Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát sinh chồi rễ và loại giá thể phù hợp cho sự sinh trưởng của cây gừng đen kaempferia parviflora ở vườn ươm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN SỰ PHÁT SINH CHỒI, RỄ VÀ LOẠI GIÁ THỂ PHÙ HỢP CHO SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÂY

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN SỰ PHÁT SINH CHỒI, RỄ VÀ LOẠI GIÁ THỂ PHÙ HỢP CHO SỰ SINH TRƯỞNG

CỦA CÂY GỪNG ĐEN

(Kaempferia parviflora)

Ở VƯỜN ƯƠM

NGUYỄN THỊ THÚY DIỄM

AN GIANG, THÁNG 03 NĂM 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN SỰ PHÁT SINH CHỒI, RỄ VÀ LOẠI GIÁ THỂ PHÙ HỢP CHO SỰ SINH TRƯỞNG

CỦA CÂY GỪNG ĐEN

(Kaempferia parviflora)

Ở VƯỜN ƯƠM

NGUYỄN THỊ THÚY DIỄM

AN GIANG, THÁNG 03 NĂM 2017

Đề tài nghiên cứu khoa học “Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát sinh chồi, rễ và loại giá thể phù hợp cho sự sinh trưởng của cây gừng đen

(Kaempferia parviflora ) ở vườn ươm”, do tác giả Nguyễn Thị Thúy Diễm, công tác

tại Khoa Nông nghiệp và Tài nguyên Thiên nhiên thực hiện Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo Trường Đại học An Giang

thông qua ngày

Thư ký

Phản biện 1

Phản biện 2

Chủ tịch Hội đồng

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn!

Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp & TNTN, Bộ môn Khoa học Cây trồng Trường Đại học An Giang đã tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thực hiện đề tài Lương y Nguyễn Thiện Chung (Hội Đông y huyện Tịnh Biên) đã cung cấp thông tin về nguồn giống gừng đen giúp chúng tôi thực hiện và hoàn thành đề tài

Th.s Huỳnh Trường Huê, Th.s Võ Thị Xuân Tuyền cùng các bạn đồng nghiệp đã động viên và giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Các em sinh viên Nguyễn Linh Tuấn (DH13TT), Lê Hoàng Nam và Trương Nhật Minh (DH14BT), Vỏ Vạn Kiếp (DH15TT) đã giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Long Xuyên, ngày 27 tháng 03 năm 2017

Người thực hiện

Nguyễn Thị Thúy Diễm

TÓM TẮT

Cây gừng đen (Kaempferia parviflora) thuộc họ gừng (Zingiberaceae), được chứng

minh là cây có giá trị dược liệu cao, thường được sử dụng để điều trị các bệnh về tim mạch, dị ứng, loét dạ dày, Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích thiết lập

quy trình vi nhân giống cây gừng đen (Kaempferia parviflora) Các thí nghiệm bao gồm: (1) Khảo sát quá trình nhân chồi; (2) Khảo sát quá trình tạo rễ in vitro; (3) Khảo sát quá trình thuần dưỡng cây gừng đen in vitro trong điều kiện nhà lưới Những chồi non thu từ

các củ gừng đen được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung agar (8g/L), đường sucrose (30 g/L), nước dừa tươi (100 mL/L) Sau 2 tuần các chồi được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như BA, TDZ, BA và NAA ở các nồng độ khác nhau để khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình nhân nhanh chồi và tạo rễ cây gừng đen in vitro Kết quả cho thấy rằng, chồi cây gừng đen nhân nhanh trong môi trường MS

có bổ sung 1,5 mg/L BA kết hợp 0,5 mg/L TDZ đạt 4,2 chồi/mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy Môi trường để tạo rễ là môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L hoặc 1,5 mg/L NAA Môi trường ra rễ thích hợp nhất là môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L NAA hoặc 1,5 mg/L NAA, cho tỷ lệ chồi ra rễ 100% đạt lần lượt là 20,57 rễ/chồi với 2,71 lá/chồi và 19,71 rễ/chồi với 2,86 lá/chồi sau 6 tuần nuôi cấy Thuần dưỡng cây gừng đen nuôi cấy

mô với giá thể đất kết hợp mụn dừa (1:1) đạt kết quả tốt nhất

ABSTRACT

Black Ginger (Kaempferia parviflora) is a species of the family Zingiberaceae, one of

the high-valued medicinal plants, is mainly used for the treatment of cardiovascular and cerebrovascular disease, allergy, against gastric ulcers, The study was carried out to

establish a micropropagation process of black ginger (Kaempferia parviflora) for

production Experiments comprised three stages: shoot proliferation, rooting and acclimatization of plantlets The young shoots explant from parent ginger plant in green house were aseptically cultured on solidified MS (Murashige & Skoog, 1962) supplemented sucrose (30 g/L), agar (8 g/L) and coconut water (100 ml/L) After 2 weeks, shoots were cultured on solidified MS medium supplemented with various concentrations of BA, TDZ, NAA for investigating the effect of plant growth regulators

concentration to shoot proliferation and rooting of Black ginger in vitro Results of

experiments showed that shoots were multiplied on MS medium supplemented with 1,5 mg/L BA and 0,5 mg/L NAA (4,2 shoots/explant at 8 week after cultured) The optimal

medium for in vitro rooting was MS medium containing 1,0 mg/L NAA or 1,5 mg/L

NAA , on which 100% of shoots induced roots with a mean of 19,71 – 20,57 roots/ explants, 2,71 – 2,86 leaf/explants within 6 weeks of culture Rooted plantlets were acclimatized successfully after one months transferred to green-house and grown in a 1:1 (v:v) soil to coir mixture

Keywords: Plant growth regulators, Kaempferia, Kaempferia parviflora, shoot proliferation

Title: Effect of plant growth regulators on shoot regeneration, rooting and acclimatization of in vitro dervived plants of Black Ginger (Kaempferia parviflora)

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu trong công trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng Những kết luận mới về khoa học của công trình nghiên cứu này chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Long Xuyên, ngày 27 tháng 03 năm 2017

Người thực hiện

Nguyễn Thị Thúy Diễm

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM TẠ……….i

TÓM TẮT……… ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM KẾT……… iv

MỤC LỤC……… v

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii

Chương 1: GIỚI THIỆU………1

1.1 Tính cần thiết của đề tài……… ……… 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu……… ……… ……2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Nội dung nghiên cứu 2

1.5 Những đóng góp của đề tài……… ….………2

Chương 2: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU……….3

2.1 Giới thiệu về cây gừng đen……… ……….3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại……….…………3

2.1.2 Đặc điểm hình thái của cây gừng đen……… ….……….3

2.1.3 Công dụng và một số kết quả nghiên cứu về các hoạt chất sinh học có tác dụng chữa bệnh trong củ gừng đen 5

2.2 Các phương pháp nhân giống cây gừng đen 7

2.2.1 Phương pháp tách chiết thông thường 7

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 8

2.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.3.1 Khái niệm và cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.3.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 10

2.4.1 Chất khử trùng mẫu cấy 10

2.4.2 Môi trường nuôi cấy 11

2.4.3 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 13

2.5 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ gừng trên thế giới và việt nam 14

2.5.1 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ gừng trên thế giới 14

2.5.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ gừng trên ở Việt Nam 16

2.6 Giả thuyết nghiên cứu 17

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….……….18

3.1 Mẫu nghiên cứu……….……….18

3.2 Thiết kế nghiên cứu……… …….18

3.2.1 Môi trường và điều kiện nuôi cấy……….…18

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu……… …………19

3.2.2.1 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu 19

3.2.2.2 Bố trí thí nghiệm 20

3.3 Công cụ nghiên cứu 24

3.5 Phân tích dữ liệu 24

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… ……… 25

4.1 Hiệu quả của BA, TDZ và NAA lên quá trình nhân chồi cây gừng đen in vitro 25

4.1.1 Thời gian xuất hiện chồi 25

4.1.2 Hiệu quả của BA +TDZ, BA + NAA và TDZ + NAA lên sự gia tăng số chồi của câyhồi gừng đen 27

4.1.3 Hiệu quả của BA +TDZ, BA + NAA và TDZ + NAA lên sự gia tăng số lá của câyhồi gừng đen 37

4.1.4 Hiệu quả của BA +TDZ, BA + NAA và TDZ + NAA lên sự hình thành

rễ của cây chồi gừng đen 42

4 2 Hiệu quả của NAA đến sự hình thành rễ của cây gừng đen in vitro 49

4.2.1 Tỷ lệ tạo rễ và thời gian xuất hiện rễ 49

4.2.2 Hiệu quả của NAA lên sự hình thành rễ của cây gừng đen 50

4.2.3 Hiệu quả của NAA lên sự hình thành lá của cây gừng đen 52

4.3 Ảnh hưởng của các loại giá thể lên sự sinh trưởng của cây gừng đen in vitro ở giai đoạn vườn ươm 55

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Khuyến nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC………66

