Nhân giống cây khoai môn colocasia esculenta l an giang bằng phương pháp nuôi cấy mô

An Giang bằng phương pháp nuôi cấy mô” được thực hiện với 4 thí nghiệm tại phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô thuộc khu Thí nghiệm Trường Đại học An Giang, nhằm mục đích tìm được môi trường c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

NHÂN GIỐNG CÂY KHOAI MÔN (Colocasia

esculenta L.) AN GIANG BẰNG PHƯƠNG

PHÁP NUÔI CẤY MÔ

NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN

AN GIANG, THÁNG 7 – NĂM 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA: NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

NHÂN GIỐNG CÂY KHOAI MÔN (Colocasia

esculenta L.) AN GIANG BẰNG PHƯƠNG

PHÁP NUÔI CẤY MÔ

NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN

AN GIANG, THÁNG 7 – NĂM 2017

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Đề tài nghiên cứu khoa học “Nhân giống cây Khoai Môn (Colocasia esculenta L.)

An Giang bằng phương pháp nuôi cấy mô” do tác giả Nguyễn Thị Mỹ Duyên,

công tác tại Khoa Nông Nghiệp và Tài Nguyên Thiên Nhiên thực hiện Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo Trường Đại học

An Giang thông qua ngày ………

em sinh viên lớp DH13SH Trường Đại học An Giang đã cộng tác giúp tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Rất cám ơn Quý Thầy, Cô đồng nghiệp Khoa Nông nghiệp &TNTN đã tận tình chia sẽ và hỗ trợ giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Xin chân thành cảm ơn!

TÓM LƯỢC

Đề tài nghiên cứu “Nhân giống cây Khoai Môn (Colocasia esculenta L.)

An Giang bằng phương pháp nuôi cấy mô” được thực hiện với 4 thí nghiệm tại

phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô thuộc khu Thí nghiệm Trường Đại học An Giang, nhằm mục đích tìm được môi trường có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp

và kiểu cấy phù hợp để tạo chồi và nhân nhanh số lượng chồi Khoai Môn, tạo cây Khoai Môn hoàn chỉnh Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như BA, TDZ, NAA và 2,4D ở các nồng độ khác nhau Các cây Khoai Môn giống thích nghi tốt trong nhà lưới

Kết quả nghiên cứu đạt được là: tỷ lệ hình thành chồi tái sinh hoàn toàn 100% khi các chồi Khoai Môn được nuôi cấy trên môi trường MS + 2mg/l BA Sự hình thành chồi quan sát được đạt 5,2 chồi sau 6 tuần nuôi cấy Môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi Khoai Môn là môi trường MS + 3mg/l BA + 0,5mg/l NAA (đạt 3,6 chồi và cao 4,37 cm) Kỹ thuật mới mới cấy chẻ đôi (lTCL) và cắt ngang (tTCL) cho số chồi cao hơn so với kiểu cấy chồi bình thường, số chồi đạt được sau 6 tuần nuôi cấy là lần lượt là 4,89 và 4,44 chồi Chất kích thích ra rễ là NAA cho hiệu quả tạo rễ chậm nhưng tốt hơn so với IAA Môi trường tạo rễ tốt nhất là MS + 1

mg/l NAA cho rễ to, số rễ đạt 20,43 rễ sau 6 tuần nuôi cấy Cây Khoai Môn in vitro

được trồng và cho tỷ lệ sống cao giai đoạn thuần dưỡng Giá thể phù hợp cho cây Khoai Môn con là tro trấu Tất cả cây con thích nghi cho tỷ lệ cây sống đạt tuyệt đối 100% trong nhà lưới

Các kết quả nghiên cứu đã hoàn thiện được qui trình vi nhân giống cây Khoai Môn, nhận thấy đây là đối tượng rất có tiềm năng phát triển trong vi nhân giống Cần phát triển để tạo nguồn cây giống tốt, sạch bệnh triển khai cho người dân địa phương trồng

Từ khóa: Cây Khoai Môn, Colocasia esculenta L., nuôi cấy mô, nhân giống in vitro, vi nhân giống

Research results achieved: highest percentage of shoot formation was 100% when Taro shoot explants were subcultured onto MS medium supplemented with 2mg/l BA Shoot formation was obtained 5,2 shoot after six week culture Use MS +

3 mg/l BA + 0,5mg/l NAA was good for the multiplication of the shoot, with 3,6 shoot and 4,37 cm after six week culture New technology with longitudinally thin cell layer (lTCL) and transversally thin cell layer (tTCL) had total shoots earlier and higher than normal shoot, achieved 4,89 và 4,44 shoot after six week culture Use NAA was slower root formation but better than IAA MS + 1 mg/l NAA solution

was best for rooting, 20,43 big root after six week culture In vitro Taro were growed

in and high survival rate in stage acclimatization The suitable substrate for Taro

seedlings was Husk ash, all plantlets acclimatized 100% in the greenhouse

The researching results has completed micropropagation process Taro, this plant is realized high potential in micropropagation Need to develop to create a good disease-free seedlings for local people planted it

Từ khóa: Taro, tissue culture, propagation in vitro, micropropagation, thin cell layer

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu trong công trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng Những kết luận mới về khoa học của công trình nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Long Xuyên, ngày 12 tháng 5 năm 2017

Người thực hiện

Nguyễn Thị Mỹ Duyên

MỤC LỤC

Trang

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM LƯỢC iii

ABSTRACT iv

LỜI CAM KẾT v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cần thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Đối tượng nghiên cứu 2

1.4 Nội dung nghiên cứu 2

1.5 Những đóng góp của đề tài 2

1.5.1 Đóng góp về mặt khoa học 2

1.5.2 Đóng góp công tác đào tạo 2

1.5.3 Đóng góp phát triển kinh tế xã hội 2

Chương 2: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

2.1 Giới thiệu về cây Khoai Môn 3

2.1.1 Nguồn gốc cây Khoai Môn 3

2.1.2 Giá trị kinh tế cây Khoai Môn 3

2.1.3 Đặc tính thực vật cây Khoai Môn 4

2.2 Điều kiện gieo trồng 6

2.2.1 Mật độ trồng 6

2.2.2 Thời vụ trồng 6

2.2.3 Nhiệt độ 6

2.2.4 Nước 7

2.2.5 Ánh sáng 7

2.2.6 Đất đai 7

2.2.7 Chất dinh dưỡng 7

2.3 Vi nhân giống 8

2.3.1 Khái niệm vi nhân giống 8

2.3.2 Vai trò của vi nhân giống trong sản xuất nông nghiệp 8

2.3.3 Các giai đoạn trong vi nhân giống 9

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vi nhân giống 10

2.3.5 Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào 14

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

2.4.1 Trong nước 15

2.4.2 Ngoài nước 17

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian và địa điểm 18

3.2 Vật liệu và phương tiện nghiên cứu 18

3.2.1 Mẫu nghiên cứu 18

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 18

3.2.3 Các hóa chất 20

3.2.4 Phòng nuôi mẫu 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA tối ưu để tạo chồi Khoai Môn 20

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng auxin và cytokinin thích hợp để nhân chồi Khoai Môn 21

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát kiểu cấy giúp tăng hệ số nhân chồi Khoai Môn 22

3.3.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây Khoai Môn hoàn chỉnh 23

3.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát thành phần giá thể thích hợp cho việc thuần dưỡng cây Khoai Môn 24

3.4 Phân tích dữ liệu 24

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA tối ưu để

tạo chồi Khoai Môn 25

4.1.1 Tỷ lệ phần trăm mẫu tái sinh chồi 25

4.1.2 Số chồi mới tạo thành 25

4.1.3 Chiều cao chồi (cm) 27

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng auxin và cytokinin thích hợp để nhân chồi Khoai Môn 28

4.2.1 Tỷ lệ phần trăm mẫu tạo chồi 28

4.2.2 Số chồi Khoai Môn 29

4.2.3 Chiều cao chồi Khoai Môn 31

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát kiểu cấy giúp tăng hệ số nhân chồi Khoai Môn 33

4.3.1 Tỷ lệ phần trăm mẫu cấy 33

4.3.2 Số chồi mới tạo thành 35

4.3.3 Chiều cao chồi (cm) 39

4.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây Khoai Môn hoàn chỉnh 41

4.4.1 Số rễ và dài rễ (cm) 41

4.4.2 Sự phát triển chiều cao chồi (cm) và số lá 45

4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát thành phần giá thể thích hợp cho việc thuần dưỡng cây Khoai Môn 46

4.5.1 Tỷ lệ sống của cây Khoai in vitro giai đoạn vườn ươm 46

4.5.2 Chiều cao chồi (cm) và số lá 47

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 50

5.1 Kết luận 50

5.2 Khyến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 1 55

PHU LỤC 2 56

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3 Tỷ lệ phần trăm (%) mẫu Khoai Môn tạo chồi sau 6 tuần nuôi

cấy

25

Bảng 5 Sự phát triển chiều cao chồi Khoai Môn (cm) sau 6 tuần nuôi

Bảng 8 Sự phát triển chiều cao chồi Khoai Môn tại sau 8 tuần nuôi

cấy

32

Bảng 13 Số chồi Khoai Môn/ mẫu ban đầu (chồi) sau 4 tuần nuôi cấy 36 Bảng 14 Số chồi Khoai Môn/ mẫu ban đầu (chồi) sau 6 tuần nuôi cấy 37

