng, sau đó dịch trích sẽ được trích phân đoạn với các dung môi 10 % metanol, hexan, và etyl acetat Qua đó, khảo sát khả năng ức chế tế bào ung thư Kết quả cho thấy phần etyl acetat ức chế cả hai dòng tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người và các tế bào ung thư với nồng độ từ 2 đến 40 μg/mL [50]

− Đại học Công nghệ Nam Trung Quốc nghiên cứu việc kết hợp vi sóng và siêu

âm để trích ly PS từ nấm linh chi Các thông số tối ưu thu được như sau: công suất siêu

âm 50 W, công suất vi sóng 284 W, thời gian 701 giây, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 11,6/1 Hiệu suất PS thu được tăng 115,56 % so với trích ly nước nóng, tăng 27,7 % so với phương pháp siêu âm PS thu được có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch trên chuột [5]

− Trường Đại học Cát Lâm (Trung Quốc) thực hiện quá trình trích ly PS từ nấm linh chi bằng nước nóng, sử dụng phương pháp Sevag để loại protein Lượng PS thu được là 0,82 % được thử trên chuột nhắt Kết quả cho thấy sau 28 ngày nhóm điều trị với Gl-PS có trọng lượng cơ thể và nồng độ insulin huyết thanh cao hơn so với nhóm đối chứng tiểu đường Hơn nữa, mức cholesterol toàn phần, triglyceride, và cholesterol lipoprotein của nhóm điều trị Gl-PS giảm, trong khi mức độ lipoprotein cholesterol tăng Ngoài ra, Gl-PS đã không gây tử vong và thay đổi hành vi của con chuột [51]

− Trường Đại học Nottingham (Malaysia) sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt

và thiết kế Box-Behnken để tìm ra thông số tối ưu và đánh giá ảnh hưởng của các thông số đến năng suất trích ly PS với sự hỗ trợ siêu âm Điều kiện trích tối ưu được tìm thấy là: công suất 590 W, thời gian 58 phút, và nhiệt độ 81 °C Trong các điều kiện tối ưu, năng suất tối ưu dự đoán của hàm lượng PS là 52,33 mg và hàm lượng PS thực

tế đạt 52,28 mg Đồng thời tác giả tiến hành so sánh với phương pháp trích ly nóng ở cùng điều kiện nhiệt độ và thời gian Kết quả cho thấy sử dụng sóng siêu âm không chỉ tăng lượng PS từ 29,2 đến 52,25 mg [52]

1.6.1.2 Trong nước

Ở Việt Nam, PS từ nấm linh chi là một hoạt chất ngày càng được quan tâm Một số kết quả của các nhóm nghiên cứu trong nước về PS trong nấm linh chi:

− Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

Khảo sát ảnh hưởng của PS trích ly từ quả thể và sinh khối nấm linh chi theo phương pháp Takashi lên trọng lượng và thời gian sống thêm của chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180 Kết quả cho thấy PS có tác dụng tăng trọng lượng

và thời gian sống thêm 32 % trên chuột thí nghiệm [53]

Nghiên cứu một số thành phần và hoạt tính sinh học của nấm linh chi nuôi trồng ở Việt Nam cho thấy hàm lượng protein cao nhất ở quả thể nấm linh chi nuôi trồng là 20,25 %, sinh khối 16,1 %, hàm lượng đường khử ở Cổ linh chi là cao nhất 10,1 %, lipid ở Hồng linh chi là 3,73 % [54]

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ của nấm linh chi trên chuột nhắt trắng Swiss cho thấy nấm linh chi có tác dụng hạn chế sự giảm số lượng hồng cầu, bạch cầu của chuột bị chiếu xạ, hạn chế sự giảm trọng lượng, nâng cao tỷ lệ sống của chuột sau khi chiếu xạ [55]

− Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nghiên cứu quy trình trích ly các hoạt chất sinh học từ nấm linh chi Kết quả tối ưu thu được: dung môi có độ thu hồi cao nhất là nước và etanol 70o, nhiệt độ 80 oC, thời gian trích ly 7 giờ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 và hàm lượng chất cần trích thu hồi là 6,91 % [56]

− Trường Đại học Cần Thơ

Tối ưu hóa quá trình trích ly hoạt chất trong nấm linh chi bằng phương pháp trích

ly nước nóng Hàm lượng PS thu được 684,1 ± 14,5 mg/L với thời gian trích ly 30 phút nhiệt độ 130 oC [57]