5 Thời gian bắt đầu xuất hiện chồi gừng đen in vitro trên các

môi trường nuôi cấy

26

6 Hiệu quả của các tổ hợp BA +TDZ, BA + NAA và TDZ +

NAA lên sự gia tăng số chồi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 tuần sau khi cấy

28

7 Hiệu quả của các tổ hợp BA +TDZ, BA + NAA và TDZ +

NAA lên sự gia tăng số lá ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 tuần sau khi cấy

39

8 Hiệu quả của các tổ hợp BA +TDZ, BA + NAA và TDZ +

NAA lên sự gia tăng số rễ ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 tuần sau khi cấy

43

9 Hiệu quả của NAA đến khả năng ra rễ của chồi gừng đen ở

thời điểm 11 ngày sau khi cấy

49

10 Hiệu quả của NAA lên sự gia tăng số rễ rễ của chồi gừng đen

ở thời điểm 2, 3, 4, 5 và 6 tuần sau khi cấy

50

11 Ảnh hưởng của NAA lên sự gia tăng số lá rễ của chồi gừng

đen ở thời điểm 2, 3, 4, 5 và 6 tuần sau khi cấy

52

12 Hiệu quả của các loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và

phát triển của cây gừng đen in vitro ngoài vườn ươm sau khi

trồng 4 tuần

56

DANH SÁCH HÌNH

1 Lá (a), hoa (b) và củ (c) của cây gừng đen (Kaempferia parviflora) 4

2 Chồi non của cây gừng đen K Parviflora được ươm từ củ 19

3 Sự hình thành chồi trên môi trường MS bổ sung 2,5 mg/L BA kết

hợp 0,5 mg/L TDZ (a) ở thời điểm 5 ngày sau khi cấy và trên môi trường MS bổ sung 2,5 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA (b)

ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy

5 Chồi gừng đen phát triển sau 8 tuần nuôi cấy trên các môi trường:

(a) MS có bổ sung 2,5 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA (A11);

(b) MS có bổ sung 1,0 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA (A8)

34

8 Chồi gừng đen phát triển sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường: (a)

MS có bổ sung 1,5 mg/L BA kết hợp 0,5 mg/L TDZ (A3) và (b) môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (A0)

35

9 Chồi gừng đen phát triển sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường: (a)

MS có bổ sung 1,5 mg/L BA kết hợp 0,5 mg/L TDZ (A3) và (b) môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (A0)

35

10 Chồi gừng đen phát triển sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường: (a)

MS có bổ sung 3,0 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA (A12) và (b)

MS có bổ sung 1,5 mg/L TDZ kết hợp 1,0 mg/L NAA (A15)

36

11 Sự phát triển lá của chồi gừng đen sau 8 tuần nuôi cấy trên môi

trường: (a) MS có bổ sung 1,0 mg/L BA kết hợp 0,5 mg/L TDZ (A2) và (b) MS có bổ bung 3,0 mg/L BA kết hợp với 0,5 mg/L TDZ (A6)

40

12 Sự phát triển lá của chồi gừng đen sau 8 tuần nuôi cấy trên môi 41

(a)

Hình Tên hình Trang

trường: (a) MS có bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L NAA

(A7) và (b) MS có bổ bung 3,0 mg/L BA kết hợp với 1,0 mg/L

NAA (A12)

13 Sự phát triển lá của chồi gừng đen trên môi trường (a) MS có bổ

sung 3,0 mg/L TDZ kết hợp 1,0 mg/L NAA (A18) và (b) MS có

bổ bung 2,0 mg/L TDZ kết hợp với 1,0 mg/L NAA (A16)

15 Số rễ được tạo thành ở 8 tuần nuôi cấy trên môi trường (a) MS

không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (A0) và (b) MS có bổ

bung 1,5 mg/L BA kết hợp với 0,5 mg/L TDZ (A3)

46

16 Số rễ được tạo thành ở 8 tuần nuôi cấy trên môi trường (a) MS 0,5

mg/L BA kết hợp với 0,5 mg/L TDZ (A1) và (b) MS có bổ bung

1,0 mg/L BA kết hợp với 0,5 mg/L TDZ (A2)

46

17 Số rễ được tạo thành ở 8 tuần nuôi cấy trên môi trường (a) MS bổ

sung 1,0 mg/L BA kết hợp với 1,0 mg/L NAA (A8) và (b) MS có

bổ bung 1,5 mg/L BA kết hợp với 1,0 mg/L NAA (A9)

47

18 Số rễ được tạo thành ở 8 tuần nuôi cấy trên môi trường (a) MS bổ

sung 0,5 mg/L TDZ kết hợp với 1,0 mg/L NAA (A13) và (b) MS

có bổ bung 2,5 mg/L TDZ kết hợp với 1,0 mg/L NAA (A17)

47

19 Sự hình thành rễ của chồi gừng đen ở 6 tuần sau khi cấy trên môi

trường: (a) MS bổ sung 1,0 mg/L NAA; (b) MS bổ sung 1,5

mg/L NAA

51

20 Sự hình thành rễ của chồi gừng đen ở 6 tuần sau khi cấy trên môi

trường: (a) MS bổ sung 2,5 mg/L NAA; (b) MS không bổ sung

NAA

52

21 Sự phát triển lá của chồi gừng đen ở thời điểm 2 tuần sau khi cấy

trên môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/L NAA (a); môi trường

không có bổ sung NAA (b)

53

22 Sự phát triển lá của chồi gừng đen ở thời điểm 4 tuần sau khi cấy

trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L NAA (a); MS có bổ

sung 1,5 mg/L NAA (b)

54

Hình Tên hình Trang

23 Sự phát triển lá của chồi gừng đen trên môi trường MS có bổ sung

1,0 và 1,5 mg/L NAA ở thời điểm 6 tuần sau khi cấy

54

24 Cây gừng đen ở thời điểm 4 tuần sau khi trồng trên các loại giá thể:

(a) mụn dừa: đất (1:1), (b) mụn dừa: tro trấu (1:1), (c) đất: tro

trấu (1:1), (d) đất: tro trấu: mụn dừa (1:1: 1)

58

25 Sơ đồ nhân giống in vitro cây gừng đen (Kaempferia parviflora) 59

2,4 – D : 2,4 - Diclorophenoxy acetic acid

IBA : 3- indol butyric acid

IAA : 3- indol acetic acid

GA3 : Gibberellic acid

QĐ-UBND: Quyết định - Uỷ ban nhân dân

MS : Murashige & skoog (1962)

NAA : Naphthalene acetic acid

NT : nghiệm thức

TDZ : Thidiazuron

TSKC : Tuần sau khi cấy

TLS : Tỷ lệ sống

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Gừng đen (Kaempferia parviflora) còn được gọi là ngải đen, sâm thái, địa liền

đen thuộc họ gừng (Zingiberaceae) có khả năng sinh trưởng và phát triển tại vùng núi Cấm và núi Tượng Đây là một trong những loài cây thuốc quý, có trong kế hoạch “Triển khai thực hiện quy hoạch bảo tồn và phát triển cây dược liệu ứng dụng công nghệ cao tỉnh An Giang năm 2015 – 2016” căn cứ theo Quyết định số 1434/QĐ-UBND ngày 22/07/2015 (Uỷ ban nhân dân tỉnh An Giang, 2015)

Gừng đen đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian có tác dụng như: kích thích tiêu hóa, cải thiện lưu lượng máu, và tăng cường sức khỏe Các chiết xuất hoạt chất sinh học trong củ gừng đen có tác dụng kháng khuẩn rất mạnh giúp điều trị bệnh dị ứng (Tewtrakul và cs., 2007), chống loét dạ dày (Rujjanawate

và cs., 2005), chống viêm (Panthong và cs., 1989), kháng ký sinh trùng sốt rét

và kháng nấm (Yenjai và cs., 2004), kháng virus HIV-1, virus viêm gan C và Virus Cytomegalo (Sookkongwaree và cs., 2006), chống ung thư (Pattanasettanon và cs., 2007) Ngoài ra, củ gừng đen còn được xem như là nhân sâm Thái, có khả năng tăng cường sinh lực (Trisomboon, 2009) Hơn nữa, nó có thể tăng mật độ tinh trùng và tăng cường sức đề kháng của cơ thể đối với stress, làm giảm triglycerides, ngăn ngừa bệnh tiểu đường ( AVA Plant Co., Ltd, 2012) Như vây, với những giá trị trên, gừng đen đã trở thành một loại thuốc có nhiều tiềm năng chức năng điều trị bệnh Với nhu cầu về loại cây này rất cao trong sản xuất dược phẩm nên hiện nay đã được tỉnh An Giang triển khai phát triển và dự kiến trồng thương mại Do đây là đối tượng mới nên vấn đề về nguồn giống trong việc trồng cây gừng đen được đặt lên hàng đầu Trên thế giới, cây gừng đen vẫn chưa được trồng với qui mô lớn và chưa có nhiều nghiên cứu về nuôi cấy mô Dheeranupattana và cs., (2003) đã nghiên

cứu về sự cảm ứng tạo chồi Kaempferia parviflora in vitro, kết quả số chồi thu

được tương đối thấp, đạt 2,4 chồi/mẫu cấy Alveno (2012), cũng tiến hành nhân

giống in vitro cây Kaempferia parviflora, nhưng kết quả vẫn còn hạn chế Ở Việt Nam, chưa có công trình công bố kết quả nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây

gừng đen Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm bước đầu xây dựng quy

trình nhân giống in vitro cây gừng đen và tạo ra số lượng cây giống lớn, sạch

bệnh, đồng đều phục vụ cho sản xuất

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

- Xác định nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng BA, TDZ và NAA bổ sung vào môi trường MS phù hợp cho quá trình nhân nhanh và tạo rễ của cây gừng đen trong ống nghiệm