Bảng 18 Sự hình thành rễ và chiều dài rễ (cm) Khoai Môn sau 6 tuần

nuôi cấy

42 Bảng 19 Chiều cao chồi (cm) và số lá Khoai Môn sau 6 tuần nuôi cấy 45

Bảng 21 Sự phát triển chiều cao chồi (cm) và số lá giai đoạn thuần

dƣỡng

47

DANH SÁCH HÌNH

Hình 7 Chồi Khoai Môn sinh trưởng và phát triển trong môi trường MS

+ 2mg/l BA + 0,5mg/l NAA với kiểu cấy chẻ đôi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây Khoai Môn (Colocasia esculenta L.) là cây một lá mầm thuộc họ ráy

Araceae, chi Colocasia Đây là cây được trồng nhiều trên các loài đất khác nhau từ đất ruộng vườn ở đồng bằng đến đất đồi dốc ở đồi núi (Nguyễn Viết Hưng và cs, 2011)

Lá, bẹ lá, thân củ Khoai Môn đều là thức ăn thường dùng cho người và gia súc Khoai Môn có giá trị dinh dưỡng cao hơn Khoai tây gấp 1,5 lần (Phạm Hồng Nga, 2013) Bộ phận thường dùng là củ Khoai Môn là cây của vùng Á châu nhiệt đới, được trồng nhiều ở các xứ nóng để lấy củ có bột (Khoai cao, Khoai sáp,…), có củ nặng tới 500g hay tới hàng kilogram (Võ Văn Chi, 1991) Củ Khoai Môn thường dùng nấu ăn với xôi hay nấu chè, làm bánh Khi nấu chín vẫn giữ lại 37 – 70% hàm lượng vitamin B1, còn riboflavin hay vitamin B2 và vitamin PP vẫn giữ lại tỷ lệ khá cao Trong y học, củ tươi dùng giã nhỏ đắp trị mụn nhọt có mủ Dùng ngoài giã nhỏ trộn với dầu dừa xoa đắp diệt kí sinh trùng và trị ghẻ Lá giã đắp trị rắn cắn, ong đốt

và mụn nhọt (Võ Văn Chi, 1991)

Kết quả điều tra của Chương trình cây có củ Quốc gia năm 1993 cho thấy hàng năm có khoảng 15.000 ha Khoai Môn được trồng với năng suất trung bình khoảng 8 – 13 tấn/ha tùy giống (Trương Văn Hộ, 2000) Riêng ở tỉnh An Giang diện tích trồng Khoai Môn đã nhân rộng khắp các huyện Chợ Mới, Châu Phú, An Phú, Tri Tôn Hàng năm, giá trị lợi nhuận từ việc trồng Khoai Môn đã mang lại cho người dân khá cao, trừ chi phí, bình quân mỗi héc ta Khoai Môn thu lãi từ 100 – 120 triệu đồng (Thu Trang/TTXVN, 2014)

Tuy nhiên, cây Khoai Môn chủ yếu được trồng bằng củ con hay các chồi mắt ngủ được ủ nảy mầm từ củ do đó có hệ số nhân giống thấp, lượng củ làm giống cần nhiều mà chất lượng giống không đồng đều Ngoài ra, việc nhân giống bằng phương pháp truyền thống từ củ có nguy cơ truyền mầm bệnh từ thế hệ mẹ sang thế hệ con rất cao, đặc biệt đáng lo ngại nhất là bệnh do virus Nguồn giống thiếu là một trong những hạn chế lớn nhất để có thể trồng đại trà với quy mô lớn Vì vậy, yêu cầu đặt ra

là phải xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất giống đảm bảo chất lượng cung cấp đủ nguồn cây giống sạch bệnh, có độ đồng đều cao đáp ứng yêu cầu sản xuất Hiện nay,

ứng dụng công nghệ sinh học vào nhân giống in vitro Khoai Môn sẽ giúp cho việc

tạo được số lượng lớn cây con sạch bệnh, cây con đồng đều và luôn có sẵn mà không phụ thuộc vào mùa vụ

Hiện nay, tại các huyện thành trong tỉnh An Giang có nhu cầu trồng Khoai Môn rất lớn, nên nguồn củ giống không đủ đáp ứng nhu cầu, củ giống lại mang nguy

cơ mầm bệnh rất cao Do đó, vấn đề đặt ra là cần phải cung cấp kịp thời nguồn cây giống sạch bệnh đáp ứng cho nhu cầu trồng Khoai Môn của người dân Từ đó, chúng

tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Nhân giống cây Khoai Môn (Colocasia esculenta L.)

An Giang bằng phương pháp nuôi cấy mô” nhằm tạo ra nguồn cây giống khỏe, sạch bệnh, với số lượng lớn để đủ cung cấp nguồn cây giống cho Trung tâm khuyến nông tỉnh An Giang xây dựng mô hình trồng thử nghiệm Khoai Môn nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tại các huyện Chợ Mới và Châu Phú, An Giang

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xây dựng được quy trình nhân giống invitro cho cây Khoai Môn địa phương

và tạo được số lượng lớn cây giống sạch bệnh trong thời gian ngắn để chuyển giao cho Trung tâm Khuyến nông An Giang xây dựng mô hình điểm trồng thử nghiệm Khoai Môn nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tại các huyện tỉnh An Giang

Gia tăng mật số nhân cho giai đoạn nhân nhanh giống Khoai Môn in vitro bằng

một số kiểu cấy

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cây Khoai Môn (Colocasia esculenta L.)

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng auxin và cytokinin trong môi trường tái sinh và nhân chồi Khoai Môn

- Khảo sát một số kiểu cấy mới giúp tăng hệ số nhân cho chồi Khoai Môn in

vitro

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến sự tạo rễ cây Khoai Môn

- Nghiên cứu giá thể thích hợp cho việc thuần dưỡng cây Khoai Môn in vitro giai đoạn vườn ươm

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Đóng góp về mặt khoa học

Đề tài nghiên cứu đã tìm được qui trình vi nhân giống Khoai Môn bằng phương pháp nuôi cấy mô Tìm được môi trường nuôi cấy với nồng độ chất điều hòa sinh

trưởng thích hợp cho việc nhân giống in vitro và kiểu cấy mới giúp gia tăng hệ số

nhân cho chồi Khoai Môn

Thông qua kết quả nghiên cứu của đề tài làm nguồn bổ sung kiến thức quý giá cho các nghiên cứu về lĩnh vực nhân giống cây trồng, nuôi cấy mô

1.5.2 Đóng góp công tác đào tạo

Đào tạo 01 Khóa luận tốt nghiệp và 01 chuyên đề tốt nghiệp cho sinh viên đại học ngành công nghệ sinh học

1.5.3 Đóng góp phát triển kinh tế xã hội

Cung cấp được nguồn cây giống tốt, sạch bệnh cho Trung tâm khuyến nông An Giang chuyển giao cho người dân địa phương Chợ Mới và Châu Phú, An Giang

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY KHOAI MÔN

2.1.1 Nguồn gốc cây Khoai Môn

Cây Khoai Môn (Colocasia esculenta L.) là cây một lá mầm thuộc họ ráy

Araceae, chi Colocasia Nguồn gốc của cây Khoai Môn còn là vấn đề cần được tiếp tục nghiên cứu, chưa có ý kiến thống nhất của nhiều nhà khoa học chuyên nghiên cứu về cây này Tuy nhiên, gần đây nhiều tác giả đều thống nhất rằng rất nhiều dạng hoang dại và dạng trồng của cây Khoai Môn có nguồn gốc tại các dải đất kéo dài từ Đông Nam Ấn Độ và Đông Nam Á tới Papua New Guinea và Melanesia (Kuruvilla and Singh, 1981; Matthew, 1995; Lebot, 1999) Lịch sử trồng trọt cũng bắt đầu từ những vùng đất đó (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

Vào khoảng 100 năm trước công nguyên Khoai Môn đã được trồng ở Trung Quốc và Ai Cập Trong thời tiền sử, sự trồng trọt được mở rộng tới các quần đảo Thái Bình Dương, sau đó nó được đưa tới vùng Địa Trung Hải rồi tới Tây Phi Từ Tây Phi, cây trồng này được mở rộng tới Tây Ấn và tới các vùng nhiệt đới của Châu

Mỹ Ngày nay Khoai Môn được trồng phổ biến ở khắp các vùng nhiệt đới cũng như

ôn đới ấm áp (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

Theo Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc (2005) cho rằng Khoai Môn là cây trồng quan trọng trong lịch sử nông nghiệp ở Châu Á bao gồm cả Việt Nam, mặc

dù hiện nay nó đã không còn có vai trò chính trong sản xuất lương thực vì đã được thay bằng cây lúa và các cây trồng khác Ở nước ta, Khoai Môn nước được thuần hóa sớm, trước cả cây lúa nước, cách đây khoảng 10.000 – 15.000 năm