Khảo sát nhiệt độ, thời gian của quá trình trích ly nấm linh chi với sự hỗ trợ của chủng Lactobacillus nhằm phá vỡ vách tế bào, kết quả thu được như sau: nhiệt độ

130 oC, thời gian trích ly 40 phút, thu được lượng PS và hợp chất phenol là 667,7

mg/L và 631,25 mg Thời gian sử dụng chủng Lactobacillus là 48 giờ cho tỷ lệ mẫu bị

phá hủy là 52,38 % [58]

− Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh

Khảo sát quá trình trích ly PS trong nấm linh chi bằng phương pháp enzyme (sử dụng enzyme cellulase) Đồng thời so sánh hiệu suất trích ly khi sử dụng các

phương pháp khác nhau như: enzyme cellulase, vi sóng, và siêu âm Kết quả cho thấy phương pháp enzyme cho hàm lượng PS cao hơn 2 phương pháp còn lại (4,37 %) Tuy nhiên, khi kết hợp cả 3 phương pháp (enzyme + vi sóng + siêu âm) cho kết quả cao hơn đáng kể (5,24 %) [59]

Nghiên cứu trích ly PS trong nấm linh chi bằng phương pháp enzyme theo thiết kế tổng hợp trung tâm Các thông số thu được như sau: tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/50; nhiệt độ 50 oC, nồng độ enzyme 0,25 %, thời gian trích ly 3,24 giờ, hiệu suất trích ly

PS đạt 5,24 % [60]

1.6.2 Tính cấp thiết đề tài

Một trong những yêu cầu quan trọng trong quá trình trích ly là thời gian, năng lượng tiêu tốn cho quá trình là nhỏ nhất, và không làm thay đổi hoạt tính của hoạt chất Trong những năm gần đây, để đáp ứng những yêu cầu đó, các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều phương pháp trích ly khác nhau Phương pháp UAEE là một phương pháp mới đang được quan tâm với nhiều ưu điểm nổi trội như năng suất trích ly cao, loại bỏ những chất không cần thiết từ vách tế bào, bảo tồn được hoạt tính sinh học của hoạt chất, thân thiện môi trường

Nấm linh chi từ lâu được biết đến như một thảo dược quý, một vị thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khỏe và chữa trị nhiều loại bệnh Các thành phần trong nấm rất đa dạng Trong số đó, PS được chứng minh có nhiều hoạt tính như ức chế miễn dịch, chống ung thư, kháng viêm, phòng và điều trị các bệnh tim mạch, chống vi rút,

phẩm từ nấm linh chi ở Việt Nam

1.7 Mục tiêu, nội dung, và phương pháp nghiên cứu

1.7.1 Mục tiêu nghiên cứu

Trích ly thành công PS từ nấm linh chi với hàm lượng trích ly cao bằng phương pháp UAEE và đưa ra kết luận về đặc tính hóa lý và hoạt tính sinh học (kháng oxy hóa, kháng khuẩn) của cao trích thu được

1.7.2 Nội dung

− Nội dung 1: Khảo sát điều kiện trích ly PS từ nấm linh chi

− Nội dung 2: Khảo sát đặc tính hóa lý của cao trích

− Nội dung 3: Khảo sát hoạt tính sinh học: kháng oxy hóa và kháng khuẩn của

cao trích

1.7.3 Phương pháp nghiên cứu

1.7.3.1 Phương pháp khảo sát điều kiện trích ly

PS từ nấm linh chi được trích theo phương pháp UAEE đồng thời tiến hành các mẫu đối chứng bằng phương pháp trích ly nước nóng (hot water extraction – HWE) và phương pháp EAE

Điều kiện trích ly gồm bốn yếu tố: thời gian, nhiệt độ, công suất siêu âm, và pH được khảo sát ảnh hưởng theo luân phiên từng biến và đồng thời của các biến đến hàm lượng PS trích được

a Luân phiên từng biến: Mỗi yếu tố được khảo sát theo năm mức với hàm mục

tiêu là hàm lượng PS thu được, để xác định khoảng giá trị ảnh hưởng các yếu tố

b Đồng thời: Theo phương pháp bề mặt đáp ứng (response surface methodology –

RSM) với mô hình Box-Behnken (Box Behnken design – BBD) Box và Behnken đưa

ra các thiết kế bậc hai phù hợp với mô hình bề mặt đáp ứng bậc hai: Yu =

Cho m yếu tố x1,…, xm trong n phép thử, trong đó Yu, u = 1,…, n là giá trị của biến đáp ứng tại điểm thực hiện phép thử thứ u, là các hiệu ứng chính, là các hiệu ứng tương tác với j = 1, …, m và

là nhiễu trắng Có thể xem BBD cho m yếu tố là sự kết hợp giữa cách thiết kế kết hợp

