Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây đại hồng môn anthurium andreanum l bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào

Các thí nghiệm bao gồm: 1 Kỹ thuật cắt lớp mỏng ở các bộ phân khác nhau trên sự phát sinh cấu trúc 2 Sự phát sinh cụm tiền chồi của cây Đại Hồng Môn; 3 Quan sát hình thái cấu trúc giải p

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY

ĐẠI HỒNG MÔN (Anthurium andreanum L.)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LỚP

MỎNG TẾ BÀO

Chủ nhiệm đề tài: Th.S NGUYỄN THỊ THÚY DIỄM

An Giang, tháng 6 năm 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY

ĐẠI HỒNG MÔN (Anthurium andreanum L.)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LỚP

MỎNG TẾ BÀO

BAN GIÁM HIỆU LÃNH ĐẠO ĐƠN VỊ

Th.s Nguyễn Thị Thúy Diễm

An Giang, tháng 6 năm 2013

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY

ĐẠI HỒNG MÔN (Anthurium andreanum L.)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LỚP

MỎNG TẾ BÀO

TÓM LƯỢC

Đề tài: “Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây Đại Hồng Môn (Anthurium andreanum

L.) bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào” được tiến hành nhằm mục đích xác định qui trình vi nhân giống cây Đại Hồng Môn Các thí nghiệm bao gồm: (1) Kỹ thuật cắt lớp mỏng ở các bộ phân khác nhau trên sự phát sinh cấu trúc (2) Sự phát sinh cụm tiền chồi của cây Đại Hồng Môn; (3) Quan sát hình thái cấu trúc giải phẩu của sự phát sinh cụm tiền chồi và chồi; (4) Khảo sát quá trình nhân chồi; (5) Khảo sát quá

trình tạo rễ in vitro; (6) Khảo sát quá trình thuần dưỡng cây Đại Hồng Môn in vitro

trong điều kiện nhà lưới Kết quả cho thấy rằng môi trường thích hợp tạo mô sẹo từ lá:

MS + 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l 2,4- D; môi trường thích hợp tạo mô sẹo từ cuống lá là

MS + TDZ 0,5 mg/l + 2,4-D 0,5 mg/l; hoặc MS + TDZ 1 mg/l + 2,4-D 0,5 mg/l hoặc

MS + TDZ 1,5 mg/l + 2,4-D 0,5 mg/l và môi trường thích hợp tạo mô sẹo từ đoạn thân

là MS + 1,0 mg/l TDZ + 0,5 mg/l 2,4-D hoặc môi trường nuôi cấy chứa MS + 1,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l 2,4-D Môi trường thích hợp tạo cụm tiền chồi từ mô sẹo là: MS + 0,5 mg/l 2,4- D + 0,5 mg/l TDZ và môi trường thích hợp nhân nhanh cụm tiền chồi: MS + 0,5 mg/l 2,4- D + 1,0 mg/l TDZ hoặc MS + 0,5 mg/l 2,4- D + 1,5 mg/l TDZ Môi trường thích hợp tạo chồi từ cụm mô sẹo đoạn thân: MS + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l TDZ hoặc MS + 0,5 mg/l NAA + 1,0 mg/l TDZ đạt 7 -9 chồi/cụm, môi trường thích hợp để nhân chồi: MS + 0,5 mg/l 2,4 – D + 0,2 mg/l TDZ cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 17,44,3 chồi Kết quả tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường MS + 1g/l than hoạt tính +

15 mg/l Putrescine Trong quá trình thuần dưỡng cây Đại Hồng Môn in vitro, giá thể

mụn dừa kết hợp với tro trấu (1:1) cho tỷ lệ sống cao nhất (88,75%)

Từ các kết quả thí nghiệm, xây dựng được qui trình vi nhân giống cây Đại Hồng Môn

Từ khóa: Anthurium andreanum, vi nhân giống, nhân chồi, cắt lớp mỏng, mô sẹo

II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

I ĐỐI TƯỢNG 2

II PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

C CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

2.2 Đặc điểm của hệ thống lớp mỏng tế bào 4

2 3 Ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào 5

3.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật 5

3.2 Khả năng tạo mô sẹo của tế bào trong nuôi cấy mô 5

4 Các phương pháp nhân giống cây Đại Hồng Môn 7

4.1 Phương pháp nhân giống bằng hạt 7

4.2 Phương pháp nhân giống bằng tách cây hoặc giâm cành 7

4.3 Phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống) 7

5 Phương pháp vi nhân giống 8

5.1 Các giai đoạn của vi nhân giống 8

5.2 Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng thực vât 10

5.3 Các điều kiện khác trong môi trường có ảnh hưởng lên mô cấy 12

5.4 Hiện tượng hoá nâu ở mẫu cấy 14

5.5 Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Đại Hồng Môn 14

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

1 Phương tiện nghiên cứu 15

1.1 Vật liệu thí nghiệm 15

1.2 Điều kiện thí nghiệm 15

2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.1 Môi trường nuôi cấy 16

2.2 Bố trí thí nghiệm 17

2.2.1 Sự phát sinh hình thái ở các bộ phận khác nhau của

cây Đại Hồng Môn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng 17

2.2.2 Sự phát sinh cụm tiền chồi của cây Đại Hồng Môn 19

2.2.3 Quan sát hình thái cấu trúc giải phẩu của sự phát sinh

2.2.6 Thuần dưỡng cây Đại Hồng Môn in vitro trong điều kiện nhà lưới 22

2.3 Xử lý số liệu 23

CHƯƠNG 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ 24

I Sự phát sinh hình thái ở các bộ phận khác nhau của

cây Đại Hồng Môn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng 24

II Sự phát sinh cụm tiền chồi của cây Đại Hồng Môn 33

III Quan sát hình thái cấu trúc giải phẩu của cụm tiền chồi và chồi 36

DANH SÁCH BẢNG Bảng Tựa bảng Trang

1.1 Thành phần môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) 16

2.1 Tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lát cắt của lá non

2.4 Sự phát sinh chồi của lát cắt đoạn thân ở thời điểm 8 TSKC 31

2.5 Tỷ lệ tạo cụm tiền chồi ở thời điểm 4 tuần sau khi cấy 33 2.6 Đường kính của cụm tiền chồi ở thời điểm 4 tuần sau khi cấy 34

2.7 Sự gia tăng kích thước của cụm tiền chồi ở thời điểm 8 TSKC 35

2.8 Sự gia tăng số chồi bên ở thời điểm 4 TSKC 38

2.9 Sự gia tăng số chồi và chiều cao chồi ở thời điểm 8 tuần sau khi cấy 40

2.10 Sự gia tăng chiều cao, số lá và số rễ của chồi cây Đại Hồng Môn in vitro

ở thời điểm 8 tuần sau khi cấy 42

2.11 Tỷ lệ sống của cây Đại Hồng Môn (%) sau 4 tuần thuần dưỡng 45

DANH SÁCH HÌNH Hình Tựa hình Trang

1.1 Cây Đại Hồng Môn (Anthurium andreanum L.) 3

1.2 Con đường tổng hợp polyamine ở thực vật 12

2.1 Mô sẹo được tạo ra từ lát cắt lá non trên môi trường MS có bổ sung

2.2 (A) Chồi hình thành từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0,1

mg/l 2,4 – D và 1,0 mg/l BA ở 12 TSKC; (B) Lát cắt ngang của

2.3 Mô sẹo được tạo ra từ cuống lá cây Đại Hồng Môn ở 8 TSKC trên

môi trường nuôi cấy MS bổ sung l,0 mg/l TDZ và 0,5 mg/l 2,4 – D 28

2.4 (A) Chồi hình thành từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0,5

mg/l 2,4 – D và 0,5 mg/l TDZ ở 12 TSKC; (B) Rễ xuất hiện trên

môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D và 1,0 mg/l TDZ ở 12

2.5 Mô sẹo tạo ra cùng với sự phát triển của chồi bên trên môi trường

MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D và 1,5 mg/l TDZ ở 8 TSKC 30

2.6 (A) Chồi được tạo ra từ lớp mỏng của đoạn thân ở 8 TSKC trên môi

trường nuôi cấy chứa MS + 0,1mg/l 2,4-D + 0,5mg/l BA;

2.10 (A, B) Cấu trúc giải phẩu của lát cắt ngang của cụm tiền chồi; (a)

lá mầm; (b) vùng mô phân sinh chồi, thanh ngang 1mm 37

2.11 Cụm chồi hình thành từ mô sẹo trên môi trường MS + 0,5 mg/l

NAA + TDZ (A) MS + NAA 0,5 mg/l ; (B) MS + NAA 0,5 mg/l +

TDZ 0,5 mg/l; (C) MS + NAA 0,5 mg/l + TDZ 1,5 mg/l; (D) MS +

NAA 0,5 mg/l + TDZ 1,0 mg/l, thanh ngang 1 cm 39

2.12 Chồi cây Đại Hồng Môn được nhân lên trên môi trường MS có bổ

sung 2,4- D 0,5 mg/l kết hợp với 0,2 mg/l TDZ sau 8 tuần nuôi cấy,

2.13 Sự hình thành rễ của cây Đại Hồng Môn ở 8 TSKC 43

2.14 Hiệu quả của các loại giá thể lên sự phát triển của cây Đại Hồng

3.1 Quy trình vi nhân giống cây Đại Hồng Môn

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

2,4 – D : Acid 2,4 Diclorophenoxy acetic

BA : Benzyl Adenin

CĐHSTTV : Chất điều hoà sinh trưởng thực vật

MS : Murashige & skoog (1962)

NAA : Naphthalene acetic acid

NSKC : Ngày sau khi cấy

TCL : Thin cell layer

và Mỹ Phong (Mỹ Tho)…thường trồng hoa bán trong các dịp cúng kiếng và nhất là vào dịp tết hàng năm đã cung cấp cho thi trường nhiều loại hoa hồng, cúc, vạn thọ…Sản phẩm hoa kiểng ở miền tây chưa có hoa cắt cành như hồng môn, layơn, hồng…mà vẫn lấy từ Đà Lạt, mặc dù vẫn có thể trồng được các loại hoa này