2.1.2 Giá trị cây Khoai Môn

Trong 100 g củ Khoai Môn tươi có chứa nước 69 g, protid 1,8; lipid 0,1; glucid 26,5; cellulose 1,2; tro 1,4 và 64 mg calcium, 75 mg phosphor; 1,5 mg sắt; 0,02 mg caroten; 0,06 mg vitamin B1, 0,03 mg vitamin B2, 0,06 mg vitamin B1, 0,01 mg vitamin PP, 4 mg vitamin C (Võ Văn Chi, 2012)

Khoai Môn đặc biệt hữu ích cho những người dị ứng với ngũ cốc và có thể được tiêu thụ bởi trẻ em, bột Khoai Môn được sử dụng trong thức ăn của trẻ sơ sinh

và các loại thực phẩm đóng hộp cho bé (Lee, 1999) Củ Khoai Môn có ít chất béo và protein Tuy nhiên, những protein trong củ Khoai Môn cao hơn so với Khoai mỡ, sắn

và Khoai lang Khoai Môn giàu protein và một số axit amin thiết yếu, nhưng ít tryptophan, isoleucine, và methionine (Onwueme, 1978) Lá Khoai Môn có chứa hàm lượng protein cao hơn và cũng là nguồn tuyệt vời về carotene, kali, canxi, sắt, phốt pho, riboflavin, thiamine, niacin, vitamin A, vitamin C và chất xơ (Onwueme,1978) Nó cũng có lượng vitamin B lớn hơn sữa nguyên chất (Lee, 1999)

Lá và cuống lá cây Khoai Môn tươi có chứa 80% và 94% độ ẩm

Khoai Môn được sử dụng làm lương thực và thực phẩm rộng khắp thế giới từ Châu Á, Châu Phi, Tây Ấn Độ cho đến Nam Mỹ Ngoài việc góp phần vào an ninh lương thực bền vững tại thị trường trong nước, nó cũng mang lại thu nhập xuất khẩu (Revill et al, 2005)

Ngoài ra, Griffin (1982) đã nhấn mạnh tầm quan trọng khác của Khoai Môn khi đã phát triển và sử dụng Khoai Môn làm thức ăn động vật, là một nguyên liệu thô trong sản xuất mỹ phẩm và nhựa

2.1.3 Đặc tính thực vật cây Khoai Môn

Cây Khoai Môn là loại cây thân thảo, thường cao từ 0,5m đến 2m Cây Khoai Môn thường có một củ cái ở giữa thường nằm dưới đất, từ đó lá phát triển lên trên, rễ phát triển xuống dưới, trong khi đó củ non, củ nách và các dải bò lại phát triển ngang

sang các bên (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

2.1.3.1 Rễ

Rễ của cây Khoai Môn là rể chùm mọc từ đốt mầm xung quanh thân củ Rễ ngắn, hướng ăn ngang và mọc thành từng lớp theo hướng đi lên thuận với sự phát triển của đốt, thân củ Rễ thường có màu trắng và có chứa anthocianin Một số kiểu gen có cùng lúc 2 loại rễ: rễ có sắc tố và không có sắc tố Rễ phát triển thành nhiều tầng, phụ thuộc vào số lá của cây Số lượng rễ và chiều dài rễ phụ thuộc vào từng giống và đất trồng Một lớp rễ trung bình có từ 25 – 30 rễ (Tổ nghiên cứu cây có củ, 1969)

2.1.3.2 Thân củ (củ)

Phần gốc phình thành củ hoặc thân củ chứa tinh bột Củ cái chính được coi là cấu trúc thân chính của cây, nằm trong đất Trên thân củ có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm phát triển thành nhánh Sau khi dọc lá lụi đi thì trên thân củ thêm một đốt và thân củ dài ra Bề mặt củ được đánh dấu bởi vòng tròn gọi là chân dọc củ Đó là điểm nối của những lá vảy hoặc lá già Nhiều mầm bên phân bố trên những đốt củ Đỉnh của củ cái chính là điểm sinh trưởng của cây Sự mọc lên của cây đều bắt đầu từ đỉnh

củ cái Toàn bộ phần dọc lá trên mặt đất tạo nên thân giả của cây Khoai Môn (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

Củ Khoai Môn rất khác nhau về kích thước và hình dạng, tùy thuộc vào kiểu gen, loại củ giống và các yếu tố sinh thái, đặc biệt là các yếu tố có ảnh hưởng đến thân củ như cấu trúc và kết cấu của đất, sự có mặt của sỏi đá Củ cái của những giống đại diện trồng trên đất cao thường tròn hoặc hơi dài, còn những giống có củ cực dài thường là của những giống trồng ở ruộng nước và đầm lầy (bờ mương, ao) Tất cả củ cái, củ con, củ nách có cấu tạo bên ngoài gần như nhau, đều có một mầm ở đỉnh và nhiều mầm ở nách của vô số các lá vảy trên thân củ (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

Các giống Khoai Môn, củ có thể đạt tới chiều dài khoảng 30cm và đường kính khoảng 15cm Củ cái và củ con đều gồm 3 phần: vỏ ngoài, vỏ áo và lõi củ (thịt củ)

Vỏ ngoài có thể nhẵn, sằn sùi hoặc được phủ bằng những lớp vảy thường có màu nâu đậm Lớp vỏ áo nằm giữa vỏ ngoài và lõi củ Vỏ áo và lõi củ bao gồm chủ yếu các nhu mô Trong lõi củ ngoài tế bào chứa nhiều tinh bột còn có xơ củ Lượng xơ củ rất khác nhau giữa các kiểu gen và chịu ảnh hưởng lớn của môi trường Sắc tố trong củ biến động từ trắng, vàng nhạt, vàng đậm, da cam, đến hồng, đỏ và tím đỏ Ngoài ra ở một số giống thịt củ có màu xen kẽ giữa trắng và tím đỏ hoặc tím hoặc nhu mô trắng cùng với xơ có màu đậm hơn Thỉnh thoảng trên đồng ruộng quan sát thấy ở một số giống có dải bò sẽ phát rễ và mọc chồi phát triển thành cây con mới (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

2.1.3.3 Lá

Lá chính là phần duy nhất nhìn thấy trên mặt đất, lá quyết định chiều cao của cây Khoai Lá có diện tích tương đối lớn Mỗi lá được cấu tạo từ một cuống lá thẳng

và một phiến lá (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

Phiến lá của hầu hết các kiểu gen có hình khiên, gốc hình tim, có rốn ở gần giữa, là điểm nối giữa cuống và phiến lá Phiến lá nhẵn, chiều dài có thể biến động từ 20cm đến 70cm và bề rộng từ 15cm đến 50cm Kích thước của lá chịu ảnh hưởng rất lớn của điều kiện ngoại cảnh Lá Khoai Môn đạt cỡ lớn nhất ở giai đoạn sắp ra hoa Màu phiến lá biến động từ màu xanh nhạt đến tím thẩm phụ thuộc vào kiểu gen Lá

có thể chỉ có một màu thêm đốm hay vệt của màu khác Lá cũng có thể biến màu khi

bị bệnh, đặc biệt là khi nhiễm virus Trên phiến lá có 3 tia gân chính, một gân chạy thẳng từ điểm nối dọc lá với phiến lá tới đỉnh phiến lá Hai gân còn lại chạy ngang về

2 đỉnh của thùy lá Từ 3 gân chính có nhiều gân nhỏ nổi phát ra tạo thành hình mắt lưới (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

Cuống lá ở cây Khoai Môn được gọi là dọc lá Trong nhu mô của dọc lá có nhiều khoảng trống nên dọc lá thường xốp Dọc lá mập có bẹ ôm chặt ở phía gốc tạo nên thân giả Chiều dài dọc lá biến động phụ thuộc vào kiểu gen từ 25cm đến 160cm Màu dọc lá biến động từ xanh vàng đến tím đậm, đôi khi có sọc màu tím hoặc xanh đậm Dọc và lá không phải khi nào cũng cùng màu Bẹ của dọc thường là dạng ôm

có chiều dài khoảng 1/3 chiều dài của dọc Gần lúc thu hoạch củ, dọc lá càng ngày càng ngắn lại và phiến lá cũng nhỏ đi (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

2.1.3.4 Hoa và quả

Hoa của cây Khoai Môn thuộc hoa đơn tính đồng chu, hoa đực và hoa cái cùng trên một trục Cụm hoa có dạng bông mo, mọc từ thân củ, ngắn hơn cuống lá Mỗi cây có thể có từ một cụm hoa trở lên Cụm hoa cấu tạo từ một cuống ngắn một trục hoa và một bao mo Cuống hoa có màu xanh vàng hoặc tím tùy thuộc vào giống Cấu tạo của cuống hoa cũng giống cấu tạo của dọc lá Bao mo có 2 phần, phần trên có màu vàng, phần dưới màu xanh, chiều dài khoảng 20cm ôm lấy trục hoa Trục hoa ngắn hơn mo, có 4 phần: phần hoa cái dưới cùng, tiếp đến là một phần không sinh sản, trên nữa là phần hoa đực, cuối cùng là phần phụ không sinh sản, hình nhọn Hoa

không có bao Hoa đực màu vàng có nhị tụ nhiều cạnh, hạt phấn tròn, bao phấn nứt rãnh Hoa cái có bầu 1 ô, bầu rất ngắn (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