đủ cho b yếu tố ở hai mức (b < k) và cách thiết kế khối không hoàn toàn Như vậy, trong mỗi nghiệm thức, sẽ có b yếu tố có giá trị là mức cao (+ 1) hay mức thấp (− 1), các yếu tố còn lại ở mức tâm (0) Hình 1.15 minh họa cho trường hợp thiết kế BBD 3 yếu tố:

Hình 1.11: Thiết kế thí nghiệm kiểu Box-Behnken 3 yếu tố Thiết kế BBD rất thông dụng cho người làm thí nghiệm với các lý do sau:

− BBD là các thiết kế ba mức giá trị

− Mỗi yếu tố trong BBD có cùng số lân thực hiện ở mức giá trị cao và mức giá trị thấp

− BBD là thiết kế xoay quanh hoặc gần xoay quanh

− BBD đều có thể chia nhóm trực giao trừ trường hợp cho 3 và 11 yếu tố

1.7.3.2 Xác định hàm lượng polysaccharide

Xác định hàm lượng PS tổng theo phương pháp phenol – axit sunfuric [61, 62]

Nguyên tắc: Với sự có mặt của axit sunfuric (đậm đặc), PS bị thủy phân thành monosacccharide, mất nước và sắp xếp lại các monosacccharide để tạo thành các dẫn xuất furfural tạo phức màu vàng cam với phenol Hình 1.16 thể hiện phản ứng tạofurfural của D-Glucose Hàm lượng PS được xác định thông qua độ hấp thu ở bước sóng 490 nm.

Hình 1.12: Phản ứng tạo furfural của D-Glucose Hàm lượng PS tổng được tính theo công thức (1.2):

1.7.3.3 Phương pháp phân tích cấu trúc nguyên liệu trước và sau khi trích ly

Sử dụng kính hiển vi điện tử quét (scan electron microscopy – SEM): là một loại kính hiển vi điện tử sử dụng kỹ thuật quét chùm tia điện tử hội tụ trên bề mặt mẫu vật

để tạo ra hình ảnh

Nguyên lý: Chùm điện tử được điều khiển bằng các thấu kính điện từ được quét lên

bề mặt vật chất, khi các điện tử tới đập vào mẫu, các điện tử bị tán xạ đàn hồi hoặc không đàn hồi bởi các nguyên tử trong mẫu làm phát xạ các loại điện tử và sóng điện

từ Các điện tử phát xạ thể hiện ở hình 1.17 bao gồm: điện tử truyền qua, tán xạ ngược, thứ cấp, hấp thụ, và điện tử Auger

Hình 1.13: Các tín hiệu điện tử và sóng điện từ phát xạ từ mẫu do tán xạ

Các bức xạ điện từ tương tác với vật chất và bị tán xạ Tùy theo cấu trúc của vật chất mà sự tán xạ sẽ khác nhau, nên sẽ cho hình ảnh bề mặt vật chất khác nhau

Ứng dụng: Cung cấp hình thái bề mặt nguyên liệu trước và sau khi trích

1.7.3.4 Phương pháp phân tích đặc tính hóa lý của cao trích

 Sắc ký thẩm thấu gel (gel permeation chromatography – GPC)

Nguyên tắc: Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polyme có lỗ rỗng và các lỗ rỗng

này được phủ đầy dung môi dùng làm pha động Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng lượng phân tử khác nhau có thể tách riêng được hay không là tuỳ vào kích thước

lỗ rỗng Các phân tử có kích thước lớn hơn lỗ rỗng, không thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng, nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ toàn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng Dòng chảy pha động khiến các phân tử lớn không thể chui vào lỗ rỗng của mạng gel, nhanh chóng đi xuyên qua cột, ra khỏi cột, trong khi phân tử nhỏ ra khỏi cột lâu

hơn vì còn chui vào và đi ra khỏi lỗ rỗng của gel Như vậy, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khi đi ngang qua cột sắc ký gel, sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trình tự trọng lượng phân tử lớn đi ra khỏi cột trước, phân tử nhỏ đi ra khỏi cột sau

Ứng dụng: Xác định trọng lượng phân tử trung bình của cao trích

 Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy – FTIR)

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào hiệu ứng là các hợp chất hay nhóm chức có

khả năng hấp thu chọn lọc nhiễu xạ hồng ngoại Vì vậy, khi xác định được bước sóng hấp thu thì có thể xác định được hợp chất hay nhóm chức tồn tại trong vật liệu

Máy quang phổ thế hệ mới được chế tạo theo kiểu biến đổi Fourier Các loại phổ kế này là loại tự ghi, hoạt động theo nguyên tắc như hình 1.18 Chùm tia hồng ngoại phát ra từ nguồn (1) được chia thành hai phần, một đi qua mẫu (2) và một môi trường

đo (2’) rồi được bộ tạo đơn sắc (3) tách thành từng bức xạ có tần số khác nhau và chuyển đến đầu cảm biến Đầu cảm biến so sánh cường độ hai chùm tia và chuyển thành tín hiệu điện có cường độ tỷ lệ với phần bức xạ bị hấp thụ bởi mẫu Dòng điện

có cường độ rất nhỏ nên phải nhờ bộ khuếch đại (5) tăng lên nhiều lần trước khi chuyển sang bộ phận tự ghi (6) vẽ lên bản phổ hoặc đưa vào máy tính để xử lý rồi in ra phổ

Hình 1.14: Nguyên lý hoạt động của máy đo FTIR

Ứng dụng: Xác định sự có mặt của của các nhóm chức trong cao trích

 Phương pháp thử Brookfield

Nguyên tắc: Đo lực xoắn tạo ra trong điều kiện qui định để quay đĩa kim loại trong

khuôn hình trụ có chứa đầy chất lỏng Trở lực của chất lỏng khi quay đĩa biểu thị độ nhớt của mẫu thử Hình 1.19 thể hiện cấu tạo máy đo độ nhớt trục quay

Hình 1.15: Cấu tạo máy đo độ nhớt trục quay

Ứng dụng: Đo độ nhớt dung dịch cao trích

1.7.3.5 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích

 Hoạt tính kháng oxy hóa

a) Phương pháp DPPH [63]

Nguyên tắc: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch metanol

bão hòa Khi các mẫu thử nghiệm được cho vào hỗn hợp này, nếu mẫu trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do thì sẽ làm giảm độ hấp thụ ánh sáng của gốc tự do Do đó, hoạt tính kháng oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thu ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi so màu ở bước sóng 515 nm Hình 1.20 thể hiện cơ chế bắt gốc tự do DPPH của tác nhân kháng oxy hóa

Khuôn chứa mẫu Đĩa kim loại

b) Phương pháp PFRAP (potassium ferricyanide reducing power) [59, 60]

Nguyên tắc: Các hợp chất có khả năng kháng oxy hóa phản ứng với kali

ferricyanide, tạo thành kali ferrocyanide Sau đó phản ứng với ferric trichloride, tạo ra ferrocyanide ferric, một phức màu xanh lam, với độ hấp thụ tối đa ở 700 nm

Kali ferricyanide + → Kali ferrocyanide + (1.6) Năng lực khử được tính theo công thức (1.7):

Khả năng kháng khuẩn của PS được đánh giá qua các thông số nồng độ ức chế 50

% sự phát triển (inhibitor concentration – IC50): là nồng độ mà tại đó ức chế 50 % vi khuẩn Các thông số này được xác định bằng các phương pháp đo mật độ quang

Nguyên tắc: Mật độ vi sinh vật có thể xác định gián tiếp thông qua đo mật độ

quang (optical density – OD) hay độ hấp thu (absorbance – Abs) Tế bào vi sinh vật có thể tạo hệ huyền phù trong nước tạo độ đục cho môi trường Trong giới hạn nhất định, giá trị OD của dung dịch và mật độ của tế bào tế bào có mối quan hệ tuyến tính với nhau Vì vậy, có thể xác định mật độ tế bào vi sinh một cách gián tiếp thông qua

đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 550 – 610 nm Ngoài ra, phương pháp đo

OD còn được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của vi sinh vật Đây là phương pháp cho kết quả nhanh chóng, thường dùng để theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của vi sinh vật [37]

Ứng dụng: Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của cao trích