Hồng Môn là một loài hoa đẹp, sang trọng và đa dạng về màu sắc Ngoài ra, do cây có dáng đẹp, hoa lâu tàn (2 - 3 tháng), cây chịu rợp nên dùng để trang trí trong nội thất và sân vườn thiếu ánh sáng rất thích hợp Hiện nay, cây Đại Hồng Môn được nhiều nước trên thế giới trồng với diện tích lớn để cắt hoa bán như: Hà Lan, Ðức, Philippine, Ðài Loan (Nguyễn Xuân Linh và Nguyễn Thị Kim Lý, 2005) Nguồn lợi đem lại từ cây Hồng Môn là khá lớn so với cây hoa cắt cành khác Tại Maurititus người ta có thể thu được 225.000 bông hoa thương phẩm/ha/năm Lãi suất đạt được trên một bông là 1- 1,25 Rs (Ruspi) Một năm lợi nhuận thu được tối thiểu 225.000Rs tương đương 500 -

700 triệu/năm (Amon, 1989) Ở Đà Lạt, mô hình trồng hoa hồng môn, phong lan, cà phê, rau má, rau dấp cá của người dân đang là một trong những mô hình rất hiệu quả một năm thu khỏang 150 - 200 triệu đồng/ ha, tạo công ăn việc làm cho người lao động thường xuyên với mức lương 700.000 đ/tháng Mô hình này đã được nhân rộng và rất thành công (Long dinh, 2006)

Ở Việt Nam, cây Hồng Môn có hai loại Loại cây nhỏ gọi là Tiểu Hồng Môn và loại cây

lớn gọi là Đại Hồng Môn Cây Đại Hồng Môn (Anthurium andreanum L.) được trồng

nhiều ở Đà Lạt như loại cây trồng để thu hoạch hoa cắt cành Cây Đại Hồng Môn có thể nhân giống bằng các phương pháp truyền thống như cắt đoạn, tách mầm, gieo bằng hạt nhưng các phương pháp nhân giống như thế cho số lượng cây con rất hạn chế và cần nhiều thời gian mới đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng (1 năm chỉ cho 1-3 mầm/cây) Phương pháp nhân giống thông thường không cho kết quả tốt và để tạo được

lượng lớn sản phẩm chất lượng cao, cây Đại Hồng Môn cần được nhân giống in vitro Nhiều nghiên cứu về nhân giống hồng môn in vitro đã thực hiện như phương pháp nhân giống thông qua tạo callus từ hạt (Pierik et al., 1974; Teresa et al., 2004), phương pháp

nuôi cấy chồi (Kunisaki, 1980; George, 1996), nghiên cứu tạo chồi nách và chồi bất

định (Geier, 1987), nghiên cứu tạo phôi vô tính (Đoàn Duy Thanh et al., 2003), tái sinh cây Anthurium sp thông qua tạo callus từ lá (Dương Tấn Nhựt et al., 2004; Nguyễn Thị

Lý Anh et al., 2005)

Trong vi nhân giống, phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào (Thin cell layer – TCL) là

kỹ thuật cho phép kiểm soát điều kiện nuôi cấy một cách dễ dàng do nồng độ hormone nội sinh của mẫu thấp Sự phân cực của các tế bào trong lớp mỏng tế bào giảm, tạo được nhiều chồi hơn, do đó hệ số nhân chồi cao Ngoài ra, mức độ biến dị thấp và tạo điều kiện nhân nhanh các giống cây trồng Những nghiên cứu nhân giống cây Đại Hồng Môn ở nước ta bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào còn rất hạn chế Xuất phát

2

từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây Đại Hồng

Môn (Anthurium andreanum L.) bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào” nhằm

mục đích xây dựng quy trình vi nhân giống cây Đại Hồng Môn

A MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

I MỤC TIÊU

Xác định quy trình thích hợp để vi nhân giống cây Đại Hồng Môn (Anthurium

andreanum L.) bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào

II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Thực hiện nuôi cấy và nhân giống cây Đại Hồng Môn trong điều kiện in vitro, gồm các

- Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin lên sự tạo chồi từ mô sẹo

- Hiệu quả của auxin và cytokinin lên sự nhân chồi của cây Đại Hồng Môn

- Xác định nồng độ thích hợp của Putrescine lên sự tạo rễ của cây Đại Hồng Môn

- Hiệu quả của các loại giá thể lên sức sống của cây con Đại Hồng Môn

B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

II PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Vi nhân giống cây Đại Hồng Môn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong điều

kiện in vitro và thuần dưỡng cây con trong nhà lưới

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô và nhà lưới thực nghiệm của tổ Sinh

Lý Thực Vật, Bộ môn Sinh Lý Sinh Hoá, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 3-2011 đến tháng 3-2012

C CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

scherzerianum và Anthurium andreanum Hồng Môn có nguồn gốc từ Trung và Nam

Mỹ, cụ thể là từ Columbia, Peru, Brazil và Venezula (Suryanarayana, 2005) Hiện nay,

Anthurium andreanum đã được trồng ở nhiều nước như Mỹ, Hà Lan, Nhật, Đài Loan,

Philippin (Nguyễn Xuân Linh & Nguyễn Thị Kim Lý, 2005) Ở Việt Nam, Hồng Môn được gọi với nhiều tên gọi khác nhau: buồm đỏ, vĩ hoa, hoa chúc,…

1.2 Đặc điểm thực vật

Thân: Cây Đại Hồng Môn là cây thân cỏ sống nhiều năm, cao 50 – 70 cm Thân có thể đứng hay leo, có khả năng phân nhánh Thân có nhiều đốt, càng già thân càng cứng (Jiang Qing Hai & Trần Văn Mão, 2004)

Rễ: thuộc loại rễ chùm ít ăn sâu, phát triển theo chiều ngang Thường cây có nhiều rễ phụ mọc ra từ các đốt thân (Nguyễn Xuân Linh & Nguyễn Thị Kim Lý, 2005)

Lá: có hình bầu dục dài dạng quả tim, mặt trên lá màu xanh khá trơn láng, mặt dưới nhạt màu hơn Lá có cuống dài, mọc từ gốc cây và sắp xếp theo kiểu xoắn ốc (Nguyễn Xuân Linh & Nguyễn Thị Kim Lý, 2005)

Hoa: Cuống hoa mọc từ giữa cây Hoa được mang trên một cọng dài khoảng từ 40 cm đến 1 m tùy theo cây lớn hay nhỏ, trên đầu cọng hoa có một cọng hoa gần giống trái tiêu lốt (bông mo), dài khoảng 3 - 4 cm Ðặc biệt, hoa này có một bao gọi là mo, mo có dạng bầu dục, đường kính khoảng từ 8 - 15 cm có màu đỏ sặc sỡ, khi còn non nó cuộn tròn lại (Suryanarayana, 2005) Hoa tập trung dày đặc thành cụm Hoa tươi lâu 2-3 tháng (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cây Đại Hồng Môn (Anthurium andreanum L.)

Theo Suryanarayana (2005) cây Đại Hồng Môn có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới nên

nó có tập tính ưa nhiệt độ cao Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp nhất từ 25 - 320C Ở nhiệt

độ trên 320C cây vẫn sinh trưởng và phát triển được nhưng lá có thể bị cháy, màu sắc hoa và tuổi thọ hoa giảm

Mặc dù là cây nhiệt đới nhưng Đại Hồng Môn sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong môi trường nửa râm Vì vậy, nơi trồng Hồng Môn phải được che sáng (khoảng 60 – 70

% ánh sáng tự nhiên), tránh thừa ánh sáng Nhiều ánh sáng sẽ làm phai màu hoa và lá, lá

có thể bị cháy và làm chậm sự phát triển của cây Ẩm độ thích hợp để cây sinh trưởng

và phát triển khoảng 70 – 80% (Suryanarayana, 2005)

1 cm

4

2 Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (thin cell layer)

2.1 Định nghĩa

Hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu mô có kích thước nhỏ được thu thập

từ các cơ quan khác nhau của thực vật (thân, lá, rễ, cụm hoa), chồi hoa, các cơ quan của hoa, mô phân sinh, đỉnh sinh trưởng hoặc phôi…)

Tran Thanh Van (1973), đã sử dụng kỹ thuật cắt lát mỏng để cắt mẫu trong nuôi cấy

mô, kết quả cho thấy: mẫu cắt theo chiều dọc (lTCL - longitudinal TCL) mô lá non thu được một loại mô như là một lớp mô chứa tế bào biểu bì, cắt mẫu theo chiều ngang ( tTCL - transverse TCL) thu được một số ít tế bào từ các mô khác nhau như: biểu bì, vỏ, tầng phát sinh gỗ và lõi, các tế bào nhu mô Nguyên tắc sử dụng kích cỡ mẫu lTCL và tTCL như sau: các mẫu lTCL có kích cỡ 0,5x1x10 mm, trong khi các mẫu tTCL có thể 0,2-0,5 mm hay dày vài mm

Ngoài ra, còn có hệ thống TCL chỉ dày vài micromete (µTCL) phải sử dụng máy vi phẫu để cắt, nhưng ở kích cỡ này mẫu dễ dàng bị chết hoặc bị nhiễm khuẩn

2.2 Đặc điểm của hệ thống lớp mỏng tế bào

Đặc điểm chung của lTCL và tTCL là chúng rất mỏng, nghĩa là một mẫu cấy có càng ít

tế bào càng tốt Đặc điểm “mỏng” này là một trong những điều quan trọng vì các phân

tử maker của các quá trình biệt hóa có thể định vi in situ trong các tế bào mục tiêu hay

trong các tế bào cảm ứng Quá trình định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong muốn

Trong quá trình cắt mẫu làm mô thực vật bị tổn thương, nhiều enzyme hoặc polysaccharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Việc ứng dụng vài tế bào trong hệ thống TCL là do chúng có quan hệ với các

tế bào bị thương (nơi xảy ra tổng hợp cấu tạo vách tế bào mới và nơi phóng thích của oligosacharide) và chất dinh dưỡng cùng với các yếu tố khác ở bên trong môi trường để kiểm soát sự phát sinh hình thái Do đó, phương pháp này cho thấy mẫu cấy khá phụ thuộc vào môi trường Ngược lại, việc sử dụng các mẫu cấy lớn hơn (thân và các mảnh lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với môi trường, có thể do chúng chứa các hợp chất nội sinh cao, bao gồm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nên chúng không phụ thuộc nhiều vào môi trường

Sử dụng một tế bào hay tế bào trần, sau khi được tách ra chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào mới với tổ chức không gian và thời gian khác biệt với tổ chức trước khi tiến hành quá trình tách ra từ mô hay các cơ quan Mặt khác, trong quá trình phát triển của các tế bào đơn hay tế bào trần có sự hình thành một số lượng nhỏ

mô sẹo, phôi soma trộn lẫn tế bào Ngược lại, hệ thống TCL có sự hình thành những thành phần đó với số lượng lớn hơn Các mẫu được tạo ra trong hệ thống TCL có cùng chức năng, mang thong tin di truyền giống nhau, cảm ứng như nhau trong điều kiện nuôi cấy (ánh sáng, nhiệt độ, pH, môi trường nuôi cấy và các chất bổ sung như chất điều

hòa sinh trưởng, nước dừa, (Tran Thanh Van, 1973; Tran Thanh Van et al., 1974;

Tran Thanh Van, 1980; Tran Thanh Van, 1985; Tran Thanh Van, 2000) Bên cạnh đó, việc sử dụng hệ thống TCL rút ngắn được thời gian phát sinh hình thái (trung bình khoảng 14 ngày sau khi cấy) Tần suất cũng khá cao, gần 100% mẫu có phản ứng Mật

độ của các cơ quan được thiết lập trước, do đó tỉ số giữa số lượng tế bào cảm ứng và tế bào hiện diện trên mẫu TCL là rất cao

Tần suất cao kết hợp với thời gian phát sinh hình thái ngắn và sự trực tiếp trong quá trình hình thành cơ quan và phôi đã được khẳng định trên các loài như: sử dụng mẫu

tTCL của Garcinia mangostana có 3mm cho hiệu quả cao hơn 50 lần so với mẫu nữa lá) (Goh et al., 1990), Lilium longiflorum (Dương Tấn Nhựt et al., 2006), Begonia

tuberous (Dương Tấn Nhựt et al., 2005; Dương Tan Nhut et al., 2006; Mai Xuân Phán

et al., 2005),…

2 3 Ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào

Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) là đối tượng được nghiên cứu đầu tiên trong in vitro

thông qua kỹ thuật cắt lớp mỏng tế bào (Tran Thanh Van, 1973) Bốn chương trình phát sinh hình thái thành lập hoa trực tiếp, thành lập chồi trực tiếp, thành lập rễ trực tiếp và callus không phát sinh cơ quan được cảm ứng từ mẫu lTCL có kích cỡ 1mm x 10 mm thu từ cánh hoa, sau đó nuôi cấy trên môi trường rắn MS (Murasshige Skoog, 1962) có

bổ sung đường và các chất điều hòa sinh trưởng ở nồng độ khác nhau trong cùng điều kiện (Tran Thanh Van, 1980)

Cây hoa Lily (Lilium longiflorum) là một trong những loài hoa cắt cành đẹp, giá trị kinh

tế cao Tuy nhiên, phương pháp nhân giống Lily bằng vảy củ (Stimart & Ascher, 1978) cũng như hệ thống vi nhân giống truyền thống đã không mang lại hiệu quả cao, ngay cả

các loài khác trong giống Lilium (Priyadarshi & Sen, 1992) Điều này đã thúc đẩy mạnh

các nghiên cứu sâu hơn về hệ thống TCL trên cây hoa Lily nhằm khắc phục các nhược điểm trên

Cây hoa Cúc (Dendranthema grandiflora): Hệ thống TCL cũng được sử dụng trong các

nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiều thành phần bổ sung thêm vào môi trường như đường, chất điều hòa sinh trưởng, chất kháng sinh và các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tái sinh và phát sinh hình thái trên cây hoa Cúc Teixeira da Silva & Fukai (2003),

đã tái sinh rễ, chồi và phôi soma khi nuôi cấy các tTCL của đốt thân cây hoa Cúc trên các môi trường khác nhau

African violet (Saintpaulia ionantha) là loài hoa đẹp, có giá trị kinh tế cao Hệ thống

TCL áp dụng trên hoa African violet nhằm làm phát sinh trực tiếp các cơ quan như chồi sinh dưỡng, callus, rễ, phôi soma,…Ohki (1994), thay đổi tỷ lệ auxin/cytokinin (NAA /

BA hoặc TDZ) trên môi trường nuôi cấy thông qua hệ thống TCL, cho thấy mẫu tTCL thu nhận từ cuống lá đến gân lá có kích thước 0,3 – 0,5 mm hoặc các phiến lát mỏng có kích thước 3 x 3 mm cho từ 100 – 200 chồi/mẫu trong 4 tuần nuôi cấy Hơn 70000 cây được tái sinh từ lá trong khoảng 3- 4 tháng

3 Cơ sở lý luận của sự nhân giống vô tính

3.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Thực vật được nhân giống bằng cả hai hình thức hữu tính và vô tính Sinh sản vô tính (vegetative reproduction) như giâm cành, chiết cây…do không qua phân bào giảm nhiễm nên giữ nguyên đặc tính di truyền của cây mẹ, tương đối thông dụng ở nhiều loại cây và là quá trình chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố nội bào cũng như các yếu tố bên ngoài

Sự nhân giống vô tính (vegetative propagation) dựa trên lý thuyết về tính toàn thế (totipotency) của tế bào, do hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden & Schwann phát biểu năm 1838 với nội dung: tế bào có cấu trúc bao gồm các cơ quan thực hiện tất cả các chức năng sống và mang toàn bộ mật mã di truyền của cơ thể, đây là những đơn vị độc lập, có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể từ những thông tin di truyền mà nó đã mang

6

(Nguyễn Văn Uyển et al.,1993) Như vậy, mỗi tế bào bất kỳ đều có khả năng tiềm tàng

để phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh

3.2 Khả năng tạo mô sẹo của tế bào trong nuôi cấy mô

Các nghiên cứu về nhân vô tính thực vật bằng nuôi cấy mô (nuôi cấy in vitro) được xem

như khởi đầu từ năm 1902, khi Haberlandt tin rằng có thể tạo thành công các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng đã phân hóa bằng con đường nhân tạo và cấy thử các tế bào

tách từ lá một vài loại cây đơn tử diệp (Nguyễn Văn Uyển et al.,1993; Lê Trần Bình et

al., 1997; Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002) Thí nghiệm không thành

công vì ngày nay người ta biết các cây đơn tử diệp đa số rất khó nuôi cấy

Năm 1922, Robbins lặp lại thí nghiệm nuôi cấy trên đối tượng là mô phân sinh đầu rễ cây hòa thảo và đã đạt kết quả khả quan hơn: các rễ sinh trưởng mạnh trong một thời

gian (Nguyễn Văn Uyển et al.,1993) Sau đó, nhiều thành công liên tiếp được ghi nhận

và nhất là từ sau khi có sự phát hiện vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng cùng với

sự hỗ trợ của các thiết bị khoa học ngày càng tiến bộ đã giúp cho kỹ thuật nuôi cấy mô

có điều kiện gặt hái nhiều thành công Từ thập niên 1980 trở đi, người ta đã nuôi cấy thành công nhiều loại cây từ những bộ phận khác nhau như mô lấy từ thân, chồi, rễ, hoa,

lá, hạt phấn , và nuôi cấy tách rời các tế bào để sau đó tái sinh thành cây hoàn chỉnh Phạm Hoàng Hộ (1966), quá trình phân hóa này chính là sự biệt hóa (chuyên hóa) của tế bào, muốn tái sinh cây từ mô hay tế bào đã biệt hóa cần phải trải qua hai giai đoạn phản biệt hóa và tái biệt hóa, quan trọng nhất là phải tạo điều kiện cho mô đã phân hóa thực hiện sự phản biệt hóa để trở lại trạng thái chưa phân hóa là tế bào phôi, giống như trạng thái của tế bài trứng lúc mới thụ tinh, sau đó là sự hình thành các phôi vô tính Sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan là cơ sở để hình thành mô sẹo

Trong tự nhiên, sự phản biệt hóa thường không xảy ra ở các tế bào đã phân hóa như mạch gỗ, cương mô Tế bào nhu mô đã chuyên hóa nửa chừng cũng khó phản biệt hóa, chỉ có ở tượng tầng có thể xảy ra hiện tượng này, nhưng khi bị thương hay có tế bào bị chết, cây có phản ứng tự vệ tiết “hormon bị thương” - các enzim do glyoxysom tạo ra làm tăng sự phân giải chất dự trữ tạo nguyên liệu cho qúa trình hô hấp giúp tế bào tăng

sinh nhanh ( Hall et al., 1984) Những tế bào đã phản biệt hóa xong trong điều kiện nuôi

cấy thích hợp sẽ tái biệt hóa trở lại để phát triển thành cơ thể mới với trình tự giống như

sự phát triển từ tế bào phôi thành cây con

Theo Phạm Hoàng Hộ (1966), có thể tạo ra một thực vật mới bằng cách cấy tế bào của nhiều loại mô đã biệt hóa như biểu bì, nhu mô Như vậy, vẫn có thể tái sinh các tế bào

đã biệt hóa thành cây trong những điều kiện nhất định Nhiều kết quả nghiên cứu trong nuôi cấy mô cho thấy có thể kích thích mô sẹo phát triển và tạo phôi vô tính đã được

báo cáo trong các thí nghiệm của Nguyễn Thị Quỳnh et al (1993) khi nghiên cứu cấy

tái sinh cây cà phê từ mô lá, Tanaka & Hasegawa (1975) cấy tái sinh cây lan

Phalaenopsis từ các mảnh lá không chứa mầm Trên khoai lang, Nguyễn Tiến Thịnh et

al (1993) đã sử dụng đỉnh sinh trưởng và các mầm lá (meristem, leaf primordia) để tạo

phôi vô tính

Tuy mang cùng một lượng thông tin di truyền như nhau nhưng các loại mô trên cùng cây có thể cho phản ứng khác nhau trên cùng môi trương nuôi cấy, cụ thể là khả năng hình thành mô sẹo, sự tái sinh của các bộ phận được cấy thành chồi, rễ cũng rất khác nhau Do đó, việc chọn đúng loại mô để cấy là rất quan trọng, vì chọn được mô thích hợp sẽ dễ tác động cho sự phát triển của mô khi được đưa vào môi trường Theo

Nguyễn Văn Uyển et al (1993), các mô đang phát triển mạnh như mô phân sinh ngọn,

mô tượng tầng, mô phân sinh đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non, lá non, đế hoa,

mô phân sinh đốt, khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất điều hoà sinh trưởng thích hợp đều có khả năng tái tạo thành mô sẹo Như vậy , mô sẹo có thể hình thành từ nhiều bộ phận trong cây

Mô sẹo có khả năng tái sinh phôi rất biến động và tùy thuộc vào nhiều yếu tố: do đặc tính của loài và do ảnh hưởng môi trường bên ngoài, chủ yếu là do thành phần các

hormone thực vật Nguyễn Văn Uyển et al (1993), hình dáng và cấu trúc của mô sẹo là

những tế bào nhu mô không có tổ chức hay là một khối vô định hình cuả các tế bào nhu

mô có vách mỏng, được sắp xếp lỏng lẻo (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Còn xét về mặt chức năng thì mô sẹo là một tổ chức tế bào không phân hóa (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Mô sẹo khi hình thành sẽ gồm hai loại: (1) Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và không bào to, khó tái sinh (2) Loại cứng: có màu xanh nâu, cấu trúc chặt, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ có thể tái sinh phôi

4 Các phương pháp nhân giống cây Đại Hồng Môn

4.1 Phương pháp nhân giống bằng hạt

Suryanarayana (2005), nhân giống bằng hạt cần có thời gian dài và phải tiến hành thụ phấn nhân tạo mới cho hạt Quả được hình thành trên bông mo khoảng vài tháng sau khi thụ phấn và 8 – 9 tháng sau mới chín, trong mỗi quả mọng có chứa một hoặc hai hạt Hái hạt xong gieo ngay, sau khi gieo phải tưới nước và che ẩm, sau 8 – 10 ngày hạt nẩy mầm Cây con trồng khoảng 3- 4 năm mới ra hoa Mặt khác, số lượng cây con gieo từ hạt được tạo ra ít và thường có kiểu gen không đồng nhất nên trong sản xuất ít sử dụng

Và phương pháp này thường được sử dụng trong chọn tạo giống hoa (Nguyễn Xuân Linh & Nguyễn Thị Kim Lý, 2005)

4.2 Phương pháp nhân giống bằng tách cây hoặc giâm cành

Nguyễn Xuân Linh & Nguyễn Thị Kim Lý (2005), cây Đại Hồng Môn cũng có thể nhân giống bằng cách tách các nhánh hoặc cắt các đoạn cành, đoạn thân, nhân lên thành cây mới

Nhằm gia tăng số lượng cây con tạo ra trong nhân giống, chất điều hòa sinh trưởng cũng được sử dụng để kích thích sự hình thành cây con Suryanarayana (2005), nhân giống bằng tách cây đã sử dụng gibberellic acid ở nồng độ 100 đến 250 mg/l để kích thích tạo

rễ hình thành cây con Trong tự nhiên, cây Đại Hồng Môn sinh sản bằng cách nẩy chồi, mỗi cây tách ra phải đảm bảo 3- 4 chồi, nhưng 1 năm cây chỉ cho từ 1-3 chồi/cây Vì vậy, với các phương pháp nhân giống trên, cây con vẫn giữ được tính chất của cây mẹ

và dễ thực hiện, nhưng dễ lây lan bệnh virus và cho hệ số nhân thấp, thời gian nhân giống chậm Ngoài ra, việc tạo cây con trên cây mẹ làm cho cây mẹ sinh trưởng và phát triển không bình thường

4.3 Phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống)

Nhân giống Đại Hồng Môn bằng phương pháp in vitro đã được sử dụng phổ biến và rất hiệu quả (Suryanarayana, 2005) Nhân giống vô tính in vitro được sử dụng vào mục

đích nhân nhanh và nhân đúng kiểu cây của một kiểu gen đã được tuyển chọn

Theo Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), nhân giống vô tính in vitro có

nhiều ưu điểm:

- Tạo ra các cây con đồng nhất và giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ

8

- Hệ số nhân giống cao có thể nhân một số lượng cây con rất lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn

- Một giống cây quý có thể nhân nhanh để đưa vào sản xuất

- Có thể tạo ra các cây con sạch bệnh do có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy

Nhìn chung, nhân giống vô tính in vitro được ứng dụng thành công và dễ dàng trên các

cây hai lá mầm hơn các cây một lá mầm, các cây thân thảo dễ hơn cây thân gỗ (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002) Phương pháp phổ biến nhất là cấy chồi, cấy nốt đơn Các phương pháp tái sinh từ các bộ phân không chứa đỉnh sinh trưởng như lá, rễ,

cuống lá, thân non…cũng được áp dụng trên nhiều cây (Nguyễn Văn Uyển et al., 1993)

5 Phương pháp vi nhân giống

Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây của một kiểu gen được tuyển chọn bằng cách

sử dụng các bộ phận trên cây giống dùng làm mẫu cấy dựa trên cơ sở tính toàn năng của

tế bào và bằng kỹ thuật in vitro (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Nguyễn Đức Thành (2000),

vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây định nhân sau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy trên môi trường thích hợp Ngoài ra, vi nhân giống có thể được thực hiện thông qua tạo phôi hoặc tái sinh cây trực tiếp từ mô sẹo

5.1 Các giai đoạn của vi nhân giống

Theo Debegh & Zimmerman (1991), sự thành công của vi nhân giống chỉ đạt được khi hoàn thành 4 giai đoạn Việc không thể thực hiện một giai đoạn cũng có nghĩa là công việc vi nhân giống không thành công

Các giai đoạn thực hiện:

+ Giai đoạn 0: Sự chuẩn bị cây mẹ

Giai đoạn này góp phần rất lớn vào sự thành công của các giai đoạn sau Do đó, Cây mẹ cần phải sạch bệnh và đang ở trong giai đoạn tăng trưởng mạnh thì khi nhân giống sẽ đạt hiệu quả cao

+ Giai đoạn 1: Khử trùng, tạo chồi mô nuôi cấy

Mục đích mẫu cấy sống và không bị nhiễm Thông thường tỷ lệ mẫu sạch còn sống sau mỗi đợt khử trùng rất biến động, rất khó đạt mức cao Trong sản xuất để sớm có hàng loạt cây giống đưa ra cần rất nhiều vật liệu đưa vào khử trùng

+ Giai đoạn 2: Nhân chồi

Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất, chính

vì thế đây là giai đoạn then chốt của quá trình

Để tăng hệ số nhân, ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin, Gibberellin…) các chất bổ sung khác như: nước dừa, nước chiết nấm men, dịch thủy phân Casein… kết hợp với các yếu tố nhiệt

độ, ánh sáng, thích hợp Tùy thuộc đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh số lượng từ sự kích thích các trung tâm mô phân sinh như đỉnh sinh trưởng, chồi chính, chồi bên hoặc tái sinh phôi vô tính từ các bộ phân không chứa đỉnh sinh trưởng Phương pháp để gia tăng số chồi ở giai đoạn hai là cấy chồi đỉnh hoặc chồi bên (cấy đoạn thân) + Giai đoạn 3:Được chia làm 2 giai đoạn phụ:

- Giai đoạn 3a: kéo dài

- Giai đoạn 3b: kích thích rễ và tiền thuần dưỡng

Mục đích của giai đoạn này là giúp cho cây con gia tăng chiều cao và tạo rễ đầy đủ, sẵn sàng cho sự chuyển ra ngoài

Khi cây đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển sang môi trường tạo rễ Thường sau 2- 3 tuần, từ những chồi riêng biệt sẽ hình thành rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Giai đoạn này sử dụng chủ yếu các Auxin là nhóm hormone thực vật quan trọng

có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA

được sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi in vitro Các auxin thường được sử dụng với

hàm lượng khoáng thấp (như môi trường MS/2) Ngoài việc kích thích rễ, giai đoạn này cũng thuận lợi cho sự thuần dưỡng

+ Giai đoạn 4: Thuần dưỡng

Mục đích của giai đoạn này là làm giảm tối thiểu sự chết cây con, khi chuyển từ in vitro sang nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng Chất lượng cuối cùng của in vitro tuỳ thuộc

một phần vào việc thuần dưỡng Để tăng khả năng sống của cây con ngoài nhà lưới thì cây con nhất thiết phải trãi qua thời gian tập quen dần với điều kiện gần giống như bên ngoài như tăng dần ánh sáng, nhiệt độ Sự thất bại trong giai đoạn này là do:

• Cây con in vitro sinh trưởng trong điều kiện ẩm độ cao, ánh sáng yếu, do

đó khi đem ra bên ngoài môi trường bị thay đổi đột ngột cây con chết rất nhanh

• Cây cấy mô nuôi trong điều kiện môi trường được cung cấp đầy đủ chất khoáng và đường để hình thành sự dị dưỡng Do đó, khi ở điều kiện bên ngoài ống nghiệm cây phải chuyển từ dị dưỡng sang tự dưỡng, làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và phát triển của cây

Cây con tạo được bằng phương pháp cấy mô khi đã hoàn chỉnh với đầy đủ rễ và thân lá

sẽ được chuyển ra vườn ươm, trồng trực tiếp ra đất cho cây tiếp tục sinh trưởng trong

điều kiện trồng trọt bình thường Đây là giai đoạn có sự thay đổi rất lớn về điều kiện

sống, cây hay bị stress do chưa quen với tiểu khí hậu như ẩm độ, nhiệt độ và dinh dưỡng trong vườn uơm Các ảnh hưởng cụ thể:

+ Nhiệt độ và ẩm độ

Do chai cấy được đậy nắp kín nên độ ẩm không khí quanh cây rất cao, cây không bị mất nước Về nhiệt độ, trong phòng sáng thường có gắn máy lạnh nên cây mô luôn sống trong điều kiện nhiệt độ mát, thích hợp cho sinh trưởng Ở điều kiện vườn ươm, nhiệt

độ cao và bộ rễ lúc lấy ra khỏi chai cấy bị tổn thương chưa thể thực hiện chức năng hút nước để điều tiết nhiệt sẽ khiến cây bị mất nước, cây con sẽ có tỉ lệ chết rất cao Vì vậy, cần có giai đoạn thuần dưỡng cho cây con cấy mô thích nghi dần với điều kiện môi trường mới

Các biện pháp khắc phục quá trình thuần dưỡng có thể bắt đầu ở giai đoạn cuối của các cây cấy mô, khi chúng còn trong bình nuôi cấy và giai đoạn sau khi chuyển cây con ra

môi trường tự nhiên Phải từng bước giúp cây con in vitro thích nghi dần với môi trường

bên ngoài nhà lưới bằng cách tạo ra môi trường gần giống với môi trường trong điều kiện cấy mô (Capellades, 1989) Đối với bình nuôi cấy: nới lỏng nắp bình để tăng sự trao đổi khí với môi trường xung quan, giúp cây quen với sự thiếu hụt ẩm độ Tuy nhiên, theo cách này mẫu cấy dễ bị nhiễm Có thể giảm ẩm độ của khoảng trống bên trên nắp bình bằng cách làm lạnh đáy bình (Maene & Debergh, 1987) Trong môi trường tự nhiên hoặc nhà lưới, khi chuyển sang môi trường tự nhiên cây dễ bị mất nước

do ẩm độ thấp Phương pháp để khắc phục tình trạng này được nhiều tác giả đưa ra như

10

phun sương tạo ẩm độ, trùm cây lại bằng plastic và đặt trong điều kiện ánh sáng thấp (Scoot, 1987) Trong các khuyến cáo, người ta đề nghị không nên sử dụng phương pháp tạo ẩm độ bằng cách phun sương, vì một mặt độ ẩm quá cao dễ gây úng, mặt khác cây con rất dễ bị mất khoáng do bị rửa trôi (McCown, 1986; Miller, 1983) Phương pháp được nhiều tác giả đề nghị là trùm kín plastic trong để tạo ẩm độ cao và đặt trong điều kiện ánh sáng thấp Ngoài ra, che nilon và tưới phun sương 15 – 30 phút một lần/ngày

giúp cho cây đạt tỷ lệ sống cao (Vũ Ngọc Phương et al., 2001)

Về mặt tự dưỡng, trong môi trường nuôi cấy mô, cây được cung cấp đường thay vì phải

tự quang hợp, nhưng ra vườn ươm cây phải tự quang hợp để có hydrate carbon, trong thời gian đầu khi bộ rễ chưa hồi phục sẽ không thể hút dinh dưỡng từ đất để nuôi cây, rễ cần có thời gian hoàn thiện cấu trúc Các vườn ươm cây cấy mô thường dùng xơ dừa vụn và tro trấu (tỷ lệ 1:1) để ươm cây cấy mô trong thời gian đầu Phân bón cho cây con trong giai đoạn đầu chưa quan trọng lắm, có thể phun phân loãng qua lá trong lúc bổ sung ẩm độ mặt lá cho cây con (Preece & Sutter, 1991)

+ Bệnh và côn trùng

Cây cấy mô còn non rất mềm, môi trường thuần dưỡng có ẩm độ cao là điều kiện tốt để cho nấm bệnh phát triển, ngoài ra cũng là thức ăn ưa thích của côn trùng Vì vậy, vườn ươm và môi trường ra cây cấy mô được giữ vệ sinh sạch (Preece & Sutter, 1991) Một

số trường hợp, cây con trước khi cấy vào đất cần được ngâm vào thuốc diệt mầm bệnh,

có thể sử dụng thêm thuốc trừ sâu nếu cần (Miller, 1983; Pocock, 1983) Ngoài ra, có thể dùng plastic để che phủ (Preece & Sutter, 1991)

5.2 Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng thực vât

Các yếu tố bên ngoài bao gồm môi trường nuôi cây, điều kiện ngoại cảnh như ánh sáng, nhiệt độ, lượng oxy trao đổi, trong đó tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) trong môi trường là rất quan trọng đối với mô cấy, có thể quyết định kết qủa trong từng giai đoạn

Chất điều hòa sinh trưởng bao gồm chất kích thích sinh trưởng (Auxin, Gibberillin, Cytokinin) và chất ức chế sinh trưởng (ABA, Ethylen); chất điều hòa sinh trưởng là yếu

tố quan trọng nhất trong sự phát sinh hình thái và tái sinh cây nguyên vẹn từ tế bào và

mô thực vật tách rời trong nuôi cấy in vitro Auxin và cytokinin được bổ sung vào môi

trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái và tỉ lệ hormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay tạo rễ không giống nhau Tùy theo giống, loài thực vật mà nhu cầu

về dạng và nồng độ của auxin và cytokinin khác nhau trong sự phát sinh hình thái (Vũ Văn Vụ, 1999)

* Auxin

Auxin rất thông dụng trong thục vật, có vai trò kích thích sự tăng trưởng của tế bào, cụ thể là nới lỏng vách tế bào thông qua sự hoạt hóa các enzim tổng hợp vách , khởi động cho sự giãn nở tế bào Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử cần

cho qúa trình tăng trưởng như protein, cenlulo, pectin và ngăn cản không cho chúng bị thủy phân (Grodzinxki & Grodzinxki, 1981) Auxin kết hợp chặt chẽ các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo Để tạo

mô sẹo, 2,4 – D thường sử dụng riêng rẽ hoặc phối hợp với cytokinin và nó được thay thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái (Nguyễn Đức Lượng & Lê

Thị Thủy Tiên, 2002) Pence et al (1979) quan sát trên môi trường nuôi cấy phôi non

cacao có chứa NAA ở nồng độ 8 - 48 mg/l thêm 10% nước dừa thấy có sự phát sinh cơ quan phôi, nhưng nếu dùng 8 mg/l 2,4- D kết hợp với 80 mg/l IAA thì kết quả còn tăng nhanh hơn, nhất là trên môi trường lỏng Ở giai đoạn tái biệt hóa, lượng auxin cần được

giảm xuống dần cho đến bỏ hẳn khi cây đã hoàn toàn định hình (Pence et al., 1979; Nguyễn Văn Uyển et al., 1993)

* Cytokinin

Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) có khả năng kích thích sự phân chia tế bào ở thực vật Chúng đóng vai trò chính trong sự thành lập chồi và cơ quan nuôi cấy mô (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Các cytokinin thường được sử dụng trong cấy mô như: zeatine (Z) trích từ hạt bắp nảy mầm, 2-isopentenyladenine (iP), Kinetin, benzyladenine (BA), Thidiazuron (TDZ),…(Pierik, 1987)

Theo Wililam (1996) cytokinin ảnh hưởng lên sự phát sinh chồi, nhân chồi và trẻ hoá

mô cấy cũng như kích thích sự phân chia tế bào và định hướng phân hóa tế bào Việc bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của vài chồi nhỏ từ các mẫu cấy sau khoảng 4 – 6 tuần nuôi cấy, nếu nồng độ cytokinin quá cao

sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhưng các chồi này không thể kéo dài hoặc lá

bị biến dạng hay chồi có hiện tượng mọng nước (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002) Vì vậy, cytokinin thường không được sử dụng trong môi trường kích thích

sự ra rễ của chồi để tạo cây con

* Tương tác giữa auxin và cytokinin

Theo các nghiên cứu của nhiều tác giả đã cho thấy tỉ lệ auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành lập chồi và rễ Một tỉ lệ cytokinin cao và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi Trong khi tỉ lệ cytokinin thấp và auxin cao thích hợp cho

sự tạo rễ, mức độ trung gian giữa hai tỉ lệ thích hợp cho sự tạo mô sẹo (callus) (Debergh, 2003) Hiện tương này được xác nhận trên nhiều cây khác và là cơ sở cho lý thuyết điều khiển sinh trưởng, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy (Nguyễn

Văn Uyển et al., 1993)

* Polyamines

De Kler (2001), Polyamine là các hợp chất căn bản tìm thấy với hàm lượng cao trong thực vật và được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy với nồng độ cao (10-1000 µM) Những polyamine phổ biến nhất là putrescine, spermidine, spermine,…Chúng có thể giúp tăng cường tái sinh rễ, chồi và phôi, trì hoãn hoặc ngăn cản lão hóa và điều hòa

sự ra hoa Chúng hoạt động bằng việc ổn định màng tế bào, nucleic acid hoặc protein hoặc có thể gắn vào các protein điều hòa

- Putrescine:

Putrescine là polyamine được tổng hợp từ arginine Putrescine qua quá trình trao đổi chất có thể hình thành nên spermidine, và từ spermidine tạo thành spermine Sự kết hợp giữa glycerol với polyamine putrescine, spermidine và spermine cho một lượng lớn sinh

ng hợp polyMDC), có

vitro của G

Psản xuất tC) hoặc trực

e là tiền chấyamine, đặckhả năng ả

đường tổng

trong môi

lượng

n đảm bảo mCần phải c

o, kali, can Mô cấy c

a++, Mg++

về phươngkhối của th

đa lượng tro

Grateloupia

Putrescinetrực tiếp từ

c tiếp từ Arg

ất trong sinh

c biệt qua hảnh hưởng

g hợp polya trường có

mọi thành phcung cấp ch

xi, magiê,

ần được đặtKhoáng đa

g diện sinh hực vật (Jacong môi trườ

a doryphor

ừ Ornithin bginine bởi A

h tổng hợp hoạt tính S-của ảnh hư

amine ở thự ảnh hưởng

hần dinh dư

ho cây các sắt và vi lư

t trong môi lượng rất c

lý dinh dưỡcob, 1993)

ờng nuôi cấy

(Garciajime

bới sự hoạArginine decethylen; vì

- adenosyl ưởng đến sự

ực vật

g lên mô cấ

ưỡng tương nguyên tố ượng như mtrường có scần cho câyỡng và cả d

ự tổng hợp

ấy

tự như môikhoáng đamangan, bo,

g

i

a

c

Khoáng vi lượng tham gia vào enzim trong những hoạt động thuộc quá trình chuyển hóa cơ bản và có vai trò không thể thay thế ở nhiều trường hợp, nhưng do thành phần khoáng vi lượng chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ nên một số chất có thể đã có trong các thành phần tạp của chất khác Vi lượng sắt sử dụng cho nuôi cấy mô dưới dạng chelate (Fe-EDTA) khoảng 20 - 40 mg/l Chelate giữ cho sắt phóng thích từ từ vào môi trường

trong thời gian mô tăng trưởng (Nguyễn Văn Uyển et al.,1993)

Độ pH trong môi trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Murashige & Skoog (1962) nhận thấy pH khoảng 5,7 – 5,8 thích hợp cho sự duy trì hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS Cho đến nay hầu như các nghiên cứu về nuôi cấy mô dùng thành phần khoáng do Murashige & Skoog (1962) đề nghị, vì công thức môi trường đảm bảo được cân bằng ion, và là môi trường giàu, đáp ứng rộng với nhiều loại mô cấy của nhiều loài

* Vitamin và các thành phần hữu cơ

Các vitamin có tác dụng kích thích sinh trưởng của mô cấy, nhất là khi sử dụng kết hợp

với kích thích tố (Nguyễn Văn Uyển et al., 1993) Theo Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị

Thuỷ Tiên (2002), vitamin cần cho mô cấy bao gồm một số vitamin nhóm B, với lượng

từ 1 đến 10 mg/l Myo - Inositol có tác dụng cải thiện sự sinh trưởng của mô cấy và được dùng trong khoảng 50 - 5000 mg/l, mặc dù không phải là yếu tố quyết định Nguồn cacbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia tăng sinh khối Nguồn cacbon này không do quá trình quang hợp cung cấp mà nó được bổ sung vào môi trường dưới dạng đường Hai dạng đường thường gặp nhất trong

nuôi cấy in vitro là glucose và saccharose, nhưng saccharose được sử dụng phổ biến

hơn (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nồng độ đường saccharose dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là 20 - 30 g/l (Bùi Bá Bổng, 1995)

Trong nuôi cấy mô, nước dừa được sử dụng nhiều với thể tích từ 10 - 30 hoặc 40 % thể tích môi trường Trong nước dừa có các loại muối khoáng, các axit amin, các chât sinh trưởng như cytokinin và Myo-Inositol có lợi cho sự phát triển cây có nguồn gốc từ

protocorm (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

* Agar

Agar là một loại polysaccarite của tảo biển Nồng độ sử dụng thường là 6-8 g/l, có tác dụng đông cứng môi trường, điều này đạt được nhờ các polysaccarite kết hợp với các phân tử H2O tạo thành polime, ở 800C thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái lỏng còn ở 400C thì trở về trạng thái rắn Agar chủ yếu sử dụng làm giá thể cho mô và tế bào thực vật phát triển

* Than hoạt tính

Theo Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên (2002), than hoạt tính có tác dụng khử độc, hút các hợp chất cản, hút các hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc các chất làm đen môi trường Khi bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ kích thích tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây trường xuân nhưng lại có tác dụng cản đối với thuốc lá, đậu nành, trà mi Khả năng kích thích sự tăng trưởng của tế bào mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy Một số trường hợp, than hoạt tính thúc đẩy phát sinh phôi vô tính, kích thích sinh trưởng và phát sinh cơ quan ở các loài thân gỗ Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,5 - 3 g/l

14

* Ảnh hưởng các điều kiện vật lý của môi trường lên mô cấy

Các điều kiện vật lý của môi trường ảnh hưởng lên mô cấy chủ yếu là: ánh sáng, nhiệt

độ, cấu trúc (lỏng, đặc…) và độ thông thoáng

Khác với cây sống trong tự nhiên, mô cấy được cung cấp năng lượng phần lớn từ đường, nhưng ánh sáng lại là cần thiết cho sự phát sinh hình thái như sự công bố của nhiều nghiên cứu Toyoki Kozai (1995) thấy rằng chất luợng ánh sáng cũng như độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến khả năng tăng trưởng của cây bao gồm sự tăng trưởng, hình thành rễ, lá , trong nuôi cấy tăng sinh (proliferante culture), kết quả tốt nhất là dùng môi trường lỏng để trên máy lắc tạo đầy đủ độ thoáng trong môi trường ngoài mục đích phá ảnh hưởng phân cực của nước

Mô cấy trong điều kiện in vitro thường ít có sự trao đổi khí với bên ngoài do bình cấy

được đậy kín để đảm bảo vô trùng Độ ẩm cao và thiếu trao đổi khí có thể làm cho mô phát triển theo chiều hướng mọng nước (hiện tượng thuỷ tinh thể- hyperhydricity) Các

mô hoặc cây mọng nước đa số phát triển hình thái rất kém, không sử dụng cho việc nhân giống tiếp tục, khi chuyển ra môi trường bên ngoài cây cũng không thể tự dưỡng

và sớm tàn lụi

5.4 Hiện tượng hoá nâu ở mẫu cấy

Mẫu cấy có thể gặp hiện tượng hoại tử, hóa nâu hay chuyển sang màu đen khi đem cấy

do các phenol như cinnamic, coumarin, salicilic aid…tồn tại trong cây dưới dạng glycozit Theo Mai Trần Ngọc Tiếng (1994) thì phenol hiện diện trong mẫu cấy ít hay nhiều phụ thuộc nhiều yếu tố như giống, loài, vị trí mô, tình trạng sinh lý, sinh hóa của mô,… Phenol ức chế sự phát triển của mô theo cơ chế liên kết với protein và ức chế hoạt động của enzim Để khắc phục hiện tượng này người ta có thể sử dụng các cách thức sau:

- Loại bỏ các hợp chất phenol do mẫu cấy tiết ra môi trường nuôi cấy

- Bổ sung các chất khử phenol vào môi trường nuôi cấy

- Ngăn chặn hoạt động của enzim phenolase

- Giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng cách lắc mẫu trong môi trường lỏng

có thành phần tương tự như môi trường đặc

- Giảm diện tích vết cắt trên mẫu

Trong đó phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất là dùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra Tuy nhiên than hoạt tính có thể hấp thu một phần chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy Một chất khác cũng được sử dụng là polyvinyl pyrolidone (PVP) có thể hấp thụ phenol và làm giảm hiện tượng hoá nâu (Johansson, 1983) Bên cạnh đó người ta còn dùng acid ascorbic, acid citric,… để ngăn cản sự hoá nâu này (Pierik,1987)

5.5 Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Đại Hồng Môn

Pierik et al (1974) đầu tiên phát triển một phương pháp vi nhân giống Anthurium từ mô

sẹo Mô sẹo được tạo ra từ phôi hạt và được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1-5 mg/l BAP + 1 mg/l 2,4 - D Sau đó Pierik & Steegmans (1976) sử dụng lá cây trưởng thành để làm vật liệu vi nhân giống

Kunisaki (1980) đã sử dụng chồi Anthurium adreanamum để làm vật liệu nuôi cấy ban

đầu trong môi trường MS có bổ sung 15% thể tích nước dừa để tạo cây trong ống

nghiệm Thí nghiệm này đã cho kết quả thấp do tỷ lệ mẫu không sạch cao Kunisaki còn

thử nghiệm nuôi cấy cây Anthurium trong điều kiện thiếu sáng

Geier & Reuther (1981) và Geier (1982) sử dụng chồi, cuống lá, bông mo, lát cắt mỏng

của cuống lá và lá non của Anthurium tạo mô sẹo Mô sẹo khi tạo ra có thể tái sinh chồi

bất định Mặc dù chồi được tạo ra từ chồi bất định nhưng sự thay đổi về di truyền trong

vi nhân giống không cao Cây con có sự đồng dạng nằm trong giới hạn cho phép

Geier (1987) đã tiến hành thí nghiệm tạo chồi từ chồi nuôi cấy là chồi nách và chồi bất định Chồi được cấy vào môi trường MS lỏng bổ sung thiamine HCl 0,4mg/l, acid nicotinic và pyridoxine HCl mỗi loại 0,5mg/l, nước dừa 15% và sucrose 2% Môi trường nhân chồi được sử dụng là môi trường thạch thành phần tương tự có bổ sung thêm 0,2 mg/l BAP nhưng không có nước dừa (George, 1996) Tuy nhiên, việc nhân này gặp bất lợi là lượng chồi tạo ra không nhiều

