Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh carotenoid có khả năng chống oxy hóa ở núi cấm huyện tịnh biên tỉnh an giang

Carotenoid có chức năng như một chất chống oxy hóa được sử dụng để ngăn ngừa tác nhân gây bệnh tim mạch, tăng cường hệ thống miễn dịch, và ức chế sự phát triển của một số loại ung thư Pa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA - TPHCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

SINH CAROTENOID CÓ KHẢ NĂNG

CHỐNG OXY HÓA Ở NÚI CẤM,

HUYỆN TỊNH BIÊN, TỈNH AN GIANG

BẰNG HỒNG LAM

AN GIANG, THÁNG 09 NĂM 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA - TPHCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

SINH CAROTENOID CÓ KHẢ NĂNG

CHỐNG OXY HÓA Ở NÚI CẤM,

HUYỆN TỊNH BIÊN, TỈNH AN GIANG

Chủ nhiệm đề tài: Bằng Hồng Lam Thành viên: Văn Viễn Lương

AN GIANG, THÁNG 09 NĂM 2020

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Đề tài nghiên cứu khoa học: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh carotenoid có khả năng chống oxy hóa ở Núi Cấm, huyện Tịnh Biên, tỉnh

An Giang” do nhóm tác giả Ths Bằng Hồng Lam và Ths Văn Viễn Lương,

công tác tại Khoa Nông Nghiệp - TNTN thực hiện Nhóm tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo Trường Đại học An Giang thông qua ngày 10/09/2020

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại học An Giang, lãnh đạo Khoa Nông Nghiệp

- TNTN đã tạo điều kiện về thời gian, cũng như các đồng nghiệp bộ môn CNSH

và Bộ môn Khoa học KHCT đã hỗ trợ chúng tôi trong thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học

Phòng Quản trị - Thiết bị đã hỗ trợ, giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu này

Các đồng nghiệp trong Khu thí nghiệm đã nhiệt tình hỗ trợ chúng tôi trong

suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của nhóm chúng tôi Các

số liệu và kết quả có nguồn gốc rõ ràng Các kết luận mới về khoa học của đề tài này chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào trước đây

An Giang, ngày 15 tháng 09 năm 2020

Người thực hiện

Bằng Hồng Lam

TÓM TẮT

Nghiên cứu đã phân lập được 55 dòng vi khuẩn có khả năng sinh carotenoid từ 20 mẫu đất thu tại Núi Cấm, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang Trong đó, 10 dòng vi khuẩn có hàm lượng carotenoid tổng số cao lần lượt là NC7-4 = 3,40 µg/mL ở λmax = 539 nm, NC20-6 = 3,17 µg/mL ở λmax = 478

nm, NC3-3 = 3,10 µg/mL (λmax = 475 nm), NC13-2 = 2,90 µg/mL (λmax = 455 nm), NC1-6 = 2,79 µg/mL (λmax = 450 nm), NC15-7 = 2,75 µg/mL (λmax =

449 nm), NC10-2 = 2,69 µg/mL (λmax = 448 nm), NC12-2 = 2,58 µg/mL (λmax

= 500 nm), NC8-3 = 2,50 µg/mL (λmax = 446 nm) và NC4-3 = 2,41 µg/mL (λmax = 460 nm) Bên cạnh đó, kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH từ dịch trích carotenoid của 10 dòng vi khuẩn có khả năng sinh carotenoid trên cho thấy dịch trích carotenoid của dòng NC12-2 có hoạt tính chống oxy hóa tốt nhất trong tất cả các dòng (IC 50 =2,57 mg/mL) và tốt hơn

cả β-carotene chuẩn (IC 50 =2,70 mg/mL) Kết quả giải trình tự 16S rRNA cho thấy NC1-6, NC3-3, NC4-3, NC7-4, NC8-3, NC10-2, NC12-2, NC13-2, NC15-

7 và NC20-6 có mức độ tương đồng 100% lần lượt với các dòng

aurantiacum var Colo Road, Geobacillus stearothermophilus strain AHBR12, Serratia marcescens strain XPn-6, Stenotrophomonas maltophilia strain XS 8-

4, Burkholderia cenocepacia strain FDAARGOS_720, Bacillus infantis NRRL B-14911, Chryseobacterium shandongense strain H5143, Kocuria rhizophila strain TB19 và Brevundimonas vesicularis strain Os_Ep_VSA_58

Từ khóa: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), carotenoid, half

maximal inhibitory concentration (IC 50 ), kháng oxy hóa

by sequencing the 16S rRNA gene displayed that NC1-6, NC3-3, NC4-3,

NC7-4, NC8-3, NC10-2, NC12-2, NC13-2, NC15-7 and NC20-6 showed 100%

stearothermophilus strain AHBR12, Serratia marcescens strain XPn-6, Stenotrophomonas maltophilia strain XS 8-4, Burkholderia cenocepacia strain FDAARGOS_720, Bacillus infantis NRRL B-14911, Chryseobacterium shandongense strain H5143, Kocuria rhizophila strain TB19 and Brevundimonas vesicularis strain Os_Ep_VSA_58, respectively

Keywords: Antioxidant, carotenoid, DPPH, IC 50

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH SÁCH BẢNG x

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3

1.5 ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

2.1 CAROTENOID 4

2.1.1 Giới thiệu về carotenoid 4

2.1.2 Cấu trúc cơ bản của carotenoid 4

2.1.3 Đặc điểm chung của carotenoid 6

2.1.4 Phân loại carotenoid 7

2.1.5 Sự sinh tổng hợp carotenoid ở vi khuẩn 8

2.1.6 Ứng dụng của carotenoid 10

2.1.7 Một số vi khuẩn có khả năng sinh carotenoid 11

2.1.7.1 Corynebacterium xerosis 11

2.1.7.2 Exiguobacterium aurantiacum 11

2.1.7.3 Geobacillus stearothermophilus 12

2.1.7.4 Serratia marcescens 12

2.1.7.5 Stenotrophomonas maltophilia 13

2.1.7.6 Burkholderia cenocepacia 13

2.1.7.7 Bacillus infantis 13

2.1.7.8 Chryseobacterium shandongense 14

2.1.7.9 Kocuria rhizophila 14

2.1.7.10 Brevundimonas vesicularis 15

2.2 CHẤT CHỐNG OXY HÓA 15

2.2.1 Tổng quan về chất chống oxy hóa và gốc tự do 15

2.2.1.1 Tổng quan về chất chống oxy hóa 15

2.2.1.2 Tổng quan về gốc tự do 15

2.2.2 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa là carotenoid 17

2.2.3 Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 18

2.2.3.1 Phương pháp đánh giá dựa trên năng lực oxy hóa – khử 19

2.2.3.2 Phương pháp khử các gốc tự do 20

2.3 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 21

2.3.1 Trong nước 21

2.3.2 Ngoài nước 21

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 23

3.1.1 Vật liệu 23

3.1.2 Địa điểm và thời gian 23

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 23

3.1.3.1 Thiết bị 23

3.1.3.2 Dụng cụ 23

3.1.3.3 Hóa chất 24

3.1.3.4 Môi trường 24

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.2.1 Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sản xuất carotenoid 25

3.2.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng sản xuất carotenoid cao từ các dòng vi khuẩn đã phân lập 30

3.2.3 Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch trích carotenoid thô từ

các dòng vi khuẩn được tuyển chọn 31

3.2.4 Định danh các dòng vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử 33

3.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 34

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CAROTENOID 35

4.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được 35

4.1.2 Đặc điểm hình thái tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được 40 4.1.3 Đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập được 43

4.2 TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CAROTENOID CAO TỪ CÁC DÒNG VI KHUẨN ĐÃ PHÂN LẬP 46

4.3 KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH TRÍCH CAROTENOID THÔ TỪ CÁC DÒNG VI KHUẨN ĐƯỢC TUYỂN CHỌN 51

4.4 ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN ĐƯỢC TUYỂN CHỌN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ 64

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

5.1 KẾT LUẬN 65

5.2 KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC 77

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Hai con đường sinh tổng hợp carotenoid ở vi khuẩn 9

Hình 2: Gốc tự do 16

Hình 3: Công thức phân tử DPPH 20

Hình 4: Cơ chế phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH 31

Hình 5: Màu sắc khuẩn lạc của dòng NC5-1 (A), NC15-7 (B), NC13-2 (C), NC4-3 (D), NC3-3 (E), NC20-6 (F), NC12-2 (G) và NC7-4 (H) 38

Hình 6: Đường kính khuẩn lạc của dòng NC10-2 (A), NC8-3 (B), NC13-4 (C) và NC8-9 (D) 39

Hình 7: Kích thước tế bào của dòng NC15-7 (0,5 x 0,5) µm 42

Hình 8: Kích thước tế bào của dòng NC4-1 (1 x 1) µm 42

Hình 9: Kích thước tế bào của dòng NC1-6 (1,5 x 0,5) µm 42

Hình 10: Kích thước tế bào của dòng NC12-2 (4 x 1) µm 42

Hình 11: Dòng NC10-2 là vi khuẩn gram âm bắt màu hồng 44

Hình 12: Dòng NC4-3 là vi khuẩn gram dương bắt màu tím 45

Hình 13: Dòng NC7-4 (A) và NC8-3 (B) dương tính với catalase 45

Hình 14: Dòng NC12-2 (A) và NC4-3 (B) có nội bào tử màu xanh lục 45

Hình 15: Dòng NC13-2 (A) không di động và NC20-6 (B) di động 46

Hình 16: Dịch trích carotenoid của dòng NC1-5 (A), NC1-6 (B), NC13-2 (C), NC3-3 (D), NC12-2 (E) và NC7-4 (F) 50

Hình 17: Màu sắc của DPPH khi phản ứng với mẫu đối chứng β-carotene chuẩn ở các nồng độ khác nhau 51

Hình 18: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của β-carotene chuẩn 52

Hình 19: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của dịch trích NC13-2 55

Hình 20: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của dịch trích NC7-4 56

Hình 21: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của dịch trích NC12-2 56

Hình 22: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của dịch trích NC3-3 57

Hình 23: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của dịch trích NC20-6 58

Hình 24: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của dịch trích NC8-3 58

Hình 25: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của dịch trích NC1-6 59

Hình 26: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của dịch trích NC10-2 60 Hình 27: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của dịch trích NC15-7 60 Hình 28: Biểu đồ thể hiện khả năng khử gốc DPPH của dịch trích NC4-3 61

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Cấu trúc và đặc điểm của một số carotenoid vi khuẩn phổ biến 5

Bảng 2: Phân loại theo sự có mặt của nguyên tử oxy trong phân tử 7

Bảng 3: Phân loại theo cấu trúc hóa học 8

Bảng 4: Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học 17

Bảng 5: Các phương pháp chủ yếu xác định hoạt tính kháng oxy hóa 19

Bảng 6: Tổng hợp các chỉ tiêu về hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được 35

Bảng 7: Tỷ lệ phần trăm màu sắc khuẩn lạc 37

Bảng 8: Tỷ lệ phần trăm đặc điểm khuẩn lạc 38

Bảng 9: Tỷ lệ phần trăm đường kính khuẩn lạc 39

Bảng 10: Tổng hợp các chỉ tiêu về hình thái tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được 40

Bảng 11: Tỷ lệ phần trăm hình dạng và kích thước tế bào 41

Bảng 12: Tổng hợp các chỉ tiêu về đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập được 43

Bảng 13: Hàm lượng carotenoid tổng số của dịch trích carotenoid thô từ các dòng vi khuẩn phân lập được 46

Bảng 14: Phần trăm khử gốc tự do DPPH của β-carotene chuẩn 53

Bảng 15: Phần trăm khử gốc tự do DPPH của mẫu dịch trích carotenoid thô từ 10 dòng vi khuẩn được tuyển chọn 54

Bảng 16: Hàm lượng carotenoid tổng trong dịch trích carotenoid thô 62

Bảng 17: Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của β-carotene và dịch trích carotenoid thô của 10 dòng vi khuẩn được tuyển chọn 63

Bảng 18: Kết quả định danh 16S rRNA của 10 dòng vi khuẩn 64

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Carotenoid là một nhóm các sắc tố tự nhiên có màu sắc đa dạng từ màu đỏ đến màu vàng, được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên và được tổng hợp bởi các thực vật và vi sinh vật để đáp ứng với các điều kiện môi trường khác nhau, trong khi con người hay các động vật khác cần phải hấp thu chúng từ thực phẩm (Kirti

và cs., 2014)

Carotenoid có chức năng như một chất chống oxy hóa được sử dụng để ngăn ngừa tác nhân gây bệnh tim mạch, tăng cường hệ thống miễn dịch, và ức

chế sự phát triển của một số loại ung thư (Park và cs., 2005; Cabral và cs., 2011)

do các chất chống oxy hóa tác động qua việc trung hòa hay dập tắt sự tấn công của các tác nhân oxy hóa (sinh ra trong quá trình hô hấp hiếu khí và quá trình chuyển hóa) lên các đại phân tử sinh học quan trọng của sự sống như DNA, protein, màng lipid Sự tổn thương các đại phân tử này, nhất là DNA là nguyên nhân sâu xa của sự lão hóa và bệnh tật, nhất là bệnh tim mạch và ung thư Bên cạnh đó, carotenoid là được sử dụng như là chất tạo màu trong ngành công nghiệp thực phẩm để tạo màu cá hồi, cá và thịt gia cầm hoặc để xác định

màu sắc của lòng đỏ trứng (Johnson & Schroeder, 1995) Chúng cũng có những

ứng dụng trong nước giải khát như nước cam, bánh kẹo, và các loại thực phẩm chế biến khác Chất màu được thêm vào nhiều loại thực phẩm làm cho thực phẩm tốt cho sức khỏe hơn và hấp dẫn hơn; thực tế là màu sắc đóng một vai trò quan trọng trong sự lựa chọn của người tiêu dùng (Meléndez-Martínez và cs., 2004) Do đó, carotenoid được sử dụng thương mại như chất màu thực phẩm tự nhiên, dinh dưỡng bổ sung, phụ gia thức ăn, bổ sung thức ăn gia súc, và gần đây hơn là dược thực phẩm cho mục đích mỹ phẩm và dược phẩm (Noviendri và cs., 2011) Thức ăn là vấn đề quan trọng nhất trong chăn nuôi, quyết định trực tiếp đến năng suất, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt, trứng, sữa, Đặc biệt, sắc tố carotenoid là yếu tố cần phải có trong thức ăn Ngoài tác dụng cung cấp chất tiền vitamin A, sắc tố carotenoid còn là chất chống oxy hóa sinh học để bảo vệ tế bào, buồng trứng, làm tăng năng suất và sản lượng trứng Khi con người ngày càng nhận thức cao về việc tiêu thụ quá nhiều chất màu nhân tạo gây ra những rủi ro sức khỏe nghiêm trọng do độc tính của chúng tạo ra như các phản ứng dị ứng, ung thư, hen suyễn, bụng đau, buồn nôn, tổn

thương gan và thận (Srivastava, 2015; Wrolstad & Culver, 2012) Trong khi đó,

carotenoid tự nhiên chứa các đặc tính có hoạt tính sinh học có thể cải thiện sức

khỏe và nhiều trong số chúng là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người (Hsu và cs., 2012)

Carotenoid từ các nguồn vi khuẩn là một lựa chọn đầy hứa hẹn có thể thay thế cho các chất phụ gia màu khác được chiết xuất từ thực vật bởi vì chúng được coi như là chất màu tự nhiên có hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe con người, không bị ảnh hưởng bởi vấn đề sản xuất theo mùa và cho năng suất cao (Indra

Arulselvi và cs., 2014) Vì vậy, vi khuẩn là một nguồn tuyệt vời có thể sử dụng

để sản xuất carotenoid Một số nghiên cứu cho thấy rằng các vi khuẩn như

Serratia marcescens, Pseudomonas sp., Pseudoalteromonas sp., Alteromonas denitrificans, Hahell sp., Vibrio sp., Micrococcus roseus, Brevibacterium linens, Bradyrhizobium sp., Xanthomonas campestrispv,… có khả năng sản xuất

carotenoid

An Giang là tỉnh thuộc vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có nhiều đồi núi nên có nguồn sinh vật đa dạng và phong phú, đặc biệt là nguồn vi sinh vật từ vùng đồi núi Đặc biệt là vi sinh vật sinh chất chống oxy hóa thường được phân lập ở nơi có điều kiện sống khắc nghiệt như nhiệt độ cao, ánh sáng mặt trời chiếu, nơi bị chiếu xạ UV mạnh, hạn hán Chính vì vậy, núi Cấm, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang được chọn để thu mẫu đất để phân lập vi khuẩn sinh carotenoid có khả năng kháng oxy hóa bởi vì Núi Cấm là một trong những ngọn núi cao nhất của tỉnh An Giang, là nơi có thời gian chiếu sáng mỗi ngày khoảng 11-12 giờ với cường độ bức xạ của ánh sáng mặt trời từ 4,3- 4,9kw/m2/ngày Với mong muốn tìm được đa dạng nguồn vi khuẩn bản địa có khả sinh carotenoid có hoạt tính chống oxy hóa từ vùng núi của An Giang nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất và tiêu thụ carotenoid ngày càng cao như hiện nay là vấn đề cần thiết Do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh carotenoid có khả

năng chống oxy hóa ở Núi Cấm, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang” được thực

hiện

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tuyển chọn được khoảng 10 dòng vi khuẩn sản xuất carotenoid có khả năng chống oxy hóa ở Núi Cấm, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: Các dòng vi khuẩn sinh carotenoid có khả năng chống oxy hóa thu từ núi Cấm, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang

Phạm vi nghiên cứu: Phân lập, tuyển chọn và xác định tên khoa học của một số dòng vi khuẩn tổng hợp carotenoid có khả năng chống oxy hóa phân lập được từ núi Cấm, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sản xuất carotenoid trong tự nhiên Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng sản xuất carotenoid cao từ các dòng vi khuẩn đã phân lập

Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất carotenoid thu được từ các dòng vi khuẩn được tuyển chọn

Định danh các dòng vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử

1.5 ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI

Đóng góp về mặt khoa học: Tìm ra các dòng vi khuẩn sinh carotenoid

(sắc tố màu) bản địa có khả năng chống oxy hóa

Đóng góp công tác đào tạo: Bổ sung kiến thức vào tài liệu giảng dạy và

giúp cho sinh viên thực hiện chuyên đề tốt nghiệp đại học

Đóng góp phát triển kinh tế xã hội: Kết quả nghiên cứu về vi khuẩn sinh

carotenoid có khả năng chống oxy hóa ở An Giang làm cơ sở cho việc sản xuất chế phẩm carotenoid bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và thủy sản của tỉnh nhà

Đóng góp bảo vệ môi trường: Nếu sử dụng vi khuẩn sinh carotenoid có

khả năng chống oxy hóa bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và thủy sản sẽ giúp làm giảm việc sử dụng kháng sinh vào chăn nuôi và thủy sản dẫn đến làm giảm thải

ô nhiễm kháng sinh vào môi trường

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 CAROTENOID

2.1.1 Giới thiệu về carotenoid

Carotenoid là thuật ngữ chỉ chung cho các hợp chất sắc tố thuộc một họ của isoprenoids, được tổng hợp bởi thực vật và vi sinh vật, không được tổng

hợp từ động vật (Rao & Rao, 2007)

Ở thực vật, carotenoid góp phần vào hoạt động của bộ máy quang hợp và

bảo vệ thực vật chống lại sự phá hủy của ánh sáng mặt trời (Rao & Rao, 2007)

Đối với con người, carotenoid là hợp chất chống oxy hóa quan trọng vì có mặt trong rất nhiều loại thực phẩm đồng thời có khả năng hoạt động trong môi trường chất béo nơi dễ xảy ra sự oxy hóa và gây hậu quả nghiêm trọng (màng

tế bào) Ngoài ra, carotenoid còn là tiền chất vitamin A, là vi dưỡng chất quan

trọng nhất có tác động nhiều đến sức khỏe con người (Mactier & Weaver, 2005)

Hơn nữa, chế độ ăn uống giàu carotenoid có thể chống lại một số bệnh như ung thư, bệnh tim mạch, đục thủy tinh thể và tia cực tím có tác hại cho da (Giovannucci, 1999)

Theo Viện Khoa học Quốc Tế cho rằng “nồng độ carotenoid trong máu là những dấu hiệu sinh học tốt nhất của sự hấp thụ carotenoid từ quả cây và rau quả ở con người” Trong đó, β-carotene là một loại carotenoid phổ biến nhất có tác dụng giảm tác hại của ánh nắng mặt trời (Eicker và cs., 2003) Bên cạnh đó còn có lycopene cũng có tác dụng làm giảm tác hại của ánh nắng mặt trời (Darvin và cs., 2008) Ngoài ra, carotenoid còn có chức năng làm giảm nguy cơ của một số bệnh mãn tính gồm bệnh tim mạch (Liu và cs., 2000), bệnh thoái hóa (Cho và cs., 2004), béo phì (Tohill và cs., 2004), bệnh ung thư (Marmot, 2007) và sự thối hóa điểm vàng gây ra bệnh mù mắt ở người cao tuổi là do sự thiếu hụt hai loại carotenoid thuộc nhóm xanthophyll là lutein và zeaxanthin (Bone và cs., 1988)

2.1.2 Cấu trúc cơ bản của carotenoid

Đặc điểm nổi bật nhất của cấu trúc carotenoid là hệ thống dài các liên kết đôi và đơn xen kẽ nhau tạo thành phần trung tâm của phân tử cấu thành một hệ liên hợp (Britton, 1995) Một hệ liên kết đôi liên hợp của một polyene có 9 liên kết đôi trở lên chịu trách nhiệm cho các tính chất về sắc tố của carotenoid Cụ thể là, năng lượng của chuyển đổi điện tử mạnh [từ mức năng lượng mặt đất (1Ag-) sang trạng thái S2 (1Bu+)] tương ứng với sự hấp thụ giữa 400-500 nm và

do đó carotenoid có màu sắc như vàng, cam hoặc đỏ (Britton, 1995) Mức độ

của sự liên hợp và sự hiện diện hoặc không hiện diện của các nhóm chức quyết định màu sắc của các phân tử

Carotenoid là isoprenoid có chứa 40 nguyên tử carbon trên mỗi phân tử,

số nguyên tử hydro biến thiên và không có các nguyên tố khác Chúng được sinh tổng hợp bởi liên kết đuôi của hai phân tử C-20 geranylgeranyl diphosphate

để tạo ra bộ khung carbon C-40 cha mẹ, từ đó dẫn xuất ra tất cả các biến thể riêng lẻ Lycopene và β-carotene có thể minh họa cấu trúc khung carbon C-40

cơ bản Cấu trúc cơ bản có thể được thay đổi bởi: (i) sự tạo vòng ở một đầu hoặc

cả hai đầu của phân tử, (ii) sự thay đổi về mức độ hydro hoá, (iii) bổ sung các nhóm chức năng có chứa oxy để tạo ra một tập hợp có trên 750 hợp chất (Britton, 1995) Cấu trúc và đặc điểm của một số carotenoid vi khuẩn thông thường được thể hiện trong Bảng 1

Bảng 1: Cấu trúc và đặc điểm của một số carotenoid vi khuẩn phổ biến

Astaxanthin

Bicyclic, red

2 hydroxy groups,

2 keto groups

Violaxanthin

Bicyclic, yellow

2 hydroxy groups,

2 groups

epoxy-Neoxanthin

Bicyclic, yellow

3 hydroxy groups,

1 epoxy group (Britton, 1995)

Hệ liên kết đôi liên hợp cấu thành bộ khung cứng của các phân tử carotenoid và tạo ra khả năng khử cao của các phân tử carotenoid, làm cho

chúng có khả năng chống oxy hóa mạnh Hoạt động của carotenoid như chất chống oxy hoá được đánh giá bởi phản ứng của carotenoid với các chất oxy hóa, các gốc tự do peroxy,… Tính năng này dường như đóng một vai trò quan trọng

trong chức năng ổn định của carotenoid (Gruszecki & Strzałka, 2005)

Tất cả các carotenoid có nhiều liên kết đôi liên hợp thường là 9-13, với mỗi một liên kết có thể tạo ra nhiều đồng phân hình học Chẳng hạn, β-carotene

có 9 liên kết đôi trong chuỗi polyene có thể tự do tạo thành cấu hình cis/trans

Về mặt lý thuyết, nó có thể tạo thành 272 đồng phân, trong khi đồng phân bất đối xứng của nó là α-carotene có khả năng hình thành nên 512 đồng phân (Olson

& Krinsky, 1995) Đặc tính hấp thụ sắc tố màu và hấp thụ ánh sáng được sử

dụng rộng rãi trong việc xác định carotenoid (Britton và cs., 2004)

2.1.3 Đặc điểm chung của carotenoid

Xét về tính kị nước, carotenoid là một nhóm các phân tử cực kỳ kị nước

với ít hoặc không có khả năng hòa tan trong nước (Wisniewska & Subczynski,

1998) Trong màng cốt lõi bên trong của tế bào, chúng sẽ bị giới hạn trong các vùng kị nước, trong khi đó khi liên kết với protein thì chúng sẽ tiếp cận với môi trường nước Sự phân cực của carotenoid bị thay đổi bởi các nhóm chức năng phân cực và sự tương tác của carotenoid với các phân tử khác cũng bị ảnh hưởng

Các đặc tính vật lý, hoá học và sinh học quan trọng của carotenoid được tổng hợp trong sơ đồ bên dưới (Vershinin, 1999)

Cấu trúc chuỗi polyene

- Bảo vệ chống oxy hóa

- Ngăn ngừa ung thư

- Điều trị rối loạn chuyển hóa porphirin ở hồng cầu

- Tạo sắc tố cho thực vật

- Sàng lọc ánh sáng

- Bảo vệ protein của trứng (ở động vật không xương sống) khỏi ảnh hưởng của protease

- Sắc tố võng mạc

- Chất chỉ thị sinh học môi trường

- Tác nhân kháng khuẩn

- Thực phẩm, chất dinh dưỡng

2.1.4 Phân loại carotenoid

Có nhiều cách phân loại carotenoid, những cách phân loại được sử dụng phổ biến như sau:

Phụ thuộc vào sự có mặt của nguyên tử oxy trong phân tử, carotenoid được chia thành 2 nhóm như trong Bảng 2 (Tazzini, 2013)

Bảng 2: Phân loại theo sự có mặt của nguyên tử oxy trong phân tử

Xanthophyll (chứa nguyên tử O) Carotene (không chứa nguyên tử O)

γ-Carotene (gamma-Carotene) (orange) Lycopene (red)

Neurosporene Phytoene (colorless) Phytofluene

α-Zeacarotene β-Zeacarotene ζ-Carotene (zeta-Carotene)

(Tazzini, 2013)

Phụ thuộc vào cấu trúc hóa học, carotenoid được chia thành 5 nhóm như trong Bảng 3 (Tazzini, 2013)

Bảng 3: Phân loại theo cấu trúc hóa học

Acyclic carotene (chuỗi C thẳng)

ζ-Carotene Phytoene (colorless) Lycopene (red) Neurosporene Phytofluene

Cyclic carotene (chứa 1 hoặc 2 vòng C)

α-Carotene (orange) β-Carotene (orange) γ-Carotene (orange) δ-Carotene

α-Zeacarotene β-Zeacarotene

Hydroxycarotenoid/carotenol (chứa ít nhất

1 nhóm hydroxyl)

α-Cryptoxanthin (yellow) β-Cryptoxanthin (orange) Lutein (yellow)

Lycoxanthin Rubixanthin Zeaxanthin (yellow-orange) Zeinoxanthin

Epoxycarotenoid (chứa ít nhất 1 nhóm

epoxic)

Antheraxanthin Auroxanthin β-Carotene-5,6-epoxide Lutein-5,6-epoxide Luteoxanthin Neoxanthin Violaxanthin (yellow)

Các carotenoid đặc biệt

Bixin Capsanthin Capsorubin Crocetin

(Tazzini, 2013) 2.1.5 Sự sinh tổng hợp carotenoid ở vi khuẩn

Sinh tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật bắt đầu với sự tổng hợp khối carbon isopentenyl pyrophosphate (IPP) và đồng phân dimethylallyl

5-pyrophosphate (DMAPP) bằng một trong hai con đường mevalonate (MVA) và methylatethritol 4-phosphate (MEP) Quá trình đồng phân IPP thành DMAPP được xúc tác bởi isomerase pyrophosphate isopentenyl (IDI) Sau khi IPP được tổng hợp, sự kéo dài chuỗi bắt đầu bằng cách ngưng tụ liên tục từ đầu đến đuôi của dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) thành chuỗi polyprenyl

pyrophosphate dài (Lee & Schmidt-Dannert, 2002) Sự kéo dài chuỗi được xúc

tác bởi prenyl transferases để tổng hợp nên geranyl pyrophosphate (GPP, C10), farnesyl pyrophosphate (FPP, C15) hoặc geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP, C20), là tiền thân của mono-, di-, và tri-terpenes và carotenoid FPP (C15) và

GGPP (C20) là tiền thân của C30 và C40 carotenoid (Lee & Schmidt-Dannert, 2002; Lu & Li, 2008)

Hình 1: Hai con đường sinh tổng hợp carotenoid ở vi khuẩn

(Paniagua-Michel và cs., 2012) Hầu hết vi khuẩn chỉ sử dụng con đường MEP để tổng hợp carotenoid như

vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lam, vi khuẩn lưu huỳnh lục (Chlorobium), vi khuẩn tím (Rhodobacter) và nhiều vi khuẩn không quang hợp (Aquificales,

Thermotogales, Chlamydiae, Bacteroides và vi khuẩn Gram dương) cũng thuộc

nhóm này Một số ít vi khuẩn sử dụng con đường MVA và một số rất ít sử dụng

cả hai con đường MEP và MVA (Hình 1) (Paniagua-Michel và cs., 2012)

2.1.6 Ứng dụng của carotenoid

Carotenoid được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng thực phẩm, được sử dụng trong công nghiệp thức ăn, thực phẩm và dinh dưỡng Các khám phá gần đây về các đặc tính có lợi cho sức khoẻ của carotenoid tạo ra sự quan tâm lớn

về sự tổng hợp carotenoid đa dạng về cấu trúc cho các ứng dụng dược phẩm Hiện nay, carotenoid được sử dụng thương mại như chất màu thực phẩm tự nhiên, dinh dưỡng bổ sung, phụ gia thức ăn, bổ sung thức ăn gia súc, và gần đây hơn là nutraceuticals cho mục đích mỹ phẩm và dược phẩm (Noviendri và cs., 2011)

Ở hầu hết các quốc gia, việc sử dụng phụ gia thực phẩm (bao gồm chất màu) bị kiểm soát bởi các quy định nghiêm ngặt Luật pháp chỉ định chất màu nào có thể được sử dụng trong nguồn chất màu, độ tinh khiết của chất màu, thức

ăn nào chất màu có thể được thêm vào, và ở mức độ chất màu nào có thể được

bổ sung vào một thực phẩm cụ thể Trong ứng dụng thực phẩm, lycopene là carotenoid được EU, Mỹ cho phép sử dụng như một chất màu thực phẩm và chỉ duy nhất nguồn chiết xuất cho phép là cà chua (Noviendri và cs., 2011)

Một ứng dụng quan trọng khác của carotenoid là được sử dụng như là chất tạo màu trong ngành công nghiệp thực phẩm để tạo màu cá hồi, cá và thịt gia

cầm hoặc để xác định màu sắc của lòng đỏ trứng (Johnson & Schroeder, 1995)

Chúng cũng có những ứng dụng trong nước giải khát như nước cam, bánh kẹo,

và các loại thực phẩm chế biến khác Chất màu được thêm vào nhiều loại thực phẩm làm cho thực phẩm tốt cho sức khỏe hơn và hấp dẫn hơn; thực tế là màu sắc đóng một vai trò quan trọng trong sự lựa chọn của người tiêu dùng (Meléndez-Martínez và cs., 2004)

Carotenoid được nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực liên quan đến dinh dưỡng và sức khỏe của con người như:

- Carotenoid có khả năng hấp thu: (1) các oxy đơn rất tốt (Conn và cs., 1991; Edge và cs., 1997), (2) các các gốc tự như CCl3O2, RSO2, NO2 và (3) các gốc arylperoxyl khác nhau Bởi vì, carotenoid thông qua chuyển điện tử sản xuất các gốc cation tự do (Mortensen và cs., 2001)

- β - carotene làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch (Kardinaal và cs., 1993; Gaziano, 1994)

- Lycopene có khả năng ngăn ngừa ung thư (Giovannucci, 1999), có hiệu quả ngăn ngừa ung thư như ung thư phổi chuột (Kim và cs., 1997) và các mô hình ung thư ruột kết ở chuột (Narisawa và cs., 1996; Narisawa và cs., 1998; Astorg và cs., 1997), bảo vệ phổi và tuyến tiền liệt của động vật (Cohen, 2002)

- Carotenoid bảo vệ chống lại sarcopenia hoặc tổn thương cơ bắp ở người lớn tuổi (Semba và cs., 2007)

- Carotenoid (từ trái cây và rau quả, chủ yếu β - carotene) ngăn ngừa sự phát triển của ung thư miệng và cổ họng (Zheng và cs., 2006)

- Carotenoid (trái cây và rau quả) tỉ lệ nghịch với bệnh liên quan thực quản,

dạ dày và nguy cơ ung thư đại trực tràng Carotenoid có hiệu quả với các bệnh nhạy cảm (dị ứng) (Block và cs., 1992)

Carotenoid có trong da đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ da khỏi tác động của bức xạ UV Như một “mỹ phẩm dinh dưỡng-nutricosmetic” các nghiên cứu lâm sàng đã được tiến hành để đánh giá khả năng bảo vệ khỏi ánh sáng của carotenoid ngăn ngừa lão hóa da sớm Một trong những nghiên cứu đầu tiên về khả năng chống tia UV của β-carotene đã được công bố Gần đây, một nghiên cứu đã so sánh hiệu ứng mỹ phẩm của 3 nhóm sử dụng carotenoid lutein và zeaxanthin: kết hợp uống và bôi da; bôi da; đường uống Kết quả cho thấy tất cả các nhóm điều trị có sự tăng cường độ đàn hồi của da

(Anunciato & da Rocha Filho, 2012)

2.1.7 Một số vi khuẩn có khả năng sinh carotenoid

2.1.7.1 Corynebacterium xerosis

Corynebacterium xerosis phát triển thành các khuẩn lạc có đường kính

(0,2–1,0) mm, màu vàng nâu, hơi khô và không bị tan huyết khi nuôi cấy trong

thạch máu Quan sát dưới kính hiển vi, C xerosis là vi khuẩn Gram dương, hình que, có đầu hình chùy Về mặt sinh hóa, C xerosis dương tính với catalase,

có thể lên men glucose, sucrose và maltose (Coyle và cs., 1993; Vela và cs., 2006) Vela và cs (2006) lần đầu tiên mô tả việc xác định tám chủng C xerosis

từ các mẫu lâm sàng động vật, sử dụng các phương pháp vi sinh cổ điển cũng

như di truyền học phân tử C xerosis là một sinh vật có ở da và niêm mạc của người và động vật C xerosis được coi là một mầm bệnh bất thường nhưng nó

có thể gây ra viêm màng trong tim, nhiễm trùng da và các bệnh khác (Coyle &

Lipsky, 1990; Funke và cs., 1996; Riegel và cs., 1996; Wauters và cs., 1998;

Vela và cs., 2006)

2.1.7.2 Exiguobacterium aurantiacum

Chi Exiguobacterium lần đầu tiên được phân lập từ nước thải chế biến khoai tây vào năm 1983 dưới dạng một loài duy nhất, Exiguobacterium

aurantiacum E aurantiacum là trực khuẩn gram dương có tính kiềm, hiếu khí,

chịu mặn, không tạo bào tử Tất cả các dòng phân lập hình thành khuẩn lạc màu

vàng cam trên thạch máu, dương tính với catalase và DNase, phát triển trên thạch dinh dưỡng ở pH 10 và với sự hiện diện của NaCl 6% (Pitt và cs., 2007)

Exiguobacterium aurantiacum có một số đăc tính sinh hóa là catlase

dương tính; oxidase âm tính; có khả năng lên men đường glucose, ribose, maltose, sucrose, glycogen; thủy phân casein và tyrosine (Pitt và cs., 2007)

2.1.7.3 Geobacillus stearothermophilus

Geobacillus stearothermophilus là loài ưa nhiệt, hiếu khí, gram dương, tế

bào hình que, kích thước tế bào (0,6-1 µm) x (2-3,5 µm), hình thành bào tử với bào tử hình elip làm biến dạng túi bào tử có khả năng di động, lên men đường glucose, maltose, thủy phân tinh bột, catalse dương tính, tăng trưởng ở nồng độ NaCl 5%, phát triển ở pH trong khoảng (6,0-8,0), nhiệt độ thích hợp nhất cho

sự phát triển là 55oC Vi khuẩn G stearothermophilus phân bố trong đất, suối

nước nóng, cát sa mạc, nước Bắc Cực, trầm tích đại dương, thức ăn và phân trộn (Kotzekidou, 2014)

Geobacillus stearothermophilus sản xuất nhiều loại enzyme, nhiều trong

số đó có ý nghĩa công nghiệp như protease trung tính ứng dụng trong chất tẩy rửa, công nghiệp da, ngành công nghiệp thực phẩm trong bia và các sản phẩm bánh mì; α-amylase thủy phân các liên kết α-1,4 glucosidic trong amylose và amylopectin; glucose isomerase sản xuất siro fructose; gellan lyase sử dụng làm chất tạo keo, chất làm đặc hoặc chất ổn định trong ngành thực phẩm, dược phẩm

và mỹ phẩm Ngoài ra, G stearothermophilus tạo ra các proteinase và lipase

bền nhiệt, tồn tại được sau các xử lý nhiệt được áp dụng trong quá trình sản xuất sữa bột thương mại (Kotzekidou, 2014)

2.1.7.4 Serratia marcescens

Serratia marcescens là một loại vi khuẩn kỵ khí, gram âm, di động, hình

que ngắn, được phân loại là một mầm bệnh cơ hội Nó được phát hiện vào năm

1819 bởi Bartolomeo Bizio ở Padua, Ý Bizio đặt tên chi Serratia để vinh danh

và nhà vật lý người Ý đặt tên là Serratia, và chọn marcescens cho tên loài sau

từ tiếng Latinh có nghĩa là phân rã (Mohammed, 2019) S marcescens đầu tiên

được cho là vô hại (không gây bệnh) Do khả năng tạo ra sắc tố đỏ, nó được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1906 như một chất đánh dấu để theo dõi hoạt động hoặc sự lây truyền của vi khuẩn (Luthra và cs., 2014)

Serratia marcescens phát triển ở 37oC, nhưng nó có thể phát triển ở nhiệt

độ từ 5–40oC Chúng phát triển ở mức độ pH nằm trong khoảng từ 5-9 S

marcescens nổi tiếng với sắc tố đỏ mà nó tạo ra được gọi là prodigiosin

Prodigiosin được tạo thành từ ba vòng pyrrole (Gayathri & Subashkumar, 2017)

2.1.7.5 Stenotrophomonas maltophilia

Stenotrophomonas maltophilia là loài hiếu khí bắt buộc, gram âm, có dạng

hình que thẳng hoặc cong, kích thước (0,5 x 1,5) µm, di động với một vài lông

roi phân cực S maltophilia có thể tồn tại trong môi trường nước nghèo dinh

dưỡng, nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là 35oC (Carmody và cs., 2011)

Một số đặc điểm sinh hóa của S maltophilia là catalase dương tính;

oxidase dương tính; có khả năng lên men đường glucose, lactose, maltose; thủy phân esculin; hóa lỏng gelatin và thủy phân Tween 80 (Brooke, 2012)

2.1.7.6 Burkholderia cenocepacia

Burkholderia cenocepacia là một loài vi khuẩn gram âm phổ biến trong

môi trường, có thể tự hình thành màng sinh học (Csávás và cs., 2017), kháng nhiều loại kháng sinh (Alshraiedeh và cs., 2016) Phản ứng bảo vệ môi trường

mạnh mẽ của B cenocepacia là do màng sinh học được hình thành bởi các nhóm

sinh vật Màng sinh học này chứa các exopolysaccharides (viết tắt là EPS) giúp tăng cường sức đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh Nó được tạo thành

từ một đơn vị polysaccharide phân nhánh cao với một glucose, một axit glucuronic, một mannose, một rhamnose và ba phân tử galactose Loài này trong Bcc cũng đã tạo ra một polysaccharide khác với một axit 3-deoxy-d-manno-2-octulosonic và ba phân tử galactose (Chiarini và cs., 2004) Các exopolysaccharid của màng sinh học hoạt động như một rào cản đối với bạch cầu trung tính khỏi hệ thống đề kháng miễn dịch của con người, làm suy yếu hoạt động bảo vệ của bạch cầu trung tính bằng cách ức chế hóa học và giảm sản xuất các loại oxy phản ứng (Bylund và cs., 2006)

Burkholderia cenocepacia là một mầm bệnh cơ hội và các bệnh nhiễm

trùng ở người thường gặp ở những bệnh nhân bị xơ nang và bệnh u hạt mãn tính, và thường gây tử vong (Csávás và cs., 2017)

2.1.7.7 Bacillus infantis

Bacillus infantis là trực khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, catalase

dương, oxidase âm tính Phát triển tốt trên thạch máu ở 37oC Khi xét nghiệm với hệ thống API 50 CH, nó dương tính với việc sử dụng Dxylose, galactose, glucose, fructose, mannitol, sorbitol, methyl aD-glucoside, N-acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, aesculin, salicin, maltose, melibiose, sucrose, trehalose, raffinose, tinh bột, glycogen, gluconate, cellobiose, lactose

và inulin và âm tính với việc sử dụng glycerol, ribose, mannose, inositol, xylitol, gentiobiose và 5-ketogluconate (Ko và cs., 2006)

Bacillus infantis được phân lập lần đầu từ mẫu máu của trẻ sơ sinh bị sốt

Hiện nay, chưa có nhiều công bố về khả năng sinh carotenoid của vi khuẩn

B.infantis (Ko và cs., 2006)

2.1.7.8 Chryseobacterium shandongense

Chryseobacterium shandongense là vi khuẩn gram âm, không di động,

không hình thành bào tử, hình que, kích thước tế bào (0,5-0,7 μm) x (2,1-2,3 μm) Tăng trưởng tốt nhất trên môi trường Trytone Soya Agar (TSA); sinh trưởng tốt trên thạch Luria Bertanni (LB) Các khuẩn lạc được nuôi cấy trong

24 giờ trên môi trường TSA có đường kính khoảng 3 mm, hình tròn với bề mặt sáng bóng và toàn bộ các cạnh, màu vàng cam (loại flexirubin, không khuếch tán), trong mờ và nhầy Điều kiện sinh trưởng là 25-37oC (tối ưu 30oC), ở pH 5,0-8,0 (tối ưu 7,0), với 0-5% NaCl (tối ưu 1%) (Yang và cs., 2015)

Chryseobacterium shandongense có một số đặc điểm sinh hóa là có khả

năng thủy phân tinh bột và casein, dương tính với oxidase và catalase, âm tính với quá trình khử nitrat và thủy phân cellulose Khi thực hiện phản ứng với bộ

kit API 20E và 20NE thì C shandongense dương tính với việc sử dụng citrate,

sản xuất acetoin, sản xuất indole, thủy phân aesculin và thủy phân gelatin, nhưng

âm tính với arginine dihydrolase, urease, lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase, sản xuất H2S và tryptophan deaminase Axit được tạo ra từ d-mannose, nhưng không phải từ mannitol, inositol, sorbitol, melibiose, amygdalin, arabinose, N-acetylglucosamine hoặc kali gluconate (Yang và cs., 2015)

2.1.7.9 Kocuria rhizophila

Kocuria rhizophila là vi khuẩn gram dương, hình cầu, chịu mặn (dung nạp

tới 10% NaCl trong môi trường tăng trưởng), phân hủy phenol được phân lập

từ thân rễ của cây hương bồ lá hẹp (Typha angustifolia) Các thành viên của chi

Kocuria được phân lập từ nhiều nguồn tự nhiên khác nhau bao gồm da động vật

có vú, đất, sinh quyển, thức ăn lên men, bệnh phẩm lâm sàng, nước ngọt và trầm

tích biển, cho thấy rằng mỗi loài Kocuria thích nghi cao với môi trường sinh

thái tương ứng (Takarada và cs., 2008)

Kocuria rhizophila cũng quan trọng trong các ứng dụng công nghiệp; ví

dụ, do kích thước bộ gen nhỏ, khả năng phát triển nhanh chóng và mật độ tế bào cao, và sự mạnh mẽ của tế bào ở các điều kiện phát triển khác nhau, nó sẽ rất thuận lợi cho sự phát triển của hệ thống chuyển đổi sinh học vi khuẩn có thể

được sử dụng trong các điều kiện khắc nghiệt như trong dung môi hữu cơ Sự hiện diện của các con đường trao đổi chất có thể xảy ra để biến đổi các hợp chất phenolic được tạo ra từ sự phân hủy của nguyên liệu thực vật và sự hiện diện của một số lượng lớn các gen liên quan đến vận chuyển màng, đặc biệt là các chất vận chuyển axit amin và bơm dòng chảy thuốc, có thể góp phần vào việc sinh vật sử dụng dịch tiết từ rễ cũng như khả năng chống chịu với các hợp chất hữu cơ khác nhau (Takarada và cs., 2008)

2.1.7.10 Brevundimonas vesicularis

Brevundimonas vesicularis là một loại trực khuẩn gram âm hiếu khí,

không lên men, tạo ra oxidase và catalase Trước đây được gọi là Pseudomonas

vesicularis, sinh vật này được phân loại lại dưới chi Brevundimonas trên cơ sở

phân biệt các đặc điểm kiểu gen và kiểu hình B vesicularis thường được tìm

thấy trong đất và nước, được coi là phổ biến trong môi trường và là nguyên nhân hiếm gặp gây nhiễm trùng ở người Hầu hết các báo cáo trường hợp đã mô tả

nhiễm vi khuẩn Brevundimonas spp ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch,

mặc dù có những biểu hiện nhiễm trùng riêng biệt ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch Theo hiểu biết của các tác giả, cho đến nay không có báo cáo trường hợp nào được công bố mô tả bệnh viêm phổi do B vesicularis ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch hoặc bệnh nhân có miễn dịch (Stabler và cs., 2018)

2.2 CHẤT CHỐNG OXY HÓA

2.2.1 Tổng quan về chất chống oxy hóa và gốc tự do

2.2.1.1 Tổng quan về chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa (COXH) là những chất phản ứng với gốc tự do và do

đó ngăn cản hay làm chậm quá trình oxy hóa (OXH) Chất COXH có tác dụng ngăn cản sự hình thành các dạng oxy hoạt động (ROS) hoặc dập tắt các gốc tự

do (Halliwell, 1996)

2.2.1.2 Tổng quan về gốc tự do

Gốc tự do là bất kỳ phân tử có khả năng tồn tại độc lập chứa một electron (điện tử) không bắt cặp trong obitan nguyên tử Sự hiện diện của điện tử không bắt cặp tạo nên những tính chất chung của gốc tự do Hầu hết gốc tự do không

ổn định và có tính phản ứng cao Chúng có thể cho một điện tử hoặc nhận một điện tử từ các phân tử khác, do đó chúng hoặc động như chất oxy hóa hoặc chất khử (Cheeseman & Slater, 1993)

Hình 2: Gốc tự do

Các “gốc tự do” phổ biến và quan trọng nhất là các chất hoạt động chứa

oxy và nitơ (Reactive Oxygen ROS và Reactive Nitrogen

Species-RNS) là các chất dạng khử của oxy và nitơ phân tử (Valko và cs., 2004) Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các “gốc tự do” và các dẫn xuất không phải gốc tự do Các “gốc tự do” là phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều điện

tử không bắt cặp Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxide, nitroperoxide là tiền chất của gốc tự do Các ROS và RNS phản ứng rất nhanh với các phân tử quanh, do đó gây tổn thương và làm thay đổi cấu trúc tế bào bao gồm DNA, protein, màng lipid (Matos và cs., 2001; Fang và cs.,

2002; Wertz và cs., 2004; Valko và cs., 2004; Erdman và cs., 2009)

Các ROS và RNS được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động tốt hoặc xấu đến cơ thể Khi số lượng gốc tự do nằm trong khả năng kiểm soát của cơ thể, chúng đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống của cơ thể, các ROS và RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ: (i) điều hòa phân ly tế bào; (ii) kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38MAP kinase,…) cho các gen tham gia quá trình phiên mã, chống viêm; (iii) điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzyme chống oxy hóa (Pincemail và cs., 1998; Favier, 2003) Khi cơ thể ở trạng thái khỏe mạnh,

cơ thể có khả năng sinh ra các chất chống oxy hóa giúp trung hòa lượng gốc tự

do sinh ra trong các quá trình chuyển hóa của cơ thể cũng như các gốc tự do ngoại sinh Thế nhưng khi bước sang tuổi trung niên hay khi cơ thể không đạt trạng thái khỏe mạnh, cân bằng vốn có giữa gốc tự do và chất chống oxy hóa bị phá vỡ, kéo theo đó là hàng loạt chuỗi phản ứng bất lợi lên các phân tử lipid, protein, acid nucleic của tế bào, dẫn đến hàng loạt các tổn thương và kết quả là

sự hoạt động bất thường của các cơ quan Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên: (i) đột biến ở DNA; (ii) biến tính protein; (iii) oxy hóa lipid (Pincemail và cs., 1998; Favier, 2003)

Sự phá hủy các đại phân tử sinh học bởi ROS và RNS là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm Sự oxy hóa các Low–Density Liporotein (LDL) dẫn đến sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu, giai đoạn đầu tiên của bệnh cao huyết áp và nhiều bệnh tim mạch Các ROS và RNS tấn công phospholipid màng tế bào làm thay đổi tính mềm dẻo của màng, thay đổi chức năng của nhiều thụ thể trên màng do đó ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của màng cũng như trao đổi thông tin của màng tế bào và môi trường Sự oxy hóa các DNA bởi ROS và RNS gây nên biến dị di truyền là một trong những nguy cơ phát triển ung thư Nhiều enzyme và protein vận chuyển cũng bị oxy hóa và vô hoạt bởi ROS và RNS (Pincemail và cs., 1998; Favier, 2003; Albert và cs., 2003) Sự tích lũy các sản phẩm của sự oxy hóa các cấu tử tế bào gây nên hiện tượng lão hóa sớm Các ROS và RNS cũng tham gia vào các quá trình gây nên bệnh suy giảm hệ thần kinh như Alzheimer, trong đó hiện tượng chết các tế bào thần kinh gắn liền với hiện tượng phân ly tế bào gây nên bởi các ROS và RNS (Albert và cs., 2003) Để bảo vệ cơ thể khỏi tác động xấu của các ROS và RNS,

tế bào được trang bị một hệ thống bảo vệ chống lại các tác nhân oxy hóa được trình bày ở Bảng 4

Bảng 4: Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học

2.2.2 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa là carotenoid

Carotenoid là hợp chất chống oxy hóa quan trọng vì có mặt trong rất nhiều loại thực phẩm, đồng thời có khả năng hoạt động trong môi trường chất béo là nơi dễ xảy ra sự oxy hóa và gây hậu quả nghiêm trọng (màng tế bào)

Cơ chế hoạt động chống oxy hóa của các carotenoid (Mortensen và cs.,

2001; Stahl & Sies, 2003)

- Hấp thụ oxy đơn

- Hấp thụ gốc tự do

Oxy đơn (1O2) là sản phẩm phụ của các quá trình oxy hóa sinh học và là

một cấu tử có mặt trong không khí (Jovanovic & Simic, 2000) Dưới tác dụng

của tia cực tím A (UV – A, λ = 300 – 400 nm), các phân tử riboflavine,

flavinmononucleotid (FMN) và flavin adenine dinucleotide (FAD) hấp thụ năng lượng và chuyển lên trạng thái kích thích Các chất này chuyển năng lượng cho oxy phân tử để trở lại trạng thái bình thường Oxy khi nhận năng lượng của các

chất này trở thành oxy đơn (Jovanovic & Simic, 2000) Để chuyển một phân tử

oxy bình thường thành oxy đơn cần 22 Kcal Phân tử oxy không ở dạng thuận

từ bình thường mà ở dạng nghịch từ Vì vậy, chúng rất dễ phản ứng với DNA, lipid, các phân tử không no của màng tế bào và gây bệnh Khả năng hấp thụ oxy đơn của carotenoid phụ thuộc vào số liên kết đôi có trong mạch carbon của chúng Mỗi phân tử carotenoid có khả năng vô hoạt 1000 phân tử oxy đơn trước khi tham gia vào các phản ứng hóa học và biến đổi thành các hợp chất khác

(Jovanovic & Simic, 2000) Ngoài khả năng vô hoạt oxy đơn, các carotenoid

còn vô hoạt gốc tự do bằng cách kết hợp với các gốc này theo một trong các cơ

chế sau (Britton, 1995; Mortensen và cs., 2001)

- Chuyển điện tử: Car + ROO  Car+ + ROO-

- Chuyển hydro: Car + ROO  Car + ROOH

- Cộng hợp: Car + ROO  ROOCar

Trong cơ thể carotenoid hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóa khác Các gốc tocopheryl được khử thành dạng hoạt động tocopherol nhờ nhận

được hydro từ vitamin C với chất vận chuyển trung gian carotenoid (Niki và cs., 1995; Stahl & Sies, 2003) Các carotenoid với đặc điểm hòa tan trong chất béo

được tích lũy trong cơ thể, xâm nhập dễ dàng vào thành tế bào do đó hiệu quả

chống oxy hóa của chúng cao hơn các chất oxy hòa tan trong nước (Tapiero và

cs., 2002; Brown và cs., 2003)

2.2.3 Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá theo rất nhiều cách Các phương pháp đánh giá có thể kể đến là đánh bắt các gốc tự do, đánh giá năng lực oxy hóa-khử gốc tự do, sử dụng hệ thống mẫu sinh học và hệ thống mẫu thực phẩm (Shahidi & Zhong, 2015) Sau đây là một vài phương pháp hóa học đơn giản

Bảng 5: Các phương pháp chủ yếu xác định hoạt tính chống oxy hóa

Tên phương pháp Cơ chế trao đổi Chất oxy hóa Cách đánh giá Nguồn Phương pháp đánh bắt gốc tự do ROS/RNS

Gốc peroxyl sinh ra bởi AAPH

Đo độ phát quang

Prior và cs.,

2005

hoặc EPR Blois, 1958

Chemiluminescence HAT Hydrogen

peroxyde

Đo độ phát quang

Phương pháp đánh giá năng lực oxy hóa khử

Chú thích: AAPH: 2,2’-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride

DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl;

ABTS: 2,2′-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid)

(Shahidi & Zhong, 2015)

2.2.3.1 Phương pháp đánh giá dựa trên năng lực oxy hóa – khử

Chất kháng oxy hóa cũng được xem như là một chất khử Khả năng cho electron của chúng không chỉ có thể cho phép bắt các gốc tự do và các chất oxy khác dẫn xuất từ ROS, mà cũng khử các nguyên tố về trạng thái hóa trị thấp hơn Năng lực khử hoặc năng lượng khử của chất kháng oxy hóa là một chỉ thị quan trọng cho hiệu suất kháng oxy hóa của chúng, và được đánh giá qua phản ứng oxy hóa khử với các ion kim loại khác nhau như sắt, đồng, chrom và cerium Phương pháp này có thể được phân loại vào nhóm phương pháp ET và được thực hiện đơn giản hơn so với đánh bắt ROS (Shahidi & Zhong, 2015)

2.2.3.2 Phương pháp khử các gốc tự do

Hoạt tính kháng oxy hóa được đánh giá trực tiếp thông qua đánh giá số lượng các nguyên tử hydro hoặc các electron được chuyển từ chất kháng oxy hóa tiềm năng đến các gốc tự do trong một hệ đơn giản không có lipid Căn cứ vào các phản ứng hóa học liên quan, những phương pháp này chia làm 2 loại: phương pháp phản ứng dựa trên trao đổi nguyên tử hydro (HAT) và dựa trên trao đổi electron độc thân (ET) Chất kháng oxy hóa có thể bắt các gốc theo cơ chế HAT hay ET đều dẫn đến kết quả giống nhau, mặc dù động học và thế năng

của phản ứng phụ khác nhau (Prior và cs., 2005)

Phương pháp khử gốc tự do DPPH

DPPH là cách viết tắt phổ biến của hợp chất hữu cơ picrylhydrazyl DPPH là một phân tử gốc tự do ổn định, dạng bột tinh thể có màu tối DPPH có hai ứng dụng chính: một là theo dõi các phản ứng hóa học liên đến các gốc tự do, đáng chú ý nhất là các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa; và một ứng dụng khác là tiêu chuẩn về vị trí và cường độ cộng hưởng điện từ (Sharma & Bhat, 2009)

2,2-diphenyl-1-DPPH có một số dạng tinh thể khác nhau bởi sự đối xứng mạng tinh thể

và nhiệt độ nóng chảy (melting point - m.p.) Bột DPPH được sử dụng trong

thương mại là hỗn hợp các giai đoạn (các pha) mà nó nóng chảy ở ~130°C

DPPH-I (m.p 106°C) là orthorhombic - dạng tinh thể trực giao , DPPH-II (m.p 137°C) là amorphous - dạng tinh thể vô định hình và DPPH-III (m.p 128-

129°C) là triclinic - hệ tinh thể ba chiều (ba nghiêng) (Kiers và cs., 1976)

DPPH là một gốc tự do nổi tiếng và được biết đến như một cái bẫy cho các gốc khác (là một chất bắt gốc tự do từ các gốc khác) Do đó, tốc độ khử của một phản ứng hóa học khi thêm DPPH được sử dụng như một vật chỉ thị cho các gốc tự do trong phản ứng này Do DPPH có dải hấp thụ mạnh tập trung ở khoảng bước sóng 517 nm, nên gốc DPPH có màu tím đậm trong dung dịch, và trở nên không màu hoặc vàng nhạt khi được trung hòa Tính chất này cho phép

Hình 3: Công thức phân tử DPPH

Hình 1: Công thức phân tử DPPH

(Nguồn: Alger, 2017)

theo dõi phản ứng một cách trực quan và đồng thời số lượng gốc ban đầu có thể được tính từ sự thay đổi độ hấp thụ quang ở bước sóng 517 nm hoặc nhờ vào tín hiệu EPR của DPPH (Blois, 1958)

2.3 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.3.1 Trong nước

Nghiên cứu của Bùi Minh Giao Long và cs (2011) đã phân lập 54 chủng

vi khuẩn có khả năng sinh carotenoid từ nguồn đất, nước ở biển và các hồ tôm tại Việt Nam Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các dịch trích hữu cơ từ các chủng

vi khuẩn được thử nghiệm qua chất thử DPPH đã sàng lọc được 5 chủng vi khuẩn có hoạt tính chống oxi hóa cao (trên 50%)

Trần Hữu Tâm (2014) đã phân lập, định danh được hai chủng vi khuẩn

Bacillus tại Việt Nam là Bacillus marisflavi DD1.1 và Bacillus infantis AT14,

đáp ứng yêu cầu làm nguyên liệu sản xuất probiotic cung cấp carotenoid Đồng

thời, xây dựng được quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp làm nguyên

liệu probiotic cung cấp carotenoid

2.3.2 Ngoài nước

Một số vi khuẩn đã được nghiên cứu do tiềm năng công nghệ sinh học để sản xuất sắc tố, trong số đó vi khuẩn thuộc nhóm chịu nhiệt và mặn như

Halococcus morrhuae và Halobacterium salinarum có các khuẩn lạc đỏ và cam

Bacterioruberin từ vi khuẩn H salinarum là loại carotenoid được tìm thấy nhiều nhất (Asker & Ohta, 1999) Flavobacterium sp là một vi khuẩn phân lập từ

biển, được biết liên quan đến sản xuất tối ưu zeaxanthin (Masetto và cs., 2001)

và Haloferax alex&rinus có triển vọng công nghiệp cho việc sản xuất canthaxanthin (Asker & Ohta, 2002) Những vi khuẩn khác có khả sản xuất canthaxanthin bao gồm: Corynebacterium michiganense, Micrococcus roseus,

Brevibacterium sp strain KY 4313, Gordonia jacobaea và Dietzia natronolimnaea HS-1 (Nasrabadi & Razavi, 2010) Flavobacterium lutescens

và Flavobacterium multivorum được sử dụng để sản xuất β-cryptoxanthin trong

điều kiện môi trường tối ưu (Serrato‐Joya và cs., 2006) Các vi khuẩn khác như

Agrobacterium aurantiacum và Escherichia coli biến đổi gen, Mycobacterium brevicaie, Mycobacterium lacticola, Rhodobacter sphaeroides, Rhodococcus maris, Streptomyces chrestomyceticus và Erwinia uredovora cũng có khả năng

tổng hợp carotenoid (Schmidt-Dannert, 2000)

Hai loài Bacillus marisflavi và Bacillus aquimaris có khả năng tổng hợp

sắc tố vàng cũng đã được phân lập từ biển Hoàng Hải ở Hàn Quốc (Yoon và cs., 2003)

Theo Duc và cs (2006) các sắc tố carotenoid có màu nâu, đen, vàng, cam,

đỏ được quan tâm trong sản xuất công nghiệp có thể được tổng hợp bởi Bacillus

sp Trong đó, những loài đáng chú ý là Bacillus atrophaeus có khả năng sản xuất ra sắc tố đen, và Bacillus cibi, Bacillus jeotgali, Bacillus indicus, Bacillus

clarkii, Bacillus okuhidensis, Bacillus vedderi, Bacillus pseudofirmus có khả

năng sản xuất sắc tố vàng đến cam

Theo Khaneja và cs (2010) ở vi khuẩn các sắc tố thường thấy nhất là vàng,

cam và hồng Các chủng vi khuẩn gần như luôn là thành viên của chi Bacillus

và hầu hết các trường hợp liên quan đến các loài đã biết như Bacillus marisflavi,

Bacillus indicus, Bacillus firmus, Bacillus altitudinis và Bacillus safensis Ba

loại carotenoid được tìm thấy với mức độ hấp thụ tối đa ở các bước sóng 455,

467 và 492 nm, tương ứng với màu sắc có thể nhìn thấy là màu vàng, cam và hồng

Nugraheni và cs (2010) đã phân lập được dòng Bacillus licheniformis có khả năng sản xuất sắc tố có màu cam từ cỏ biển Thalassia hemprichii ở quần

đảo Karimunjawa, Indonesia Kết quả phân tích bằng HPLC cho thấy sắc tố này

có thể là Diadinoxanthine

Indra Arulselvi và cs (2014) đã phân lập được 24 dòng vi khuẩn có khả năng sinh carotenoid sắc tố vàng ở Ấn Độ, trong đó có dòng YCD3b có khả năng sinh carotenoid cao nhất được xác định bằng phân tích quang phổ khi đo

độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm, tương đương với phổ hấp thụ của mẫu tham chiếu β-carotene

Müller và cs (2011) đã nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của các carotenoid khác nhau bằng các phương pháp: đánh giá năng lực khử (FRAP), đánh bắt gốc ABTS, DPPH vả phương pháp đánh bắt gốc peroxyl (luminol-chemiluminescene assay) Kết quả đã cho thấy trong mỗi phương pháp, kết quả khác nhau có thể là do các cấu trúc riêng biệt của mỗi carotenoid

Các nghiên cứu khác có thể nhắc đến là của Samanta và cs (2016) cũng báo cáo kết quả về khả năng kháng oxy hóa (thực hiện bằng phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH và ức chế tự oxy hóa của acid linoleic) của dịch trích

carotenoid từ dòng vi khuẩn Kocuria marina DAGII cao hơn so với β-carotene

chuẩn Ngoài ra, nghiên cứu của Shindo và Misawa (2014) đã phát hiện được các carotenoid mới, cũng như mối quan hệ giữa nhóm vi khuẩn và cấu trúc

carotenoid, từ vi khuẩn Gram âm Rubritalea squalenifaciens, và vi khuẩn Gram dương Planococcus maritimus

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Vật liệu

Vật liệu thí nghiệm là mẫu đất được thu tại núi Cấm, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang

3.1.2 Địa điểm và thời gian

Địa điểm: Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc Khu thí nghiệm – Trường Đại học An Giang

Kẹp gắp

Đĩa peptri

Micropipette và đầu col tương ứng

Que cấy tròn và que cấy thẳng

3.1.3.3 Hóa chất

Hóa chất dùng cho trích carotenoid: nước cất, chloroform, methanol Hóa chất dùng khảo sát khả năng kháng oxy hóa: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), chloroform, Betacarotene chuẩn

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sản xuất carotenoid

3.2.1.1 Mục tiêu: Chọn được các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng sản xuất

carotenoid

3.2.1.2 Phương pháp tiến hành

a Phương pháp thu mẫu

Mẫu đất được thu tại núi Cấm, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang với độ sâu

từ 2-5 cm so với mặt đất và mỗi mẫu thu khoảng 500 g, thu từ đỉnh núi Cấm xuống tới chân núi Cấm Mẫu sau khi thu được cho vào túi nilon đã khử trùng Tổng số mẫu thu là 20 mẫu Các mẫu sau khi thu thập được chuyển đến phòng thí nghiệm để phân lập trong khoảng thời gian từ 48-72 giờ, nếu mẫu chưa phân lập kịp thì được bảo quản trong tủ lạnh 4oC cho đến khi phân lập

b Phương pháp phân lập: theo mô tả của Indra Arulselvi và cs (2014)

có hiệu chỉnh cho phù hợp

Mẫu đất sau khi thu về được tiến hành pha loãng bằng nước muối sinh lý 0,9%: 10 g đất hoà tan với 90 mL nước muối sinh lý 0,9% đã khử trùng Hút 10ml dung dịch này đem tăng sinh trong 90ml môi trường Nutrient borth (NB) Sau đó, hỗn hợp mẫu này được pha loãng đến nồng độ 10-5,10-6, 10-7 Hút 0,1

mL dung dịch mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng cấy trải trên đĩa môi trường Nutrient Agar (NA) Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày Quan sát và chọn những khuẩn lạc có màu vàng, cam, và đỏ trên môi trường để tách ròng và mô tả các đặc điểm về hình thái, sinh hóa để nhận diện vi khuẩn dựa trên hệ thống phân loại của Bergey’s Mannual of Systermatic Bacteriology

c Chỉ tiêu đánh giá

Các dòng vi khuẩn phân lập sau khi tách ròng được tiến hành quan sát hình thái và đặc điểm sinh hóa theo các chỉ tiêu về đặc điểm hình thái, sinh hóa như sau:

c1 Các chỉ tiêu về đặc điểm hình thái:

Các dòng vi khuẩn cần phân lập có các đặc điểm về hình thái:

- Khuẩn lạc:

+ Màu sắc khuẩn lạc: vàng, cam và đỏ

+ Các đặc điểm: rìa khuẩn lạc, độ nổi

+ Đường kính khuẩn lạc

- Tế bào:

+ Hình dạng tế bào: que dài, que ngắn

+ Kích thước tế bào

* Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc:

Mục tiêu: Quan sát ghi nhận hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được như màu sắc khuẩn lạc, đặc điểm khuẩn lạc và đường kính khuẩn

lạc

Tiến hành: Sau khi phân lập và tách ròng các khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường NA Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ

bên cạnh) để nhận diện hình thái khuẩn lạc (Indra Arulselvi và cs., 2014)

* Phương pháp quan sát hình dạng tế bào:

Mục tiêu: Quan sát ghi nhận hình dạng tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được

Tiến hành: Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng của vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi quang học theo phương pháp của Lê Duy Linh và cs (2001)

- Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:

+ Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên kính mang vật

+ Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội

+ Dùng kim cấy lấy một khuẩn lạc rồi trải đều trên giọt nước trên kính mang vật

+ Dùng kính đậy vật, đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 450, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ

và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí

- Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 40X và 100X, quan sát hình dạng và ghi nhận hình dạng của vi khuẩn

* Phương pháp xác định kích thước tế bào:

Mục tiêu: Xác định kích thước tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được

Tiến hành: Sau khi quan sát hình dạng vi khuẩn ta tiến hành đo kích thước của các dòng vi khuẩn phân lập được theo phương pháp của Lê Duy Linh và cs (2001)

- Để đo kích thước vi khuẩn ta dùng thước trắc vi thị kính và thước trắc

- Phương pháp đo kích thước vi khuẩn như sau:

+ Tìm trị số 1 khoảng của thước trắc vi thị kính:

▪ Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ ảnh của thước

▪ Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho hai thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính

▪ Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính

▪ Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau:

X = (N/n) x 10μm

Trong đó:

X: trị số một khoảng cách của thước trắc vi thị kính

N: số khoảng của thước trắc vi vật kính

n: số khoảng của thước trắc vi thị kính

▪ Đếm số khoảng cách của thước trắc vi nằm trong hai vạch này

▪ Tính kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng cách trùng của hai thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính