Sưu tầm tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi trồng hai loài nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại ở vùng thất sơn an giang

Vì vậy, việc tìm ki m, thu thập, nghiên cứu ặ iểm sinh học và quy trình nuôi trồng của một số loài nấm hoang dại có giá trị dinh dưỡng và dược liệu là cần thi t ể ti n tới việc thuần hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Mã ngành: 94 20 2001

Cần Thơ 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Mã ngành: 62 42 02 01

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS TRẦN NH N NG

TS I THỊ INH IỆU

Cần Thơ 2017

TRANG XÁC NHẬN CỦ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Luận án “Sưu tầm, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi trồng hai

loài nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại ở vùng Thất Sơn, An Giang” do nghiên cứu sinh Hồ Thị Thu Ba thực hiện theo sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Nh n ng và TS i Thị Minh iệu

Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án

LỜI CẢM TẠ

Đầu ti n, xin h n thành m ơn Viện Nghi n ứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Họ , Khoa Sau Đại Họ và an Gi m Hiệu Trư ng Đại họ ần Thơ tạo i u kiện dễ dàng, thuận tiện ho h ng t i họ tập

Xin chân thành c m ơn thầy PGS.TS Trần Nh n ng tận tình chỉ dẫn trong suốt th i gian thực hiện luận án

Xin ồng k nh gởi l i h n thành m ơn n qu thầy PGS.TS Phạm Thành Hổ GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt hướng dẫn tận tình truy n ạt ki n thức cần thi t và kinh nghiệm qu u ho t i hoàn thành luận n này

Xin trân trọng c m ơn qu thầy cô PGS.TS Nguyễn Minh hơn, PGS.TS Nguyễn Văn Thành, TS i Thị Minh Diệu, PGS TS Trương Trọng Ngôn, PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp ung ấp cho tôi những ki n thức quý báo trong suốt khóa học

Nh n y t i ng xin gửi l i bi t ơn n quý thầy trư ng Đại Học An Giang tạo i u kiện ể t i hoàn thành hương trình này

Xin c m ơn em Nguyễn Thị Thanh Giang, em Trương Trần Thuận, em Trương Ngọ Điệp và em sinh vi n gi p ỡ và ộng viên tôi trong suốt quá trình học tập

Xin chân thành c m ơn anh Nguyễn Văn ình, Hai (Vồ Đ ựng), anh Ẩn, … và rất nhi u bà con ở Núi Cấm, N i ài hỗ trợ gi p ỡ và ưu mang thầy trò chúng tôi trong suốt th i gian tìm ki m những loài nấm mới Đặc biệt ng xin m ơn an qu n lý Núi Cấm miễn phí hoàn toàn vé vào cổng cho thầy trò chúng tôi suốt bốn năm qua

Xin trân trọng c m ơn tất c

Cần Thơ, ngày 14 tháng 12 năm 2017

ii

TÓM TẮT

Luận n “Sưu tầm, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi trồng hai loài nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại ở vùng Thất Sơn, An Giang” ược thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình tối ưu nu i trồng một loài nấm ăn

và một loài nấm dược liệu mới Luận n ược hoàn thành với bốn nội dung Nội dung thứ nhất là thu thập ược 28 mẫu nấm hoang dại từ tự nhi n trong ó

có 5 mẫu nấm ăn, 7 mẫu nấm dược liệu, 5 mẫu nấm ộc và 11 mẫu hưa x ịnh Dựa theo k t qu i u tra và kh o sát từ ngư i d n ịa phương, ồng

th i dựa theo ặ iểm hình th i và trình tự gen Internal Trans ri ed Spa er,

loài nấm ượ x ịnh là nấm Thượng Hoàng (Phellinus sp.), linh chi tầng (Ganoderma applanatum), nấm vân chi (Trametes sp.), nấm dai (Lentinus

squarrosolus) Nội dung thứ hai là x ịnh ộc tính cấp c năm mẫu nấm u

kh ng g y ộc tính cấp trên chuột, ti n hành ph n lập ược bốn loài là thượng hoàng, linh chi tầng, nấm dai và nấm vân chi Nội dung ti p theo là x ịnh thành phần dinh dưỡng và dược tính của bốn loài nấm ược chọn ở trên K t

qu cho thấy hai loài nấm là nấm Thượng Hoàng Phellinus sp và nấm dai

Lentinus squarrosolus có giá trị dinh dưỡng và dượ t nh ao, do ó hai loài

nấm này ược chọn ể ti p tục các nghiên cứu sau X ịnh ộc tính bán trư ng diễn nấm Thượng Hoàng trên chuột, k t qu chuột hoàn toàn bình thư ng trong th i gian thử nghiệm Ti p tục thử tác dụng của nấm Thượng Hoàng trên dòng t ào ung thư m u K562 và ung thư ại trực tràng HCT116

ơ h apoptosis ược kích hoạt, t bào ung thư kh ng gia tăng và gi m ng

kể khi gia tăng nồng ộ Nội dung cuối cùng là nghiên cứu quy trình nuôi

trồng nấm ăn là nấm dai Lentinus squarrosolus và nấm dược liệu là nấm Thượng Hoàng Phellinus sp Quy trình nuôi trồng nấm dai Lentinus

squarrosolus: Môi trư ng nhân giống cấp một tốt nhất với 6 ngày gồm PDA

bổ sung nước dừa, m i trư ng nhân giống cấp hai gồm lúa bổ sung 5% cám ược chọn với th i gian 12 ngày và m i trư ng nuôi trồng ược chọn là 90%

m n ưa y ao su ổ sung 5% cám và 5% bột bắp với 70 ngày ăn trắng bịch

và ra thể qu sau 28 ngày Đối với quy trình nuôi trồng nấm Thượng Hoàng

Phellinus sp m i trư ng nhân giống cấp một tốt nhất với 6 ngày là PDA, môi

trư ng nhân giống cấp hai gồm lúa bổ sung 5% m ược chọn với th i gian

12 ngày và môi trư ng nuôi trồng ược chọn là 90% m n ưa y ao su ổ sung 5% cám và 5% bột bắp với 50 ngày ăn trắng bịch và nấm ra thể qu sau

70 ngày

Từ khóa: Nấm hoang dại v ng Thất Sơn, nấm thượng hoàng, nấm linh

hi tầng, nấm dai, nấm v n hi

ABSTRACT

The dissertation, entitled “Collecting, selecting and the studying the cultivation of a wild edible mushroom and a wild medicinal mushroom in the That Son region, An Giang provin e“ was ondu ted establish the optimal procedure for cultivation of a wild edible mushroom and a wild medicinal mushroom There were four main research contents The first content was that twenty-eight wild mushroom samples were collected, whereas there were five edible mushrooms, seven medicinal mushrooms, five poisonous mushrooms and eleven unidentified mushrooms Based on the results of surveys, questionares, and morphological and Internal Transcribed Spacer sequences characteristics, five mushrooms were identified as Linh Chi Tang mushroom

(Ganoderma applanatum), Van Chi mushroom (Trametes sp.), Thuong Hoang mushroom (Phellinus sp.), Dai mushroom (Lentinus squarrosolus) and Moc

Ba Hue mushroom The second research content was evaluating acute toxicity of the selected mushrooms, and the results showed that all 5 wild mushroom species were not toxic to tested mice Subsequently, all 5 wild mushrooms were isolated using PDA medium, and only four mushrooms consisting of Linh Chi Tang mushroom, Van Chi mushroom, Thuong Hoang mushroom, Dai mushroom were successfully isolated The third research content related to determination of nutrient contents and pharmaceutical

activity of the selected mushrooms As a result, Phellinus sp and Lentinus

squarrosolus were selected for further experiments The sub-chronic toxicity

was also evaluated on mice, and the tested mice had no effects The activity of Thuong Hoang mushroom was examined using K562 blood cancer cells and HCT116 colorectal cancer cells The cancer cells reduced when the

concentrations of sample were increased The final content focused on the cultivation of Phellinus sp and Lentinus squarrosolus For the Lentinus

squarrosolus mushroom, the best medium for the first propagation was PDA

added coconut milk with 6 days growth in vitro; the best medium for the

second propagation was intact rice + 5% rice bran with 12 days developing in the culture bottle; and the optimal medium for fruit body development with high yield was 90% rubber sawdust + 5% rice bran + 5% corn flour with 70 days full development and 28 days for harvesting of fruit bodies For the

Phellinus sp mushroom, the best medium for the first propagation was PDA

with 6 days growth in vitro; the best medium for the second propagation was

intact rice + 5% rice bran with 12 days in the culture bottle; and the optimal medium for fruit body development with high yield was 90% rubber sawdust + 5% rice bran + 5% corn flour with 50 days for full development and 70 days for harvesting of fruit bodies

Key words: wild mushroom in the That Son region, Phellinus sp.,

Trametes sp., Ganoderma applanatum and Lentinus squarrosolus

iv

CAM KẾT KẾT QUẢ

T i xin am oan y là ng trình nghi n ứu của b n thân và thầy hướng dẫn Các số liệu, k t qu trình bày trong luận n là trung thự và hưa ược ai công bố trong bất kỳ luận n nào trướ y

Tác gi luận án

Hồ Thị Thu Ba

MỤC LỤC

ỤC ỤC v

NH S CH ẢNG viii

NH S CH H NH x

DANH MỤC C C TỪ VIẾT TẮT xii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1 1 Đ t vấn ề 1

1 2 c ti u v n i dung nghi n cứu 1

1 2 1 Mụ ti u ……… ……… ……… … 1

1 2 2 Nội dung nghi n ứu ……… …… 2

1 3 Đ i tư ng v ph m vi nghi n cứu 2

1 3 1 Đối tượng nghi n ứu ……… ………… 2

1 3 2 Phạm vi nghi n ứu ……… 2

1.4 Những óng góp mới ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QU N TÀI IỆU 3

2 1 h i qu t về nấm trồng 3

2 1 1 Nấm và sinh họ nấm lớn ……… ……… ………… 3

2 1 2 Gi trị dinh dưỡng và y dượ ủa nấm trồng … ……… …… 5

2.1.3 Nấm ăn và sự phát triển n ng nghiệp n vững ……… … 7

2 2 Sự ph t triển nghề trồng nấm 8

2.2.1 Lịch sử phát triển ngh trồng nấm ăn và nấm dược liệu ……… 8

2.2.2 Sự phát triển ngh trồng nấm trên th giới ……… 9

2.2.3 Sự phát triển ngh trồng nấm ở Việt Nam ……… 12

2 3 C ng nghệ trồng nấm 13

2 3 1 Sơ ồ kh i qu t quy trình trồng nấm… … ……… 13

2 3 2 Meo giống nấm ……… ………… 14

2 3 3 h i n nguy n liệu thành ơ hất trồng nấm …… ……… 14

2 3 4 Gieo meo và ủ lan tơ ……… ……… 15

2 3 5 hăm só ( y u tố m i trư ng và thu h i ……… ……… 16

2 4 Định danh nấm ăn v nấm dư c liệu 17

2 5 C c phương ph p x c ịnh ho t tính gây c tế b o v cơ chế tác

ng kh ng ung thư của m t s loài nấm dư c liệu

vi

2.6 Các nghiên cứu có li n quan 20

2.6.1 Các nghiên cứu v khu hệ nấm ở Việt Nam ……… 20

2.6.2 Các nghiên cứu v nấm ăn và nấm dược liệu ở Việt Nam ………… 22

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PH P NGHI N CỨU 24

3 1 Phương tiện nghi n cứu 24

3.1.1 Th i gian và ịa iểm ……… … 24

3 1 2 Nguy n vật liệu ……… ………… …… 24

3 1 3 Hóa hất ……… 24

3 1 4 Thi t ị và dụng ụ ……… ……… ………… 24

3 2 Phương ph p nghi n cứu 25

3 2 1 Nội dung 1: Sưu tập một số loài nấm lớn ở vùng rừng núi Thất Sơn AG, i u tra kh o s t ngư i d n ịa phương tìm ra loài nấm sử dụng ượ , ịnh danh các loài nấm này ……… 25