Ở Việt Nam, việc nhân giống in vitro cây Hồng Môn cũng đã được thực hiện như nghiên cứu tạo phôi vô tính (Đoàn Duy Thanh et al., 2003), tái sinh cây Anthurium sp thông qua tạo callus từ lá (Dương Tấn Nhựt et al., 2004; Nguyễn Thị Lý Anh et al., 2005) Dương Tấn Nhựt et al (2004), cho rằng phương pháp nhân giống này đã tạo ra

một lượng lớn cây giống đồng nhất trong một thời gian ngắn với giá thành thấp chỉ bằng khoảng 1/10 giá thành nhập nội

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Phương tiện nghiên cứu

1.1 Vật liệu thí nghiệm

Đối tượng nghiên cứu là cây con Đại Hồng Môn (Anthurium andreanum L) từ các thí

nghiệm trước và được duy trì tại Phòng Thí nghiệm Nuôi cấy mô Bộ Môn Sinh lý Sinh hoá, Khoa Nông nghiệp Và Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Vật liệu thí nghiệm là các bộ phận (lá, cuống lá và đoạn thân) của cây Đại Hồng Môn

(Anthurium andreanum L) in vitro

1.2 Điều kiện thí nghiệm

Phòng nuôi cấy mô có trang bị máy điều hoà nhiệt độ 24 ± 20C, đèn neon (thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày), tủ cấy vô trùng, nồi khử trùng nhiệt ướt, dụng cụ và trang thiết

bị khác dùng trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

Hoá chất: Hoá chất được sử dụng trong môi trường nuôi cấy bao gồm: khoáng đa lượng

- vi lượng (MS) (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung vitamin như Thiamin, pyridoxin, nicotinic acid, myo-inositol; đường sucrose; agar; nước dừa; các chất điều hoà sinh trưởng như: Thidiazuron (TDZ), Benzyl adenin (BA), 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4 - D), Naphthalene acetic acid (NAA), Putrescine

Vườn ươm: Cây mô được ươm trong điều kiện không quá 320C, ẩm độ trung bình 80%, lưới đen che sáng, mụn dừa, tro trấu, trấu sống và các vật dụng cần thiết khác trong vườn ươm

1.3 Địa điểm và thời gian thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô và nhà lưới thực nghiệm của tổ Sinh

Lý Thực Vật, Bộ môn Sinh Lý Sinh Hoá, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện thí nghiệm từ tháng 3/2011 đến tháng 3/2012

16

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) gồm khoáng

đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin theo MS, Thành phần đa vi lượng của môi trường

này như sau:

Bảng 1.1: Thành phần môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)

0,1 2,0

Môi trường cơ bản MS có bổ sung thêm các chất như: đường sucrose (30 g/l), agar (7

g/l), nước dừa tươi (150 ml/l), Myo - Inositol (0,1 g/l) Tuỳ theo từng thí nghiệm mà bổ

sung chất điều hoà sinh trưởng (BA, TDZ, NAA, 2,4-D, …) ở các nồng độ khác nhau Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở pH = 5,7 – 5,8

Các keo thuỷ tinh chứa 30 ml môi trường và được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt

độ 1210C, áp suất 1 atm trong thời gian 20 phút

2.2 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm các thí nghiệm sau:

2.2.1 Sự phát sinh hình thái ở các bộ phận khác nhau của cây Đại Hồng Môn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng

™ Thí nghiệm 1: Hiệu quả của sự kết hợp nồng độ giữa 2,4 – D và BA lên sự phát sinh hình thái từ kỹ thuật cắt lớp mỏng của lá non

Mục đích: Xác định hiệu quả của các chất điều hoà sinh trưởng 2,4 - D kết hợp với BA

ở các nồng độ khác nhau trên các lát cắt mỏng của lá non cây Đại Hồng Môn in vitro

Vật liệu: là mảnh lá cây Đại Hồng Môn in vitro từ cặp lá thứ 2 tính từ ngọn cây xuống

Dùng dao phẩu thuật cắt lớp mỏng theo chiều ngang (transverse thin cell layer - tTCL) kích thước 3mm x 3mm, sau đó cấy mẫu vào môi trường nền có bổ sung 2,4 - D, BA ở các nồng độ khác nhau Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 lần lập lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 2 mẫu Các nghiệm thức bao gồm:

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu sống, đặc điểm mẫu cấy, số mẫu tạo callus

Tỉ lệ tạo callus (%) = (Số mẫu tạo callus/Số mẫu sống) x 100

Tỉ lệ mẫu sống (%) = (Số mẫu sống/Tổng số mẫu cấy) x 100

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 4, 6, 8 tuần sau khi cấy

™ Thí nghiệm 2: Hiệu quả của sự kết hợp nồng độ giữa 2,4 – D và TDZ lên

sự phát sinh hình thái từ kỹ thuật cắt lớp mỏng của cuống lá

Mục đích: Xác định hiệu quả của các chất điều hoà sinh trưởng 2,4- D kết hợp với TDZ

ở các nồng độ khác nhau trên các lát cắt mỏng của cuống lá cây Đại Hồng Môn in vitro

Vật liệu: cuống lá của cây Đại Hồng Môn in vitro

18

Các mẫu cuống lá được cắt thành lát mỏng có kích thước đồng đều nhau được cắt theo chiều ngang dày 1,0 – 1,5 mm tạo lớp mỏng tTCL (transverse thin cell layer), sau đó cấy mẫu vào môi trường nền có bổ sung 2,4 - D, TDZ ở các nồng độ khác nhau

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 lần lập lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 2 mẫu Các nghiệm thức bao gồm:

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu sống, đặc điểm mẫu cấy, số mẫu tạo callus

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 4, 6, 8 tuần sau khi cấy

™ Thí nghiệm 3: Hiệu quả của sự kết hợp nồng độ giữa 2,4 – D và cytokinin (BA, TDZ) lên sự phát sinh hình thái từ kỹ thuật cắt lớp mỏng của phần thân Mục đích: Xác định hiệu quả của các chất điều hoà sinh trưởng 2,4- D kết hợp với BA,

TDZ ở các nồng độ khác nhau trên các lát cắt mỏng của đoạn thân cây Đại Hồng Môn

in vitro

Vật liệu: Đoạn thân của cây Đại Hồng Môn in vitro

Các mẫu đoạn thân được cắt thành lát mỏng có kích thước đồng đều nhau được cắt theo chiều ngang dày 1,0 – 1,5 mm tạo lớp mỏng tTCL (transverse thin cell layer), sau đó cấy mẫu vào môi trường nền có bổ sung 2,4 - D, TDZ ở các nồng độ khác nhau

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 lần lập lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 2 mẫu Các nghiệm thức bao gồm:

9/ MS + 0,5 mg/l 2,4- D + 1,0 mg/l TDZ

10/ MS + 0,5 mg/l 2,4- D + 1,5 mg/l TDZ

11/ MS + 0,5 mg/l 2,4- D + 2,0 mg/l TDZ

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu sống, đặc điểm mẫu cấy, số mẫu tạo callus, số mẫu tạo

chồi, số chồi, chiều cao chồi

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 4, 6, 8 tuần sau khi cấy

2.2.2 Sự phát sinh cụm tiền chồi của cây Đại Hồng Môn

™ Thí nghiệm 4: Hiệu quả của sự kết hợp 2,4- D, BA và TDZ lên sự tạo cụm tiền chồi

Mục đích: Xác định nồng độ thích hợp của chất điều hoà sinh trưởng 2,4- D, BA và

TDZ lên quá trình tạo cụm tiền chồi

Vật liệu: Tất cả các mô sẹo được tạo ra từ lớp mỏng của lá, cuống lá và thân của cây

Đại Hồng Môn in vitro

Các mô sẹo có màu vàng tươi được chuyển vào môi trường nền có bổ sung 2,4 – D kết hợp BA hoặc TDZ Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lập lại 4 lần, mỗi lần lập lại là 4 mẫu callus/keo (đường kính callus khoảng 2-3 mm) Các nghiệm thức bao gồm:

1/ MS + 0,5 mg/l 2,4- D

2/ MS + 0,5 mg/l 2,4- D + 0,5 mg/l BA

3/ MS + 0,5 mg/l 2,4- D + 1,0 mg/l BA

4/ MS + 0,5 mg/l 2,4- D + 0,5 mg/l TDZ

Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính trung bình của cụm tiền chồi (mm), % tạo cụm tiền

chồi, đặc điểm của cụm tiền chồi

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 4 tuần sau khi cấy

™ Thí nghiệm 5: Hiệu quả của nồng độ 2,4- D và TDZ lên sự nhân nhanh

cụm tiền chồi

Mục đích: Xác định nồng độ thích hợp của chất điều hoà sinh trưởng 2,4- D và TDZ

lên quá trình nhân cụm tiền chồi

Vật liệu: Các cụm tiền chồi thu được từ thí nghiệm 4

Cụm tiền chồi được tách thành khối nhỏ kích thước khoảng 2 mm x 2 mm cấy vào môi trường nền có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng là 2,4- D và TDZ

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lập lại 4 lần, mỗi lần lập lại là 4 mẫu callus/keo Các nghiệm thức như sau:

1/ MS

2/ MS + 0,5 mg/l 2,4 D

3/ MS + 0,5 mg/l 2,4 – D + 0,5 mg/l TDZ

Khảo sát hình thái và cấu trúc giải phẩu của cụm tiền chồi và chồi

Khảo sát cấu trúc giải phẩu của mẫu sống theo phương pháp của Hà Thị Lệ Ánh (2006) Mục đích của kỹ thuật này là nhận diện các loại mô thông qua sự ăn màu của vách tế bào với phẩm nhuộm

Thực hiện:

- Cắt dọc mẫu cụm tiền chồi thành từng lát mỏng, rồi ngâm mẫu trong nước Javel đến khi mẫu mất màu hoàn toàn (màu trắng) trong thời gian khoảng 20 phút

- Rửa 3 lần với nước cất

- Ngâm mẫu trong acid acetic 5% trong 3 phút

- Rửa 3 lần với nước cất

- Nhuộm mẫu với phẩm nhuộm son phèn – lục iod trong thời gian 15 phút

- Rửa nước cất đến khi sạch thuốc nhuộm dư thừa, ngâm trong nước, sau đó tiến hành quan sát mẫu Mẫu được quan sát dưới kính lúp và kính hiển vi quang học vật kính X10

2.2.4 Nhân chồi

™ Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin lên sự phát sinh chồi từ mô sẹo đặc của lát mỏng thân

Mục đích: Xác định nồng độ thích hợp của chất điều hoà sinh trưởng NAA và TDZ lên

sự phát sinh chồi từ mô sẹo đặc của thân

Vật liệu: các khối mô sẹo đặc thu từ thí nghiệm 3

Cấy cụm mô sẹo đặc có kích thước khoảng 0,5 – 0,6 cm vào môi trường nền có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (NAA và TDZ) ở các nồng độ khác nhau

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lập lại 4 lần, mỗi lần lập lại là 2 mẫu/keo Các nghiệm thức như sau:

1/ MS + 0,5 mg/l NAA

2/ MS + 0,5 mg/l NAA + 0,5mg/l TDZ

3/ MS + 0,5 mg/l NAA + 1,0 mg/l TDZ

4/ MS + 0,5 mg/l NAA + 1,5 mg/l TDZ

Chỉ tiêu theo dõi: số chồi/cụm

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 4 tuần sau khi cấy

™ Thí nghiệm 7: Hiệu quả của auxin và cytokinin lên sự nhân chồi của cây Đại Hồng Môn

Mục đích: Xác định nồng độ thích hợp của chất điều hoà sinh trưởng 2,4 – D kết hợp

với BA hoặc TDZ lên sự nhân nhanh chồi

Vật liệu: các cụm chồi cây Đại Hồng Môn thu được từ thí nghiệm 6

Các cụm chồi sau khi được hình thành sẽ được tách ra thành từng chồi và cấy vào môi trường nền có bổ sung 0,5 mg/l 2,4- D kết hợp với các loại cytokinin khác nhau như Benzyl adenine (BA), Thidiazuron (TDZ)

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 5 lần, mỗi lần lặp lại là 5 keo tương đương với 2 mẫu cấy/keo Các nghiệm thức bao gồm:

Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi/cụm, chiều cao chồi, số lá, hình thái mô nuôi cấy

Tính hệ số nhân chồi theo công thức của Geogre (1993):

K = (N/N0)T/t : hệ số nhân chồi/ năm

Trong đó:

N: Số chồi thu được

N0 : Số chồi ban đầu T: Thời gian cần để thực hiện

t : thời gian giữa hai lần cấy chuyền

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 4 và 8 tuần sau khi cấy

2.2.5 Tạo rễ in vitro

™ Thí nghiệm 8: Hiệu quả của Putrescine lên sự tạo rễ của cây Đại Hồng Môn Mục đích:Xác định nồng độ thích hợp của Putrescine lên sự tạo rễ của cây Đại Hồng Môn

Vật liệu: cây Đại Hồng Môn có 2-3 lá thu được từ thí nghiệm 7

Các cụm chồi sau khi được tạo thành sẽ được tách rời từng chồi và chuyển vào môi trường tạo rễ để tạo ra cây hoàn chỉnh Môi trường sử dụng để nuôi cấy là môi trường nền có bổ sung 1 g/l than hoạt tính và Putrescine ở các nồng độ khác nhau

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 8 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lập lại 5 lần, mỗi lần lặp lại là 5 keo tương đương với 2 mẫu cấy/keo Các nghiệm thức bao gồm:

Chỉ tiêu theo dõi: số rễ/chồi, chiều cao cây, số lá

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 4 và 8 tuần sau khi cấy

2.2.6 Thuần dưỡng cây Đại Hồng Môn in vitro trong điều kiện nhà lưới

™ Thí nghiệm 9: Hiệu quả của các loại giá thể lên sức sống của cây con Đại Hồng Môn

Mục đích: Xác định loại giá thể thích hợp cho sự phát triển của cây Đại Hồng Môn sau

in vitro

Vật liệu: Cây Đại Hồng Môn in vitro có 3- 5 lá với bộ rễ phát triển thu được từ thí

nghiệm 8

Cây Đại Hồng Môn in vitro với rễ đã hình thành trong môi trường nuôi cấy được

chuyển ra trồng trong nhà lưới Trước khi ươm ra giá thể, cần chuyển bình cây Đại

Hồng Môn in vitro xuống nhà lưới và giữ cây trong bình khoảng 5 ngày để cây thích

nghi với môi trường tự nhiên bên ngoài Sau đó, lấy cây ra khỏi môi trường, rửa sạch agar Cây được ươm trên các giá thể mụn dừa, tro trấu và trấu, bao gồm các nghiệm thức sau:

1/ Mụn dừa + trấu (1 : 1)

2/ Tro trấu + Trấu (1 : 1)

3/ Mụn dừa + Tro trấu (1 : 1)

4/ Mụn dừa + Tro trấu + trấu (1 : 1 :1)

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức, 4 lần lập lại, mỗi lần lập lại quan sát 20 cây

Điều kiện ươm: nhà ươm được che mát bằng lưới đen giảm ánh sáng, tránh nắng mưa trực tiếp Giữ ẩm thường xuyên bằng cách tưới phun sương 2 – 4 lần/ngày tuỳ theo điều kiện thời tiết Giảm tối đa sự bốc hơi nước trên bề mặt lá bằng các vật liệu che chắn là lưới đen ở tuần đầu tiên khi ươm Nhiệt độ trồng trong giai đoạn vườn ươm không quá 320C

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ sống, đặc điểm cây con

Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 3, 4 tuần sau khi trồng

2.3 Xử lý số liệu

Các số liệu là tỷ lệ phần trăm biến động từ 0- 100% được chuyển đổi sang dạng Arcsin

x theo công thức trong bảng tính Excel: giá trị cần chuyển đổi bằng

ASIN(SQRT(x)/10)*180/3,1416; với x là giá trị phần trăm cần đổi; giá trị là 0 phần trăm được thay thế bởi 1/4n và giá trị 100% được thay thế bằng 100 – 1/(4n), trong đó n

là số mẫu dựa trên để tính phần trăm, là giá trị % cần chuyển đổi (Gomez và Gomea, 1984)

Các số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC, kiểm định LSD ở mức

ý nghĩa 5%

24

CHƯƠNG 2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

I Sự phát sinh hình thái ở các bộ phận khác nhau của cây Đại Hồng Môn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng

™ Thí nghiệm 1: Hiệu quả của sự kết hợp nồng độ giữa 2,4 – D và BA lên sự phát sinh hình thái từ kỹ thuật cắt lớp mỏng của lá non

* Sự phát sinh mô sẹo

Thí nghiệm cho thấy, mô sẹo bắt đầu hình thành từ các lát cắt của lá sau 4 tuần nuôi cấy Sau đó, mô sẹo tiếp tục phát triển và kết quả được ghi nhận sau 8 tuần nuôi cấy như sau:

Bảng 2.1 cho thấy các nghiệm thức có và không có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng đều có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy Phần lớn, ở các nghiệm thức có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng đạt tỷ lệ sống cao hơn so với nghiệm thức không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng và có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% Trong đó, tỷ lệ sống đạt cao nhất ở nghiệm thức MS có bổ sung 0,1 mg/l 2,4 – D kết hợp với 1,0 mg/l BA (69,57%) vào thời điểm 8 tuần sau khi cấy Tỷ lệ sống thấp nhất ở nghiệm thức MS có

bổ sung 0,1 mg/l 2,4 – D kết hợp với 1,5 mg/l BA (12,24%) và khác bịêt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức không có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng và nghiệm thức MS có bổ sung 0,1 mg/l 2,4 – D kết hợp với 2,0 mg/l BA

Kết quả Bảng 2.1 cũng cho thấy ở thời điểm 8 tuần sau khi cấy (TSKC) tất cả nghiệm thức đều xuất hiện mô sẹo Mô sẹo có màu vàng nhạt hơi sáng, dạng hạt nhỏ, xốp mềm, nằm ở rìa mảnh lá tại vị trí các vết cắt sau đó phù to tiếp tục trên toàn bộ mẫu lá (Hình 2.1) Theo Jacob (1993), sự hình thành mô sẹo là phản ứng tăng sinh hỗn loạn của mô bị thương trong điều kiện có tác nhân kích thích giúp hình thành mô sẹo trước khi phát triển và phân hóa

Mô sẹo tạo nhiều nhất ở nghiệm thức MS có bổ sung 0,1 mg/l 2,4 - D kết hợp với 0,2 mg/l BA và nghiệm thức MS có bổ sung 0,1 mg/l 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/l BA (đạt 45,00 - 61,38 %) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5% so với các nghiệm thức khác Tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo thấp nhất là ở nghiệm thức không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (12,24 %) Điều này chứng tỏ là sự kết hợp giữa 2,4-D và BA ở các nồng độ khác nhau đều có hiệu quả kích thích sự hình thành mô sẹo Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên (2002) cho rằng mẫu cấy thực vật thuộc nhóm cây hai lá mầm có khả năng tạo mô sẹo khi có sự kết hợp giữa auxin và cytokinin

Bảng 2.1: Tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lát cắt của lá non ở thời điểm

8 tuần sau khi cấy

Ghi chú: Tất cả các số liệu đã được chuyển đổi sang dạng Arcsin xkhi phân tích

thống kê Trên cùng một cột, các số trung bình được theo sau cùng một chữ thì không

khác biệt có ý nghĩa thống kê

* :Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%

** :Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1%

Hình 2.1 Mô sẹo được tạo ra từ lát cắt lá non trên môi trường MS có bổ

sung 0,5 mg/l BA và 0,1 mg/l 2,4 - D ở 8 tuần sau khi cấy

Mô sẹo

1 cm