- Xác định được loại giá thể phù hợp cho sự sinh trưởng của cây gừng đen ở giai đoạn vườn ươm

1.3 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu được thực hiện trên đối tượng là giống gừng đen

(Kaempferia parviflora), được thu thập tại Hội đông Y huyện Tịnh Biên, An Giang, với phạm vi là nhân nhanh cây gừng đen trong điều kiện in vitro và

thuần dưỡng cây con trong vườn ươm Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Nông nghiệp & TNTN, Trường Đại học An Giang, trong thời gian 12 tháng từ tháng 11 năm 2015 đến tháng 11 năm 2016

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, TDZ và NAA đến khả năng nhân chồi của

cây gừng đen in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của cây gừng đen in

thích hợp trong thuần dưỡng cây gừng đen in vitro

Kết quả của đề tài có thể được ứng dụng vào các nghiên cứu tiếp theo trên đối tượng gừng đen để hoàn chỉnh quy trình vi nhân giống nhằm cung cấp nguồn giống có chất lượng tốt phục vụ sản xuất trên quy mô lớn và góp phần giúp cho người dân chuyển đổi cơ cấu giống cây trồng, tăng thu nhập

Bên cạnh đó, kết quả này còn là nền tảng cho việc ứng dụng công nghệ sinh học trong nhân giống cây gừng đen, đồng thời bổ sung vào tài liệu giảng dạy môn học nuôi cấy mô tế bào thực vật, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, cây

dược liệu,

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY GỪNG ĐEN

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Gừng đen là một loại cây dược liệu thuộc họ (Zingiberaceae) (Putiyanan và cs.,

2008), được gọi với nhiều tên gọi khác nhau như thiền liền đen, địa liền đen, ngải đen, sâm thái, có nguồn gốc từ Thái Lan, Ấn Độ, Myanmar, Lào (Picheansoonthon & Koonterm, 2008) Ở Việt Nam, hiện nay gừng đen được trồng nhiều ở một số tỉnh thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt là trên các vùng núi Cấm và núi Tượng của tỉnh An Giang, nhưng nó chỉ được trồng rải rác trong các vườn hộ gia đình

Trong các hệ thống phân loại thực vật, thì gừng đen được phân loại như sau: Giới (Kingdom): Plantae

Ngành (phylum): Spermathophyta,

Lớp (class): Monocotyledones

Bộ (ordo): Zingiberales

Họ (familia): Zingiberaceae

Chi (genus): Kaempferia

Loài (species): Kaempferia parviflora Wall ex Baker

Tên khác: Ngải đen, nhân sâm Thái, gừng đen Thái, địa liền đen

Tên đồng nghĩa: Kaempferia rubromarginata (S.Q.Tong) R.J.Searle

Tên tiếng anh: Black Ginger

(Nguồn: Techaprasan và cs., 2010)

Các cây trong chi địa liền (Kaempferia L.) thuộc họ gừng có đặc điểm thực vật

học chung là: Cây thảo nhỏ, đầu rễ thường phình lên thành dạng củ Thân giả rất ngắn hoặc không có, phiến lá đôi khi có đốm màu hay hồng ở mặt dưới Cụm hoa đầu, mọc giữa các bẹ lá hay ở đất từ thân rễ, hoa xuất hiện trước hay sau khi có lá Nhị lép bên dạng cánh tràng, cánh môi trắng hay tím, đôi khi có đốm và màu khác ở gần gốc cánh môi (Nguyễn Quốc Bình, 2009)

2.1.2 Đặc điểm hình thái của cây gừng đen

Gừng đen (Kaempferia parviflora) là cây thân thảo sống lâu năm, có thân rễ

hình trứng gồm nhiều củ nhỏ, da màu xám và bên trong thịt củ có màu tím đen (Hình 1c) Lá đơn, xếp so le đối xứng trên thân, trên có nhiều vân, viền lá màu tím tía, lá mọc thành bẹ, phiến lá hình trứng hay hình bầu dục, cuống lá dài khoảng 1 – 10 cm (Hình 1a và Hình 1b) (Picheansoonthon & Koonterm, 2008)

Cụm hoa mọc từ đỉnh của thân giữa các bẹ lá, có từ 1 – 4 hoa Hoa không đều,

có màu trắng với những đốm màu tím ở giữa (Evi, 2012)

Hầu hết các loài Kaempferia spp phân bố tự nhiên trong các rừng lá rộng, lề

rừng Chúng có thể được tìm thấy ở các bãi cỏ ven đường và khu vực rác thải Chúng sống được cả trong điều kiện khí hậu ẩm quanh năm và theo mùa Hàng năm, cây gừng đen mọc lá non và sinh trưởng nhanh trong mùa hè (khoảng tháng 4 – 5), sau đó khoảng 1 tháng thì cây ra hoa và thu hoạch vào tháng 11 -

12, lúc này toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi Củ được lưu trữ ở nơi khô ráo và lạnh khoảng 1-3 tháng trước khi trồng Dựa trên nghiên cứu Evi (2012), cây gừng đen có thể phát triển tốt phia dưới bóng râm tự nhiên

Hình 1 Lá (a), hoa (b) và củ (c) của cây gừng đen (Kaempferia parviflora)

(b) (a)

(c)

2.1.3 Công dụng và một số kết quả nghiên cứu về các hoạt chất sinh học

có tác dụng chữa bệnh trong củ gừng đen

Theo Đông y, gừng đen có vị cay, đắng, mùi hăng, tính ôn, tác dụng hành khí, phá huyết, thông kinh, tiêu thực, mạnh tì, kích thích tiêu hóa, tiêu viêm, tiêu xơ Thường được dùng chữa các bệnh như: ung thư cổ tử cung, viêm ngứa âm đạo, hỗ trợ trị rối loạn kinh nguyệt, đau bụng kinh, ăn không tiêu, đầy bụng, nôn mửa nước chua, chữa các vết thâm tím trên da Ngoài ra, nó còn có công năng tuyệt diệu đặc biệt là trị thương, sinh da non, chảy máu dạ con, phòng trị sốt rét, suy nhược cơ thể, thiếu máu Trong Tây y, gừng đen được sử dụng trong các đơn thuốc bổ giúp ăn nhiều và ngon miệng (Gừng Việt, 2015) Hiện nay, một số nước như Thái Lan, Nhật Bản, đã nghiên cứu thành công tính dược của gừng đen trong việc điều trị ung bướu, các bệnh về xương khớp, kháng ký sinh trùng sốt rét, kháng nấm, kháng khuẩn, tuyệt vời nhất là chống oxy hóa, chống viêm, chống dị ứng, ngăn ngừa và chữa bệnh Alzheimer, chống loét dạ dày, giải lo âu và tác động chống trầm cảm, hiệu quả ức chế béo phì, kích thích hoạt động tình dục, gia tăng mật độ tinh trùng, tăng cường sức đề kháng của cơ thể đối với stress, làm giảm triglycerides, ngăn ngừa bệnh tiểu đường Và đã thương mại hóa những sản phẩm bào chế thành thuốc dạng viên bán trên thị trường

Nghiên cứu khoa học hiện đại cho thấy gừng đen có thành phần hóa học là các chất flavonoid, đặc biệt polymethoxtflavone chiếm hàm lượng cao nhất trong các flavonoid Theo kết quả phân tích của Trường Đại học Dược Kyoto cho thấy, trong 8 loại polymethoxyflavone đã xác định được từ củ gừng đen thì 5,7-dimethoxyflavone là hoạt chất có dược tính cao nhất Ngoài ra, trong củ gừng đen còn chứa nhiều hoạt chất sinh học khác như glycosides, ethanolic, sesquiterpenoids, làm cho nó có nhiều chức năng trong việc phòng và trị bệnh Sau đây là một số bằng chứng khoa học chứng minh tác dụng chữa bệnh của các hoạt chất sinh học có trong củ gừng đen (Oryza oil & fat chemical co., k.n.)

 Cải thiện tuần hoàn ngoại vi, làm giảm phù nề

Một thử nghiệm lâm sàng đã được tiến hành để khảo sát ảnh hưởng của chất chiết xuất từ gừng đen về tuần hoàn máu ngoại vi Với mẫu thử là chiết xuất gừng đen (chứa > 2,5% 5,7-dimethoxyflavone trong 10% flavonoid tổng) khoảng 150mg/ngày đã được thử nghiệm trên 14 người ở liều duy nhất và uống liên tục trong 1 tuần Kết quả nghiên cứu cho thấy, uống liên tục chất chiết xuất từ củ gừng đen giúp cải thiện ngoại vi tuần hoàn máu, cải thiện mạch máu ngoại vi và các triệu chứng phù nề giảm Ngoài ra, huyết áp của các đối tượng thử nghiệm vẫn ở trạng thái bình thường sau khi uống

Wattanapitayakul và cs (2007), nhận thấy các hợp chất được chiết xuất từ gừng đen giúp tăng cường sản xuất nitric oxide (NO) trong các tế bào nội mô

của con người, giúp cải thiện lưu thông máu và điều hòa huyết áp Điều này cho thấy sử dụng gừng đen rất có ích trong việc thúc đẩy sức khỏe nội mô mạch máu giúp phòng chống bệnh xơ cứng động mạch

 Tác dụng chống dị ứng

Tewtrakul và cs (2007) đã tiến hành một cuộc điều tra khảo sát và so sánh các hoạt động chống dị ứng của một số thực vật họ gừng (bao gồm gừng đen) Kết quả nghiên cứu cho thấy, các hoạt chất sinh học từ gừng đen như 5-hydroxy-3,7, 3',4',-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-7-methoxyflavone và 5-hydroxy-7,4' -dimethoxyflavone đã thể hiện tác dụng kháng khuẩn rất mạnh giúp điều trị bệnh dị ứng mạnh nhất trong số các thực vật họ gừng khảo sát

 Tác dụng kháng viêm, kháng nấm, kháng virus

Các đặc tính chống viêm của các hợp chất trong gừng đen đã được nghiên cứu nhiều Panthong và cs (1989) cho thấy hợp chất 5,7-dimethoxyflavone có vai trò quan trọng chống viêm ở mô sau khi tổn thương Methoxy flavonoid có tác dụng chống viêm loét dạ dày (Rujjanawate và cs., 2005) Tewtrakul và cs (2008), đã cho thấy trong số các hợp chất được phân lập từ cây này, hợp chất 5-hydroxy-3,7,3', 4'-tetramethoxyflavone có hiệu quả ức chế các hoạt động của lipopolysaccharide (LPS), dẫn đến ức chế NO sản sinh trong các tế bào đại thực bào RAW264.7

Các dẫn xuất flavonoid được chiết xuất từ củ ngải đen như: dimethoxyflavone (DMF), 5,7,4'-trimethoxyflavone (TMF), 3,5,7,3',4'-pentamethoxyflavone (PMF), 7-methoxyflavone 5,7,4-trimethoxyflavone và 5,7, 3',4'-tetramethoxyflavone có tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét plasmodial và kháng nấm (Yenjai và cs., 2004)

5,7-Các chất chiết xuất methanol trong củ gừng đen như methoxyflavone; 5,7-dimethoxyflavone; 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone có khả năng ức chế virus HIV-1, virus viêm gan C và Virus Cytomegalo (Sookkongwaree và cs., 2006)

5-hydroxy-7- Cải thiện chức năng não

Ảnh hưởng của các hợp chất trong gừng đen trên phosphodiesteases (PDEs) đã được nghiên cứu và kết quả cho thấy các hợp chất có tác dụng ức chế trên PDEs ở nồng độ 1 µg/mL và 10 µg/mL Trong các hợp chất được phân lập thì hợp chất 5,7-dimethoxyflavone ức chế hoạt động PDEs ở nồng độ 3μM và 30μM (Temkitthawon và cs, 2011)

 Tăng cường sinh lực

Củ gừng đen còn được xem như là nhân sâm Thái, có tác dụng tăng cường sinh lực ở nam giới do có chứa một lượng đáng kể các chất ức chế Phosphodiesterase 5 (Trisomboon, 2009) Temkitthawon vàcs (2011), đã thực

hiện nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của các hoạt chất từ củ gừng đen trên phosphodiesterase-5 (PDE5) Kết quả cho thấy các dẫn chất trong gừng đen có tác dụng ức chế PDE5 ở nồng độ 1μg/ml và 10μg/ml Trong các hợp chất được phân lập thì hợp chất 5,7-dimethoxyflavone ức chế hoạt động PDEs ở nồng độ 30μM

 Hội chứng chống chuyển hóa (chống béo phì, chống bệnh tiểu đường)

Đã có nghiên cứu trên chuột béo phì mắc bệnh tiểu đường loại II cho thấy sự tích tụ mỡ nội tạng và mức độ đường trong máu đã giảm xuống tương ứng ở chuột ăn thức ăn có chứa chất chiết xuất ngải đen (1% và 3%) trong 8 tuần Trong khi đó, không có tác dụng trên ở những con chuột bình thường Điều này cho thấy các chất được chiết xuất từ gừng đen có thể điều trị dự phòng cho hội chứng chuyển hóa (Akase và cs., 2011)

 Tác dụng chống oxy hóa

Trong một hệ thống sinh học, các loại oxy phản ứng (ví dụ như superoxide và các gốc hydroxyl) được tạo ra để đáp ứng stress oxy hóa, góp phần vào sự phát triển của các bệnh thoái hóa khác nhau ví dụ như ung thư, viêm và lão hóa Các tác dụng chống oxy hóa của gừng đen trên mô hình Superoxide Dismutase (SOD) và mô hình DPPH đã được nghiên cứu Kết quả đã chứng minh được gừng đen có tác dụng chống oxy hóa liều phụ thuộc vào cả 2 mô hình SOD và DPPH

 Tác dụng chống ung thư

Một số nghiên cứu về chống ung thư đã khẳng định: gừng đen có khả năng trong ngăn ngừa và điều trị ung thư Theo Patanasethanont và cs (2007), các chất 3,5,7,3',4'-pentamethoxyl flavonoid, 5,7-dimethoxyflavone từ gừng đen có tác dụng ức chế hoạt động của P-glycoprotein (chất có khả năng bảo vệ khối u trước sự tấn công của các loại thuốc chống ung thư)

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG ĐEN

2.2.1 Phương pháp tách chiết thông thường

Gừng đen là cây có các thân rễ bò ngang hay còn gọi là củ Cây thường được trồng hoặc nhân lên từ thân rễ, nhưng về hiệu quả nhân giống thì chưa có nhiều tài liệu công bố trên đối tượng cây gừng đen Và để nhân giống, người ta cắt thân rễ gừng đen thành nhiều phần, mỗi phần có 1 -2 mầm, đem trải phơi nơi thoáng mát trong vài ngày để cho vết cắt khô lại rồi đem đi trồng, tuy nhiên khả năng nhân giống của nó lại rất chậm Bên cạnh đó củ gừng đen chỉ nẩy chồi vào thời điểm duy nhất khoảng tháng 4 -5 và thời gian sinh trưởng của nó kéo dài đến tháng 12, lúc này các lá sẽ khô héo và chết đi, củ gừng đen sẽ ở

thời kỳ ngủ nghỉ và chồi mới sẽ mọc và xuất hiện vào lúc bắt đầu mưa năm sau

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro

Đây là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống cây gừng đen trên quy mô công nghiệp, với phương pháp này sẽ tạo ra được số lượng lớn cây con đồng nhất và sạch bệnh, ít tốn kém chi phí và không gian tồn trữ giống So với Phương pháp thông thường thì một cây mẹ một năm có thể cho ra 12 -13 củ

giống thì phương pháp nuôi cấy in vitro có thể cho ra hàng triệu cây/năm

Ngày nay, việc ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống các cây họ gừng đã được sử dụng phổ biến và đạt hiệu quả rất cao như hệ số nhân chồi cây nghệ vàng trung bình là 9,6 ± 0,59 chồi (Sen và cs., 2010) Đặng Ngọc Phúc và

cs (2011), khi nghiên cứu nhân giống in vitro từ đỉnh sinh trưởng và đoạn thân

cây sa nhân tím cho thấy hệ số nhân nhanh chồi tốt nhất là 7,40 chồi/mẫu

Shahinozzaman và cs (2013), nghiên cứu nhân giống in vitro trên cây nghệ

đen hệ số nhân giống trung bình tốt nhất đạt 10,17±1,89 chồi Lương Thanh Quỳnh Như & Nguyễn Bảo Toàn (2007), sau 1 năm, hệ số nhân giống cây đa lộc đạt được là 5,25chồi/mẫu

2.3 KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

2.3.1 Khái niệm và cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô hay nuôi cấy in vitro là một từ rất tổng quát dùng để chỉ việc nuôi

cấy tế bào hay mô để chúng phát triển trong môi trường dinh dưỡng vô trùng trong một thời gian vô hạn Nuôi cấy mô có mục đích chính là nhân những dòng thành lượng lớn, tức là nhân từ một mảnh thực vật đặt vào môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng Cơ sở sinh học của phương pháp này là phát triển các mầm chồi trên các mảnh thân cây qua nuôi cấy, hay tạo nên chồi bất định trên các mẫu cấy

Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật được Haberland khởi xướng năm 1902, đó là mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Tính toàn năng của tế bào chính là cơ sở lí luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật (Ngô Xuân Bình, 2010)

Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật là một công cụ rất tốt để nghiên cứu sinh học thực vật, nó đã được ứng dụng nhanh chóng vào thực tiễn, khi các cây còn trong ống nghiệm Có nhiều mục đích khi áp dụng phương pháp nhân giống vô

tính in vitro: (1) Tạo được một số lượng lớn cây con giống với cây mẹ; (2) Tạo

ra các cây con sạch bệnh do có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh trước khi

đưa vào môi trường nuôi cấy; (3) Cứu lấy các loài thực vật đang có nguy cơ bị biến mất; (4) không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường khác nhau như khí hậu, mùa vụ, điều kiện đất đai (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002)

2.3.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

 Giai đoạn 0: lựa chọn và chuẩn bị cây mẹ

Khởi đầu của quá trình nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô cần phải có

sự lựa chọn cây mẹ cẩn thận, cần chọn những cây đặc trưng cho giống loài và đang trong giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống sẽ đạt kết quả cao (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Giai đoạn 1: khử trùng bề mặt

Đây là giai đoạn đưa mẫu từ bên ngoài vào điều kiện nuôi cấy vô trùng Mục đích là tạo mẫu cấy vô trùng Nó là một sự kết hợp giữa một phương pháp tiệt trùng đầy đủ để mẫu cấy không bị nhiễm và có tỉ lệ sống cao Thông thường khó đạt thành công 100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu (Debegh & Zimmerman, 1991)

 Giai đoạn 2: nhân mẫu cấy

Mục đích của giai đoạn này là tạo được số lượng cây theo ý muốn thông qua quá trình kích thích các trung tâm mô phân sinh như đỉnh sinh trưởng, chồi chính, chồi bên (Nguyễn Bảo Toàn, 2005) Có 3 phương pháp nhân chồi là phát sinh chồi bất định từ mô sẹo nhận được từ mô sinh vật nuôi cấy, phát sinh chồi bất định trực tiếp từ mô sinh vật không thông qua mô sẹo và phương pháp nhân chồi bên (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Theo Debegh

& Zimmerman (1991), đây là giai đoạn then chốt của quá trình nhân giống Để tăng hệ số nhân, ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin, Gibberellin…) các chất bổ sung khác như: nước dừa, nước chiết nấm men, dịch thủy phân Casein… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng, thích hợp Tùy thuộc đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh số lượng từ sự kích thích các trung tâm mô phân sinh như đỉnh sinh trưởng, chồi chính, chồi bên hoặc tái sinh phôi vô tính từ các bộ phân không chứa đỉnh sinh trưởng Phương pháp để gia tăng số chồi ở

giai đoạn hai là cấy chồi đỉnh hoặc chồi bên (cấy đoạn thân)

 Giai đoạn 3: kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dƣỡng

Chồi và cây con được tạo ra ở giai đoạn 2 thường rất nhỏ chưa có đủ khả năng

để phát triển ngoài môi trường tự nhiên Do đó, mục đích của giai đoạn này là tạo cây phát triển đầy đủ rễ, thân, lá có khả năng thực hiện quang hợp và sống sót mà không cần cung cấp nguồn cacbonhydrate nhân tạo Giai đoạn này được chia thành hai giai đoạn:

+ Giai đoạn 3a: kéo dài các chồi ở giai đoạn 2 để đạt kích thước thích

hợp cho việc tạo rễ đầy đủ Môi trường kéo dài thường không chứa cytokinin hay một lượng cytokinin thấp hơn giai đoạn 2 Cytokinin ức chế sự tạo rễ Tùy thuộc vào loại cây, sự kéo dài có thể xảy ra trên các chồi đơn hay cụm chồi (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

+ Giai đoạn 3b: đây là giai đoạn kích thích tạo rễ và tiền thuần dưỡng

Auxin là chất thường được sử dụng để tạo rễ, trong nhóm này các chất NAA,

IAA, IBA được sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi in vitro Bên cạnh đó

than hoạt tính cũng được sử dụng rất phổ biến trong môi trường tạo rễ

Ngoài ra đây cũng là giai đoạn thích hợp cho việc tiền thuần dưỡng nhằm làm tăng khả năng tự dưỡng của cây nuôi cấy mô trước khi đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên với các phương pháp thực hiện như cung cấp cho cây con lượng cacbonhydrate, làm thấp ẩm độ tương đối trong bình chứa, để keo ngoài điều kiện tự nhiên trước khi đưa ra ngoài (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Giai đoạn 4: thuần dưỡng

Các cây con sau giai đoạn cấy mô khi mang trồng trực tiếp ở nhà lưới hay môi trường tự nhiên thường có tỷ lệ chết rất cao Để tăng khả năng sống của cây con ngoài nhà lưới thì cây phải trải qua giai đoạn huấn luyện thích nghi với sự thay đổi của nhiệt độ, ẩm độ, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng hoàn toàn Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, rễ của các cây cấy mô được tạo ra trong quá trình nuôi cấy chưa có chức năng hoàn toàn, các rễ này cần có thời gian mới hoàn thiện các cấu trúc bên trong

Vì vậy trong giai đoạn đầu cần tránh làm cho cây con bị mất nước (Nguyễn Bảo Toàn, 2005)

2.4 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY

MÔ THỰC VẬT

2.4.1 Chất khử trùng mẫu cấy

Khử trùng mẫu cấy thường sử dụng các hoá chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật như: calcium hypochlorite (Ca(ClO)2), thủy ngân clorua (HgCl2), Chloramin B, sodium hypochlorite (NaOCl – nước Javen), oxy già (H2O2), nước Brome, các chất kháng sinh… Trong đó, Ca(ClO)2 được sử dụng khá nhiều vì chúng có độc tính thấp đối với mô cấy và an toàn cho người sử dụng, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt, mà giá thành lại rẻ Tuy nhiên, khả năng diệt khuẩn của hóa chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ

xử lý và mức độ xâm nhập của vi sinh vật trên bề mặt mô cấy (Vũ Văn Vụ và cs., 2007) Kết quả nghiên cứu của Sharma và cs (2005) đã cho thấy cồn 70%

có tác dụng khử trùng bề mặt thân rễ cây địa liền và cây ngải máu Sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2% trong 15 phút để diệt nấm và vi khuẩn bám

trên mẫu Huỳnh Trường Huê (2009) khử trùng chồi gừng với Ca(OCl)2 10% trong thời gian 25-30 phút đạt tỷ lệ mẫu vô trùng cao

2.4.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy giữ vai trò quan trọng trong sự thành công của nuôi cấy

mô Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy bao gồm: nước, muối khoáng (đa lượng và vi lượng), nguồn cacbon, vitamin, chất làm đặc môi trường (agar), Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài, tùy theo bộ phận nuôi cấy, tùy theo từng giai đoạn sinh trưởng và phát

triển của mẫu cấy (Vũ Văn Vụ và cs., 2005)

Các loại môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật như: môi trường

MS (Murashige và Skoog), môi trường White, Knop và B5 của Gamborg… Trong đó, môi trường White, Knop là môi trường nghèo dinh dưỡng; môi trường B5 của Gamborg là môi trường có hàm lượng dinh dưỡng trung bình Cho đến nay hầu hết các nghiên cứu về nuôi cấy mô thường sử dụng thành phần khoáng do Murashige & Skoog (1962) đề nghị, vì công thức môi trường đảm bảo được cân bằng ion, và là môi trường giàu, đáp ứng rộng với nhiều loại

mô cấy của nhiều loài

2.4.2.1 Khoáng đa lượng và vi lượng

Môi trường nuôi cấy in vitro cần đảm bảo mọi thành phần dinh dưỡng tương tự

như môi trường cây sống bên ngoài đất Cần phải cung cấp cho cây các nguyên

tố khoáng đa lượng cơ bản như nitơ, phốt pho, kali, can xi, magiê, sắt và vi lượng như Mn, Bo, Zn, Cu, Mo, Co, Mô cấy cần được đặt trong môi trường

có sự đối xứng các ion như K+

, NO3-, NH4+, Ca++, Mg++ Khoáng đa lượng rất cần cho cây do các vai trò của các nguyên tố đa lượng về phương diện sinh lý dinh dưỡng và cả do tỷ lệ của chúng trong cấu trúc thành sinh khối của thực vật (Jacob, 1993) Do đó, cần phải được cung cấp đầy đủ các nguyên tố đa vi lượng trong môi trường nuôi cấy

Khoáng vi lượng tham gia vào enzim trong những hoạt động thuộc quá trình chuyển hóa cơ bản và có vai trò không thể thay thế ở nhiều trường hợp, nhưng

do thành phần khoáng vi lượng chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ nên một số chất có thể đã có trong các thành phần tạp của chất khác Vi lượng sắt sử dụng cho nuôi cấy mô dưới dạng chelate (Fe-EDTA) khoảng 20 - 40 mg/L Chelate giữ cho sắt phóng thích từ từ vào môi trường trong thời gian mô tăng trưởng (Nguyễn Văn Uyển và cs.,1993)

Độ pH trong môi trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Theo Murashige & Skoog (1962), pH khoảng 5,7 – 5,8 thích hợp cho sự duy trì hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS

2.4.2.2 Vitamin và các thành phần hữu cơ

Các vitamin có tác dụng kích thích sinh trưởng của mô cấy, nhất là khi sử dụng kết hợp với kích thích tố (Nguyễn Văn Uyển và cs., 1993) Theo Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), vitamin cần cho mô cấy bao gồm một số vitamin nhóm B, với lượng từ 1 đến 10 mg/L Myo - Inositol có tác dụng cải thiện sự sinh trưởng của mô cấy và được dùng trong khoảng 50 - 5000 mg/L, mặc dù không phải là yếu tố quyết định

Nguồn cacbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia tăng sinh khối Nguồn cacbon này không do quá trình quang hợp cung cấp mà nó được bổ sung vào môi trường dưới dạng đường Hai dạng

đường thường gặp nhất trong nuôi cấy in vitro là glucose và saccharose, nhưng

saccharose được sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nồng độ đường saccharose dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là 20 - 30 g/L (Bùi Bá Bổng, 1995)

Trong nuôi cấy mô, nước dừa được sử dụng nhiều với thể tích từ 10 - 30 hoặc

40 % thể tích môi trường Trong nước dừa có các loại muối khoáng, các axit amin, các chât sinh trưởng như cytokinin và Myo-inositol có lợi cho sự phát triển cây có nguồn gốc từ protocorm (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy

Tiên, 2002)

2.4.2.3 Agar

Agar là một loại polysaccarite của tảo biển Nồng độ sử dụng thường là 6 - 8 g/L, có tác dụng đông cứng môi trường, điều này đạt được nhờ các polysaccarite kết hợp với các phân tử H2O tạo thành polime, ở 80 0C thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái lỏng còn ở 40 0C thì trở về trạng thái rắn Agar chủ yếu sử dụng làm giá thể cho mô và tế bào thực vật phát triển

2.4.2.4 Than hoạt tính

Theo Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên (2002), than hoạt tính có tác dụng khử độc, hút các hợp chất cản, hút các hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc các chất làm đen môi trường Khi bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ kích thích tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây trường xuân nhưng lại có tác dụng cản đối với thuốc lá, đậu nành, trà mi Khả năng kích thích sự tăng trưởng của

tế bào mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do

mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy Một số trường hợp, than hoạt tính thúc đẩy phát sinh phôi vô tính, kích thích sinh trưởng và phát sinh cơ quan ở các loài thân gỗ Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,5 - 3 g/L

2.4.2.5 Ảnh hưởng các điều kiện vật lý của môi trường lên mô cấy

Các điều kiện vật lý của môi trường ảnh hưởng lên mô cấy chủ yếu là: ánh sáng, nhiệt độ, cấu trúc (lỏng, đặc…) và độ thông thoáng

Khác với cây sống trong tự nhiên, mô cấy được cung cấp năng lượng phần lớn

từ đường, nhưng ánh sáng lại là cần thiết cho sự phát sinh hình thái như sự công bố của nhiều nghiên cứu Cường độ ánh sáng 100 – 2500 lux dùng phổ biến trong nuôi cấy nhiều loại mô Theo Murashige (1977), ở cường độ ánh sáng cao hơn thì chồi sinh trưởng chậm lại, nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ Ánh sáng tham gia vào sự phát triển phôi soma Ánh sáng ở cường độ cao gây nên sự sinh trưởng của mô sẹo, ở cường độ trung bình kích thích sự tạo chồi và

ở cường độ thấp sẽ làm gia tăng chiều cao chồi và làm chồi có màu xanh đậm (Vũ Văn Vụ và cs., 2007)

Toyoki Kozai (1995) thấy rằng độ thông khí trong môi trường cũng có ảnh hưởng lớn đến khả năng tăng trưởng của cây bao gồm sự tăng trưởng, hình thành rễ, lá , trong nuôi cấy tăng sinh (proliferante culture), kết quả tốt nhất là dùng môi trường lỏng để trên máy lắc tạo đầy đủ độ thoáng trong môi trường ngoài mục đích phá ảnh hưởng phân cực của nước

Theo Dương Công Kiên (2003), nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển cho từng đối tượng nuôi cấy là không giống nhau Nhiệt độ thấp hoặc rất thấp được

sử dụng để làm chậm hay làm ngừng hẳn sinh trưởng của mẫu nuôi cấy Nhiệt

độ của phòng nuôi cấy thường được giữ ổn định bằng máy điều hoà nhiệt độ trong suốt thời gian nuôi cấy và được điều chỉnh từ 24 - 26 0

C

Mô cấy trong điều kiện in vitro thường ít có sự trao đổi khí với bên ngoài do

bình cấy được đậy kín để đảm bảo vô trùng Độ ẩm cao và thiếu trao đổi khí có thể làm cho mô phát triển theo chiều hướng mọng nước (hiện tượng thuỷ tinh thể- hyperhydricity) Các mô hoặc cây mọng nước đa số phát triển hình thái rất kém, không sử dụng cho việc nhân giống tiếp tục, khi chuyển ra môi trường bên ngoài cây cũng không thể tự dưỡng và sớm tàn lụi

2.4.3 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật giữ vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lý của thực vật Chúng hoạt động ở nồng độ và liều lượng rất thấp, có thể kích thích hoặc

ức chế các hoạt động sinh lý của thực vật Các chất điều hòa sinh trưởng của thực vật bao gồm các chất điều hòa sinh trưởng tự nhiên và các chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp Benzyladenine (BA) và Thidiazuron (TDZ) thuộc nhóm cytokinin tổng hợp, α – naphtalenacetic acid (NAA) và acid 2,4 – diclorophenoxyacetic (2,4 - D) thuộc nhóm auxin tổng hợp là những chất được

sử dụng phổ biến trong các kỹ thuật vi nhân giống, giữ vai trò quan trọng trong

quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro, có hiệu quả tác động phụ thuộc

vào nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất, mẫu nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cs., 2005)

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng của tế bào, cụ thể là nới lỏng vách tế bào thông qua sự hoạt hóa các enzim tổng hợp vách , khởi động cho sự giãn nở

tế bào, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử cần cho qúa trình tăng trưởng như protein, cenlulo, pectin và ngăn cản không cho chúng bị thủy phân (Grodzinxki & Grodzinxki, 1981) Theo Vũ Văn Vụ và cs (2005), auxin kích thích tạo rễ ở nồng độ thấp, còn ở nồng độ cao thì ức chế sự thành lập rễ và thay vào đó là sự tạo thành mô sẹo Nồng độ auxin trong môi trường tạo rễ thường là 0,5 – 3,0 mg/L NAA hoặc IBA Trong việc tạo rễ trực tiếp, các auxin như NAA, IAA, IBA thường được dùng so với 2,4-D; sử dụng NAA 0,5 mg/l hoặc NAA kết hợp với IBA 0,5 – 1 mg/l đã làm cho rễ phồng lên và thân

có mô sẹo ở chồi Prunus tenella, trong khi chỉ dùng IBA 0,5 mg/l thì tạo rễ

mỏng bình thường và ít mô sẹo (Sriskandarajah và cs, 1989)

Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đóng vai trò quan trọng trong

sự phát sinh chồi và nhân chồi, giữ tuổi thọ cho mô cấy Ở nồng độ cao chúng

có thể cảm ứng tạo chồi bất định nhưng ức chế tạo rễ; chúng kích thích tạo chồi nách do ức chế chồi đỉnh (Vũ Văn Vụ và cs., 2005) Theo Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), việc bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy

có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của vài chồi nhỏ từ các mẫu cấy sau khoảng 4 – 6 tuần nuôi cấy, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhưng các chồi này không thể kéo dài hoặc lá bị biến dạng hay chồi có hiện tượng mọng nước

Ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng của cytokinin lên sự phân hoá cơ quan ở thực vật là sự phân hoá chồi Cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích sự gia tăng kích thước và phân chia tế bào, đặc biệt nếu kết hợp với auxin thì sự kích thích diễn ra mạnh hơn Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy mô có ý nghĩa quan trọng trong việc nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy

mô Tỷ lệ cân đối giữa auxin và cytokinin sẽ cho phép tạo cây hoàn chỉnh Trong quá trình tạo chồi, auxin được sử dụng với nồng độ thấp kết hợp với cytokinin ở nồng độ cao sẽ làm gia tăng tốc độ nhân chồi của cây Tuy nhiên,

tỷ lệ này thay đổi tuỳ theo đối tượng nuôi cấy và loại mô được nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cs., 2005) Theo Rout (2000) cho rằng mức độ auxin và cytokinin ngoại sinh giữ vai trò quan trọng trong việc kích kích và phát triển chồi, ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát sinh hình thái Trong một số cây, việc tạo chồi trực tiếp được kích thích bởi cytokinin, khi thêm auxin vào thì sẽ gây ức chế Khi một mình cytokinin kích thích tạo chồi thì hoạt động của chúng có thể tùy thuộc vào sự hiện diện của auxin nội sinh bên trong cây

2.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO MỘT SỐ CÂY

THUỘC HỌ GỪNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.5.1 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ gừng trên thế giới

Hầu hết các cây thuộc họ gừng có thể được nhân giống bằng cách gieo hạt hoặc tách chồi củ từ cây mẹ Tuy nhiên, các phương pháp này cho hiệu quả nhân giống thấp không đáp ứng được nhu cầu của thị trường Vì vậy, phương pháp nuôi cấy in vitro cho phép tạo ra một lượng lớn cây con trong khoảng thời gian ngắn đã trở thành phương pháp lí tưởng để nhân giống các cây họ gừng phục

vụ cho nhu cầu sản xuất và đáp ứng nhu cầu nguyên liệu cho nền y học

Nhiều cây thuộc họ gừng đã được nghiên cứu in vitro như: Curcuma soloensis (Zhang và cs., 2011), Etlingera elatior (Yunus và cs., 2012), Hedychium

spicatum (Giri & Tamta, 2011), Kaempferia galanga (Greetha và cs., 1997;

Chirangini và cs., 2005; Parida và cs., 2010), Kaempferia rotunda (Greetha và cs., 1997; Chirangini và cs., 2005), Zingiber montanum (Hamirah và cs., 2010),

Zingiber serumbet (Faridah và cs., 2011)

Kambaska và Santilata (2009) nhận thấy việc nhân giống cây gừng Zingiber

officinale Rosc cv-Suprava và Suruchi trong môi trường MS bổ sung 2 mg/L

BAP kết hợp với 0,5 mg/L NAA cho kết quả tạo chồi tốt nhất

Sultana và cs (2009), đã sử dụng lá, chồi và rễ của cây gừng làm vật liệu nuôi cấy Kết quả cho thấy môi trường MS bổ sung 1 mg/L Kinetin kết hợp 1 mg/L BAP cho kết quả tạo chồi tốt nhất và môi trương MS bổ sung 1 mg/l IBA thích hợp cho việc tạo rễ

Kết quả nghiên cứu của Zhang và cs (2011) đã thấy ở 30 ngày sau khi cấy,

Thidiazuron (TDZ) có tác dụng kích thích quá trình nhân chồi tốt hơn khi kết

hợp với BA trên Curcuma soloensis Chồi C Soloensis được nuôi cấy trên môi

trường chỉ có BA đạt 5 chồi/mẫu, nhưng khi có mặt TDZ (2,5 μM) thì số chồi tăng lên khá cao đạt 18,7 chồi/mẫu Khi kết hợp BA và NAA thì số chồi C

Soloensis cũng tăng đáng kể Khi kết hợp TDZ với NAA vào môi trường cho

thấy số lượng chồi tạo ra không đáng kể

Yunus và cs (2012) đã tiến hành nuôi cấy chồi cây đa lộc (Etlingera elatior)

trên môi trường có bổ sung riêng lẽ BAP, Kinetin hoặc 2-ip Kết quả cho thấy

ở 12 tuần sau khi cấy, chất lượng chồi và số chồi ở môi trường có bổ sung BAP cao hơn so với các cytokinin khác Số chồi cao nhất đạt 4,59 chồi/mẫu trên môi trường có bổ sung 0,7 ppm BAP

Giri và Tamta (2011) đã bổ sung TDZ, BAP, Kinetin vào môi trường nuôi cấy

cây ngải tiên (Hedychium spicatum) Kết quả cho thấy số chồi H spicatum ở

nghiệm thức có TDZ tăng khoảng 200% so với BAP và Kinetin Số chồi cao nhất đạt 3,86 chồi/mẫu trên môi trường có bổ sung 1 μM TDZ

Hiện nay, nhiều nghiên cứu về vi nhân giống Kaempferia galanga đã được thực hiện và K galanga đã được trồng trồng ở quy mô lớn Một số nghiên cứu

về K galanga được thực hiện bởi Greetha và cs (1997), Chirangini và cs (2005), Parida và cs (2010)

Theo Greetha và cs (1997) số chồi mới và rễ hình thành tốt nhất trong môi

trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/L và BAP 1,0 mg/L (đạt 8 chồi/mẫu)

Swapna và cs (2004) đã nghiên cứu vi nhân giống trên cây K galanga cho

thấy, ở môi trường MS bổ sung IAA, BAP, NAA, 2,4-D và Kinetin ở nồng độ 0,5 - 2,5 mg/L cho kết quả tái sinh chồi cao nhất ở môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L IAA và 2,5 mg/L BAP đạt 78,33% Mặt khác, Chirangini và cs (2005) cho rằng khi kết hợp BAP và IAA hoặc NAA thì không có sự thúc đẩy tăng trưởng chồi, nhưng khi sử dụng BAP riêng lẽ thì có sự gia tăng số chồi đạt 8,75

chồi/mẫu Kalpana & Anbazhagan (2009) các chồi K galanga L được nuôi

cấy trên môi trường MS có bổ sung BA, NAA, IBA và IAA ở nồng độ khác nhau, từ 0,1 - 3,0 mg/L Kết quả cho thấy môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/L

BA và 0,2 mg/L NAA cho hiệu quả nhân chồi cao và môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L của IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ Các cây con được thuần dưỡng trong giá thể đất đỏ, cát và vermiculate (1: 1: 1) đạt tỷ lệ sống 81%

Parida và cs (2010) cho rằng môi trường MS bổ sung 1 ppm BA và 0,5 ppm IAA là môi trường tối ưu để nhân nhanh chồi K galanga (đạt 11,5 chồi/mẫu) Preetha và cs (2013), các chồi K Galanga có thể tái sinh tốt nhất trên môi

trường MS bổ sung 1 mg/L BA và 0,5 mg/L NAA

Ngược lại với K Galanga, cây gừng đen (Kaempferia parviflora) vẫn chưa

được trồng với qui mô lớn và chưa có nhiều nghiên cứu về nuôi cấy mô Prathanturarug và cs (2000) đã tiến hành nghiên cứu vi nhân giống cây

Kaempferia parviflora, kết quả cho thấy sau khi cấy 8 tuần các chồi được nuôi

cấy trên môi trường MS có bổ sung 35,52 mM BAP đạt 3,4 chồi/mẫu Dheeranupattana và cs (2003) đã nghiên cứu về sự cảm ứng tạo chồi

Kaempferia parviflora in vitro, kết quả số chồi thu được tương đối thấp, chỉ đạt

2,4 chồi/mẫu cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 ppm NAA và 3 ppm BA

Alveno (2012), cũng tiến hành nhân giống in vitro cây gừng đen (Kaempferia

parviflora), kết quả vẫn còn hạn chế, do số chồi trên môi trường MS bổ sung 3,

75 ppm BAP không nhiều so với đối chứng nhưng tỷ lệ tái sinh chồi trên môi trường này cao Zuraida và cs (2014) đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy callus

và dịch treo tế bào cây Kaempferia parviflora Kết quả cho thấy môi trường

MS có bổ sung 0,2 mg/L 2,4 – D kết hợp với 0,2 mg/L NAA thúc đẩy sự cảm ứng tạo callus cao nhất Callus được tạo ra có khả năng tăng trưởng tốt nhất trong môi trường nuôi cấy khi có sự hiện diện của 1 mg/L 2,4 – D

2.5.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ gừng trên

ở Việt Nam

Ở Việt Nam, chưa có công trình công bố kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô cây

Kaempferia parviflora Tuy nhiên, hiện nay những nghiên cứu về nhân giống

một số cây thuộc họ gừng in vitro đã thực hiện ở nước ta

Lâm Ngọc Phương (1997), đã tiến hành nghiên cứu nhân giống cây gừng

(Zingiber officinale Rosc) bằng phương pháp nuôi cấy mô, với mẫu cấy được

sử dụng từ củ gừng non với kích cỡ 1 x 2 cm Kết quả cho thấy môi trường nhân chồi tốt nhất là môi trường MS bổ sung BA từ 1 – 3 mg/L Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là môi trường MS bổ sung BA nồng độ 1 – 3 mg/L kết hợp 0,5 mg/L NAA Cây con có bộ lá cân đối với bộ rễ, cao từ 5 – 6 cm được chuyển ra trồng ở vườn ươm với tỷ lệ thành công trên 95%, tạo thành củ non sau 2 tháng trồng Theo Danh Giàu (2003) đã cho thấy môi trường nuôi cấy có hiệu quả nhân giống cao là môi trường MS bổ sung BA trong khoảng 2 - 2,5 mg/L Kết quả nghiên cứu của Huỳnh Trường Huê (2009) cũng cho thấy sử dụng môi trường MS có bổ sung kích thích tố BA 2 mg/L có tác dụng gia tăng

in vitro được cấy trên môi trường bổ sung BAP 1,5 mg/L kết hợp NAA 0,25

mg/L cho số chồi lớn nhất đạt 7,40 chồi/mẫu Chồi in vitro được cảm ứng rễ

trên môi trường MS bổ sung NAA hay IBA Rễ được cảm ứng tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA (18,42 rễ/ chồi)

Dương Thị Nguyệt (2011) đã nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro cây địa liền (Kaempferia galanga L.) Kết quả cho thấy, trong giai đoạn khử

trùng sử dụng HgCl2 0,1% trong 10 phút để đạt kết quả tốt nhất thu được các mẫu địa liền vô trùng với tỷ lệ sống cao là 93,3% Môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo chồi từ mắt củ là MS bổ sung 1,5 mg/L kinetin Môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi là MS bổ sung 0,5 mg/L kinetin kết hợp 1,0 mg/L BAP và 0,2 mg/L NAA Môi trường thích hợp cho sự kéo dài chồi là MS

bổ sung 0,5mg/L GA3 Môi trường thích hợp cho ra rễ là MS bổ sung 0,4mg/L IBA Giá thể thích hợp nhất trong 2 tuần đầu cấy chuyển ra vườn ươm là 50% cát : 50% đất

Võ Châu Tuấn (2014) nghiên cứu hình thành callus từ bẹ lá cây nghệ đen cho kết quả tốt khi môi trường có bổ sung BA và 2,4 - D ở các nồng độ BA 1,0 mg/L và 2,4 - D 1 mg/L hoặc BA 2,0mg/L và 2,4 - D 2,0 mg/L Tỷ lệ callus thu

được lần lượt là 46,01% và 40,1%, callus màu trắng, xốp và khả năng sinh trưởng tốt

2.6 GIẢ THUYẾT NGHIÊN CỨU

- Tìm được một nồng độ BA kết hợp TDZ, hoặc BA/TDZ kết hợp NAA tối ưu cho quá trình nhân nhanh và tạo rễ của cây gừng đen trong ống nghiệm

- Tìm được một loại giá thể phù hợp lên sự sinh trưởng của cây gừng đen ở giai đoạn vườn ươm

18

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 MẪU NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là củ gừng đen (Kaempferia parviflora) được thu thập tại Hội

đông Y huyện Tịnh Biên, An Giang và được đem về ươm tại khu thực nghiệm, Khoa Nông Nghiệp & TNTN, Trường Đại học An Giang

Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu: Chọn củ gừng đen đã già, không bị nhiễm bệnh Xử lý

củ với thuốc trừ bệnh Antracol 70WP trong 120 phút Sau đó, ủ củ trong tro trấu đã được xử lý bệnh Thời gian ủ khoảng 20 ngày

3.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU

3.2.1 Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Bảng 1: Thành phần môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)

0,1 2,0

19

Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nghiên cứu là môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) (Bảng 1), có bổ sung thêm các chất như: đường sucrose (30 g/L), agar (8g/L), nước dừa tươi (100 ml/L), Myo - Inositol (0,1 g/L), than hoạt tính (0,5 g/L) Tùy thuộc vào các thí nghiệm mà có hoặc không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng như BA, TDZ và NAA ở các nồng độ khác nhau Môi trường khi pha xong được chỉnh pH = 5,8 và rót vào keo Mỗi keo chứa 50 ml môi trường và được khử trùng ướt ở 121 0

C, áp suất 1 atm trong 30 phút

Điều kiện nuôi cấy: Các mẫu cây được nuôi cấy dưới ánh sáng huỳnh quang với thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 2 0C

Điều kiện vườn ươm: các cây khi chuyển ra ngoài vườn ươm được che phủ 60% ánh sáng, nhiệt độ 28 - 33 0C, độ ẩm 70 - 80%

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu

Mục tiêu: Tạo vật liệu khởi đầu cho thí nghiệm nhân chồi

Vật liệu: Mẫu là những chồi mầm được ươm từ củ có chiều cao từ 10 – 15 cm, sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh (Hình 2)

Hình 2: Chồi non của cây gừng đen K Parviflora được ươm từ củ

Qua trình khử trùng bề mặt: mẫu gồm các chồi mầm gừng đen, rửa sạch tro trấu, sau

đó tiến hành khử trùng Trước hết loại bỏ hết rễ, cắt bỏ 1/2 lá, rửa dưới vòi nước

21

Tiến hành: Chồi được cắt bỏ rễ, lá, còn khoảng 15 mm cấy vào môi trường MS có bổ sung BA, TDZ và NAA ở các nồng độ khác nhau Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, một nhân tố với 19 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại

5 lần, mỗi lần lặp lại là 2 keo tương đương với 2 mẫu cấy Tổng số đơn vị thí nghiệm

là 95 Các nghiệm thức được thể hiện ở Bảng 2

Chỉ tiêu theo dõi :

- Thời gian xuất hiện chồi

Tính hệ số nhân chồi theo công thức của Geogre (1993):

K = (N/N0)T/t : Hệ số nhân chồi/ năm

Trong đó:

N: Số chồi thu được N0 : Số chồi ban đầu T: Thời gian cần để thực hiện

t : Thời gian giữa hai lần cấy chuyền Thời gian lấy chỉ tiêu : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, và 8 tuần sau khi cấy

 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của cây gừng đen

in vitro

Mục đích: Xác định hiệu quả của NAA lên sự tạo rễ của cây gừng đen

Vật liệu: Các chồi đạt chiều cao 20 – 25 mm, có 3 – 4 lá được thu từ thí nghiệm 1 Tiến hành: Cấy các chồi này trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2 tuần trước khi bố trí thí nghiệm 2 Sau đó tiến hành cắt bỏ rễ và cấy vào môi trường MS có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau

Chỉ tiêu theo dõi :

- Thời gian xuất hiện rễ (ngày)

 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các loại giá thể lên sự sinh trưởng của cây

gừng đen in vitro ở giai đoạn vườn ươm

Mục đích: Xác định loại giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng của cây gừng đen sau

in vitro

Vật liệu: Cây con gừng đen in vitro được chọn thuần dưỡng có chiều cao trung bình

từ 60- 65 mm, có từ 2-3 lá và 5-7 rễ thu được từ thí nghiệm 2

Tiến hành: Cây con gừng đen in vitro với rễ đã hình thành trong môi trường nuôi cấy

được chuyển ra trồng trong nhà lưới Trước khi ươm ra giá thể, cần tiến hành huấn

23

luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài bằng cách chuyển bình

cây gừng đen in vitro xuống nhà lưới và giữ cây trong bình khoảng 7 ngày để cây

thích nghi với môi trường tự nhiên bên ngoài Sau đó, lấy cây ra khỏi môi trường, rửa sạch agar, tiếp đó trồng cây vào các ly nhựa bên trong chứa các loại giá thể trồng bao gồm: đất, mụn dừa, tro trấu ở các tỷ lệ khác nhau Mỗi ly trồng 1 cây

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố với 4 nghiệm thức, 5 lần lập lại, mỗi lần lập lại là 5 cây Mỗi nghiệm thức theo dõi 25 cây Tổng số đơn vị thí nghiệm là 20 Các nghiệm thức bao gồm:

1/ Đất + tro trấu (1:1)

2/ Đất + tro trấu + mụn dừa (1:1: 1)

3/ Mụn dừa + đất (1:1)

4/ Mụn dừa + tro trấu (1:1)

Điều kiện trồng trong nhà lưới: Các giá thể ươm được che mát bằng lưới đen giảm ánh sáng, tránh nắng mưa trực tiếp Giữ ẩm thường xuyên bằng cách tưới phun sương 2 - 3 lần/ngày tuỳ theo điều kiện thời tiết Giảm tối đa sự bốc hơi nước trên bề mặt lá bằng các vật liệu che chắn là lưới đen ở tuần đầu tiên khi ươm Nhiệt độ trồng trong giai đoạn vườn ươm không quá 32 0C

Chỉ tiêu theo dõi: Tổng số cây sống

- Tỷ lệ cây sống (%) = x 100%

Tổng số cây đưa ra ngoài vườn ươm

- Chiều cao cây gia tăng (cm): Chiều cao về sau – chiều cao ban đầu

- Số lá/cây gia tăng (lá/cây): Số lá về sau – số lá ban đầu

- Đặc điểm của cây con

Thời gian lấy chỉ tiêu: 4 tuần sau khi trồng

3.3 CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU

Phòng nuôi cấy mô có trang bị máy điều hoà nhiệt độ 24  2 0C, đèn neon (thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày), tủ cấy vô trùng, cân điện tử, nồi thanh trùng (Autoclave), máy đo pH, tủ sấy, Ngoài ra còn có các trang thiết bị và dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô

Các hóa chất thí nghiệm bao gồm: các chất khử trùng mẫu cấy (Ca(OCl)2, cồn) và hóa chất được sử dụng trong môi trường nuôi cấy bao gồm: khoáng đa lượng - vi lượng (MS) (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung vitamin như Thiamin, pyridoxin,

3.4 TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Nông Nghiệp & TNTN, Trường Đại học An Giang, từ tháng 11-2015 đến tháng 11-2016 Các nội dung và công việc thực hiện được cụ thể ở Bảng 4 như sau:

Bảng 4: Tiến trình nghiên cứu đề tài

Người thực hiện

Theo dõi và lấy chỉ tiêu các thí nghiệm

Tháng 12/2015 đến tháng 5/2016

Tháng 6 /2016 đến tháng 7/2016