Phân lập vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ kiệu muối chua cơm mẻ lạp xưởng tươi và antibio

Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng nhóm vi khuẩn lactic được phân lập trong các loại thực phẩm lên men có khả năng sinh chất kháng khuẩn.. Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập 1-2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ KIỆU MUỐI CHUA, CƠM

MẺ, LẠP XƯỞNG TƯƠI VÀ ANTIBIO

Sinh viên thực hiện: PHAN THỊ BÍCH DUYÊN

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

An Giang, tháng 01 năm 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ KIỆU MUỐI CHUA, CƠM

MẺ, LẠP XƯỞNG TƯƠI VÀ ANTIBIO

Sinh viên thực hiện: PHAN THỊ BÍCH DUYÊN

DSH113488 NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

DSH113512

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Ths Lê Hoàng Bảo Ngọc

Đề tài nghiên cứu khoa học” Phân lập vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi và antibio”, do sinh viên Phan Thị Bích Duyên và Nguyễn Thị Phương Thảo thực hiện dưới sự hướng dẫn của cô Lê Hoàng Bảo Ngọc Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo Khoa Nông nghiệp-TNTN, Trường Đại học An Giang thông qua ngày………

Chủ tịch hội đồng Thư ký

Phản biện 1 Phản biện 2

Cán bộ hướng dẫn

Lời cảm ơn

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện nghiên cứu khoa học này, ngoài sự nổ lực của bản thân, chúng em đã được sự hỗ trợ rất lớn của tập thể thầy cô

và gia đình Qua đây chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Cha mẹ với công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và là chỗ dựa tinh thần vững chắc luôn quan tâm, lo lắng, tạo mọi điều kiện cả về vật chất và tinh thần để chúng con có thể học tập, rèn luyện và tự hoàn thiện mình trong suốt thời gian qua

Quý thầy cô Khoa Nông nghiệp – Tài nguyên Thiên nhiên và Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại trường

Cô Lê Hoàng Bảo Ngọc, cô Bằng Hồng Lam và thầy Nguyễn Phú Thọ đã hết lòng hướng dẫn, nhiệt tình giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho chúng em trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Các thầy cô, các anh chị phòng thí nghiệm đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi để chúng em hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Xin chân thành gửi lời chúc sức khỏe và thành đạt đến tất cả quý thầy cô và anh chị Trân trọng cảm ơn!

An Giang, ngày 02 tháng 01 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Phan Thị Bích Duyên

Nguyễn Thị Phương Thảo

Abstract

Urgency: Food poisoning has become one of the urgent problems to be solved in order to protect human health, the use of food preservatives are restricted chemical use because of side effects its unprofitable Currently, many studies demonstrate that groups of lactic acid bacteria isolated in fermented foods have antibacterial fertility This form of antibacterial resistance to the development of pathogens and is used as food preservatives

Research Objective: Isolation of lactic acid bacteria 1-2 infertile antimicrobial in food fermentation and lyophilized enzyme

Research Contents: Isolation of lactic acid bacteria from fermented products procession, fresh rice, fresh sausage, antibio survey morphological characteristics, biochemical test isolates was finally examined antibacterial fertility of the isolates Method: Check the ability to produce antimicrobial substances from the isolates by

diffusion method on agar wells combined with indicator bacteria Escherichia coli

Survey process was conducted on two experiments:

- Experiment 1: Isolation of lactic acid bacteria from the batch of rice, fresh sausage, pickled and antibio procession and perform a few checks identify lactic bacteria

- Experiment 2: The survey and selection of lactic acid bacteria antibacterial born Results: Isolation of 11 strains of lactic acid bacteria and antimicrobial test, in which

5 strains capable synthetic antibacterial agent: CM1, LX1, LX2, A1 and A2 but their antimicrobial properties rather weak Therefore, the lactic acid bacteria in samples isolated antibacterial born weak

Tóm tắt

Tính cấp thiết: Ngộ độc thực phẩm đã trở thành 1 trong những vấn đề cấp thiết cần được giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người, việc dùng chất bảo quản thực phẩm hóa học đang bị hạn chế sử dụng vì những tác dụng phụ không có lợi của nó Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng nhóm vi khuẩn lactic được phân lập trong các loại thực phẩm lên men có khả năng sinh chất kháng khuẩn Dạng chất kháng khuẩn này có khả năng chống lại sự phát triển của mầm bệnh và được ứng dụng như chất bảo quản thực phẩm

Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập 1-2 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn trong các thực phẩm len men và men tiêu hóa đông khô

Nội dung nghiên cứu: Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio, khảo sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa các chủng phân lập được, cuối cùng khảo sát khả năng sinh chất kháng khuẩn của các chủng phân lập được

Phương pháp: Kiểm tra khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn từ các dòng phân lập bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch kết hợp với vi khuẩn chỉ thị

Escherichia coli

Quá trình khảo sát được tiến hành trên 2 thí nghiệm:

- Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn lactic từ sản phẩm cơm mẻ, lạp xưởng tươi, kiệu muối chua và antibio đồng thời thực hiện một vài kiểm tra nhận diện vi khuẩn lactic

- Thí nghiệm 2: Khảo sát và chọn lọc các chủng vi khuẩn lactic sinh chất kháng

khuẩn

Kết quả: Phân lập được 11 chủng vi khuẩn lactic và kiểm tra tính kháng khuẩn, trong

đó 5 chủng có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn: CM1, LX1, LX2, A1 và A2 nhưng tính kháng khuẩn của chúng khá yếu Vì vậy, các chủng vi khuẩn lactic trong các mẫu phân lập được sinh kháng khuẩn yếu

Lời cam kết

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu trong công trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng Những kết luận mới về khoa học của công trình nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Long Xuyên, ngày 02 tháng 01 năm 2016

Phan Thị Bích Duyên

Nguyễn Thị Phương Thảo

Mục lục

Nội dung Trang

Lời cảm ơn i

Abstract ii

Tóm tắt iii

Lời cam kết iv

Mục lục v

Danh sách hình viii

Danh sách bảng ix

Danh sách sơ đồ x

Danh sách chữ viết tắt xi

Chương 1 Giới thiệu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 Lược khảo tài liệu 3

2.1 Giới thiệu về cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp xưởng tươi và antibio 3

2.1.1 Cơm mẻ 3

2.1.2 Kiệu muối chua 3

2.1.3 Lạp xưởng tươi 5

2.1.4 Antibio 5

2.2 Vi khuẩn lactic 6

2.2.1 Đặc điểm chung 6

2.2.2 Sự phân bố 7

2.2.3 Phân loại vi khuẩn lactic 7

2.2.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 9

2.2.5 Những ứng dụng của vi khuẩn lactic 10

2.3 Quá trình lên men lactic 12

2.4 Sơ lược về vi khuẩn chủng chỉ thị Escherichia coli (E.coli) 13

2.4.1 Phân loại khoa học (Castellani & Chalmers, 1919) 13

2.4.2 Đặc điểm cơ bản của Escherichia coli (Nguyễn Lân Dũng, 2008) 13

2.5 Chất kháng khuẩn 15

2.5.1 Tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic 15

2.5.2 Sơ lược về bacteriocin 15

2.5.2.1 Giới thiệu chung 15

2.5.2.2 Phân loại 16

2.5.2.3 Cơ chế tác động 17

2.5.3 Lợi ích và hạn chế của bacteriocin 18

2.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic trong và ngoài nước 19

2.6.1 Trong nước 19

2.6.2 Ngoài nước 20

Chương 3 Phương pháp nghiên cứu 21

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

3.2 Mẫu nghiên cứu 21

3.3 Thiết kế nghiên cứu 21

3.4 Công cụ nghiên cứu 21

3.4.1 Thiết bị và dụng cụ 21

3.4.2 Môi trường và hóa chất: 22

3.5 phương pháp nghiên cứu 23

3.5.1 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu: cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp xưởng tươi, antibio và quan sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa để nhận diện vi khuẩn lactic 23

3.5.1.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ kiệu muối chua 23

3.5.1.2 Phân lập vi khuẩn lactic từ cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio 24

3.5.1.3 Khảo sát đặc điểm hình thái và kiểm tra sinh hóa để nhận diện vi khuẩn lactic 25 3.5.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic phân lập được 28

3.5.2.1 Chuẩn bị dịch ly tâm vi khuẩn lactic 28

3.5.2.2 Chuẩn bị dịch huyền phù của dòng chỉ thị vi khuẩn E.Coli 28

3.5.2.3 Thử khả năng sinh chất kháng khuẩn 28

Chương 4 Kết quả và thảo luận 31

4.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn lactic trong 4 mẫu sản phẩm, quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm gram và kiểm tra sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập được 31

4.1.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn lactic trong 4 mẫu sản phẩm và quan sát hình

thái khuẩn lạc của chúng 31

4.1.2 Kết quả nhuộm gram và kiểm tra sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập được 34

4.2 Kết quả xác định và chọn lọc những chủng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn cao 40

Chương 5 Kết luận và kiến nghị 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

Tài liệu tham khảo 45

Danh sách hình

Nội dung Trang

Hình 1: Cơm mẻ 3

Hình 2: Kiệu muối chua 4

Hình 3: Lạp xưởng tươi 5

Hình 4: Antibio 6

Hình 6: Vi khuẩn lactic hình que 6

Hình 5: Vi khuẩn lactic hình cầu 6

Hình 7: Vi khuẩn E.coli 14

Hình 8: Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli 14

Hình 9: Vi khuẩn E.coli chụp dưới kính hiển vi 100X 14

Hình 10: Mô tả vòng kháng khuẩn trên đĩa petri 29

Hình 11: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu Antibio: A1 33

Hình 12: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu cơm mẻ: CM2 33

Hình 13: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu Kiệu: K1 34

Hình 14: Hình thái khuẩn lạc trên mẫu Lạp xưởng tươi: LX1 34

Hình 15: Hình thái tế bào vi khuẩn của chủng A1 36

Hình 16: Hình thái tế bào vi khuẩn của chủng CM2 36

Hình 17: Hình thái tế bào vi khuẩn của dòng K1 37

Hình 18: Hình thái tế bào vi khuẩn của dòng LX1 37

Hình 19: Kết quả kiểm tra sinh hóa của chủng A1 38

Hình 20: Kết quả kiểm tra sinh hóa của chủng CM2 38

Hình 21: Kết quả kiểm tra sinh hóa của chủng K1 39

Hình 22: Kết quả kiểm tra sinh hóa của chủng LX1 39

Hình 23: Vòng kháng khuẩn của chủng A1 41

Hình 24: Vòng kháng khuẩn của chủng A2 41

Hình 25: Vòng kháng khuẩn của chủng CM1 42

Hình 26: Vòng kháng khuẩn của chủng LX1 42

Hình 27: Vòng kháng khuẩn của chủng LX2 43

Danh sách bảng

Nội dung Trang Bảng 1: Các chi vi khuẩn lactic, kiểu lên men và sản phẩm chính 8Bảng 2: Thành phần môi trường MRS Broth 22Bảng 3: Thành phần môi trường Nutrient 22Bảng 4: Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn và quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc 32Bảng 5: Kết quả kiểm tra sinh hóa các chủng vi khuẩn lactic phân lập được 35Bảng 6: Kích thước vòng kháng khuẩn của 5 chủng vi khuẩn 40

Danh sách sơ đồ

Nội dung Trang

Sơ đồ 1: các bước phân lập vi khuẩn lactic từ kiệu muối chua 23

Sơ đồ 2: phân lập vi khuẩn lactic từ cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio 25

Sơ đồ 3: quy trình nhuộm gram 26

Sơ đồ 4: kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn 30

Chương 1 Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, ngộ độc thực phẩm đã trở thành một trong những vấn đề cấp thiết cần được giải quyết để bảo vệ sức khỏe con người Bên cạnh đó, việc dùng chất bảo quản thực phẩm hóa học đang bị hạn chế sử dụng vì những tác dụng phụ không có lợi của

nó Theo thống kê của Bộ Y tế, hàng năm có khoảng 200 – 600 trường hợp ngộ độc thực phẩm, trong đó chiếm 50% là ngộ độc do vi sinh vật (Lương Đức Phẩm, 2005)

Ở nước ta, các sản phẩm lên men truyền thống đã có từ rất lâu đời và được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và trong các ngành công nghiệp thực phẩm Thực phẩm tạo thành do quá trình lên men lactic từ các chủng vi khuẩn rất phong phú và công nhận

an toàn đối với người sử dụng Tuy nhiên, từ trước đến nay vi khuẩn vẫn luôn bị hiểu lầm là loài vi sinh vật gây hại vì con người thường gắn liền chúng với bệnh tật Nhưng trên thực tế, có rất nhiều loại vi khuẩn có lợi cho chúng ta Trong hệ tiêu hóa của chúng ta có một hệ vi sinh vật với số lượng rất lớn, trong đó có hơn 400 loài vi

khuẩn khác nhau (Melissa Peterson et al., 2002), đặc biệt là chủng vi khuẩn lactic

Người ta đã chứng minh chắc chắn rằng nhiều loại vi khuẩn lactic sản sinh ra chất

kháng khuẩn (Pongtep Wilaipun et al., 2002) Hoạt động kháng vi sinh vật của nhóm

vi khuẩn này đã được ứng dụng hơn 10.000 năm qua và con người đã có thể kéo dài thời gian sử dụng của nhiều loại thực phẩm thông qua quá trình lên men do vi khuẩn này lên men Phần lớn hiệu quả bảo quản của vi khuẩn lactic là do khả năng sinh tổng hợp nhiều thành phần có tác dụng ức chế như: các acid hữu cơ, H2O2, và bacteriocin (Lindgren & Dobrogosz, 1990; Piard & Desmazeaud, 1992) Do đó, việc

sử dụng các dòng vi khuẩn có lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hiện đang được chú trọng, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic Trong tương lai có thể sử

dụng trong bảo quản thực thực phẩm như một biện pháp sinh học (Hugas et al.,

2003) Nhóm vi khuẩn này có ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn với acid lactic là nguyên liệu cần thiết của nhiều ngành công nghiệp Đặc biệt, trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm như sữa chua, các loại dưa từ rau củ, các loại sản phẩm thủy sản lên men (Lương Đức Phẩm, 2004) do đó ta có thể ứng dụng nó trong việc sản xuất các chế phẩm probiotic có lợi cho sức khỏe Hơn nữa, hệ vi sinh khuẩn lactic là một trong những nguồn vi sinh vật sinh ra bacteriocin, dạng chất kháng khuẩn có khả năng chống lại sự phát triển của các mầm bệnh và được ứng dụng như chất bảo quản thực phẩm, điển hình là nisin

Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện cũng khá phổ biến chủ yếu trong sản phẩm lên men truyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua và một số sản phẩm men tiêu hoá đông khô Nên vấn đề sản xuất và bảo quản thực phẩm lên men an toàn cũng rất cấp thiết

Đề tài “Phân lập vi khuẩn lactic trên rau quả muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi và antibio có khả năng sinh chất kháng khuẩn” được thực hiện Nhằm làm tiền đề cho việc nghiên cứu dòng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn cao để ứng dụng trong sản xuất và bảo quản thực phẩm lên men

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập được 1 - 2 chủng vi khuẩn có khả năng sinh chất kháng khuẩn trong các sản phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio và khảo sát khả năng kháng

khuẩn của chúng

1.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm kiệu muối chua, cơm mẻ, lạp xưởng tươi, antibio và khảo sát đặc điểm hình thái, kiểm tra sinh hóa các chủng phân lập được

Khảo sát khả năng sinh chất kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được

Hình 1: Cơm mẻ (Nguyễn Anh Tuấn, 2011)

Chương 2 Lược khảo tài liệu 2.1 Giới thiệu về cơm mẻ, kiệu muối chua, lạp xưởng tươi và antibio

2.1.1 Cơm mẻ

Lên men cơm mẻ chủ yếu là lên men vi khuẩn lactic có nhiều chủng loại vi khuẩn lactic tham gia theo kiểu đồng hình hay dị hình Hệ vi sinh vật trong cơm mẻ truyền thống gồm: tuyến trùng, nẩm men và vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic lên men chua

(sản sinh acid lactic) từ tinh bột chín (Nguyễn Văn Bá, 2008)

C6H12O6 CH3CHOCOH + Kcal (lên men đồng hình)

(Acid lactic)

Bản thân vi khuẩn lactic tạo nên chất kháng sinh cần thiết để diệt các vi sinh vật có hại khác nên rất có lợi cho người ăn Cũng nhờ những đặc tính này mà ăn cơm mẻ sống có lợi hơn nhiều khi ăn cơm mẻ chín

2.1.2 Kiệu muối chua

Quá trình lên men lactic trong muối chua kiệu chia thành ba giai đoạn: (Internet8) Giai đoạn 1: Muối ăn (NaCl) có nồng độ 2,5 – 3% khi muối kiệu sẽ làm cho môi trường ưu trương đường và các chất từ tế bào kiệu một phần sẽ khuếch tán ra môi trường, do đó vi khuẩn lactic cùng các vi sinh vật khác cùng phát triển

Giai đoạn 2: Do vi khuẩn lactic phát triển mạnh, nên pH môi trường giảm xuống 3 – 3,5 làm ức chế các vi khuẩn khác, chỉ còn vi khuẩn lactic phát triển, chúng chiếm ưu thế tuyệt đối, kiệu trở nên chua, ngon Đây là giai đoạn quyết định, nếu không tạo được ưu thế của vi khuẩn lactic, thì các vi khuẩn khác sẽ phát triển làm kiệu khú bởi các nguyên nhân sau:

- Kiệu rửa không kỹ, làm dập nát, có nhiều tạp khuẩn

- Cho muối không đúng 2,5 – 3% (nếu quá 5 – 6% sẽ ức chế cả vi khuẩn lactic, nếu dưới 3% thì nhiều tạp khuẩn sẽ phát triển lấn át)

- Không đậy, nén kỹ, không tạo được điều kiện kỵ khí cho vi khuẩn lactic phát triển

pH là yếu tố rất quan trọng, nếu vi khuẩn lactic phát triển ưu thế thì pH sẽ là 3 – 3,5, còn nếu không thì vi sinh vật khác sẽ phát triển (pH 4,5 – 5: vi khuẩn gây thối hoạt động, pH 5 – 5,5: vi khuẩn đường ruột phát triển, pH 2,5 – 3: nấm men dại hoạt động, pH 1,2 – 3: nấm mốc phát triển)

Giai đoạn 3: Khi kiệu đã chua, pH giảm xuống đến 3, thì ngay cả vi khuẩn lactic cũng bị ức chế, nếu cứ để tự nhiên như vậy thì các nấm men dại, nấm mốc sẽ bắt đầu phát triển phân giải axit lactic thành CO2 và H2O, pH tăng lên, sản phẩm bắt đầu có váng (váng dưa, váng cá) và môi trường giảm chua, có mùi mốc, có nhiều bọt khí

(nấm men dại thường có là Geotrichumcandidum)

Khi muối kiệu lên men lactic ra sẽ có thành phẩm đạt yêu cầu:

- Tạo được sinh khối vi khuẩn có ích, át các sinh vật gây thối

- Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm

- Chuyển kiệu về dạng “chín sinh học” do đó mà hiệu suất tiêu hóa tăng Nếu muốn giữ sản phẩm không cho “quá lactic” thì có thể giữ ở nhiệt độ thấp (20C-40C) đồng thời bổ sung chất diệt nấm như bensozt natri 1%, dịch chiết tỏi, gừng, giềng Cần nói thêm rằng vi khuẩn lactic không phá vỡ tế bào thực vật, nên kiệu muối chua vẫn

có hình dạng gần như không thay đổi

Hình 2: Kiệu muối chua (Trịnh Huyền Na, 2014)

2.1.3 Lạp xưởng tươi

Lạp xưởng tươi là sản phẩm thịt lên men phổ biến của một số tỉnh miền Tây: Tiền Giang, Sóc Trăng… với sự phối trộn hài hòa giữa thịt, mỡ, một số phụ gia và sự lên men lactic của hệ vi sinh vật làm cho lạp xưởng chua có kết cấu, hương vị và màu sắc đặc trưng Vì hàm lượng nước trong sản phẩm còn cao (khoảng 45%) nên sản phẩm có cấu trúc mềm hơn lạp xưởng khô và để tránh hư hỏng phải bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ lạnh

2.1.4 Antibio

Cơ chế tác động có ích của Lactobacillus acidophilus chứa trong antibio bao gồm:

- Lactobacillus acidophilus có khả năng tạo ra các chất có tác dụng kiềm khuẩn trực

tiếp như: acid lactic, lactocidin, acidophilin

- Lactobacillus acidophilus kích thích miễn dịch không chuyên biệt của niêm mạc:

Hình 3: Lạp xưởng tươi (Nguyễn Hòa, 2008)

men carbohydrate tạo sản phẩm chính cuối cùng là acid lactic (Abee et al., 1999)

Vi khuẩn lactic có khả năng phân giải H2O2 để tạo ra nước và O2 để phát triển

Hình 6: Vi khuẩn lactic hình que (Hoàng Văn Vinh, 2006)

Hình 5: Vi khuẩn lactic hình cầu

(Hoàng Văn Vinh, 2006)

Hình 4: Antibio (Thanh Hoài, 2013)

2.2.2 Sự phân bố

Ít gặp trong đất và nước, thường phát triển trong những môi trường có chứa nhiều chất hữu cơ phức tạp như:

- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp Lactobacillus lactic, Lactobacillus

bulgarius, Lactobacillus helviticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus ferment, Lactobacillus brevis, Streptococcus diacetyllactis Để tồn tại trong môi trường sữa vi

khuẩn lactic tổng hợp ATP từ cơ chất lactose

- Trên bề mặt thực vật và xác thực vật đang bị phân giải hay có Lactobcillus

plantanium, Lactobcillus delnikii, Lactobcillus ferment, Lactobacillus brevis, Streptococcus lactis Chúng còn được tìm thấy trên các loại rau quả, trái cây

- Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có Lactobacillus acidophilus,

Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus salivanius, Streptococcus pyogenes, Bifidobacterrium, Pneumococcus

2.2.3 Phân loại vi khuẩn lactic

Dựa vào quá trình lên men đường: có 2 loại

- Vi khuẩn lactic đồng hình: Streptococus lactic, Streptococcus cremoris,… Vi

khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85%- 95% acid lactic Do thiếu porphyrin

và cytochrom, không có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu năng lượng bằng con đường lên men bắt buộc Trong tế bào vi khuẩn có chứa enzymealdolase và triosophotphatizomerase

- Vi khuẩn lactic dị hình: Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh 50% acid lactic, 25% cồn và 25% acid acetic Nhóm vi khuẩn này gồm có các vi khuẩn sinh

hương Streptococcus votrovorus, Streptococcus paracotrovorus, Streptococcus

diactylactis, và Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermenti,

Bảng 1: Các chi vi khuẩn lactic, kiểu lên men và sản phẩm chính (Lê Văn Việt Mẫn,

2014)

Dựa vào hình thái: người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que, kích thước thay đổi tùy loài

Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào 0,5 m

-1 m Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn

Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5 m

-0,8 m và chiều dài khoảng 1,6 m Trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1-3 m Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung

- Giống Lactobacillus có dạng hình que Tùy vào điều kiện của môi trường sống mà

hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài Sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ

- Giống Pediococcus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn Có hoạt tính thủy

phân protein rất yếu

- Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể phân nhánh

dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối Sau nhiều lần cấy truyền chúng trở thành dạng trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong

Chi và dưới chi Kiểu lên men

Sản phẩm chính (Tỷ lệ phân tử)

Cấu hình của acid lactic

-Vi khuẩn lactic kỵ khí nghiêm ngặt

- Vi khuẩn lactic yếm khí tùy tiện: Pediococcus cerevisiae

- Vi khuẩn lactic vi hiếu khí (hiếu khí tùy tiện)

Dựa vào nhiệt độ phát triển tối ưu: Các vi khuẩn ưa ấm có nhiệt độ tối thích từ 250C – 370C, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích từ 500

C – 650C, nhóm ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ 50C hoặc thấp hơn (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008)

- Vi khuẩn lactic ưa ấm: Streptococus lactic, Lactobacillus casei, L plantarum,…

- Vi khuẩn lactic ưa nhiệt: Streptococus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L

helvetcus,…

2.2.4 Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn lactic

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ… (Lê Văn Việt Mẫn, 2004)

Nhu cầu dinh dưỡng cacbon:

- Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin)

- Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ

Nhu cầu dinh dưỡng nitơ:

- Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ

có sẵn trong môi trường

- Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,… Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được

sử dụng nhiều nhất và hiệu quả nhất Tuy nhiên, ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

Nhu cầu về vitamin:

- Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loại vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…

Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác:

- Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ

- Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của các acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

- Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

Nhu cầu muối vô cơ khác:

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô

cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, phospho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

2.2.5 Những ứng dụng của vi khuẩn lactic

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn cacbon hydrat khác nhau mà các chủng

vi khuẩn lactic đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất và chế biến (Lê Văn Việt Mẫn, 2004)

 Những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:

Trong công nghệ thực phẩm, việc sử dụng quá trình lên men lactic không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà còn nhằm đưa ra thị trường các loại thực phẩm có tính chất và hương vị mong muốn Các ứng dụng chủ yếu gồm:

- Chế biến các sản phẩm sữa:

+ Ngoài khả năng lên men làm cho sữa không bị hỏng, các chủng vi khuẩn lactic còn

có nhiều khả năng đặc biệt khác Nhờ đó mà người ta đã sản xuất hàng loạt các sản phẩm từ nguồn nguyên liệu sữa ban đầu

+ Như lợi dụng khả năng làm đông tụ sữa của vi khuẩn Streptococcus lactic để sản

xuất sữa chua hay khả năng tạo ra các mùi vị, tạo các chất thơm của chủng

Leuconostoc để sản xuất bơ, phomat…

+ Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong các trang trại chăn nuôi Thức ăn khi ủ không những giảm được sự tổn thất giá trị dinh dưỡng mà còn bổ sung nhiều loại vitamin do vi sinh vật tổng hợp Phương pháp này dựa vào sự chuyển hóa đường

có sẵn trong nguyên liệu của vi khuẩn lactic

+ Để khối ủ chua thức ăn gia súc có chất lượng tốt, người ta thường sử dụng vi khuẩn

lactic thuần khiết như: Lactobacillus plantarum, Thermobacterium cerealle

- Muối chua rau quả

+ Cũng như ủ chua thức ăn gia súc, vấn đề muối chua rau quả cũng nhằm thực hiện hai mục đích:

Bảo quản nguyên liệu

Làm tăng giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan

+ Đây là phương phương pháp vừa chế biến vừa bảo quản rau quả rất phổ biến, được

sử dụng nhiều trong gia đình cũng như trong kĩ nghệ đồ hợp Hiện nay có nhiều sản phẩm muối chua được sản xuất và sử dụng và sử dụng rộng rãi như dưa cải muối chua, dưa chuột muối chua…

- Sản xuất acid lactic và muối lactat

Ngoài việc ứng dụng trong các sản phẩm lên men, người ta còn sử dụng các chủng

lactic như Lctobacterium coaglulans và Lactobacillus delbrueckii để sản xuất ra một

lượng lớn acid lactic và muối lactat dùng làm chất phụ gia thực phẩm

 Ứng dụng trong y học:

- Sinh ra acid lactic, tạo ra nhiều chất chống vi khuẩn khác nhau như acid hữu cơ, diacetyl, hydrogen peroxide và các bacteriocin nên ngăn cản được sự hiện diện và

phát triển của các vi khuẩn gây bệnh như Ecoli, Salmonella (gây tiêu chảy), vi khuẩn

Pylori (gây viêm loét dạ dày) và nấm Candida

- Phòng ngừa và ngăn chặn rối loạn tiêu hóa, giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, khôi phục lại cân bằng vi khuẩn tự nhiên trong cơ thể, chuyển lactose thành acid lactic, hạn chế dị ứng do cơ thể không dung nạp được lactose

- Hơn thế nữa, vi khuẩn lactic còn có tác dụng giảm cholesterol, kháng các tác nhân gây ung thư Vài chủng vi khuẩn sinh ra những enzyme có khả năng chuyển những chất tiền sinh ung thư, những tác nhân sinh ung thư như glucosidase, azoreductase thành bệnh ung thư.Vi khuẩn lactic có khả năng ức chế sự phát triển các tế bào ung thư, ức chế hoạt động của các vi khuẩn sinh ra enzyme và phân huỷ nitrosamine

- Một số vi khuẩn lactic có khả năng bảo vệ chống lại sự phân hủy và đột biến DNA

in vitro và in vivo

 Một số ứng dụng khác:

- Ứng dụng trong ngành công nghệ vật liệu

- Ứng dụng trong ngành mỹ phẩm

Ngoài những mặt có lợi được ứng dụng và phát huy, vi khuẩn lactic còn gây ra những tác hại Gây ra hiện tượng vẫn đục và bị chua trong công nghệ sản xuất bia, nước ngọt, rượu vang, làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng của sản phẩm Do đó chúng ta cần phải có biện pháp phòng và chống lại những ảnh hưởng xấu đó (Lê Văn Việt Mẫn, 2004)

2.3 Quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình thu năng lượng nhờ vi khuẩn lactic, bao gồm sự biến đổi một phân tử đường thành 2 phân tử axit lactic và năng lượng tách ra (Lương Đức

Phẩm et al., 2009):

C6H12O6 CH3HONCOOH + 0,075x106J

Lượng sản phẩm tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân hủy, acid sucxinic 20%, rượu etylic chiếm 10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%

Dựa vào sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm là lên men đồng hình và lên men dị hình

- Lên men đồng hình (điển hình):

+ Trong trường hợp này acid pyruvic được tạo thành theo sơ đồ Parnas (EMP) Sau đó acid pyruvic sẽ tạo thành axit lactic dưới tác dụng của enzyme lactadehydrogenase

Embden-Mayerhorf-+ Sản phẩm chính là acid lactic 90% – 98%

+ Sản phẩm phụ là ethanol, acid acetic, CO2, acetone

+ Chủ yếu thuộc 2 giống Lactobacterium (trực khuẩn) và Streptococcus Một số chủng điển hình: Lactobacterum bungaricum, Streptococcus lactic…

- Lên men dị hình (không điển hình):

+ Xảy ra trong trường hợp vi khuẩn lactic không có các enzyme cơ bản, vì vậy xilulose 5-phosphate sẽ tạo thành theo con đường pento-phosphate (PP)

+ Chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn tạo ra các sản phẩm phụ khác như: acid acetic, ethanol, CO2 Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm

+ Có men decacboxylase để phân hủy acid pyruvic, CO2, CH3CHO Tuy nhiên không phân hủy hết được acid pyruvic

+ Cho độ tinh khiết không cao và phức tạp

+ Chủ yếu thuộc 2 giống Lactobacillus và Bacterium Một số chủng điển hình:

2.4 Sơ lƣợc về vi khuẩn chủng chỉ thị Escherichia coli (E.coli)

2.4.1 Phân loại khoa học (Castellani & Chalmers, 1919)

Chi (genus): Escherichia

Loài (species): E coli

2.4.2 Đặc điểm cơ bản của Escherichia coli (Nguyễn Lân Dũng, 2008)

Kích thước: 2 – 3 m x 0,5 m

Khuẩn lạc tròn, màu trắng đục

- Đặc điểm nuôi cấy:

Sống hiếu khí và kị khí tùy tiện

Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 50C – 400C, nhiệt độ tối ưu: 370C

pH thích hợp 7,0 – 7,2

Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA tạo khóm tròn ướt (dạng S) màu trắng đục

Trên môi trường Rapid‟ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím

Trên môi trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ

Trên các môi trường đường

- Các phản ứng sinh hóa: Indol dương, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính, Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính, H2S âm tính, hoàn nguyên nitrat thành nitrit, Lysine decarboxylaza dương tính

Đun 550

C trong 1 giờ hoặc 600C trong 30 phút sẽ bị tiêu diệt

Dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường

Hình 7: Vi khuẩn E.coli (Lynn Yarris, 2011)

Hình 8: Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli (Madprime, 2005)

Hình 9: Vi khuẩn E.coli chụp dưới kính hiển vi 100X

(Võ Thành Thìn, 2012)

2.5 Chất kháng khuẩn

2.5.1 Tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic

Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh ra các acid hữu cơ, chúng tạo ra môi trường không thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào Acid lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm dừng quá trình trao đổi chất, gây chết những tế bào

nhạy cảm với nó (Lê Văn Nhương và et al., 2009)

Hơn thế nữa, vi khuẩn lactic biểu thị một loạt các hoạt động kháng khuẩn Trong số các hoạt động đó, việc sản xuất acid lactic và acid acetic là quan trọng nhất Ngoài

ra, một số chủng vi khuẩn lactic được biết đến để sản xuất các hợp chất kháng khuẩn như ethanol, acid formic, acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, reutericyclin và đặc biệt là bacteriocin Bên cạnh việc sản xuất ra hợp chất như bacteriocin, một số vi khuẩn lactic còn có thể tổng hợp peptide kháng khuẩn khác góp phần vào việc bảo quản thực phẩm một cách an toàn Một trong những đặc điểm của các hợp chất kháng khuẩn là khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh đường

ruột như Escherichia coli, Salmonella và nhóm Vibrio spp (De Vuyst & Leroy,

2007)

2.5.2 Sơ lƣợc về bacteriocin

2.5.2.1 Giới thiệu chung

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein

Loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin

đó Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể con người gây ra các vấn đề

về sức khỏe, nhưng bacteriocin bị ảnh hưởng bởi tác động của các enzyme như trypsin, pepsin, α-chymotrypsin…

Những sản phẩm do vi khuẩn sinh ra có khả năng gây ức chế những vi khuẩn khác có rất nhiều như enzyme, antibiotic, bacteriocin Hiện nay người ta đã phát hiện ra

nhiều loại bacteriocin do vi khuẩn tổng hợp nên như nisin (Lactococcus lactis), subtilin (Bacillus subtilis), pediocin (Pediococcus acidilactici)…

Người ta đã đưa ra nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, những tiêu chí này được dùng trong nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác nhau để định nghĩa những loại bacteriocin khác nhau Những tiêu chí như sau:

- Phạm vi ức chế đối với những loại khác

- Sự có mặt của loại protein hoạt động

- Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn

- Loại tế bào mà nó tác dụng

- Những yếu tố di truyền

- Do quá trình tổng hợp sinh học có tính ức chế

Năm 1953, thương phẩm nisaplin xuất hiện trên thị trường như chất bảo quản thực phẩm và đến năm 1969, tổ chức WHO công nhận nisin là chất bảo quản an toàn có nguồn gốc sinh học Trong công nghệ thực phẩm, nisin là bacteriocin được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi nhất trong chế biến và bảo quản một số loại thực phẩm như phomat, xúc xích, sữa chua, một số loại sản phẩm thịt, rau quả đóng hộp Trong y dược, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm sinh học để điều trị một số bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá

Ngoài ra, reuterin và dẫn xuất của reutericyclin cũng có thể ức chế các vi khuẩn Gram âm và Gram dương, nấm và động vật nguyên sinh như giun, sán Các diacetyl, acetaldehyde và acetoin cũng có tác dụng kìm hãm đối với các vi sinh vật

có hại ngay cả ở nồng độ thấp

2.5.2.2 Phân loại

Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề tranh cãi Các bacteriocin thường được phân loại kết hợp với các chỉ tiêu khác nhau Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và cuối cùng là

trình tự chuỗi amino acid (Desriac et al., 2010) Một cách tổng quát, bacteriocin

được chia thành 3 lớp: lớp I, lớp II và lớp III

Lớp I

Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền nhiệt

và tác động lên cấu trúc màng Một thành viên nổi tiếng của nhóm này là nisin

(Parada et al., 2007) Các Lanbiotic được chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên

sự tương đồng cấu trúc

- Phân lớp Ia

Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương, chúng hoạt động bằng cách hình thành các lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhắm đến (Ouwehand & Vesterlund, 2004)

Nisin thuộc nhóm này Đây là một peptide được hình thành bởi 34 amino acid Có 2 biến thể của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z, chúng chỉ khác nhau bởi amino acid thứ 27: histidine trong nisin A được thay thế bởi asparagin trong nisin Z

Loại bacteriocin này, được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic, được sử

dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm Nó có phổ kháng khuẩn Gram (+) rộng,

E.coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng ngoài của

chúng bị phá hỏng Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với

Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus spp Và Clostridium spp (Ouwehand & Vesterlund, 2004) Chúng được sử dụng chủ