Quả mọng có đường kính khoảng 3 – 5cm và chứa nhiều hạt Mỗi hạt ngoài phôi còn có nội nhũ (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

2.2 ĐIỀU KIỆN GIEO TRỒNG

2.2.1 Mật độ trồng

Trước khi trồng cần căn cứ vào chủng loại giống, điều kiện đất đai để lựa chọn mật độ phù hợp Giống có dạng khóm đứng, đẻ nhánh nhiều thì trồng dày hơn những giống dạng xoè, đẻ nhánh ít, đất tốt trồng thưa hơn đất xấu Mật độ 25.000 - 35.000 cây/hecta, với khoảng cách hàng 60cm, cách cây 50cm cho Khoai Môn (N.T.Thanh, 2009)

2.2.2 Thời vụ trồng

Thời vụ trồng khoảng đầu tháng 3 – 4, thu hoạch tháng 10 – 11 Những nơi chủ động nước tưới có thể trồng quanh năm nhưng tốt nhất từ tháng 10 đến tháng 11 năm sau (N.T.Thanh, 2009)

Tại An Giang, đôi khi do lợi nhuận cao và điều kiện thuận lợi, người dân trồng Khoai Môn quanh năm (Hình 1)

Hình 1: Ruộng Khoai Môn tại Chợ Mới, An Giang

2.2.4 Nước

Do có bề mặt thoát hơi nước lớn nên cây Khoai Môn có yêu cầu về độ ẩm cao

để phát triển Cây cần lượng mưa hoặc nước tưới khoảng 1.500 đến 2.000mm để cho năng suất tối ưu Cây phát triển tốt nhất trong điều kiện đất ướt hoặc điều kiện ngập Trong điều kiện khô hạn cây giảm năng suất củ rõ rệt Củ phát triển trong điều kiện khô hạn thường có dạng quả tạ (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

2.2.5 Ánh sáng

Cây Khoai Môn đạt được năng suất cao nhất trong điều kiện cường độ ánh sáng cao, tuy nhiên nó là loại cây chịu được bóng râm hơn hầu hết các loại cây khác Điều này có nghĩa là nó có thể cho năng suất hợp lý thậm chí trong điều kiện che bóng nơi những cây trồng khác không thể phát triển được Đây là một đặc tính ưu việt khiến cây Khoai Môn là cây trồng xen lý tưởng với cây ăn quả và các cây trồng khác Ánh sáng mặt trời cũng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây Khoai Môn Sự hình thành củ được hình thành trong điều kiện ngày ngắn, trong khi hoa lại

nở mạnh trong điều kiện ngày dài (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

2.2.6 Đất đai

Cây Khoai Môn là loại cây có thể thích ứng với nhiều loại đất khác nhau và được trồng ở nhiều loại đất tương đối chua, thành phần tương đối nhẹ và nhiều mùn Năng suất cao hay thấp phụ thuộc vào giống và phân bón nhiều hay ít Tuy nhiên Khoai Môn nước cũng thích ứng tốt với loại đất nặng ngập nước (60 – 80 sét và li-Mông) hoặc đất ẩm thường xuyên Dường như trong điều kiện ngập nước cây Khoai Môn có khả năng di chuyển oxy từ các phần trên mặt đất qua dọc xuống rễ Điều này

có thể tạo cho rễ có thể hô hấp và phát triển bình thường thậm chí khi đất quanh nó

bị ngập và thiếu oxy Trong thực tế sản xuất, những vùng có năng suất Khoai nước cao thường là những vùng đất phù sa ven sông, hay những vùng có kỹ thuật thâm canh khá (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

2.2.7 Chất dinh dưỡng

Cũng như các loại cây trồng lấy củ khác, cây Khoai Môn yêu cầu đất tốt đầy đủ các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng để cho năng suất cao Những nơi đất quá cằn cõi cần bón nhiều phân bón hữu cơ mới phù hợp để trồng Khoai Phân bón rất có ý nghĩa trong việc tăng năng suất củ và thân, lá của cây Khoai Môn (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

Cây Khoai Môn phát triển tốt ở pH khoảng 5,5 – 6,5 Một đặc tính quý của Khoai Môn là giống có đặc tính chống chịu mặn cao Chính vì vậy ở Nhật và Ai Cập cây Khoai Môn được sử dụng như cây trồng đầu tiên để khai hoang đất ngập mặn (Kay, 1973) Điều này cho thấy tiềm năng sử dụng cây Khoai Môn để khai thác một

số vùng sinh thái khó khăn, nơi những cây trồng khác không thể trồng được, hoặc kém phát triển (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc, 2005)

2.3 VI NHÂN GIỐNG

2.3.1 Khái niệm vi nhân giống

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004) vi nhân giống là phương pháp nhân giống kiểu cây của một kiểu gen được tuyển chọn Mẫu cấy ban đầu có thể là chồi hoặc mô phân sinh đã được khử trùng và đưa vào môi trường nuôi cấy phù hợp Các chồi mới hình thành được tách ra chuyển sang môi trường mới và quy trình cứ thế được lặp lại Mặt khác vi nhân giống còn có thể được thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái sinh từ

mô sẹo Phương pháp này cho số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn, nhưng thường kéo theo sự biến dị soma (Nguyễn Đức Thành, 2000)

2.3.2 Vai trò của vi nhân giống trong sản xuất nông nghiệp

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), việc áp dụng nuôi cấy

mô trong sản xuất nông nghiệp hiện nay mang lại một số lợi ích như:

- Kiểm soát được dịch bệnh: phương pháp nuôi cấy mô có thể loại được những

cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh

- Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt về sản phẩm cuối Do đó, năng suất lao động sẽ tăng, chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tiêu thụ và chế biến

Theo Lê Thị Bích Chi (2012) thì nhân giống in vitro có một số ưu điểm so với

các phương pháp nhân giống khác như:

- Cho hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa vào sản xuất

- Nhân được số lượng cây lớn trên một diện tích nhỏ

- Tạo cây sạch bệnh, phục hồi các giống nhiễm virus và bảo quản nguồn gen trong ngân hàng gen

- Cây con được bảo quản tốt và thuận tiện cho việc vận chuyển

2.3.3 Các giai đoạn trong vi nhân giống

Vi nhân giống được chia thành bốn giai đoạn khác nhau (không kể giai đoạn 0) mỗi giai đoạn có một chức năng riêng (Debergh và Read, 1991)

Bảng 1: Các giai đoạn của vi nhân giống

In vivo Giai đoạn 0 Lựa chọn và chuẩn bị cây mẹ

In vitro

Giai đoạn 3b Tạo rễ và tiền thuần dưỡng

In vivo Giai đoạn 4 Thuần dưỡng

2.3.3.1 Giai đoạn 0: Lựa chọn và chuẩn bị cây mẹ

Khởi đầu của quá trình vi nhân giống cần phải lựa chọn cây mẹ cẩn thận, chúng phải đặc trưng cho giống loài và đang ở trong giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống mới đạt hiệu quả cao (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

2.3.3.2 Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy

Đây là giai đoạn đưa mẫu từ bên ngoài vào điều kiện nuôi cấy vô trùng Mẫu phải đảm bảo tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ tăng trưởng nhanh (Lê Trần Bình và ctv., 1997) Để có được kết quả này còn phụ thuộc vào cách lấy mẫu, chọn đúng phương pháp khử trùng để có được nhiều mẫu cấy vô trùng còn khả năng sinh trưởng

2.3.3.3 Giai đoạn 2: Nhân nhanh số lượng

Mục đích của giai đoạn này là tạo được số lượng cây theo ý muốn thông qua quá trình kích thích mô phân sinh như: đỉnh sinh trưởng, chồi chính, chồi bên (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Có 3 phương pháp nhân chồi đó là phát sinh chồi bất định

từ mô sẹo nhận được từ mô sinh vật nuôi cấy, phát sinh chồi bất định trực tiếp từ mô sinh vật không thông qua mô sẹo và phương pháp nhân chồi bên

2.3.3.4 Giai đoạn 3: kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dưỡng

Chồi và cây con được tạo ra ở giai đoạn 2 thường rất nhỏ, chưa có đủ khả năng

để phát triển ở điều kiện tự nhiên Do đó, mục đích của giai đoạn này là tạo cho cây phát triển đầy đủ rễ, thân, lá, có khả năng thực hiện quang hợp và sống sót mà không cần cung cấp nguồn hydrocacbon nhân tạo Giai đoạn này đưa chia thành 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 3a (kéo dài): giai đoạn này kéo dài các chồi ở giai đoạn 2 để đạt kích thước thích hợp cho việc tạo rễ đầy đủ Môi trường kéo dài thường không chưa cytokinin hoặc chứa một lượng cytokini thấp hơn giai đoạn 2 (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

- Giai đoạn 3b: đây là giai đoạn kích thích tạo rễ và tiền thuần dưỡng Auxin và than hoạt tính thường được sử dụng cho việc tạo rễ Mục đích của việc sử dụng than hoạt tính trong giai đoạn này là để làm tối môi trường, hấp thu các phân tử kim loại, các phân tử có cấu trúc vòng (như chất điều hòa sinh trưởng) hoặc các chất phenol do mô thực vật tiết ra (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

2.3.3.5 Giai đoạn 4: Thuần dưỡng

Sự thuần dưỡng là công việc giúp cho các cây con cấy mô thích nghi dần với điều kiện môi trường tự nhiên (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Các cây con cấy mô khi được mang trồng trực tiếp ở nhà lưới hoặc môi trường

tự nhiên thường có tỷ lệ chết rất cao Có nhiều nguyên nhân gây ra hiện tượng này Trước hết là do cấu trúc giải phẩu của cây cấy mô không thích hợp với điều kiện tự

nhiên, thứ hai là cây con đem ra từ trong phòng nuôi cấy chưa thích nghi với sự thay đổi đột ngột của điều kiện môi trường Vì vậy, để tăng khả năng sống sót của cây con ngoài nhà lưới thì phải huấn luyện cho cây thích nghi với sự hay đổi của nhiệt độ, ẩm

độ, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng hoàn toàn (Lê Trần Bình và ctv., 1997)

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vi nhân giống

2.3.4.1 Môi trường nuôi cấy

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy Có nhiều loại môi trường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, tùy vào đối tượng cây trồng, mô nuôi cấy hay mục đích nghiên cứu mà các thành phần hóa chất sử dụng trong môi trường nuôi cấy thay đổi (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Nhưng nhìn chung, tất cả các loại môi trường này đều có một số thành phần cơ bản sau: đường cung cấp nguồn cacbon, các muối khoáng đa lượng và vi lượng, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng Ngoài ra, tùy tác giả còn thêm một số chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định như acid amin, Fe-EDTA,… hoặc không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,… (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

2.3.4.2 Đường

Trong nuôi cấy in vitro, nguồn cacbon được bổ sung vào môi trường dưới dạng

đường giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối Đường có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nếu hàm lượng đường cao, mô nuôi cấy khó hút được nước, còn hàm lượng đường thấp, là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng thủy tinh thể (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006) Hai dạng đường thường gặp nhất

trong nuôi cấy in vitro là glucose và sucrose, trong đó sucrose (2 – 8%) được sử dụng

phổ biến hơn (Lê Trần Bình và ctv., 1997)

2.3.4.3 Chất khoáng

Theo Lâm Ngọc Phương (2009), các chất khoáng được thành lập trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy Có nhiều nguyên tố khoáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, mỗi nguyên tố có một vai trò riêng Các nguyên tố khoáng được chia thành hai nhóm: nguyên tố khoáng đa lượng và nguyên tố khoáng vi lượng (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2005)

- Khoáng đa lượng: các nguyên tố khoáng đa lượng cần phải cung cấp là Nitrogen (N), phospho (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Lưu huỳnh (S) có vai trò quan trọng đối với cây trồng (Nguyễn Bảo Toàn, 2005), chúng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thụ của mô cấy

và không gây độc (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2005) Nguyên tố N

và P cần thiết cho sự tổng hợp chất hữu cơ, là thành phần của các phân tử protein và các acid nucleic Nguyên tố K là một chất hoạt hóa của nhiều enzyme cần thiết cho sự quang tổng hợp và hô hấp, và nó cũng hoạt hóa enzyme cần để tạo tinh bột và protein Nguyên tố Ca cần thiết cho sự vững chắc của vách tế bào và mô thực vật

- Khoáng vi lượng: các vi lượng thường thêm vào môi trường là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Molypden (Mo), Cobalt (Co), Sắt (Fe) Nhu cầu về khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là rất cần thiết (Nguyễn Văn Uyển và ctv., 1984) Fe, Zn đóng vai trò then chốt trong

hệ thống enzyme, Fe còn có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp diệp lục tố,… (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Trong môi trường nuôi cấy

mô, Fe được sử dụng chủ yếu dưới dạng Fe-EDTA, vì ở dạng này sắt được hòa tan hoàn toàn không bị kết tủa mà chúng phóng thích từ từ vào môi trường nuôi cấy theo nhu cầu của mô thực vật (Nguyễn Văn Uyển và ctv., 1984)

2.3.4.4 Vitamin

Để mô cấy có sức sinh trưởng tốt hơn, ta cần cung cấp thêm một hoặc một số loại vitamin vừa đủ vào môi trường nuôi cấy Các loại vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid (vitamin B3), pyridoxin (vitamin B6) và myo-inositol Các loại này được sử dụng với một lượng rất nhỏ (mg/l) Thiamin được sử dụng như là coenzyme trong biến dưỡng carbohydrate Nicotinic acid được sử dụng như là coenzyme trong các chất biến dưỡng nicotinamid adenin dinucleotic (NAD) hay nicotinamid dinucleotic phosphat (NADP) Pyridoxin là coenzyme trong phản ứng dị hóa aminoacid Myo-inositol là thành phần của phosphatidyl inositol và phytic acid hỗ trợ cho sự sinh trưởng của tế bào (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

2.3.4.5 Thạch (agar)

Agar được sử dụng làm chất đông cứng môi trường để làm giá thể cho môi trường nuôi cấy tế bào thực vật tách rời, nó là một phức hợp polysaccharid tự nhiên

được trích từ loài tảo đỏ (Gelidium amansii) sống ở biển, loài tảo này thuộc ngành

Rhodophyta (George, 1993) Agar tan trong nước ở 1000 C và đông đặc ở 450

C không phản ứng với các chất trong môi trường nuôi cấy nên được sử dụng rộng rãi Nồng độ agar được sử dụng vào khoảng 6 – 8 g/l (Debergh, 1983)

2.3.4.6 Các chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những hợp chất hữu cơ khác với những chất dinh dưỡng Với một hàm lượng nhỏ, chúng kích thích, ức chế, hoặc bổ sung bất

kì một quá trình sinh lý nào trong thực vật (Nguyễn Minh Chơn, 2010) Có 2 nhóm chất là auxin và cytokinin

 Auxin

Trong nuôi cấy mô thực vật, các chất thuộc nhóm auxin thường được sử dụng gồm: 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxy acetic acid), NAA (Naphthalen acetic acid), IBA (Indole-3-butyric acid), IAA (Indole-3-acetic acid)

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Trong nuôi cấy

mô tế bào thực vật, auxin có khả năng phân chia tế bào, phân hóa rễ và ức chế thành lập chồi bên (Bùi Bá Bổng, 1999) Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là IAA (Indole-3-acetic acid) Nó hiện diện ở nồng độ cao ở vùng mô phân sinh của thực vật

và có liên quan đến nhiều đáp ứng sinh lý

Alpha-naphthaleneacetic acid (NAA) là auxin tổng hợp, thường ổn định với

nhiệt độ và ánh sáng hơn IAA

Khi dùng auxin ở nồng độ thấp thì gia tăng sự hình thành rễ phụ Ngược lại nếu dùng ở nhiệt độ cao thì ảnh hưởng không tốt đến sự tạo lập rễ, trong khi đó lại kích thích các lớp mô bảo vệ

Nhóm auxin có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ Do đó,

nó được áp dụng trong vi nhân giống và tạo rễ của cành giâm Các loại auxin thường được sử dụng cho nuôi cấy mô là IAA, IBA, NAA,…Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1 – 0,2ppm vì chúng có hiệu quả ở nồng độ thấp (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006)

2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4D): đây là một chất diệt cỏ tổng hợp và

hiệu quả auxin rất mạnh, hầu như không hòa tan trong nước (Dương Công Kiên, 2002)

 Cytokinin

Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, kết hợp với auxin gây ra

sự phân chia tế bào thực vật

- Benzyl adenine (BA) hoặc 6-benzy lamino purine (BAP) đây là cytokinine

tổng hợp, có công thức hóa học là C12H11N5 (Dương Công Kiên, 2002; https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6-Benzylaminopurine), đóng vai trò chính trong sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cấy mô, kích thích sự tăng chồi

Benzyl adenin (BA) là một loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều loại thực vật Các loại cytokinin khác (kinetin, 2-iP và zeatin) cũng

có sử dụng nhưng ít hơn BA Ngoài tác dụng tạo chồi, cytokinin cũng cảm ứng sự tạo rễ hoặc tác động lên sự tăng trưởng của rễ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

- Thidiazuron (TDZ) có công thức hóa học là C9H8N4OS, thuộc nhóm cytokinine được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô ngày nay TDZ với một liều

lượng thấp có tác dụng kích thích sự hình thành chồi non (Murthy et al., 1998; trích trong Dương Công Kiên, 2003)

Cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh

trưởng của chồi in vitro Các cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy bao gồm

BA, kinetin, zeatin, TDZ, 2-iP Trong đó, BA và kinetin là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả Nồng độ thường được sử dụng là 0,1 – 2ppm Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo

rễ của chồi nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006)

Tỷ lệ cytokinin và auxin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự hình thành tạo chồi và tạo rễ Tỷ lệ cytokinin cao và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi, ngược lại tỷ lệ auxin cao và cytokinin thấp thích hợp cho tạo rễ (Nguyễn Bảo Toàn, 2010; George, 1993)

2.3.4.7 Các yếu tố khác

Bên cạnh các yếu tố về môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thì các yếu tố sinh lý như cường độ và thời gian chiếu sáng, nhiệt độ, nồng độ CO2,

ẩm độ bình nuôi cấy, ẩm độ của vườn ươm,… cũng có ảnh hưởng đến vi nhân giống

Điều kiện thuần dưỡng: các cây con sau giai đoạn cấy mô khi mang ra thuần dưỡng ở môi trường tự nhiên thường có tỷ lệ chết rất cao Để tăng khả năng sống của cây con ngoài vườn ươm thì cây phải trải qua giai đoạn huấn luyện thích nghi với sự thay đổi của nhiệt độ, ẩm độ, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng hoàn toàn Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, rễ của các cây cấy mô được tạo ra trong quá trình nuôi cấy chưa có chức năng hoàn toàn, các rễ này cần có thời gian hoàn thiện các cấu trúc bên trong Vì vậy, trong giai đoạn đầu cần tránh làm cho cây con bị mất nước (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

- Ẩm độ: cây cấy mô sinh trưởng trong môi trường có ẩm độ cao, vì vậy khi

chuyển sang môi trường tự nhiên có độ ẩm thấp nên cây dễ mất nước Do đó, nhiều kỹ thuật tạo ẩm độ đã được đề nghị bởi các tác giả nghiên cứu Theo các khuyến cáo cho thấy không nên sử dụng phương pháp tạo ẩm độ bằng phương pháp phun sương, vì như thế cây con dễ bị mất khoáng do rữa trôi Phương pháp được nhiều tác giả đề nghị là phủ kín bằng plastic trong để giữ

ẩm độ cao và đặt cây con trong điều kiện ánh sáng thấp (Đặng Phương Trâm, 2001)

- Ánh sáng: cây cấy mô dễ thích nghi trong điều kiện ánh sáng thấp, nếu đặt

dưới ánh sáng cao dễ bị cháy lá do cấu trúc hình thái giải phẫu lá mỏng và ít

tế bào thịt lá (tế bào mô giậu) Khi đặt trong môi trường mới thì cường độ ánh sáng bằng hoặc cao hơn một ít, sau đó tăng dần ánh sáng lên Một số tác giả

đề nghị thời gian thích nghi này cần khoảng 2 – 3 tuần (Miller, 1983; Pocock, 1983)

- Nhiệt độ: Nhiệt độ không khí là yếu tố quan trọng trong quá trình thuần

dưỡng cây con Nhiệt độ không khí liên quan nhiều đến ánh sáng chiếu vào môi trường (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

- Giá thể: Môi trường để ươm cây con rất quan trọng, trong đó pH đất, độ giữ

ẩm, độ thoáng khí và dinh dưỡng cần được chú ý Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, rễ của các cây cấy mô được tạo ra trong quá trình nuôi cấy chưa có chức năng hoàn toàn, các rễ này cần có thời gian mới hoàn thiện các cấu trúc bên trong Vì vậy, trong giai đoạn đầu cần tránh cho cây con bị mất nước (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

- Bệnh và côn trùng: Do môi trường thuần dưỡng cây cấy mô có ẩm độ cao là

điều kiện tốt cho nấm bệnh phát triển Ngoài ra cây cấy mô cũng là thức ăn

ưa thích của côn trùng, nên phương pháp thường được áp dụng cho các nhà lưới hoặc vườn dưỡng cây là luôn vệ sinh sạch sẽ môi trường ra cây Trong một số trường hợp, cây con trước khi ươm vào giá thể được ngâm trong thuốc diệt nấm bệnh, cũng như giá thể ươm cây cần được phun thêm thuốc trừ sâu (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.3.5 Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào

Hệ thống lớp mỏng tế bào - thin cell layer – TCL bao gồm các mẫu cấy có kích thước nhỏ được cắt ra từ những bộ phận khác nhau của thực vật (thân, lá, rễ, phát hoa, các bộ phận của hoa, lá, mầm, phôi) Nếu mẫu cấy được cắt theo chiều dọc được gọi là lTCL, nếu được cắt theo chiều ngang gọi là tTCL Các lTCL (1mm x 0,5 hay 10mm) chỉ chứa một loại mô như lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp (3 – 6 lớp) của tế bào vỏ, ngược lại các tTCL (dày khoảng 0,2/0,5mm đến vài mm) bao gồm một số tế bào thuộc các mô khác nhau (mô biểu bì, mô vỏ, thượng tầng, mô ruột hay tế bào nhu mô) (Tran Thanh Van và Gendy, 1996) tTCL và lTCL có đặc điểm chung là mỏng Đặc điểm mỏng có vai trò quan trọng vì các phân tử đánh dấu sự biệt

hóa có thể định vị in situ ở những tế bào đích hay những tế bào đáp ứng Quá trình

định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong muốn (Tran Thanh Van và Bui Van Le, 2000)

Khi cắt mẫu, mô thực vật bị tổn thương, nhiều enzyme hoặc các polysacharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Tran Thanh Van và Mutaftschiew, 1990) Lý do cơ bản của việc ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống TCL là chúng có mối quan hệ mật thiết với các tế bào bị thương (nơi xảy ra tổng hợp cấu tạo vách tế bào mới và nơi phóng thích của oligosacharide) và chất sinh dưỡng cùng các yếu tố khác bên trong môi trường để “kiểm soát” sự phát sinh hình thái Tuy nhiên, cũng bởi lý do đó có thể nói chúng khá phụ thuộc vào môi trường Ngược lại các mẫu cấy lớn hơn (như thân hoặc các mảnh lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với môi trường và có thể chứa các hợp chất nội sinh cao hơn, bao gồm các chất sinh trưởng thực vật nên chúng không phụ thuộc vào môi trường

Một hệ thống đa bào như hệ thống TCL được định nghĩa như trên mang những

tổ chức không gian và thời gian cố hữu Khác với khi sử dụng một tế bào tách ra hay

tế bào trần, sau khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào mới với tổ chức không gian và thời gian khác biệt với sự tổ chức trước khi tiến hành quá trình tách ra từ mô hay cơ quan cho Hơn nữa, hầu hết các trường hợp trong quá trình phát triển của tế bào đơn hay tế bào trần có sự hình thành mô sẹo, phôi sinh dưỡng trộn lẫn tế bào không phải là phôi như các tế bào ống và rễ Ngược lại, hệ thống TCL có sự hình thành phần đó với số lượng lớn hơn Không những chúng được tiếp xúc trực tiếp với môi trường mà còn được chương trình hóa một cách riêng biệt hoặc kết hợp tương ứng với không gian và thời gian (Tran Thanh Van, 1980) Việc giảm số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa quan trọng vì ảnh hưởng đến quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hóa mô, cơ quan Bên cạnh đó, khoảng thời gian để quá trình phát sinh hình thái xuất hiện tương đối ngắn (trung bình khoảng 14 ngày sau khi cấy) Tần suất cũng khá cao, gần 100%

mẫu có phản ứng Như trên mẫu của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) có kích cỡ 1 x

10 mm bao gồm 3 – 6 lớp tế bào biểu bì và được thu nhận từ cánh hoa, các cơ quan sau đây được biệt hóa trực tiếp trên bề mặt TCL (mà không trải qua quá trình mô sẹo trung gian)

Các tính chất mong muốn khác có được trong phương pháp nuôi cấy lớp mỏng

tế bào là sự đồng nhất về sinh lý, di truyền, và có thể ứng dụng phương pháp này cho mọi thực vật Tuy nhiên, điều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của

mẫu TCL còn phụ thuộc vào loài và phải thử nghiệm lại tất cả các điều kiện in vitro

bao gồm chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng, ánh sáng, nhiệt độ (Tran Thanh Van, 1980)

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.4.1 Trong nước

Khoai Môn là loại cây có củ được trồng ở hầu hết các vùng sinh thái và là nguồn đặc sản quý ở một số vùng miền Bắc như Khoai Môn Lệ Phố, Khoai sọ Thuận Châu, Khoai Mán Vàng Tuy nhiên các giống địa phương cho năng suất không cao,

dễ bị sâu bệnh hại, hệ số nhân giống thấp, khó để giống,… Từ đó, nhóm nghiên cứu Nguyễn Quang Thạch và ctv (2010) đã tiến hành nghiên cứu nhân giống Khoai Môn

bằng phương pháp in vitro từ năm 2006 – 2010 Đề tài thực hiện trên 5 giống Khoai

là Khoai Môn Tím (MT), Khoai sọ Vàng (SoV), Khoai sọ Hòa Bình (HB), Khoai sọ Lạng Giang (LG3) và Khoai sọ Sapa Kết quả nghiên cứu đã tìm được môi trường nhân nhanh có triển vọng đối với Khoai Môn là môi trường MS + 1,5mg/l TDZ, và môi trường ra rễ hiệu quả là môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng

Hay như nghiên cứu của Trần Thị Lệ và Trần Thị Triệu Hà (2011) có kết quả tái sinh chồi tốt nhất cho Khoai sọ Tây Nguyên và Hà Tĩnh là trên môi trường MS có 3mg/lBAP; môi trường phù hợp nhất cho sự nhân nhanh chồi là MS có 3mg/l BAP

và 0,5mg/l NAA; và môi trường thích hợp nhất cho việc ra rễ là MS có 0,5mg/l NAA Tương tự, kết quả nghiên cứu của Đặng Thị Thanh Mai và Nguyễn Xuân Viết

(2012) đã nhân giống nuôi cấy in vitro đỉnh chồi và chồi mắt củ 4 giống Khoai sọ

quý địa phương là Khoai sọ Cụ Cang (Sơn La), Khoai Môn Thơm (Lạng Sơn), Khoai

sọ lùi (Nam Định), Khoai chợ Đồn (Bắc Kạn) Tỷ lệ nhân chồi đạt hệ số cao đến 4,5 lần sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung từ 2 – 3 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA

Đến năm 2013, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Tuyết và ctv (2013) cho

tỷ lệ tái sinh chồi tốt nhất đối với đỉnh sinh trưởng (kích thước từ 3 – 5mm) của giống Khoai sọ KS4 là môi trường MS + 0,5 ppm TDZ + 0,01 ppm IAA + 20g/l đường sucrose + 6g/l agar, đạt 35%; môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh chồi Khoai sọ KS4 là MS + 3ppm BA + 0,5 ppm IAA + 30g/l đường sucrose + 6g/l agar, đạt 3 chồi trên mẫu

Bên cạnh nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thì cũng có nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng lên sự phát triển của mẫu cấy Như nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Dung (2012) nhân giống 2 giống Khoai Môn bản địa là TH1 và TH3 (có nguồn gốc từ Thanh Hóa), đã sử dụng chồi đỉnh cây

Khoai Môn in vitro có kích thước 0,5cm Tác giả đã khảo sát thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chồi Khoai Môn in vitro Kết quả cho thấy, môi trường MS cho chồi Khoai Môn in vitro sinh trưởng và phát

triển tốt hơn so với môi trường White và B5 (nghèo dinh dưỡng) Tương tự, môi

trường MS cho chồi Khoai Môn in vitro phát triển bình thường và tốt hơn so với môi

trường ½ MS, 1/3 MS, ¼ MS

Trong khi đó, theo một số các nghiên cứu nhằm giúp tăng hệ số nhân chồi cho mẫu cấy thì cũng có kết quả đáng lưu ý Như theo nghiên cứu của Bùi Văn Lệ (2005) sử dụng kỹ thuật cắt lát mỏng tế bào trên một số loài cây ăn quả như cây măng cụt, cam, chanh, nhãn, điều Tác giả đã khảo sát cho thấy với lát cắt dọc trên

chồi non cây cam (Poncirus trifoliate) một năm tuổi cho số chồi cao nhất là 33

chồi/lát mỏng với các nồng độ BAP (3mg/l), NAA (0,5 mg/l) và hiệu suất là 90%; ở

trên cây măng cụt (Garcinia mangostana), lát cắt dọc từ hạt và lóng thân cây con cho

thấy sự tạo chồi thích hợp ở 1 – 2 mg/l BAP với 8,4 chồi/lát mỏng cho hạt và 17,3 chồi/lát mỏng cho lóng thân Các tỷ lệ tạo chồi tương ứng là 91,6% hạt và 60% cho lóng thân

Tiếp theo nghiên cứu của Vũ Thị Lan, Cao Diễm My, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà và Lê Trần Bình (2013) nghiên cứu cho thấy rằng tái sinh chồi giống Khoai lang KB1 ở đoạn thân Khoai lang chẻ đôi cho số chồi trung bình/mẫu là 2,11 cao hơn khi tái sinh ở đoạn thân Khoai lang không chẻ đôi là 1,53 cùng trên môi trường MS + 1mg/l BAP + 0,5mg/l kinetin

Ngoài ra, các kết quả tối ưu khác khi dùng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế

bào cũng được tìm thấy trên cây nhãn (Euphoria longan) (nồng độ 2,4D là 2mg/l),

cây sung (Ficus carica) (nồng độ BAP 2mg/l) và cây điều (Anacardium occidentale)

(nồng độ BAP 5mg/l với 17,3 chồi/lát mỏng cắt dọc)

2.4.2 Ngoài nước

Yongwei Li, Cheng Xu và Jishuang Chen (2002) nhân mẫu đỉnh sinh trưởng

Khoai Môn (Colocasia esculenta) cho khả năng tái sinh chồi tốt trên môi trường MS

+ 2 mg/l BAP, đạt 28%

Năm 2007, El-Shabasi và M.S.S đã nghiên cứu qui trình vi nhân giống Khoai Môn từ việc tái sinh chồi từ mô sẹo (callus) Tỷ lệ mẫu mô sẹo phát sinh chồi đạt phần trăm cao nhất là môi trường MS với 0,4mg/l 2iP+ 0,45 mg/l dicamba Cũng trong giai đoạn này, phần trăm cây con hình thành từ callus cao nhất là 70% trên môi trường MS + 0,6 mg/l TDZ (thidiazuron); môi trường MS + 1,05 TDZ cho số lượng chồi cao nhất Trong khi ở giai đoạn 3, môi trường MS với 3mg/l kinetin + 0,3 mg/l NAA + 20mg/l adenine hemisulfate cho tỷ lệ phần trăm cụm chồi Khoai Môn cao nhất Môi trường thuần dưỡng cây Khoai Môn con tốt nhất là than bùn với vermiculite (1:1 w/w)

Trong khi nghiên cứu của Keolanui và Sanxtex (1993) khuyến cáo không nên

sử dụng nước dừa quá 10% khi nhân chồi Khoai Môn

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

- Các thí nghiệm nuôi cấy mô được thực hiện tại Phòng thí nghiệm nuôi cấy

mô thuộc khu Thí nghiệm trường Đại học An Giang

Thời gian thực hiện: từ tháng 4/2016 đến tháng 10/2016

- Thí nghiệm chuyển cây ra thuần dưỡng được thực hiện tại vườn ươm Phường

Mỹ Phước, Long Xuyên, An Giang

Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2016 đến tháng 11/2016

3.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.2.1 Mẫu nghiên cứu

Củ giống Khoai Môn sau khi được thu thập tại huyện Chợ Mới, An Giang sẽ được rửa sạch và đưa vô phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tại khu Thực nghiệm Trường Đại học An Giang để ươm gieo tạo mầm (Hình 2) Sau đó, các mầm được

mọc lên từ củ giống sẽ được khử trùng và tạo mẫu cấy vô trùng in vitro để dùng làm

nguồn vật liệu cho thí nghiệm nghiên cứu của đề tài

Hình 2: Mẫu Khoai Môn thí nghiệm

A: Củ Khoai Môn nẩy mầm; B: Chồi Khoai Môn in vitro

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

3.2.2.1 Dụng cụ

+ Ống đong, ống hút, đũa thủy tinh, kẹp dài (25-30) cm, kéo cắt mẫu cấy + Dao cắt mẫu cấy (loại số 11)

+ Bình nuôi cấy-chai lọ thủy tinh chịu nhiệt hàng Việt Nam

+ Đèn cồn, bình tia, bình xịt đựng cồn, giấy thanh trùng

+ Cốc thủy tinh chia vạch: 50 ml, 100 ml, 200 ml, 1000 ml

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA tối

ưu để tạo chồi Khoai Môn

 Mục đích: tìm ra môi trường có chứa nồng độ và thành phần chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA thích hợp nhất cho sự tái sinh chồi Khoai Môn in

vitro từ mẫu cấy vô trùng

 Vật liệu: các củ Khoai Môn được thu thập từ huyện Chợ Mới, An Giang Sau

đó đem về rửa sạch và ươm bằng tro trấu, giữ ẩm Sau khi ươm khoảng 2 tuần

sẽ nẩy mầm (Hình 2A) Cắt lấy các mầm Khoai Môn và khử trùng, sau đó cấy vào môi trường nuôi cấy MS (Murashige và Skoog, 1962), giữ mẫu ổn định trong phòng nuôi cấy mô khoảng một tháng (chờ ổn định mẫu) Các chồi

Khoai Môn in vitro này sẽ được sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm nhân

mỗi lần lặp lại là 1 bình, cấy 2 chồi trên bình

 Môi trường nuôi cấy và ký hiệu nghiệm thức:

 Chỉ tiêu theo dõi:

 Theo dõi và ghi nhận ngày xuất hiện chồi mới

 Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%): (số mẫu tạo chồi/tổng số mẫu cấy) x 100

 Số chồi (chồi): tổng số chồi mới trên mẫu cấy

 Chiều cao chồi (cm): đo chồi cao nhất (từ mặt môi trường đến đỉnh chồi)

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 2, 4, 6 tuần sau khi cấy

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng auxin và cytokinin thích hợp nhân chồi Khoai Môn

 Mục đích: tìm nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA, TDZ với NAA thích hợp để tạo số lượng lớn cụm chồi Khoai Môn

 Vật liệu: mẫu chồi Khoai Môn in vitro từ thí nghiệm 1 Chọn các chồi khỏe

mạnh Tách chồi ra khỏi cụm chồi thành từng chồi riêng lẻ có độ lớn và chiều cao đồng nhất để làm vật liệu cho thí nghiệm 2

 Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí trong phòng nuôi cấy mô theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 5 lần lặp lại,

mỗi lần lặp lại 1 bình Cấy 2 chồi/bình

 Môi trường nuôi cấy và ký hiệu nghiệm thức:

 Chỉ tiêu theo dõi:

 Theo dõi và ghi nhận ngày xuất hiện chồi mới

 Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%): (số mẫu tạo chồi/tổng số mẫu cấy) x 100

 Số chồi/mẫu cấy: tổng số chồi mới trên mẫu cấy

 Chiều cao chồi (cm): đo chồi cao nhất (từ mặt môi trường đến đỉnh chồi)

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 2, 4, 6, 8 tuần sau khi cấy

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát kiểu cấy giúp tăng hệ số nhân chồi Khoai Môn

 Mục đích: thử nghiệm kiểu cấy khác nhau để giúp cho việc tạo được số lượng

lớn cụm chồi Khoai Môn trong thời gian nhanh

 Vật liệu: mẫu chồi Khoai Môn in vitro thu từ thí nghiệm 1 Chọn các chồi to

mẫu/bình

 Nghiệm thức thí nghiệm: Được trình bày như Bảng 2

Bảng 2: Môi trường nuôi cấy và kí hiệu nghiệm thức

(K3)

 Chỉ tiêu theo dõi:

 Theo dõi và ghi nhận ngày xuất hiện chồi mới đầu tiên

 Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%): (số mẫu tạo chồi/tổng số mẫu cấy) x 100

 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%): (số mẫu tạo mô sẹo/tổng số mẫu cấy) x 100

 Tỷ lệ mẫu chết (%): (số mẫu chết/tổng số mẫu cấy) x 100

 Số chồi/mẫu cấy: đếm số chồi mới trên mỗi mẫu cấy

 Chiều cao chồi (cm): đo chồi cao nhất (từ mặt môi trường đến đỉnh chồi)

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 2, 4, 6, 8, 10 tuần sau khi cấy

3.3.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường ra rễ tạo cây Khoai Môn hoàn chỉnh

 Mục đích: khảo sát thành phần khoáng đa lượng và nồng độ NAA giúp cho

việc tạo cây Khoai Môn hoàn chỉnh

 Vật liệu: mẫu chồi Khoai Môn in vitro từ thí nghiệm 2, được cắt tỉa bỏ lá,

chừa đoạn thân khoảng 2 cm có chứa đỉnh sinh trưởng

 Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí trong phòng nuôi cấy mô theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 bình Mỗi bình cấy 2 chồi Khoai Môn được tách từ các

chồi thu được từ thí nghiệm 2

 Chỉ tiêu theo dõi:

 Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt môi trường đến đỉnh chồi

 Số rễ/mẫu cấy: đếm số rễ trên mỗi mẫu cấy

 Chiều dài rễ (cm): đo trung bình 3 rễ dài nhất

 Số lá/chồi (lá): đếm số lá trên mẫu cấy

 Đặc điểm hình thái rễ

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 2, 4, 6 tuần sau khi cấy

3.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát thành phần giá thể thích hợp cho việc thuần dưỡng cây Khoai Môn

 Mục đích: tìm thành phần giá thể trồng thích hợp giúp tăng tỷ lệ sống cao cho

cây Khoai Môn giai đoạn vườn ươm

 Vật liệu: cây Khoai Môn in vitro hoàn chỉnh từ thí nghiệm 4 (Hình 4)

 Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí trong nhà lưới theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 6 lần lặp lại, mỗi lần lặp

lại là 1 chậu, 6 cây/chậu

 E5: Tro trấu + Cát + Xơ dừa (1:1:1)

 E6: Tro trấu + Cát + Xơ dừa (2:1:1)

 Chỉ tiêu theo dõi:

 Tỷ lệ cây sống (%) = (Tổng số cây sống/ tổng số cây) x 100

 Chiều cao chồi (cm): đo chồi cao nhất (từ mặt giá thể đến đỉnh chồi)

 Số lá/chồi (lá): đếm số lá trên chồi

 Thời gian lấy chỉ tiêu: 1 và 2 tuần sau khi trồng

3.4 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU

Phân tích số liệu thu thập đƣợc bằng phần mềm Microsoft Excel 2010

Kết quả các thí nghiệm đƣợc phân tích thống kê bằng phần mềm SAS 9.1.3

Hình 4: Cây Khoai Môn nuôi cấy mô dùng cho thí nghiệm

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG BA VÀ NAA TỐI ƯU ĐỂ TẠO CHỒI KHOAI MÔN

4.1.1 Tỷ lệ phần trăm mẫu tái sinh chồi

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi trường nuôi cấy rất quan trọng bởi nó quyết định đến sự thành công hay thất bại của thí nghiệm Chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinine có vai trò rất lớn trong việc hình thành chồi Ngoài ra, theo Debergh (2006), tỉ lệ cytokinin cao và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi Do

đó, thí nghiệm được tiến hành nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung BA với nồng

độ khác nhau và kết hợp bổ sung NAA

Sau 6 tuần nuôi cấy tái sinh chồi, ta có kết quả trình bày ở Bảng 3 như sau:

Bảng 3: Tỷ lệ phần trăm (%) mẫu Khoai Môn tạo chồi sau 6 tuần nuôi cấy

NT Chất điều hòa sinh trưởng Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)

BA (mg/l) NAA (mg/l) 2 tuần 4 tuần 6 tuần

Li và ctv (2002) đạt 28% mẫu đỉnh sinh trưởng có khả năng tái sinh chồi trên môi trường MS + 2 mg/l BA Với nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và ctv (2010) trên môi trường tái sinh chồi Khoai Môn sọ là cao nhất chỉ đạt 73,45% sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 3 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA)

4.1.2 Số chồi mới tạo thành

Qua 2 tuần đầu ta thấy các mẫu cấy chỉ bắt đầu xuất hiện chồi ở vài mẫu cấy Sang đến tuần thứ 4 mới có tạo chồi ở hầu hết các mẫu cấy Tuy nhiên, số chồi được

tái sinh mới trên các mẫu cấy vẫn chưa cao và ít có sự khác biệt Kết quả sau khi nuôi cấy được trình bày ở Bảng 4

Bảng 4: Số chồi Khoai Môn (chồi) sau khi cấy

NT Chất điều hòa sinh trưởng Số chồi Khoai Môn (chồi)

BA (mg/l) NAA (mg/l) 4 tuần 6 tuần

Ghi chú: ns: khác biệt không ý nghĩa thống kê

Kết quả cho thấy, sau khi cấy 4 tuần ở tất cả nghiệm thức đều đã xuất hiện chồi với số chồi dao động từ 1,4 - 3,4 chồi, trung bình đạt 2,12 chồi Số chồi đạt cao nhất

ở nghiệm thức A1 (3,4 chồi) và thấp nhất là nghiệm thức không có sử dụng chất điều hòa sinh trưởng là A0 (1,4 chồi), giữa các nghiệm thức không có sự khác biệt ý nghĩa

về mặt thống kê Cùng thời gian sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm tái sinh chồi

đã đạt được số chồi là 3,4 chồi trên môi trường MS + 2 mg/l BA, cao hơn so với nghiên cứu của Trần Thị Lệ và Trần Thị Triệu Hà (2011) chỉ đạt 2,63 chồi trên môi trường cho kết quả cao nhất là MS + 3 mg/l BA

Đến thời điểm 6 tuần sau khi cấy (SKC), số chồi tiếp tục tăng và dao động từ 2,2 - 5,2 chồi Trong đó, nghiệm thức A1 đạt số chồi cao nhất là 5,2, thấp nhất là nghiệm thức đối chứng A0 đạt 2,2 chồi, và giữa các nghiệm thức vẫn không có sự khác biệt thống kê Kết quả này cũng đáng ghi nhận so với nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và ctv (2010) trên môi trường tái sinh chồi Khoai Môn sọ là cao nhất chỉ đạt 3,9 chồi sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 3 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA

Như vậy, sau thời gian 6 tuần theo dõi sự phát triển chồi của mẫu cấy ở các nghiệm thức thí nghiệm ta nhận thấy tất cả đều tạo chồi mới, số chồi đạt được từ 2,2 đến 5,2 chồi, trung bình đạt được là 3,4 chồi (Hình 5) Các chồi thu được từ thí nghiệm này sẽ được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo