Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh chất đối kháng diệt sâu bệnh trên cây lúa ở khóm trung hưng phường mỹ thới thành phố long xuyên tỉnh an giang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA SƯ PHẠM ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG SINH CHẤT ĐỐI KHÁNG DIỆT SÂU BỆNH TRÊN CÂY LÚA Ở KHÓM T

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

KHOA SƯ PHẠM

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG SINH CHẤT ĐỐI KHÁNG DIỆT SÂU BỆNH TRÊN CÂY LÚA Ở KHÓM TRUNG HƯNG, PHƯỜNG

MỸ THỚI, THÀNH PHỐ LONG XUYÊN, TỈNH

AN GIANG

Chủ nhiệm đề tài: PHẠM TẤN ĐẠT

Năm 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

KHOA SƯ PHẠM

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG SINH CHẤT ĐỐI KHÁNG DIỆT SÂU BỆNH TRÊN CÂY LÚA Ở KHÓM TRUNG HƯNG, PHƯỜNG

MỸ THỚI, THÀNH PHỐ LONG XUYÊN, TỈNH

AN GIANG

THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Năm 2012

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục bảng và danh mục hình Chương I : MỞ ĐẦU 1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài 2

Chương II : TỔNG QUAN 1 Đặc điểm hình thái chung của nấm sợi 4

2 Đặc điểm một số loài nấm ký sinh sâu bệnh phổ biến 5

2.1 Đặc điểm hình thái và khả năng gây bệnh 5

2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 8

2.3 Đặc điểm phân loại chung 9

2.4 Phân bố 9

3 Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học 10

3.1 Khả năng sinh enzyme thủy phân ngoại bào 10

3.2 Khả năng sinh các chất đối kháng 11

3.3 Cơ chế tác động của nấm lên sâu bệnh 12

Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Vật liệu 13

2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.1 Phương pháp thu mẫu 15

2.2 Phương pháp phân lập mẫu theo Uyenco, 1988 15

2.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào 16

2.4 Phương pháp xác định hoạt tính chất đối kháng 17

2.5 Phương pháp định danh 17

2.6 Phương pháp bảo quản nấm sợi 18

2.7 Phương pháp sử dụng phần mềm thống kê để xử lý số liệu

thực nghiệm 19

Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng ký sinh côn trùng 20

2 Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng nấm sợi 21

2.1 Nghiên cứu hoạt tính enzyme chitinase 21

2.2 Nghiên cứu hoạt tính enzyme protease 22

2.3 Nghiên cứu khả năng sinh chất đối kháng 24

3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại sơ bộ ba chủng nấm sợi 26

Chương V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Kết luận 30

2 Kiến nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Thời điểm lấy mẫu 13 chủng nấm sợi 20

Bảng 2: Khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng nấm sợi 21

Bảng 3: Hoạt tính enzyme protease của các chủng nấm sợi 23

Bảng 4: Hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi 25

Bảng 5: 3 chủng nấm sợi được tuyển chọn 26

Bảng 6: Kết quả định danh 3 chủng nấm sợi 30

DANH MỤC HÌNH Hình 1: Tác hại của thuốc trừ sâu hóa học 1

Hình 2: Bào tử mọc ra khuẩn ty 4

Hình 3: Khuẩn lạc nấm 4

Hình 4: Các dạng bào tử trần của nấm sợi 5

Hình 5: Sự tiếp hợp của nấm sợi 5

Hình 6: Côn trùng bị nấm Beauveria bassina ký sinh 6

Hình 7: Bào tử nấm Beauveria bassina 6

Hình 8: Côn trùng bị nấm Metarhizium ký sinh 7

Hình 9: Hình dạng bào tử nấm Metarhizium anisopliae 7

Hình 10: Côn trùng bị nấm Paecilomyces ký sinh 7

Hình 11: Hình dạng bào tử nấm Peacilomyces 7

Hình 12: Hoạt tính enzyme chitinase của 9 chủng nấm sợi 22

Hình 13: Hoạt tính enzyme protease của 8 chủng nấm sợi 24

Hình 14: Hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi với vi khuẩn E.coli 25

Hình 15: Mặt phải, trái khuẩn lạc chủng M3 27

Hình 16: Hình dạng hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử của chủng M3 (×40) 27

Hình 17: Mặt phải, trái khuẩn lạc chủng M9 28

Hình 18: Hình dạng hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử của chủng M9 (×40) 28

Hình 19: Mặt phải, trái khuẩn lạc chủng M10 28

Hình 20: Hình dạng hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử của chủng M10 (×40) 29

LỜI CẢM ƠN 

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Khưu Phương Yến Anh, là người luôn quan tâm, theo dõi và hướng dẫn rất tận tình trong suốt thời gian em thực hiện

Từ những năm 50 của thế kỷ XX, các loại thuốc hóa học trừ sâu bệnh cho cây trồng được dùng phổ biến và rộng rãi Các loại thuốc này là hợp chất clo và phospho hữu cơ có tác dụng diệt sâu bệnh, diệt muỗi rất hiệu quả Ban đầu người

ta đặt niềm tin vào chúng rất nhiều và hi vọng chúng sẽ là cứu cánh cho ngành trồng trọt và trồng rừng ở trên khắp Trái Đất Song cùng với thời gian, thuốc trừ sâu hóa học đã lộ ra nhược điểm không thể khắc phục được, như làm cho sâu hại quen dần và “nhờn thuốc”, đáng lẽ sâu bị giảm đi nhưng lại có chiều hướng gia tăng, thuốc tồn dư ngấm vào đất gây ô nhiễm môi trường đất và nước (đặt biệt là nước ngầm), tồn dư trong sản phẩm lương thực – thực phẩm làm ảnh hưởng tới sức khỏe con người và vật nuôi (Lương Đức Phẩm, 2011)

Trên đồng ruộng Việt Nam hiện nay đã xuất hiện khá nhiều dịch vi sinh

vật gây bệnh côn trùng hại như dịch virus (virus sâu xanh bông NPV Ha, virus sâu khoang NPV Sl, virus sâu róm thông NPV Dp,…), vi khuẩn Bacillus

thuringiensis (Bt), vi nấm Beauveria, Metarhizium, Paecilomyces, Normuraea,…

có ích trong tự nhiên Chúng có khả năng hạn chế hoặc khống chế được một phần dịch sâu hại cây trồng khi gặp điều kiện thời tiết thích hợp (Phạm Thị Thùy, 2010)

2

Trước thực trạng này, con người không ngừng thử nghiệm các biện pháp mới để phòng chống sâu bệnh mà không gây nhiều tác hại như thuốc trừ sâu hóa học Cũng từ đó, các chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc sinh học được ra đời và đang ngày càng được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi Chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc vi sinh có nhiều điểm ưu việt như sau:

- Không gây độc hại cho người và gia súc, không nhiễm bẩn môi trường sống Không làm mất đi những nguồn tài nguyên có ích như các loài thiên địch

và các vi sinh vật có lợi cho con người Không ảnh hưởng đến chất lượng nông sản, thực phẩm cũng như đất trồng trọt (Phạm Thị Thùy, 2010)

- Việc sử dụng các chế phẩm vi sinh vật diệt sâu bệnh cho đến nay chưa phát hiện thấy hiện tượng “lờn thuốc” ở các loại côn trùng Đó là điều rất đáng được quan tâm, vì ở các thuốc trừ sâu bệnh hóa học, do đã được sử dụng lâu dài trước nay và việc sử dụng còn quá tùy tiện nên tính “lờn thuốc” xuất hiện ngày một nhiều ở các loài sâu bệnh, bắt buộc người dân phải tăng nồng độ sử dụng lên

mà hiệu quả lại cứ giảm dần Các vi sinh vật diệt côn trùng có thể tồn tại trong điều kiện môi trường không thuận lợi (không vật chủ, điều kiện khí hậu khắc nghiệt,…) (Trần Thị Thanh, 2001)

- Hiệu quả của thuốc vi sinh thường kéo dài, vì chúng không chỉ tiêu diệt trực tiếp lứa sâu đang phá hại mà còn có thể lan truyền cho thế hệ tiếp theo, ví dụ như đợt trứng kế tiếp nở ra lứa sâu non mới nếu tiếp xúc với sâu hại đã chết do vi sinh vật, thì cũng sẽ bị chết bởi vi sinh vật Điều này cho thấy hiệu quả phòng trừ của thuốc trừ sâu vi sinh là rất cao và kéo dài, thuốc vi sinh khắc phục được hạn chế của thuốc hóa học (Phạm Thị Thùy, 2010)

Với những đặc tính ưu việt của chế phẩm diệt côn trùng có nguồn gốc vi sinh vật, nên các chế phẩm này không ngừng được nghiên cứu và ứng dụng rộng

rãi hơn Chính vì lý do đó, đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh chất đối kháng diệt sâu bệnh trên cây lúa ở khóm Trung Hưng, phường Mỹ Thới, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang” được thực

hiện là cơ sở để có thể tạo ra chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học diệt sâu có hiệu

quả, an toàn cho con người, vật nuôi và môi trường

2 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn từ 3 – 4 chủng nấm sợi trên xác côn trùng thu được từ ruộng lúa có khả năng sinh chất đối kháng mạnh

- Tiến hành định danh đến chi

3 Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài

- Phân lập nấm sợi từ xác côn trùng

- Thử hoạt tính enzyme chitinase và protease bằng phương pháp khối thạch

- Kiểm tra khả năng sinh chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập được bằng phương pháp đục lỗ và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh chất đối kháng mạnh

3

- Quan sát đại thể và vi thể

- Định danh các chủng đến chi

4

II TỔNG QUAN

1 Đặc điểm hình thái chung của nấm sợi

Nấm sợi là vi sinh vật có nhân chuẩn Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo

từ chitin-glucan, chitosan Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm không vách ngăn hoặc có vách ngăn Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm hay còn gọi là khuẩn ty thể (hình 2) Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng khuẩn lạc khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm (hình 3) Khuẩn lạc nấm sợi thường có dạng hình tròn, hoặc gần tròn Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, dạng phẳng, có những vết khía xuyên tâm, hoặc lồi lõm không đều Mép khuẩn lạc có thể trơn hoặc răng cưa (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

Hình 2: Bào tử mọc ra khuẩn ty Hình 3: Khuẩn lạc nấm

(Nguồn: http://vietsciences2.free.fr/giaokhoa/biology/virologie/nammocnamnhay

diay.htm http://en.wikipedia.org/wiki/File:Four_3-day_old_Aspergillus_colonies_on_a_

Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp thụ qua màng, không có cơ quan tiêu hóa, không có khả năng quang hợp Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số

ký sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật

Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo kiểu

vô tính hoặc hữu tính (Bùi Xuân Đồng, 2000)

Bào tử vô tính: Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín Bào tử

trần là dạng bào tử phổ biến nhất

5

Hình 4: Các dạng bào tử trần của nấm sợi

(Nguồn: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/vinam01b.htm )

Sinh sản hữu tính: Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như: đẳng

giao, dị giao, noãn giao và tiếp hợp Ngoài ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản

hữu tính bằng bào tử túi và bào tử đảm

Hình 5: Sự tiếp hợp của nấm sợi

(Nguồn: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/vinam01b.htm)

2 Đặc điểm một số loài nấm ký sinh sâu bệnh phổ biến

2.1 Đặc điểm hình thái và khả năng gây bệnh

2.1.1 Nấm Beauveria (nấm Bạch Cương)

Bệnh do nấm này được nghiên cứu tương đối sớm Cuối thế kỷ XIX ở Mỹ

đã dùng nấm Beauveria để trừ một loại bọ xít cánh trắng Sau khi tiếp xúc với bề

mặt cơ thể vật chủ, bào tử của nấm Beauveria bắt đầu mọc mầm và xâm nhập

vào bên trong cơ thể vật chủ Quá trình này bắt đầu từ sau khi vật chủ bị nhiễm

bào tử khoảng 10 giờ và có thể kéo dài vài ngày Sau khi xâm nhập vào trong cơ

thể vật chủ, nấm bắt đầu sinh trưởng và phát triển Nấm tiêu diệt dần các tế bào

bạch huyết khi bị tấn công trong giai đoạn đầu xâm nhiễm cơ thể ký chủ Khi

nấm tiêu diệt hết tế bào bạch huyết thì vật chủ chết Nấm tiếp tục sinh trưởng và

phát triển Lượng sợi nấm bên trong cơ thể vật chủ ngày càng tăng và xác côn

trùng càng trở nên rắn lại Khi gặp độ ẩm thuận lợi, các sợi nấm mọc ra ngoài bề

mặt cơ thể vật chủ và tạo thành bào tử mới (Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài,

Nguyễn Văn Tó, 2006)

Nấm có sợi từ màu trắng đến màu kem có pha một ít màu đỏ, da cam, đôi

khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt

hoặc màu xanh da trời (Lê Hữu Phước, 2011)

Sợi nấm phân nhánh mảnh, có vách ngăn, đường kính sợi là 2 – 5µm

Cuống bào tử trần đứng riêng rẽ hoặc tụ thành đám, không phân nhánh hoặc có

phân nhánh, hình ống hoặc hình bình, chiều dài không đều nhau Trên cuống có

những mảnh nhỏ mang bào tử trần (Lương Đức Phẩm, 2011)

6

Hình 6: Côn trùng bị nấm Beauveria Hình 7: Bào tử nấm Beauveria

ký sinh

Beauveria sinh sản bằng bào tử trần, đơn bào, bào tử không màu có dạng

hình cầu, đường kính 1 - 4µm hay hình trứng (1,5 – 5,5) × 1,3µm (Lương Đức Phẩm, 2011) Chúng mang nhiều giá sinh bào tử, phồng to ở phía dưới với kích thước (3 – 5) × (3 – 6)µm Các giá bào tử trần thường tạo thành các nhánh ở phần ngọn hoặc trực tiếp tạo thành nhánh của giá, phần ngọn của bào tử có dạng cuống hẹp hình zích zắc không đều (Phạm Thị Thùy, 2010)

Nấm Beauveria xâm nhiễm nhiều loài côn trùng gây hại cho nông nghiệp

thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh màng Hymenoptera, và cả bộ cánh nửa cứng Himiptera, bộ hai cánh Diptera (Yoshinori Tanada và Harry K Kaya, 1993)

2.1.2 Nấm Metarhizium (nấm Lục Cương, nấm xanh)

Nấm này được Metschinikov phát hiện đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung hại lúa mì bị bệnh Nấm xanh thường gây bệnh cho côn trùng sống trong đất, thuộc hệ vi sinh vật đất trong tự nhiên Bào tử của nấm xanh sau 24 giờ tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong Trong cơ thể côn trùng sợi nấm phát triển xâm nhập vào các bộ phận nội quan Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt Trên đó tạo thành các bào tử màu xanh xám (Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó, 2006)

Nấm Metarhizium có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang, đường

kính sợi 3- 4µm Sợi có màu từ trắng đến hồng Bào tử của nấm là bào tử trần, dạng hình que, có kích thước 3,5 – 7,2µm, có bào tử xám đến ôliu – lục (xanh ôliu) (Lương Đức Phẩm, 2011) Bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường thấy bào tử tạo ra trên bề mặt côn trùng một lớp phấn khá rõ (Trần Thị Thanh, 2001)

M anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu

tối hoặc hồng vỏ quế, khuẩn lạc mọc chậm M anisopliae có 2 thứ với đặc điểm:

Hình 10: Côn trùng bị nấm Hình 11: Hình dạng bào tử nấm

Paecilomyces ký sinh Paecilomyces

(Nguồn: Lưu Hữu Phước, 2011) (Nguồn: http://www.mold-help.org/content/

8

2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

2.2.1 Nấm Beauveria (nấm Bạch Cương)

Nấm Beauveria khó sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không có chitin Ở

nhiệt độ dưới 100C và trên 450C thì nấm thường không hình thành bào tử Nhiệt

độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là 25 - 300C và bị chết ở 49 - 550C, nhiệt độ cho nấm phát triển tốt nhất là 22 - 250C, pH thích hợp là 6 và có thể dao

động trong khoảng 3 – 8,5 Nấm Beauveria có khả năng phân giải tinh bột,

cellulose và chitin (Lê Hữu Phước, 2011)

Nấm Beauveria có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau

Chúng phát triển tốt trên môi trường có thể chứa glucose hay lipid Muốn tạo

thành bào tử, nấm Beauveria đòi hỏi phải có độ ẩm không khí cao, tuy nhiên độ

ẩm dưới 50% vẫn kích thích nấm sinh bào tử (Gottwald G L, H L Tedders, 1982)

Trên các nguồn thức ăn khác nhau nấm sinh ra các men thủy phân thành các chất đơn phân tử rồi đồng hóa Việc phân giải vỏ chitin được tiến hành ngay khi nấm xâm nhập vào cơ thể côn trùng, sau đó là việc phân giải protein và lipid

ở các mô bên trong Trong nuôi cấy nấm thì tỷ lệ C : N cần được xác định Ngoài

ra một lượng chitin nhất định là cần thiết cho quá trình phát triển bào tử đính (conidiospore) và bào tử chồi (blastospore) Không chỉ có vậy, các nguyên tố vi lượng, vitamin đều cần thiết cho việc phát triển của nấm (Nguyễn Văn Đĩnh và cộng sự, 2007)

2.2.2 Nấm Metarhizium (nấm Lục Cương, nấm xanh)

Nấm Metarhizium phát triển trong giới hạn pH 6,9 – 7,4, nhiệt độ thích

hợp cho sự phát triển của nấm là 25 – 300C (Lương Đức Phẩm, 2011) Nếu t0

>

280C sợi nấm sẽ không sản sinh ra bào tử trần Ngoài ra muốn nấm có bào tử cần phải có độ ẩm không khí khá cao (Trần Thị Thanh, 2001)

Nấm Metarhizium không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không có

chitin, chúng sống được ở nhiệt độ thấp 80C, có biên độ về độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và thiếu O2 chúng có thể sống tới 445 ngày (Lê Hữu Phước, 2011)

Ở dưới 100

C và trên 350C thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra Nhiệt

độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 300C và chết ở 490C trong 10 phút Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trưởng là 250C và pH 3,3 – 8,5 Metarhizium có khả

năng phân giải tinh bột, cellulose và chitin (lông và da côn trùng) (Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó, 2006)

9

Độ ẩm cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm Tuy nhiên, độ ẩm thấp sẽ có lợi cho nấm duy trì sự sống Bào tử phân sinh của

nấm Paecilomyces có khả năng sống lâu trong điều kiện độ ẩm từ 0 – 34% hơn là

trong điều kiện độ ẩm 75% (Trần Văn Mão, 2002)

Nấm ký sinh côn trùng nói chung rất cần ánh sáng cho sự phát triển và

nấm Paecilomyces cũng không ngoại lệ Vì vậy, ánh sáng là nhân tố không thể thiếu trong sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces (Trần Văn Mão, 2002)

2.3 Đặc điểm phân loại chung

Nấm gây bệnh cho côn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm nguyên thủy sống dưới nước đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn Nấm gây bệnh cho côn trùng có mặt trong cả 4 lớp nấm:

- Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: Trong lớp nấm này, các loài ký sinh ở côn trùng tập trung ở 3 bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales

Đặc biệt có những họ nấm gồm tất cả các loài đều là ký sinh trên côn trùng như

Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae Những giống nấm ký sinh côn

trùng quan trọng của lớp nấm bậc thấp là: Coelosporidum, Chrytridiosis (bộ

Chrytridiales), Coelomonyces (bộ Blastocladiales) và Entomophthora (bộ Entomophthorales)

- Lớp nấm túi Ascomycetes: Trong lớp nấm túi có bộ Laboulbiniales là

những nấm ngoại ký sinh côn trùng có chuyên tính cao, còn các loài nấm túi khác đều là nội ký sinh của côn trùng Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn

trùng là: Cordyceps, Aschrsonia (bộ Hypocreales)

- Lớp nấm đảm Basidiomycetes: Trong lớp nấm đảm chỉ ở 2 giống có các loài gây bệnh trên côn trùng Đó là giống Septobasidium và Ureinella

- Lớp nấm bất toàn Deuteromycetes: Phần lớn các loài nấm ký sinh côn trùng đều thuộc bộ Moniliales Những giống Beauveria, Paecilomyces, Spicaria,

Metarhizium, Cephalosporium và Sorosphorella chứa các loài sau khi xâm

nhiễm vào côn trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời gian nhất định

2.4 Phân bố

Hai giống nấm Beauveria và Metarhizium khá phổ biến trong tự nhiên Vì

vậy, có thể phân lập chúng từ mẫu đất hoặc tốt nhất từ xác côn trùng chết (khi còn ở dạng sâu, kể cả tằm bị bệnh) Khi thời tiết khắc nghiệt không có côn trùng, người ta cũng có thể lấy mẫu đất ở những nơi có chất thải hữu cơ, xác thực vật, ở đất trồng các cây đước ở đầm lầy, ở đất trầm tích các dòng sông, trong tổ một số loài chim và cả trong rễ cây dâu tây cũng có thể phân lập được những nấm này

Các loài thuộc giống Paecilomyces phân bố phổ biến trong môi trường đất

và vật liệu hữu cơ mục nát (Samson và cộng sự, 1974) Nấm Paecilomyces có rất

nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng, cả những vùng nhiệt đới và ôn đới

(Trần Văn Mão, 2002) Nấm Paecilomyces có thể được tìm thấy ở đất tơi xốp,

carneus được xem là một tác nhân gây bệnh côn trùng yếu

+ Paecilomyces farinosus cũng được phân lập từ đất Nó là một tác nhân

gây bệnh côn trùng phổ biến, đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng nấm này như một tác nhân kiểm soát sinh học trong phòng trừ dịch bệnh

+ Paecilomyces fumosoroseus được phân lập từ côn trùng, bơ, đất và

gelatine Là loài nấm có phổ ký sinh côn trùng rộng, ký sinh trên nhiều vật chủ

như: Luciana separata, Pyrausta nubilalis, Carposina niponensis và nhiều loài

côn trùng biết bay khác (flies)

+ Paecilomyces lilacinus được phân lập từ côn trùng, đất, trên các vật liệu

hữu cơ, cao su tổng hợp, Đây cũng là loài có khả năng ký sinh côn trùng, đặc biệt ở giai đoạn ấu trùng Ngoài ra, người ta đã thành công trong việc sử dụng loài nấm này như một tác nhân kiểm soát loài giun tròn ký sinh trong ruột người (nematodes)

3 Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học

3.1 Khả năng sinh enzyme thủy phân ngoại bào

3.1.1 Khái quát về enzyme

Enzyme là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên, và tham gia vào các phản ứng sinh học Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton, được cấu tạo từ L-acid amine liên kết nhau bởi liên kết peptid Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzyme Bản chất sinh học của enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học và thực hiện các phản ứng sinh hóa trong và ngoài tế bào sinh vật

Enzyme gồm 2 nhóm: Nhóm enzyme một cấu tử gồm những enzyme có thành phần hóa học duy nhất là protein và nhóm enzyme hai cấu tử gồm những

enzyme có hai thành phần: phần protein thuần gọi là apoenzyme có vai trò xúc tác, phần thứ hai là coenzyme gồm những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác Ngoài ra, có một số kim loại như Fe, Cu, Zn, Mn, …đóng vai trò liên kết giữa enzyme và cơ chất, liên kết giữa apoenzyme và coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

3.1.2 Cơ chế hoạt động của enzyme

Hoạt động của phân tử enzyme được biểu hiện trong trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động của enzyme có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất

mà chúng tham gia Phản ứng không có sẳn mà được hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất giống như chìa khóa vào ổ khóa tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất

11

Cơ chế tác động của enzyme vào cơ chất qua ba giai đoạn:

• Giai đoạn 1: Enzyme tương tác với cơ chất bằng những liên kết yếu tạo

thành phức hợp enzyme - cơ chất

• Giai đoạn 2: Khi cơ chất tạo phức với enzyme, thì cơ chất sẽ bị thay đổi

cấu hình không gian và mức độ bền vững các liên kết Các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm Phức enzyme cơ chất sẽ được tách ra

• Giai đoạn 3: Enzyme được giải phóng, cơ chất chuyển thành sản phẩm

và tách khỏi enzyme

3.1.3 Khái quát một số loại enzyme phổ biến do nấm sợi ký sinh côn trùng tiết ra

• Protease là enzyme phân cắt mối peptide (- CO - NH -) trong phân tử

protein và chuỗi polypeptide, xúc tác phản ứng thủy phân protein thành peptide

và acid amine Vì vậy protease gồm có proteinase phân hủy phân tử protein thành các đoạn peptide có khối lượng phân tử nhỏ và peptidase phân hủy các liên kết ở cuối mạch polypeptide và tách các gốc acid amine thành acid amine tự do

• Lipase là một enzyme xúc tác trong quá trình thủy phân các triglyceride

không trộn nước ở mặt phân cách nước và lipid Các chất tạo thành trong quá trình thủy phân là monoglyceride, diglyceride hoặc glyxerol và các acid béo nhờ hoạt động trên bề mặt phân pha dầu nước

• Chitinase là enzyme thủy phân chitin qua việc xúc tác sự thủy giải liên

kết 1,4 – β – glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N – acetyl – D – glucosamin liên tiếp nhau trong chitin Dựa vào khả năng phân cắt, enzyme phân giải chitin bao gồm 4 loại:

+ Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên

tạo các đoạn olygosaccharides

+ Chitin – 1,4 – β – chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các

sản phẩm chính là các dimer chitobiose

+ N – acetyl – β – D – glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt

chitin từ một đầu, cho sản phẩm chính là các monomer N – acetyl – D – Glucosamine

+ Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 đơn phân N–acetyl–

D–glucosamine

3.2 Khả năng sinh các chất đối kháng

3.2.1 Khái quát về chất đối kháng

Chất đối kháng côn trùng là những sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật

có khả năng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của côn trùng

12

3.2.2 Đặc điểm các chất đối kháng do nấm sợi ký sinh sâu bệnh tiết ra

Nấm Beauveria diệt được côn trùng nhờ độc tố Beauvericin Độc tố này

có công thức C45H57O9N3, đây là một loại depsipeptide mạch vòng và tên gọi là cyclo (N – metyl – L – phelnyl alanin – D – α – hydroxy – izovaleryl)3, có điểm sôi ở 93 – 940C Từ một lít dịch lên men tách được 1,5g và một ký môi trường lên men rắn có thể tách được 3,8g Beauvericin (Lương Đức Phẩm, 2011)

Độc tố diệt côn trùng của nấm Metarhizium bao gồm nhiều ngoại độc tố

có tên Destruxin A, B, C và D Destruxin A và B có thể tách ra từ dịch nuôi cấy

nấm Metarhizium Destruxin A có công thức là C29H47O7N5, điểm sôi ở 1880

C Destruxin B có công thức là C30H51O7N5 và điểm sôi là 2340C Đó là những depsipeptide vòng (Lương Đức Phẩm, 2011) Năm 1961, 1962, Y Kodaira đã tách được ngoại độc tố Destruxin A và Destruxin B từ dịch nuôi cấy nấm lục

cương Metarhizium Trong một lít dịch nuôi cấy, tác giả có thể thu được 13 –

15mg độc tố Destruxin A và B (Phạm Thị Thùy, 2010)

Độc tố của nấm Paecilomyces là Paecilotoxin, cấu trúc rất phức tạp, có

pháp danh hóa học là (2S) – N – [(1S) – 1 – [[(1S) – 1 – [2 – [[(1S) – 1 – [[(1S) – 1 – [2 – [2 – (3 – arbamoylpropylcarbamoyl] – 3 – methyl – butyl] carbamoyl] propan – 2 – ylcarbamoyl] – 2 – hydroxy – 3 – methyl – butyl] carbamoyl] – 5 – hydroxy – 3 – methyl – 7 – oxo – nonyl] – 4 – methyl – 1 – [(E,4S) – 4 – methylhex – 2 – enoyl] pyrrolidine – 2 – carboxamide (Nevalainen Helena, 1977)

4 Cơ chế tác động của nấm lên sâu bệnh

Beauveria: Trong tự nhiên, khi bào tử nấm Beauveria rơi vào cơ thể côn

trùng, gặp điều kiện thời tiết thích hợp, chỉ sau 12 – 24 giờ thì bào tử nấm nảy mầm, chúng hình thành sợi đâm xuyên qua lớp vỏ chitin, sau đó phát triển bên trong cơ thể côn trùng, côn trùng phải huy động các tế bào bạch huyết để chống

đỡ, nhưng nấm Beauveria đã tiết ra độc tố Beauvericin có chứa protease và một

số chất khác phá hủy ngay cả tế bào bạch huyết làm cho sâu chết, sợi nấm mọc rất nhiều trong cơ thể sâu và sau đó chui ra ngoài, tạo một lớp bào tử phủ trên cơ thể sâu (Phạm Thị Thùy, 2010)

Metarhizium: Khi bào tử nấm lục cương bám lên bề mặt côn trùng trong

khoảng 24 giờ thì bào tử sẽ nảy mầm, tạo thành ống mầm xuyên qua vỏ côn trùng, sau đó tiếp tục phân nhánh tạo nên một mạng sợi nấm chằng chịt bên trong

cơ thể côn trùng, cũng giống như nấm Beauveria Nấm Metarhizium đã tiết ra

các độc tố Destruxin A, B và chính các độc tố trên đã gây chết côn trùng

Paecilomyces: Côn trùng bị nấm này tấn công thì ở chỗ bào tử bám vào sẽ

sản sinh ra enzyme phân hủy vỏ chitin của côn trùng Nấm sẽ phát triển bên trong thân của sâu non tạo nên một vệt đen không có hình thù nhất định Côn trùng chết đi thường có màu trắng, đôi khi có màu tím nhạt, thân hơi cứng lại (Phạm Thị Thùy, 2004)

13

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu

1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm sợi ký sinh trên xác côn trùng được phân lập tại các ruộng lúa thuộc khóm Trung Hưng, phường Mỹ Thới, thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang

- Các thiết bị: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, tủ ấm, kính hiển vi, tủ lạnh, máy

đo pH, cân phân tích điện tử, máy chụp ảnh kỹ thuật số,…

- Các dụng cụ thí nghiệm: thước đo khuẩn lạc, lò điện, bình tam giác, ống

nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang, que cấy, giấy quỳ, giấy lọc, giấy

báo cũ, phiến kính, lá kính, bông mỡ, bông thấm nước, khoan nút chai,…

1.4 Môi trường (MT)

MT phân lập, nuôi cấy và giữ giống, định danh nấm sợi

MT 1: MT Czapek- Dox cải tiến dùng để phân lập nấm sợi (Nguyễn Đức

MT 2: MT Potato glucose agar (PGA) dùng để nuôi cấy, giữ giống và

định danh nấm sợi (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

- Nước chiết khoai tây : 200 ml

14

- pH = 5,5 - 6,0 Khử trùng 1atm trong 30 phút

* Cách chế nước chiết khoai tây

Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch Cân 200g, xắt lát, thêm 1 lít nước cất, đun sôi trong 30 phút Lọc lấy dịch trong

MT thử hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

MT 3: MT thử hoạt tính protease (Trần Thanh Thủy, 1999)

* Cách chiết chitin từ vỏ, đầu tôm

- Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô

- Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 700C-750C/ 4 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước cất

- Tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở 260C- 300C/ 16 giờ, rửa sạch

- Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh

15

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Phương pháp thu mẫu

Cách lấy mẫu: Dùng kẹp đặt xác côn trùng bị nhiễm nấm vào trong ống tuýp, bên trong để kèm theo một ít bông gòn thấm ướt, ghi rõ thời gian và địa điểm lấy mẫu

Nhận biết côn trùng bị nhiễm nấm: Côn trùng nhiễm nấm ký sinh thường

có tơ (sợi nấm) xuất hiện trên bề mặt cơ thể, có thể quan sát bằng mắt thường Xác chết sâu thường bám chặt trên lá hoặc thân cây và dần khô cứng lại Có thể lấy mẫu ở bất cứ giai đoạn nào trong chu trình phát triển của cây lúa, tuy nhiên nên lấy mẫu ở giai đoạn gần cuối chu trình phát triển, vì giai đoạn này số lượng côn trùng gây hại thường nhiều, do đó nấm ký sinh côn trùng cũng tăng theo

Thời điểm lấy mẫu thích hợp nhất là buổi sáng sớm hoặc chiều mát, vì đây

là lúc không khí có độ ẩm cao, sợi nấm trương nước, phát triển mạnh, thuận lợi cho việc phân lập

2.2 Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu theo Uyenco, 1988

2.2.1 Phương pháp pha loãng mẫu

Lấy 10g mẫu côn trùng nhiễm nấm (cùng một ruộng lúa) cho vào ống nghiệm, thêm 90ml nước cất vô trùng, lắc đều, mạnh ta được dung dịch pha loãng 10-1

Lắc đều, rồi hút 1 ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2

Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5

2.2.2 Phương pháp cấy mẫu

Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa môi trường Czapek-dox Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch Sau đó sử dụng que trang

đó trải tiếp hai đĩa tiếp theo

2.2.3 Phương pháp ủ mẫu

Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo cũ, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3 – 7 ngày Chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường PGA

2.2.4 Phương pháp làm thuần

Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước cất vô trùng, trải lên đĩa petri chứa môi trường PGA, sau đó ủ mẫu và quan sát Nếu các dạng khuẩn lạc đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều có một dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết

Sau đó chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy truyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa

2.3.2 Tiến hành thí nghiệm

Nuôi nấm cần thử hoạt tính enzyme: Cấy nấm vào môi trường PGA, nuôi

ở nhiệt độ phòng từ 3 – 5 ngày, chờ khi nấm phát triển thành khuẩn lạc tương đối lớn, đường kính khuẩn lạc khoảng từ 1 – 2 cm

Dùng khoan nút chai (d=10mm) vô trùng, khoan các khối thạch trên môi trường PGA có chứa hệ sợi nấm, đặt khối thạch vào môi trường cần thử hoạt tính enzyme protease, chitinase trên các đĩa petri Giữ đĩa petri ở nhiệt độ phòng Sau

3 – 4 ngày dùng thuốc thử nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo khuẩn lạc

2.3.3 Kiểm tra kết quả

- Kiểm tra hoạt tính chitinase: Dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt

thạch Nếu nấm sợi có hoạt tính chitinase, vùng chitin bị phân giải có màu nâu đỏ

nhạt hoặc trắng, các vùng khác có màu nâu đỏ

- Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch Nếu nấm sợi sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh khuẩn lạc, do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2 Vùng chứa protein

chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 protein bị kết tủa

2.3.4 Đánh giá khả năng tạo enzyme

Đặt ngược đĩa petri Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính lỗ thạch (d = 10mm)

Dựa vào kết quả (D - d) để đánh giá khả năng sinh enzyme của các chủng nấm sợi Nếu giá trị (D - d) càng lớn thì khả năng sinh enzyme của nấm sợi càng cao

Theo Mai Thị Hằng (2002) quy ước:

 D-d ≥ 20mm : hoạt tính enzym mạnh

 D-d ≥ 10mm : hoạt tính enzym trung bình

 D-d < 10mm : hoạt tính enzym yếu