Nghiên cứu tạo mẫu nghệ xà cừin vitro và nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây bình vôi bằng phương pháp nuôi cấy mô

in vitro và nghiên cứu qui trình vi nhân giống cây Bình vôi Stephania rotunda Lour bằng phương pháp nuôi cấy mô” được tiến hành từ tháng 8/2010 đến tháng 9/2012 tại Trường Đại học An G

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU TẠO MẪU NGHỆ XÀ CỪ (Curcuma xanthorhiza Roxb.) IN VITRO VÀ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI (Stephania rotunda Lour) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU TẠO MẪU NGHỆ XÀ CỪ (Curcuma xanthorhiza Roxb.) IN VITRO VÀ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI (Stephania rotunda Lour) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

Nguyễn Thị Mỹ Duyên

An Giang – 9/2013

TÓM LƯỢC

Nghệ xà cừ (Curcuma xanthorhiza Roxb.) và Bình vôi (Stephania rotunda Lour) là 2 đối

tượng cây trồng có rất nhiều lợi ích cho sức khoẻ con người Trong đó cây Bình vôi (còn gọi Ngải tượng) là cây dược liệu đang khan hiếm và cần được bảo tồn Vì nhu cầu phát triển cây 2 cây dược liệu này để cung cấp cho việc điều trị bệnh cho người, cần thiết phải tạo ra nhiều cây

giống để trồng Do đó, đề tài “Nghiên cứu tạo mẫu Nghệ xà cừ (Curcuma xanthorhiza Roxb.)

in vitro và nghiên cứu qui trình vi nhân giống cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour) bằng

phương pháp nuôi cấy mô” được tiến hành từ tháng 8/2010 đến tháng 9/2012 tại Trường Đại

học An Giang, với tổng cộng 6 thí nghiệm đã đạt được kết quả:

A Tạo được nguồn mẫu vô trùng cho cây Nghệ xà cừ để làm vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm tiếp theo trong vi trình vi nhân giống Thí nghiệm đã tìm được hiệu quả của Ca(ClO)2 là 10% trong 30 phút cho kết quả tạo được mẫu vô trùng là 47,9%, hiệu quả khử trùng không khác biệt thống kê so với HgCl2 0,1% Điều này cho phép ta sử dụng chất hypochloride canxi thay thế việc sử dụng thủy ngân

B Hoàn thành qui trình vi nhân giống cây Bình vôi: (1) Giai đoạn khử trùng Bình vôi, đã tạo được nguồn mẫu vô trùng cho cây Bình vôi với tỷ lệ mẫu vô trùng đạt khá cao 89,44% khi sử dụng HgCl2 nồng độ 0,1% với thời gian là 25 phút; (2) Giai đoạn tái sinh chồi, môi trường thích hợp cho việc tạo chồi cây Bình vôi là môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l BA, đạt số chồi cao nhất là 5,00 chồi; (3) Giai đoạn nhân nhanh chồi, môi trường thích hợp nhất là MS + 2 mg/l

BA cho số chồi là 4,00 chồi; (4) Giai đoạn tạo rễ Bình vôi, sử dụng đoạn thân có mang mầm ngủ cấy vào môi trường MS + BA (1 mg/l) + NAA (0,5 mg/l) + 0,5 g/l than hoạt tính thì thấy có sự tạo rễ trên thân mầm; (5) Bình vôi cấy mô có sau 30 ngày thuần dưỡng ngoài vườn ươm, tỷ lệ sống đạt 58,33% trên môi trường Tro trấu, cây cao trung bình là từ 1,18cm đến 1,61cm và có từ 3,56 đến 4 lá

Từ khóa: Bình vôi, Nghệ xà cừ , nuôi cấy mô , Stephania, Curcuma

MỤC LỤC

Trang

TÓM LƯỢC iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu của đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về Bình vôi 3

2.1.1 Phân loại và phân bố 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật 3

2.1.3 Thành phần hoá học và dược tính 4

2.1.4 Kỹ thuật trồng và chăm sóc cây Bình vôi 5

2.1.4.1 Làm đất 5

2.1.4.2 Trồng cây Bình vôi 5

2.1.4.3 Chăm sóc 6

2.1.4.4 Thu hoạch và bảo quản 7

2.2 Giới thiệu cây Nghệ xà cừ 7

2.2.1 Nguồn gốc và phân bố 7

2.2.2 Đặc điểm thực vật học của Nghệ xà cừ 7

2.2.3 Thành phần hoá học và công dụng của củ nghệ 8

2.3 Kỹ thuật vi nhân giống (nhân giống in vitro) 9

2.3.1 Những ưu điểm và hạn chế của phương pháp nhân giống in vitro 9

2.3.1.1 Ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro 9

2.3.1.2 Hạn chế của nhân giống in vitro 10

2.3.2 Quy trình vi nhân giống 10

2.3.3 Thành phần môi trường nuôi cấy 10

2.3.3.1 Khoáng đa lượng 11

2.3.3.2 Khoáng vi lượng 11

2.3.3.3 Cacbon và nguồn năng lượng 11

2.3.3.4 Vitamin 11

2.3.3.5 Yếu tố làm đặc môi trường 12

2.3.3.6 Các yếu tố điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) 12

2.3.3.7 pH của môi trường 13

2.4 Những nghiên cứu liên quan về cây Nghệ và Bình vôi 13

2.4.1 Nghiên cứu về Nghệ 13

2.4.1.1 Nước ngoài 13

2.4.1.2 Trong nước 14

2.4.2 Nghiên cứu về Bình vôi 14

2.4.2.1 Nước ngoài 15

2.4.2.2 Trong nước 15

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Phương tiện nghiên cứu 17

3.2.1 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 17

3.2.2 Nguyên vật liệu 17

3.2.3 Hoá chất 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Cây Nghệ xà cừ 18

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu chất khử trùng thích hợp cho việc tạo mẫu Nghệ xà cừ vô trùng in vitro 18

3.3.2 Cây Bình vôi 20

3.3.2.1 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu chất khử trùng thích hợp cho việc tạo mẫu Bình vôi vô trùng in vitro 20

3.3.2.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của auxin và cytokinin để tạo chồi Bình vôi 23

3.3.2.3 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin trong việc nhân nhanh chồi Bình vôi24 3.3.2.4 Thí nghiệm 5: Tạo cây Bình vôi hoàn chỉnh 25

3.3.2.5 Thí nghiệm 6: khảo sát khả năng thích nghi của Bình vôi cấy mô ở vườn ươm 26

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Cây Nghệ xà cừ 28

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu chất khử trùng thích hợp cho việc tạo mẫu Nghệ xà cừ vô trùng in

vitro 28

4.2 Cây Bình vôi 29

4.2.1 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu chất khử trùng thích hợp cho việc tạo mẫu Bình vôi vô trùng in vitro 29

4.2.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của auxin và cytokinin để tạo chồi Bình vôi 30

4.2.3 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin trong việc nhân nhanh chồi Bình vôi 34 4.2.4 Thí nghiệm 5: Tạo cây Bình vôi hoàn chỉnh 40

4.2.5 Thí nghiệm 6: khảo sát khả năng thích nghi của Bình vôi cấy mô ở vườn ươm 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

Kết luận 43

Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ CHƯƠNG A 1pc PHỤ CHƯƠNG B 3pc

Phụ chương thí nghiệm 1 3pc Phụ chương thí nghiệm 2 3pc Phụ chương thí nghiệm 3 4pc Phụ chương thí nghiệm 4 7pc Phụ chương thí nghiệm 6 10pc

Bảng 2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khử mẫu Nghệ xà cừ 20

Bảng 3 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khử mẫu Bình vôi 23

Bảng 4 Ký hiệu nghiệm thức và môi trường nuôi cấy tạo chồi Bình vôi 24

Bảng 5 Ký hiệu nghiệm thức và môi trường nuôi cấy nhân chồi Bình

vôi

25

Bảng 6 Ký hiệu nghiệm thức và môi trường nuôi cấy tạo rễ Bình vôi 26

Bảng 7 Kết quả thí nghiệm khử trùng mẫu Nghệ xà cừ 28

Bảng 9 Sự tạo chồi của Bình vôi vào thời điểm 2 TSKC 30

Bảng 10 Sự tạo chồi của Bình vôi vào thời điểm 4 TSKC 32

Bảng 11 Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và nước dừa đến sự nhân

nhanh chồi của Bình vôi 1 TSKC

35

Bảng 12 Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và nước dừa đến sự nhân

nhanh chồi của Bình vôi 2 TSKC

35

Bảng 13 Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và nước dừa đến sự nhân

nhanh chồi của Bình vôi 4 TSKC

36

Bảng 14 Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và nước dừa đến sự nhân

Bảng 15 Tỷ lệ cây Bình vôi cấy mô sống (%) ngoài vườn ươm 41

Bảng 1pcA Thành phần của môi trường MS (Musrashige và Skoog, 1962) 1pc

Bảng 2pcA Sự tạo chồi của Bình vôi vào thời điểm 3 TSKC 2pc

Bảng 3pcA Sự tạo chồi của Bình vôi vào thời điểm 5 TSKC 2pc

Bảng 4pcA Chiều cao (cm) và số lá cây Bình vôi ngoài vườn ươm 2pc

Hình 10 Lá bị vàng và rụng ở Nghiệm thức C6 ở 5 TSKC 39 Hình 11 Chồi Bình vôi xanh tốt và cho nhiều chồi ở nghiệm thức C2 và C4

5 TSKC

39

Hình 13 Chiều cao cây và số lá cây Bình vôi cấy mô ngoài vườn ươm 41

TỪ VIẾT TẮT

ANOVA Analysis of variance (phân tích phương sai)

BA (BAP) Bezylamino purine

IAA Indole-3-acetic acid

IBA Indole-3-butyric acid

MS Murashige & Skoog

NAA Alpha-naphthaleneacetic acid

TDZ Thidiazuron

TNTN Tài nguyên thiên nhiên

TSKC Tuần sau khi cấy

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Giới thiệu

Từ xa xưa, vùng Bảy Núi - An Giang từng nổi tiếng là một kho thảo dược, nơi đã thu hút nhiều lương y và những người săn tìm thuốc Nam từ các nơi về khai thác Chính vì vậy, từ hai ba thập kỷ trở lại đây, nguồn thảo dược ngày càng cạn kiệt, trong đó có nhiều loài đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng (Khương Ninh, 2011)

Một trong những loài đó có cây Bình vôi, đây là là đối tượng cây trồng có nhiều lợi ích cho sức khoẻ con người, không những giúp chữa nhiều loại bệnh mà nó còn là một loại thuốc bổ giúp phục hồi thể lực rất hiệu quả Thành phần chính trong củ Bình vôi là chất rotundin, một hoạt chất rất cần trong y học Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất (Ngô Quang Đại, 1999) Rotundin có tác dụng làm giảm đau, an thần, gây ngủ rất hiệu quả, điều hòa hô hấp, điều hòa đối với tim và bổ tim nhẹ (Đỗ Tất Lợi, 2009)

Không chỉ riêng tại An Giang, nhiều vùng rừng núi khác của nước ta cũng đang khan hiếm nhóm cây thuốc này Chính vì vậy, theo Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006 của Chính phủ, trong danh mục “Thực vật rừng nguy cấp, quý hiếm” thì

các loài Bình vôi (Stephania sp.) được xếp trong nhóm IIA (Thực vật rừng hạn chế khai

thác, sử dụng vì mục đích thường mại) Nghị định trên kêu gọi chiến lược bảo tồn và ngăn nguy cơ tuyệt chủng Và cũng theo Quyết định số 61/2007/QĐ-TTg của phó thủ tướng chính phủ Nguyễn Sinh Hùng ngày 7/5/2007 về việc phê duyệt “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020”, trong đó nội dung số 6 là “Sản xuất L-rotundin và L-rotundin sulfat từ củ Bình vôi

(Stephania rotunda)” với nội dung là nghiên cứu trồng tập trung củ Bình vôi, bảo đảm

nguồn nguyên liệu ổn định cho công nghệ chiết xuất

Bên cạnh đối tượng Bình vôi thì Nghệ xà cừ cũng rất được quan tâm Củ nghệ không những làm tăng thêm hương vị và màu sắc của món ăn mà còn là dược phẩm tự nhiên mang đến nhiều lợi ích cho sức khỏe con người Theo Lê Thị Kim Loan (2012), cho

rằng trong củ Nghệ Curcuma xanthorhiza có curcuminoid là nhóm hợp chất màu có nhiều

tác dụng như chất chống oxy hóa (gấp 8 lần VTM E); kháng khuẩn, kháng nấm; chống, giảm viêm; đặc biệt hiện nay nó được xem là loại thuốc hữu hiệu chống ung thư Theo nghiên cứu của nhiều trường đại học trên thế giới thì hoạt chất curcumin này cải thiện được nhiều triệu chứng gây bệnh rất tốt như giảm hàm lượng cholesterol trong máu, chống viêm loét dạ dày do tác dụng tăng tiết chất nhày mucin,

Tuy nhiên, từ lâu người dân chỉ biết khai thác cây giống Bình vôi từ tự nhiên, rừng núi mà không hoặc có rất ít các nghiên cứu hay nhân giống loài cây này Đặc biệt, tỉnh An Giang đang phát triển chương trình trồng cây dược liệu và cây Bình vôi đang rất được quan tâm Chính vì thế, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cây Bình vôi và Nghệ xà cừ là

biện pháp tối ưu giúp khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống Phương pháp này tạo ra cây giống có chất lượng tốt với số lượng lớn trong thời gian ngắn, cung cấp nguồn cây giống cho thị trường ở mọi thời gian mà không bị ảnh hưởng bởi tác động bên

ngoài như thời tiết và mùa vụ Do đó, đề tài “Nghiên cứu tạo mẫu Nghệ xà cừ (Curcuma

xanthorhiza Roxb.) in vitro và nghiên cứu qui trình vi nhân giống cây Bình vôi

(Stephania rotunda Lour) bằng phương pháp nuôi cấy mô” được tiến hành nhằm tạo ra

số lượng lớn cây giống với chất lượng tốt, độ đồng đều cao đáp ứng cho nhu cầu phát triển của dự án phát triển dược liệu sạch của tỉnh An Giang

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Xác định nồng độ và thời gian của một số chất khử trùng thích hợp cho việc tạo

mẫu cấy vô trùng củ Nghệ xà cừ (Curcuma xanthorhiza Roxb.) và cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour.)

- Xác định nồng độ Auxin và Cytokinin thích hợp cho việc tạo và nhân chồi, tạo rễ cây Bình vôi

- Tìm ra qui trình vi nhân giống cây Bình vôi bằng phương pháp nuôi cấy mô với hệ

số nhân giống cao, để tạo ra số lượng lớn cây con cung cấp cho nhà vườn

1.3 Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Nghiên cứu qui trình khử trùng tạo mẫu cấy in vitro cây Nghệ xà cừ

- Nghiên cứu qui trình khử trùng tạo mẫu cấy in vitro Bình vôi

- Khảo sát ảnh hưởng của một số nồng độ chất kích thích sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lên khả năng phát triển của mẫu cấy ở các giai đoạn tái sinh chồi, nhân chồi và tạo cây Bình vôi hoàn chỉnh

- Tìm loại giá thể và điều kiện sống thích hợp cho cây Bình vôi cấy mô ngoài vườn ươm, giúp tăng tỉ lệ sống của cây khi chuyển từ điều kiện phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về Bình vôi

2.1.1 Phân loại và phân bố

Bình vôi có tên khoa học là Stephania rotunda Lour [hay Stephania glabrae (Roxb.)] thuộc họ tiết dê (Menispermaceae) (Võ Văn Chi, 2004) Bình vôi còn có tên gọi khác là Bình vôi, củ một, dây mối trơn, tử nhiên, cà tòm (Tày), co cáy khẩu (Thái), củ gà ấp, tở lùng dòi (Dao) (http://hocvienquany.vn/caythuoc/Default.aspx?Mact=206)

Hình 1: Củ Bình vôi (http://hocvienquany.vn/caythuoc/Default.aspx?Mact=206)

Cây Bình vôi phân bố ở Ấn Độ, Thái Lan, Lào và Việt Nam (Võ Văn Chi, 2004)

Ở Việt Nam, Bình vôi thường ưa mọc ở những vùng có núi đá tại các tỉnh Hà Giang, Tuyên Quang, Hoà Bình, Hà Tây (cũ), Nam Hà, Ninh Bình, Hải Phòng, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hoá, v.v (Đỗ Tất Lợi, 2009), Côn Đảo (Võ Văn Chi, 2004) và An Giang

(Trần Hùng, 1989)

2.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây Bình vôi là một loại dây mọc leo, phần dưới thân phát triển thành củ to, bám vào núi đá, củ rất to nặng tới hơn 20 kg Da thân củ màu nâu đen, xù xì giống như hòn đá Hình dáng thay đổi tuỳ theo nơi củ phát triển Nếu mọc ở đất thì củ nhỏ hơn, thường gọi là

“củ gà ấp” Từ thân củ mọc lên những thân màu xanh, nhỏ, mềm Lá mọc so le, hình bầu dục hay hình tim hoặc tròn, đường kính 8-9cm, cuống lá dài 5 – 8cm Hoa nhỏ màu vàng cam tụ tập thành tán kép Hoa đực cái khác gốc Hoa cái có cuống tán ngắn, còn hoa đực có cuống tán dài Quả chín hình cầu màu đỏ, tươi, trong chứa một hạt hình móng ngựa có gai (Đỗ Tất Lợi, 2009)

Nhiều loài có rễ củ mang tên Bình vôi như Stephania sinica Diels., S pierrei

(http://hocvienquany.vn/caythuoc/Default.aspx?Mact=206) Củ Bình vôi có thể thu hái quanh năm, đem về cạo bỏ vỏ đen, thái mỏng phơi khô rồi ngâm rượu hay sắc uống, không phải chế gì khác (Đỗ Tất Lợi, 2009)

R và S Siddiqui chiết xuất nhiều ancaloit từ củ Bình vôi Stephania glabrae và đặt tên là

hyndarin có công thức là C21H25O4N

Hình 2: Công thức Tetrahydropalmatin (hyndarin) (Đỗ Tất Lợi, 2009)

Rotundin có tên hoá học là L.Tetrahydropalmatin (C21H25O4N) là một hợp chất hữu

cơ kết tinh ở dạng tinh thể hình kim, màu trắng hoặc vàng nhạt, dễ chuyển màu khi bị đun nóng hay phơi nắng (Ngô Quang Đại, 1999) Rotundin có tác dụng làm giảm đau, an thần, gây ngủ rất hiệu quả, điều hòa hô hấp, điều hòa đối với tim và bổ tim nhẹ (Đỗ Tất Lợi,

2009)

Theo Phạm Thị Kim và Bùi Minh Đức (1983), chất rotundin giúp cải thiện và chữa trị được nhiều chứng bệnh rất tốt như bệnh mất ngủ, hen, đau bụng, sốt nóng, đau dạ dày và đặc biệt chất rotundin có thể hiệu quả trong một số trường hợp đau tim

Bình vôi làm thuốc an thần, gây ngủ, chữa nhức đầu, sốt nóng, đau dạ dày (thuộc nhiệt), ho nhiều đờm, hen suyễn, khó thở Phối hợp với các vị thuốc khác để trị ho lao, sốt rét, kiết lỵ, ngứa lở ngoài da, mụn nhọt Ngày dùng 3-6g dạng bột hoặc rượu thuốc Hoạt chất L-tetrahydropalmatin (rotundin) dùng chữa suy nhược và rối loạn tâm thần, làm thuốc

bổ sức cho người lao lực, chữa đau tim, trị hen suyễn, đau dạ dày, lỵ amíp, sốt nóng Phụ

nữ sinh đẻ uống để lọc máu (http://hocvienquany.vn/caythuoc/Default.aspx?Mact=206)

Hiện nay thuốc "Rotunda" bào chế từ rotundin đang được tiêu thụ mạnh trên thị trường Vì vậy, một số cơ sở trong nước đã tìm cách chiết tách rotundin từ củ Bình vôi Vấn đề đặt ra là rotundin sản xuất ra phải có chất lượng đạt tiêu chuẩn, với giá thành chấp nhận được Nhiều cơ sở sản xuất của ta chưa làm được điều này Một vài cơ sở đã tinh chế được rotundin đạt yêu cầu nhưng giá thành quá cao, một số khác chỉ làm ra được sản phẩm thô, hàm lượng hoạt chất đạt thấp (29-35%), không sử dụng ngay được Trong khi đó nhu

cầu thị trường về rotundin dược dụng lại khá lớn và hiện tại các sản phẩm cùng loại của Trung Quốc đã tràn vào Việt Nam (Ngô Quang Đại, 1999)

Trong năm 1998, Viện Hoá học Công nghiệp đã tiến hành nghiên cứu sản xuất rotundin từ củ Bình vôi, sau đó rotundin thô được tinh chế trong một dung môi thích hợp, tạo mầm kết tinh để nhận được sản phẩm ở dạng tinh thể sạch, dễ lọc rửa Thành phẩm thu được đạt chất lượng theo "Tiêu chuẩn Dược điển Trung Quốc-1993" và đã được thị trường chấp nhận (Ngô Quang Đại, 1999)

Phạm Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng) tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD50 đường uống Điều

đó chứng tỏ độ an toàn cao của chế phẩm (Ngô Quang Đại, 1999)

Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và 60mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml (60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày, hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh v.v (Ngô Quang Đại,1999) Hiện nay trên thị trường Việt Nam đã có một số sản phẩm như viên nén Rotunda của Công ty Cổ phần dược phẩm trung ương 2 - DOPHARMA JSC; hay Rotundin 30 của Công ty dược Nghệ An - DNA PHARMA; và trên thế giới có sản phẩm Sweet Sleep của Công ty CoCoon Nutrition nhằm mang đến giấc ngủ ngon cho mọi người

2.1.4 Kỹ thuật trồng và chăm sóc cây Bình vôi

Bình vôi là cây mọc hoang dại, sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21- 230C, lượng mưa 2.000-2.500 mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5 - 7

2.1.4.1 Làm đất

Bình vôi là loài cây tự nhiên rất dễ trồng, có thể sinh sản vô tính cao, nên để trồng Bình vôi có hiệu quả cao người dân cần làm đất tơi xốp, có thể không cần nhiều đất nhưng phải thoát nước và hơi ẩm Bình vôi là cây trồng chủ yếu để lấy củ cho nên không cần nhiều đất Nếu trồng trên diện tích rộng thì cần chọn những lô đất ẩm, ít chua và phải thoát nước tránh ngập úng Tuy nhiên phải có đủ ánh sáng cho cây vì Bình vôi là loài rất ưa ánh sáng

cao 20-30cm, rộng 50-70cm Bón lót bằng phân chuồng mục (15-20 tấn/ha), 200 kg supe lân/ha và 100 kg kali/ha (http://hocvienquany.vn/caythuoc/Default.aspx?Mact=206)

Trồng Bình vôi bằng hạt hoặc bằng củ:

+ Nếu trồng từ hạt: Khoảng tháng 9-10, hái quả chín, đãi vỏ lấy hạt Bảo quản hạt trong cát ẩm Gieo hạt vào mùa xuân (tháng 2-3) tỷ lệ mọc sẽ cao Hạt để cách năm tỷ lệ mọc sẽ thấp Ở Việt Nam, vào tháng 2-3, khi cây hồi xuân có thể vào rừng tìm kiếm cây con đem về trồng (http://hocvienquany.vn/caythuoc/Default.aspx?Mact=206)

Trộn phân với đất cho đều rồi gieo hạt Gieo 15-20g hạt/m2, theo hàng khoảng cách

5 x 5cm Phủ đất kín hạt 1 - 2cm Khoảng 20 ngày, hạt mọc mầm Gieo hạt tươi, tỷ lệ mọc đạt 70-80%

Bình vôi là loài cây hoang dại chủ yếu trồng từ hạt Nguồn hạt giống được thu hái lúc quả bắt đầu chín, hong trong râm nơi khô ráo, thoáng mát Xát nhẹ tách vỏ và loại bỏ tạp vật Sau đó, ngâm hạt vào nước ấm (3 sôi, 2 lạnh) trong 15-30 phút để phá vỡ miên trạng hạt Vớt ra để ráo nước, đem gieo theo hàng cách nhau 20-25cm, sâu 5-6cm Dùng đất mịn lấp kín hạt và tưới đủ ẩm Cắm ràng hoặc phên che bóng 30-40% tránh mất nước Làm cỏ và xới xáo thường xuyên giúp hạt nảy mầm tốt (Bành Thanh Hùng, 2012)

Tiêu chuẩn cây con đem trồng phải cao 10-15cm, có 3-4 lá, không sâu bệnh Trồng theo hố hoặc theo rạch rộng 0,8-1m Thời vụ trồng thích hợp nhất thường vào vụ xuân khi

có mưa phùn hoặc đầu mùa mưa hoặc vụ thu Làm đất theo hố, kích cỡ 30x30x30cm Đào đất đặt cây ngay ngắn, lấp đất đầy hố, nén chặt Cào đất vun lấp đầu cao hơn miệng hố 5-6cm Tủ cỏ, lá khô kín mặt hố (Bành Thanh Hùng, 2012)

+ Trồng từ củ: Thu hoạch củ giống đến đâu trồng ngay đến đó Mỗi hốc trồng một mầm củ Nên xử lý mặt cắt bằng vôi bột hay tro bếp Khoảng cách trồng 50 x 30cm Phủ đất lên mầm củ 2-3cm, phủ rơm hoặc cỏ khô để giữ ẩm Chú ý làm giàn cho dây leo, tốt nhất là làm giàn cắm chéo hình mái nhà

Trong quá trình cây sinh trưởng, hàng năm bón thúc 2-3 lần bằng nước phân chuồng hoặc 50-60kg ure, 30-40kg kali/ha cho mỗi lần Trung bình mỗi tháng làm cỏ vun xới một lần Đảm bảo đất luôn luôn ẩm và sạch cỏ dại Sau một năm có thể đánh cây con ra trồng ở ruộng sản xuất Trồng 2-3 năm có thể thu hoạch dược liệu Thời gian càng lâu năng suất càng cao Trồng bằng hạt có năng suất cao hơn trồng từ mầm củ (http://hocvienquany.vn/caythuoc/Default.aspx?Mact=206)

2.1.4.4 Thu hoạch, bảo quản

Thường Bình vôi trồng vào vụ Đông - Xuân, tháng 11 - 12 (miền Nam), ở miền Bắc

có thể trồng muộn hơn Thu hoạch sau khi trồng từ 3-4 năm hoặc lâu hơn tuỳ nhu cầu sử dụng củ to hay củ nhỏ và có thể thu hoạch quanh năm

Củ sau khi đào lên bảo quản nơi khô ráo và thoáng mát Có thể đem củ rửa sạch, cạo hết lớp vỏ đen, thái mỏng, phơi khô, có thể ngâm rượu hoặc sắc thuốc uống hoặc làm nguyên liệu điều chế rotundin (Đỗ Tất Lợi, 2009)

2.2 Giới thiệu cây Nghệ xà cừ

2.2.1 Nguồn gốc và phân bố

Nghệ xà cừ còn gọi là Nghệ tàu, tên khoa học là Curcuma xanthorhiza Roxb., thuộc

họ Gừng Zingiberaceae (Đỗ Tất Lợi, 2009) Đặc điểm của giống Nghệ này là khi củ già

màu nghệ đã chuyển sang màu vàng cam đậm, nghệ còn non màu vàng tươi

Hình 3: Cây Nghệ xà cừ (cây lớn bên phải)

(http://www.natural-domesco.com/?id_pproductv=63&lg=vn&start=6)

Cây được trồng ở các nước Ấn Độ, Inđônêxia, Campuchia, Lào, Trung Quốc và các nước nhiệt đới Ở nước ta được trồng ở khắp nơi để làm gia vị và làm thuốc (Đỗ Tất Lợi,

2009)

1.2.2 Đặc điểm thực vật học của cây Nghệ xà cừ

Nghệ xà cừ thuộc giống Nghệ vàng, là một loài cỏ cao 0,6m đến 1m Thân rễ thành

củ hình trụ hơi dẹt, khi bẻ hoặc cắt ngang có màu vàng cam sẫm Lá hình trái xoan thon

nhọn ở hai đầu, hai mặt đều nhẵn dài tới 45cm, rộng tới 18cm Cuống lá có bẹ, cụm hoa mọc từ giữa các lá lên, thành hình nón thưa, lá bắc hữu thụ khum hình máng rộng, đầu tròn màu xanh lục nhạt, lá bắc bất thụ hẹp hơn, màu hơi tím nhạt Tràng có phiến, cánh hoa ngoài màu xanh lục vàng nhạt, chia thành ba thùy, thùy trên to hơn, phiến cánh hoa trong cũng chia thành ba thùy, 2 thùy hai bên đứng và phẳng, thùy dưới hõm thành máng sâu Quả nang 3 ngăn, mở bằng 3 van (Đỗ Tất Lợi, 2009)

Tuy nhiên, theo Nguyễn Văn Tập (2012), Trưởng Khoa Tài nguyên, Viện dược liệu,

Bộ y tế, ông cho rằng cây Nghệ ở Việt Nam Curcuma xanthorhiza từ trước đến nay có hoa

không có hạt Chủ yếu nhân giống bằng cách trồng từ các củ con

2.2.3 Thành phần hóa học và công dụng của củ Nghệ

+ Tinh dầu 1 - 5% màu vàng nhạt, thơm

+ Ngoài ra còn tinh bột, canxi oxalat, chất béo

Củ Nghệ chứa 8 – 10% nước, 6 – 8% chất vô cơ, 40 – 50% tinh bột nhựa

* Công dụng:

Trong y học, củ Nghệ bắt đầu được sử dụng tại Ấn Độ từ khoảng năm 1900 TCN để chữa trị một loạt các loại bệnh tật Theo Hội đồng nghiên cứu Trung ương, củ Nghệ có thể chữa được nhiều bệnh Củ Nghệ có thể chữa bệnh hen suyễn, ho, trị cảm, nghiện rượu, mụn

và các bệnh ngoài da, củ Nghệ có thể giảm viêm nhiễm, trị to gan và nhiễm trùng bàng quang, rối loạn kinh nguyệt, tăng cường sức khỏe cho tim Củ Nghệ ngâm với nước và mật ong giúp lợi tiểu, hoặc nghiền nghệ với bơ đã qua lọc sạch có thể chữa hiệu quả bệnh tiểu đường Ngoài ra củ nghệ còn giúp trị đau răng và ngừa sâu răng, giảm đau bao tử, giúp tiêu hóa và tạo cảm giác thèm ăn Nhỏ nước nghệ đã đun sôi vào mũi giúp chữa đau đầu và chứng mất ngủ (Đỗ Tất Lợi, 2009)

Nghiên cứu của các nhà khoa học vào cuối thế kỷ 20 đã xác định curcumin đóng vai trò quan trọng trong các hoạt tính sinh học của củ nghệ Đến năm 2008, rất nhiều thử nghiệm lâm sàng ở người đang được thử nghiệm để nghiên cứu về tác dụng của curcumin trong việc điều trị các bệnh như: viêm tủy, ung thư tủy, hội chứng loạn sản tủy, ung thư ruột kết, bệnh vẩy nến, bệnh Alzheimer Hiện nay, tinh nghệ gồm curcumin và các curcuminoid đang được nghiên cứu trong điều trị ung thư, chống ôxi hóa, chống viêm khớp, chống thoái hóa, chống thiếu máu cục bộ và kháng viêm Curcumin làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn hình thành các tế bào ung thư mới Curcumin giúp cơ thể phòng ngừa

và chống ung thư Curcumin là một chất có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan B, C và nhiễm HIV (http://vi.wikipedia.org/wiki/Curcumin)

Công ty Domesco Đồng Tháp đang thực hiện nghiên cứu bào chế thuốc điều trị bệnh ung thư, một loại thuốc thảo dược 99% là hoạt chất thiên nhiên Một trong hai hoạt

chất chính của viên thuốc này là chất curcumin được chiết xuất từ củ Nghệ xà cừ Curcuma xanthorhiza

Cũng theo Lê Thị Kim Loan (2012), Trưởng Khoa Bào chế, Viện dược liệu, Bộ y

tế, cho rằng trong củ Nghệ Curcuma xanthorhiza có curcuminoid là nhóm hợp chất màu có

nhiều tác dụng: (1) chống oxy hóa (gấp 8 lần VTM E); (2) kháng khuẩn, kháng nấm; (3) chống, giảm viêm; (4) ngăn ngừa đục thủy tinh thể; (5) đặc biệt hiện nay nó được xem là loại thuốc hữu hiệu chống ung thư như ung thư vú, trực tràng, gan, với sản phẩm là viên BIOCURMIN được bào chế từ curcumin nghệ và một chất trích từ hạt tiêu

2.3 Kỹ thuật vi nhân giống (nhân giống in vitro)

2.3.1 Những ưu điểm và hạn chế của phương pháp nhân giống in vitro

2.3.1.1 Ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ hữu ích trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh học và ứng dụng, đóng góp to lớn vào các hoạt động nhân giống, chọn giống cây trồng, chuyển gen vào cây trồng, tạo nguồn nguyên liệu cho tách chiết nhiều chất hữu dụng

ở thực vật

- Tạo ra các dòng cây sạch bệnh (loại bỏ virut) từ cây mẹ bị nhiễm bệnh (Dương Công Kiên, 2002)

- Cây được tạo ra từ in vitro có sức sống mạnh vì được trẻ hóa và sạch bệnh

- Cây con giữ được đặc tính di truyền của bố mẹ

- Trong khoảng thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng lớn cây giống đồng đều

mà bằng phương pháp chiết ghép hay giâm cành khó có thể đạt được (Đặng Phương Trâm,

2005)

- Tạo ra sự đồng loạt về giống từ đó tạo ra sự đồng loạt trong sản phẩm Việc cơ giới hóa khâu trồng trọt và thu hoạch sẽ dễ dàng hơn, thuận lợi trong chế biến và tiêu thụ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

- Nhân giống vô tính không phụ thuộc vào thời tiết nên có thể tiến hành quanh năm (Nguyễn Xuân Linh và Nguyễn Thị Kim Lý, 2005)

Với những ưu điểm trên, nuôi cấy mô thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông, lâm nghiệp Đây thực sự là cuộc cách mạng trong ngành trồng trọt Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, nuôi cấy mô đã trở thành một trong những lĩnh vực được quan tâm rất nhiều trong ngành trồng trọt Nuôi cấy mô đã có những đóng góp to lớn trong việc phục tráng, nhân giống cây trồng, góp phần vào sự phát triển của ngành khoa học nông, lâm nghiệp (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

2.3.1.2 Hạn chế của nhân giống in vitro

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), việc nhân giống in vitro có

thể gặp một số bất lợi như sau:

- Tính bất định về di truyền trong một số hệ thống nuôi cấy có thể xảy ra

- Một số loài cây thân gỗ rất khó cảm ứng ra rễ

- Việc chuyển cây từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm là công đoạn khó khăn vì cây lúc này rất khó chăm sóc

- Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyền mô sẹo và huyền phù tế bào được lặp lại nhiều lần

- Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện

2.3.2 Quy trình vi nhân giống

Công nghệ nhân giống ở mức độ tế bào (micro propagation) bao gồm nội dung sản xuất từ một phần cây rất nhỏ và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt Công nghệ vi nhân giống của những cây trồng đặc biệt có khả năng áp dụng có hiệu quả về kinh tế (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007)

Vi nhân giống đã được Debergh (2006), chia thành 4 giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn có một chức năng riêng Sự thành công của công việc vi nhân giống tùy thuộc vào tất

cả các giai đoạn

In vivo Giai đoạn 0 : Sự chuẩn bị cây mẹ

In vitro Giai đoạn 1 : Bắt đầu tiệt trùng

Giai đoạn 2 : Nhân

Giai đoạn 3a : Kéo dài

Giai đoạn 3b : Tạo rễ và tiền thuần dưỡng

In vivo Giai đoạn 4 : Thuần dưỡng

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), cây mẹ cần phải sạch bệnh

và đang ở trong giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống sẽ đạt hiệu quả cao

2.3.3 Thành phần môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Môi trường cấy là một dung dịch gồm có muối khoáng, các phân tử hữu cơ (đường, vitamine…) và có thể có các kích thích tố tăng trưởng gọi là

“phytohormone” Dung dịch này phần lớn được làm đặc bởi một chất chiết ra từ rong tảo

mà người ta gọi là agar, agar cần phải đun sôi trong vài phút để hòa tan, chính vì vậy mà người ta nói là nấu chín môi trường cấy (Dương Công Kiên, 2002)

Tất cả các môi trường cấy đều bao gồm các thành phần sau:

2.3.3.1 Khoáng đa lượng

Theo Lê Văn Hòa và ctv (1999), khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên (Nguyễn Văn Uyển và ctv, 1984) Nhu cầu khoáng của mô không khác nhiều so với cây trồng do đó các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là Nitrogen, Phospho, Botasium, Calcium, Magnesium, sắt (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

2.3.3.2 Khoáng vi lượng

Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật rất ít nhưng chúng không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào Một số khoáng vi lượng thường dùng như: Mn, B, Zn, Cu, Co, I, Mo Chúng tham gia vào enzyme trong những hoạt động thuộc quá trình chuyển hóa cơ bản và có vai trò không thể thay thế ở nhiều trường hợp, nhưng do thành phần khoáng vi lượng chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ nên một số chất có thể đã có trong các thành phần tạp của chất khác (Đặng Phương Trâm, 2005)

2.3.3.3 Cacbon và nguồn năng lượng

Nguồn carbon được bỏ sung vào môi trường dưới hai dạng là glucose và sucrose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn Nồng độ sucrose trong môi trường nuôi cấy thường ở mức 2 - 3% (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Các vitamin khác như biotin, acid folic, acid ascorbic, panthothenate acid, vitamin E (tocophenol), riboflavin và p - aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

2.3.3.5 Yếu tố làm đặc môi trường

Trích từ tảo đỏ Gracillaria, là thành phần quyết định trạng thái vật lý của môi

trường Hàm lượng agar thường dùng ở mức 6- 10g/l Khi nồng độ agar quá cao, môi trường quá cứng sẽ ảnh hưởng đến sự khuếch tán của các chất điều hòa sinh trưởng và các vitamine, gây khó khăn cho sự hấp thụ dinh dưỡng của mô cấy (Bùi bá Bổng, 1995; Vũ Văn Vụ và ctv, 2005)

2.3.3.6 Các yếu tố điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV)

Các chất điều hòa sinh trưởng (tự nhiên và nhân tạo), có tác dụng điều tiết quá trình sinh lý, kích thích hay cản trở Trong lĩnh vực nuôi cấy mô thì việc sử dụng hợp lí các chất ĐHSTTV là hết sức quan trọng Hai nhóm chất ĐHSTTV được sử dụng nhiều nhất là auxin (hình thành rễ), cytokinin (hình thành chồi) Tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi cấy quy định sự phát sinh rễ hay chồi (Dương Công Kiên, 2002)

Trong quá trình phát sinh hình thái, auxin có vai trò trong việc thiết lập tính hữu cực của cơ quan thực vật và tác động trong sự phát sinh cơ quan (Bùi Trang Việt, 2001) Bổ sung auxin vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết vì chúng cần cho quá trình phân chia tế bào và quá trình phản biệt hóa tế bào (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Một đặc trưng của auxin là tạo sự phân chia tế bào Trong tự nhiên, auxin giúp sự gia tăng chiều dài thân, lóng, ngọn và sự ra rễ Trong nuôi cấy mô, auxin được dùng cho sự phân chia tế bào và phân hóa rễ, ức chế sự thành lập chồi bên Các chất thường dùng nhất trong nuôi cấy mô là 2,4-D, NAA, IBA, và IAA ở nồng độ 0,1 - 5,0 mg/l NAA và IBA thường dùng để cho ra rễ và dùng phối hợp với cytokinin trong sự nhân chồi 2,4-D rất hữu hiệu trong tạo mô sẹo (callus) (Bùi Bá Bổng, 1995)

Nhìn chung, hiệu quả của auxin tùy thuộc vào nồng độ hiện diện trong mô thực vật hay trong môi trường thực nghiệm, kiểu mô hay trong cơ quan, giai đoạn phát triển (trạng thái sinh lý) của mô hay cơ quan, loại auxin, tương tác giữa auxin với chất khác (Bùi Trang Việt, 2000)

Theo Đặng Phương Trâm (2005), cytokinin là nhóm chất kích thích tố thực vật, có vai trò làm tăng sự phân chia của tế bào, đồng thời kích thích quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein chống lại hoạt động của các enzyme thủy phân, điều này làm cho sự lão suy chậm lại Trong nuôi cấy mô thực vật, nó ảnh hưởng rõ rệt lên sự phát sinh chồi, giữ tuổi thọ cho mô cấy cũng như sự kích thích phân chia tế bào Khi cấy đỉnh chồi vào môi trường có nồng độ cytokinin thích hợp, các mầm bên của đỉnh chồi sẽ phát triển thành chồi

Cytokinin nếu sử dụng riêng lẻ sẽ làm tăng sinh chồi bên và chồi bất định, nhưng cản trở sự tạo rễ hay cảm ứng tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi ở những cây lá rộng khi sử dụng cytokinin ở nồng độ thấp (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Các loại cytokinin thường được sử dụng trong cấy mô như: kinetin, zeatin, BAP, TDZ, ZiP…Nồng độ sử dụng dao động từ 0,1 - 2 mg/l Trong các loại cytokinin thì nói trên thì kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả (Vũ Văn Vụ, 2005)

Tỷ lệ giữa auxin và cytokinin quyết định kết quả phát sinh hình thái đối với mô nuôi

cấy in vitro cũng như đối với cây nguyên vẹn Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì kích thích

hình thành rễ, ngược lại auxin/cytokinin thấp dẫn đến sự xuất hiện và phát triển chồi Tỉ lệ cân đối giữa auxin và cytokinin cho phép tạo cây hoàn chỉnh (rễ, thân, lá) Tỷ lệ này thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và loại mô được nuôi cấy (Bùi Trang Việt, 2000)

2.3.3.7 pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Giá trị pH của môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển ở nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,0 – 6,0 (Vũ Văn Vụ và ctv, 2007) pH dưới 5,5 thì agar không đông thành dạng gel hoàn toàn và trên 6 thì lại quá cứng pH của môi trường giảm từ 0,6 – 1,3 đơn vị sau khi hấp khử trùng Có một số trường hợp, sau một thời gian nuôi cấy, pH của môi trường giảm dần do sự hình thành một số acid hữu cơ trong môi trường (Dương Công Kiên, 2003)

Trong nuôi cấy mô thực vật cũng như ngoài tự nhiên, cây cấy mô có yêu cầu pH theo mức độ khác nhau nhưng nói chung nằm trong khoảng pH từ 5,5 – 5,8 ngoại trừ một

số cây đặc biệt cần có pH kiềm hay acid Khi pha môi trường thạch, nếu pH thấp quá các acid có thể làm gãy các mối nối của chuỗi cellulose trong thạch kết quả là thạch bị biến tính, môi trường không thể đông đặc như bình thường (Đặng Phương Trâm, 2005)

2.4 Những nghiên cứu liên quan về cây Nghệ và Bình vôi

2.4.1 Nghiên cứu về Nghệ

2.4.1.1 Nước ngoài

Curcuma xanthorrhiza là một trong số những cây thuộc họ Gừng được trồng ở các

vùng nhiệt đới và được sử dụng trong y học dân gian cũng như làm gia vị Đây là loài cây tương đối cao, có thể lên đến 2m Ít củ (rhizome), ít phân nhánh, củ có ruột màu vàng hay vàng đỏ, màu này nhạt hơn ở các phần còn non, ngắn

Curcuma xanthorrhiza được sử dụng như một loại thuốc bổ ở Indonesia và thuốc

chữa bệnh dễ bị khích động ở Châu Âu Ngoài các curcuminoid, loài này còn chứa các hợp chất như α-curcumen, ar-turmerone và xanthorrhizol Ba hợp chất này chứng tỏ các hoạt tính kháng ung thư mạnh đối với ung thư cổ trướng ở chuột Thêm vào đó, xanthorrhizol cũng cho thấy hoạt tính kháng sinh (Itokawa và ctv., 2008)

Pramila S Chougule (2008), đã nghiên cứu phương pháp vi nhân giống cây Nghệ

(Curcuma long Linn.) bằng việc sử dụng chồi thân rễ ngầm củ nghệ, khử trùng với nước

có Tween 20, rửa sạch hóa chất khử trùng bề mặt, sau đó sử dụng tiếp HgCl2 0,1% trong

15 phút, rửa sạch mẫu với 6 lần bằng nước cất Môi trường nuôi cấy được sử dụng là MS

với sự tổ hợp khác nhau của BAP hoặc kết hợp NAA với những tỷ lệ khác nhau Kết quả,

môi trường có bổ sung 4 mg/l BAP + 0,1mg/l NAA cho kết quả tạo chồi tốt nhất

Ở Pakistan, Shagufta Naz và ctv (2009) nghiên cứu nhân giống Nghệ vàng từ

những mầm chồi mọc từ thân rễ ngầm của những giống Nghệ được thu thập và khử trùng

bề mặt Những chồi này được cắt thu ở kích thước 1cm được nuôi cấy trên môi trường MS

với sự bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cytokinin và auxin Theo tác giả, đầu tiên mẫu

được khử trùng với chất tẩy rửa trong 5 phút, sau đó rửa dưới vòi nước chảy cho sạch chất

tẩy rửa Tiếp tục ngâm trong cồn 70oC từ 30 – 40 giây, ngâm tiếp với chất khử trùng

hypochloride 20 – 50% trong 15 phút, rửa nước cất đã khử trùng 3 lần Sau đó cấy vào môi

trường

Theo kết quả nghiên cứu của Thayamini H Seran (2013) đã tổng hợp các nghiên

cứu trên vi nhân giống các cây thuộc họ gừng, đối với việc khử trùng mẫu cấy là phần thân

củ của cây Một số nhà nghiên cứu đã được báo cáo về việc khử trùng bề mặt của chúng

and Khader (1989) Chồi thân củ MS + 3 mg/l BA Chồi bất định Balachandran et al

(1990)

Đỉnh chồi MS + 4 mg/l BA + 1,5mg/l NAA Chồi bất định Bharalee et al

(2005) Chồi thân củ

(dài 1cm)

MS + 4 mg/l BA + 1 mg/l NAA Chồi bất định Nasirujjaman et al

(2005) Mầm chồi thân củ

Naz et al (2009)

Mầm chồi thân củ

(dài 1,5-2 cm)

MS + 2mg/l BA + 0,5 mg/l NAA MS/2 + 2 mg/l NAA

Cụm chồi non Chồi tạo rễ

với đầy đủ giai đoạn từ việc khử mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% thời gian 15 phút trong

điều kiện nuôi cấy vô trùng, sau đó nhân nhanh chồi bằng sử dụng môi trường cơ bản là

MS có bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng là 3ppm BAP + 0,5ppm IAA Thời gian nhân nhanh chồi khoảng 60 ngày Tiếp theo ông tạo cây hoàn chỉnh bằng cách lấy cụm chồi hình thành trong giai đoạn nhân chồi tách ra và cấy vào môi trường MS có bổ sung 0,5 ppm NAA để hình thành rễ tạo cây hoàn chỉnh

2.4.2 Nghiên cứu về Bình vôi

2.4.2.1 Nước ngoài

- Một phương pháp khai thác rotudin bằng cách tách sắc ký lớp mỏng của stepharine và xác định quang phổ của nó được phát triển để đo lường các chất trong Stephania Glabra nuôi cấy tế bào thực vật (Bondarenko L T., 1988)

- Tế bào của cây Stephania glabra Miers được nuôi cấy lỏng và phát triển trên môi trường dinh dưỡng Murasige và Skoog có bổ sung kinetin (0,1 mg / l) và 2,4-D (1,0 mg / l)

Hệ thống cấy treo bao gồm các tế bào đơn và tổng hợp lên đến 2 mm là kích thước với cấu trúc nhất định Khi 2,4-D (axit 2,4-dichlorphenoxiacetic) trong môi trường dinh dưỡng đã được thay đổi bằng NAA (Alpha-naphthylacetic) hoặc IAA (Axit beta-indolylacetic) ở nồng độ 0,1 và 0,5 mg / l trong phần mô phân sinh, nhóm các tế bào cung cấp sự hình thành khởi đầu của phôi Các phôi với chiều dài 1,5-2,0 mm đã được chuyển sang môi trường rắn Sau 60 ngày trên môi trường rắn các phôi hình thành các cây mà lá đầu tiên là lá mầm

- Aun Chea và ctv (2007), đã nghiên cứu hoạt tính của hợp chất rotundin chiết xuất

từ củ Bình vôi (Stephania rotunda) Kết quả cho thấy, rotundin có kết quả tốt trong điều trị

một số bệnh đặc biệt là bệnh mất ngủ và không có tác dụng phụ

- Bun Sok-Siya và ctv (2009), đã chiết xuất cepharanthin từ loài Bình vôi

Stephania rotunda có tác dụng ức chế 2 dòng tế bào ung thư đại trực tràng và ung thư gan

với IC50 tương ứng là 2,4 và 5,3 M

- Theo Semwal Deepak Kumar (2009), một alkaloid nhóm Hasubanan được chiết

xuất từ loài Bình vôi Stephania glabra có tác dụng kháng một số vi khuẩn sau: Staphylococcus aureus, S mutans, Microsporum gypseum, M canis và Trichophyton rubrum

2.4.2.2 Trong nước

Trần Hùng (1989), đã thực hiện đề tài “Bước đầu nghiên cứu các loài Bình vôi ở các tỉnh phía Nam”, báo cáo tại Hội thảo quốc gia về cây thuốc (thành phố Hồ Chí Minh) cho thấy sự quan trọng của cây Bình vôi Đưa ra các dược tính quan trọng của củ Bình vôi

và cách chiết xuất hợp chất rotundin để điều trị bệnh mất ngủ (Viện dược liệu, 2005)

Huỳnh Thị Thu Huệ và ctv (2000), nghiên cứu tách dòng gen 18s rRNA từ cây

Bình vôi (Stephania) bằng kỹ thuật PCR và phục vụ cho các nghiên cứu phân loại học phân

tử

Lã Đình Mỡi và ctv (2003), nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái, cùng với các thí nghiệm nhân giống bằng sinh dưỡng và bằng hạt của một số loài trong chi Bình vôi

(Stephania Lour.) được thu thập ở các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc Qua kết quả

nghiên cứu tác giả kết luận số loài Bình vôi ở nước ta phong phú đa dạng song đã bị khai thác cạn kiệt nên nhiều loài đã đứng trước nguy cơ tiệt chủng (5 loài đưa vào sách đỏ) Do

đó việc bảo tồn và nhân giống các loài Bình vôi đặc biệt được quan tâm Cũng theo kết quả nghiên cứu việc nhân giống các loài Bình vôi từ hạt đều đạt hiệu quả cao Và trong các loài

Bình vôi thì có 2 loài có chứa hàm lượng L-tetrahydropalmatin cao đó là loài Stephania glabra và Stephania brachyandra

Huỳnh Đào Lân (2005), đã nghiên cứu điều tra đánh giá vùng nguyên liệu cây Bình vôi và đề xuất công nghệ chiết xuất chất rotudin làm thuốc an thần gây ngủ ở Nghệ An Thông qua đề tài nhằm khai thác và phát triển nguồn nguyên liệu sẳn có trong tỉnh để chủ động sản xuất, ổn định nguồn nguyên liệu và đáp ứng nhu cầu phòng và chữa bệnh của nhân dân trong tỉnh và xuất khẩu

Phạm Thanh Kỳ và ctv (2007), nghiên cứu về alkaloid trong loài Bình vôi

Stephania viridiflavens cho thấy hàm lượng alkaloid toàn phần trong củ Bình vôi thu hái ở

Sơn La là 2,92%, trong đó L-tetrahydropalmatin là 0,63% và palmatin là 0,32% Phân lập được 2 alkaloid là L-tetrahydropalmatin và palmatin

Nguyễn Quốc Huy và ctv (2009), nghiên cứu về đặc điểm thực vật của 2 loài Bình

vôi thuộc chi Stephania Lour Thu hái ở Ba Vì (Hà Nội) và Sapa (Lào Cai) Qua các đặc

điểm chi tiết về hình thái của các bộ phận từ thân, lá, hoa, quả, hạt của cây đực và cây cái

Từ đó xác định được 2 loài này có tên khoa học là Stephania dielsiana Y C Wu và Stephania brachyandra Diels, đều thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae)

Mã Chí Thành và Trần Hùng (2011), đã chiết xuất, phân lập alkaloid của Bình vôi

Cam bốt Stephania cambodia Gagnep (thu hái tại tỉnh An Giang năm 2007) để định hướng

nghiên cứu tiếp theo về tiêu chuẩn hóa dược liệu, tác dụng dược lý hay ứng dụng trong thực

tế của dược liệu này Việc phân lập các chất tinh khiết được thực hiện bằng phương pháp sắc ký chân không Kết quả từ 4,5 kg nguyên liệu thô của củ Bình vôi Cam bốt đã thu được alkaloid toàn phần Sau đó qua các phân đoạn đã phân lập được 2 chất là palmatin và jatrorrhizin

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm khử mẫu Nghệ xà cừ và nhân giống cây Bình vôi bằng phương pháp nuôi cấy mô

- Địa điểm: Tại nhà lưới vườn nhà Long Xuyên, An Giang

3.2 Phương tiện nghiên cứu

3.2.1 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

 Dụng cụ:

- Bộ micropipet

- Chai lọ, cốc thủy tinh, ca nhựa có chia vạch, ống đong, đũa thủy tinh, đĩa petri,…

- Dao, kéo cắt mẫu, kẹp cấy, giấy tiệt trùng, bông gòn, đèn cồn, nước cất…

- Viết, sổ, thước đo có chia vạch mm, thước kẹp, máy chụp hình

- Bình xịt, lưới, dao, leng, lưới, dây, bảng nghiệm thức,…

Myo-+ Các chất điều hòa sinh trưởng: NAA, BA, TDZ ở các nồng độ khác nhau

+ Đường saccharose 20g/l, agar 8g/l, với pH = 5.8

3.3 Phương pháp nghiên cứu

 Vật liệu: củ Nghệ giống mang về rửa sạch, đem ủ với tro trấu sạch, tưới ẩm, giữ trong mát từ 3 đến 4 tuần lên mầm Thu hoạch các mầm to khỏe và tiến hành khử

mẫu theo qui trình

 Qui trình khử mẫu:

(a) Thao tác ngoài tủ cấy:

- Chọn chồi Nghệ tốt, cắt tỉa khỏi thân củ

- Sau đó rửa dưới vòi nước chảy 10-15 phút

- Tiếp theo lắc với xà phòng 5-10 phút Rửa lại thật sạch dưới vòi nước 20-25 phút

(b) Thao tác trong tủ cấy: Sử dụng khử trùng mẫu với 1 loại hoá chất hay khử

trùng kép với 2 loại hoá chất có nồng độ và thời gian thay đổi theo hình 5

được chuẩn bị sẳn

 Môi trường nuôi cấy: MS + BA (2 mg/l) + NAA (0,5 mg/l)

Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần

Lắc mẫu trong hóa chất với thời gian thay đổi

Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 4-5 lần để

loại bỏ hết hóa chất khử (hình 4)

Lắc mẫu trong Ca(ClO)2 10%, HgCl2 0,1 % hoặc Chloramine B 5%, với thời gian thay đổi

Lắc mẫu trong cồn 70% trong 1 phút

Cắt tỉa lại mẫu và cấy

vào môi trường

Bảng 2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khử mẫu Nghệ xà cừ

Nghiệm thức Thời gian đối với hóa chất khử trùng (phút)

Ghi chú: %: khối lượng/thể tích (g/l)

 Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) =

- Tỷ lệ mẫu chết (%) =

- Tỷ lệ mẫu vô trùng in vitro (%) = 100% - (tỷ lệ mẫu nhiễm + tỷ lệ mẫu chết)

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 7, 14 ngày sau khi cấy

 Thống kê và xử lí số liệu bằng phần mềm MSTATC

Hóa chất khử mẫu: HgCl2 0,1%; Hypochloric Calci (Ca(Ocl)2) 10%; và Chloramine

B 5% với các thời gian khác nhau

 Qui trình khử mẫu:

(a) Thao tác ngoài tủ cấy:

- Cắt tỉa lá và mỗi đoạn chứa một mầm ngủ của Bình vôi

- Sau đó cho vào keo và rửa dưới vòi nước chảy 10-15 phút

- Tiếp theo lắc với xà phòng 5-10 phút

- Rửa lại thật sạch dưới vòi nước 20-25 phút

Tổng số mẫu nhiễm x 100 Tổng số mẫu đưa vào Tổng số mẫu chết x 100 Tổng số mẫu đưa vào

(b) Thao tác trong tủ cấy: Sử dụng khử trùng mẫu với 1 loại hoá chất hay khử

trùng kép với 2 loại hoá chất có nồng độ và thời gian thay đổi theo hình 6

trùng kép}

Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần

Lắc mẫu trong hóa chất với thời gian thay đổi

Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 4-5 lần để

loại bỏ hết hóa chất khử

Lắc mẫu trong Ca(ClO)2 10%, HgCl2

Lắc mẫu trong cồn 70% trong 1 phút

Cắt tỉa lại mẫu và cấy

vào môi trường

Hình 7. Quy trình khử trùng mẫu Bình vôi trong tủ cấy

A Mẫu sau khi khử trùng bên ngoài đem vào tủ cấy; B Rữa mẫu với nước cất sau khi khử cồn; C Mẫu được khử với hoá chất khử trùng; D Mẫu sau khi khử trùng và được rữa sạch với nước cất; E Mẫu được cắt tỉa và cấy vào môi trường

 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí trong phòng nuôi cấy mô theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 8 nghiệm thức (Bảng 3), mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo chứa 15 mẫu Sau đó, cấy mỗi mẫu vào 1 keo môi trường đã

Bảng 3. Các nghiệm thức trong thí nghiệm khử mẫu Bình vôi

Nghiệm thức Hoá chất và thời gian khử trùng

Ghi chú: %: khối lượng/thể tích (g/l)

 Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) =

- Tỷ lệ mẫu chết (%) =

- Tỷ lệ mẫu vô trùng in vitro (%) = 100% - (tỷ lệ mẫu nhiễm + tỷ lệ mẫu chết)

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 7, 14 ngày sau khi cấy

 Thống kê và xử lí số liệu bằng phần mềm MSTATC

 Mục đích: tạo chồi Bình vôi từ việc kích thích mầm ngủ của mẫu cấy vô trùng

 Vật liệu: mẫu chồi Bình vôi in vitro thu được từ thí nghiệm 2

 Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí trong phòng nuôi cấy mô theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 nghiệm thức (Bảng 4), mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo, 2 mẫu cấy trên mỗi keo

 Môi trường nuôi cấy: MS + 0,5 g/l than hoạt tính và BA, TDZ, NAA ở các nồng độ

khác nhau

Tổng số mẫu nhiễm x 100 Tổng số mẫu đưa vào Tổng số mẫu chết x 100 Tổng số mẫu đưa vào

Bảng 4. Ký hiệu nghiệm thức và môi trường nuôi cấy tạo chồi Bình vôi

Nghiệm thức Nồng độ NAA

(mg/l)

Nồng độ BA (mg/l)

Nồng độ TDZ (mg/l)

 Chỉ tiêu theo dõi:

- Số chồi (chồi): đếm tổng số chồi mới tạo thành trên mỗi mẫu cấy

- Chiều cao chồi (mm): tính chiều cao trung bình đo từ mặt môi trường đến đỉnh chồi

- Số lá (lá): tính trung bình số lá mới tạo thành trên cụm chồi (tính lá đã xòe ra)

- Đặc điểm hình thái (chất lượng chồi): bằng quan sát cảm quan

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần và 5 tuần sau khi cấy

 Thống kê và xử lí số liệu bằng phần mềm MSTATC

Bình vôi

 Mục đích: tạo số lượng lớn chồi Bình vôi

 Vật liệu: mẫu chồi Bình vôi in vitro thu được từ thí nghiệm 3

 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí trong phòng nuôi cấy mô theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo Cấy 2 chồi trên mỗi keo

 Cách tiến hành: Mẫu chồi sau khi được tạo thành ở thí nghiệm 2 sẽ được cắt tách thành từng đoạn mang 1 chồi và cấy chuyền sang môi trường MS có bổ 0,5 mg/l than hoạt tính với nồng độ BA, TDZ và nước dừa được bổ sung theo bảng 5

Bảng 5. Ký hiệu nghiệm thức và môi trường nuôi cấy nhân chồi Bình vôi

Nghiệm thức Nồng độ BA

(mg/l)

Nồng độ TDZ (mg/l)

 Chỉ tiêu theo dõi:

- Số chồi (chồi): đếm tổng số chồi mới tạo thành trên mỗi mẫu cấy

- Chiều cao chồi (mm): tính chiều cao trung bình chồi mới đo từ mặt môi trường đến đỉnh chồi

- Số lá (lá): tính trung bình số lá mới tạo thành trên chồi chính (tính lá đã xòe ra)

- Đặc điểm hình thái (chất lượng chồi): bằng quan sát cảm quan

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 1 tuần, 2 tuần, 4 tuần và 5 tuần sau khi cấy

 Thống kê và xử lí số liệu bằng phần mềm MSTATC

3.3.2.4 Thí nghiệm 5: Tạo cây Bình vôi hoàn chỉnh

 Mục đích: tạo rễ hay tạo cây Bình vôi hoàn chỉnh để chuyển ra vườn ươm

 Vật liệu: mẫu chồi Bình vôi thu được từ thí nghiệm 4

 Cách tiến hành: Mẫu chồi Bình vôi sau khi thu được từ thí nghiệm 4 sẽ được tách thành từng chồi riêng và cấy vào môi trường có NAA để tạo cây hoàn chỉnh

 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí trong phòng nuôi cấy mô theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 nghiệm thức (Bảng 6), mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo Cấy 2 chồi trên mỗi keo