3 2 2 Nội dung 2: X ịnh ộc tính cấp, phân lập và gi i trình tự gen các loài nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại không chứa ộ t nh ……… 26

3 2 3 Nội dung 3: X ịnh thành phần dinh dưỡng, dượ t nh, ộc tính n trư ng diễn và thử t ộng của nấm trên dòng t ào ung thư m u và ung thư ại trự tràng ……… … … 30

3 2 4 Nội dung 4: Nghi n ứu quy trình ng nghệ nu i trồng hoàn hỉnh hai chủng nấm ược tuyển chọn ……… …… …… 40

CHƯƠNG 4 ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4 1 N i dung 1 Sưu tập m t s lo i nấm lớn ở vùng rừng núi Thất Sơn n Giang iều tra khảo s t người dân ịa phương tìm ra c c loài nấm sử d ng ư c ịnh danh các loài nấm này 45

4.1.1 Thu thập mẫu nấm lớn ……… ……… 45

4 1 2 Đi u tra kh o sát các mẫu nấm ược chọn ………… ……… 50

4 1 3 Định danh các loài nấm ược chọn theo hình th i ……… 51

4.2 N i dung 2 X c ịnh c tính cấp, phân lập và giải trình tự gen các loài nấm ăn v nấm dư c liệu hoang d i không chứa c tính 55

4.2 1 X ịnh ộc tính cấp các mẫu nấm ược chọn từ ngư i d n ịa phương ……… 55

4.2.2 Phân lập các loài nấm ược chọn lọc ở tr n ……… 60

4.2.3 Gi i trình tự ITS x ịnh loài dựa vào ặ iểm hình thái và trình tự ITS ………

63

4.3 N i dung 3 X c ịnh thành phần dinh dưỡng dư c tính c tính

b n trường diễn và thử t c ng của nấm trên dòng tế b o ung thư

m u v ung thư i trực tr ng 65

4 3 1 X ịnh thành phần dinh dưỡng và dượ t nh n trư ng diễn … 65

4 3 2 X ịnh thành phần dược tính trong hai mẫu nấm linh chi tầng và thượng hoàng ……… 66

4 3 3 X ịnh ộ t nh n trư ng diễn nấm Thượng Hoàng ……… 69

4 3 4 X ịnh kh năng t dụng với t ào ung thư ủa nấm Thượng Hoàng Phellinus sp ……… ……… 79

4 4 N i dung 4 Nghi n cứu quy trình c ng nghệ nu i trồng ho n chỉnh hai chủng nấm ã ư c tuyển chọn 83

4.4.1 Nghiên cứu quy trình nuôi trồng nấm dai Lentinus squarosolus…… 83

4.4.2 Nghiên cứu quy trình nuôi trồng nấm Thượng Hoàng Phellinus sp 92

CHƯƠNG 5 ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 103

5.1 Kết luận 103

5.2 Kiến nghị 103

TÀI LIỆU THAM KHẢO 105

PHỤ LỤC 117

viii

DANH SÁCH BẢNG

2.1 Lịch sử nuôi trồng một số loài nấm ……… … 8

2.2 Tổng s n lượng nấm trồng trên th giới từ năm 1960 n 2002 … 9

2.3 S n lượng nấm trồng phổ bi n trên th giới năm 1981 n 1997 … 10 2.4 S n lượng nấm (tấn thu ượ vào năm 2003 và 2004 ……… … 11

3.1 B ng kh o sát thông tin nấm lớn từ ngư i d n ịa phương …… … 26

3.2 Khối lượng nấm tươi và nấm kh sấy 60o qua m ……… … 27

3.3 Khối lượng cao nấm sau khi chi t ……… … 27

3.4 Thành phần một ph n ứng PCR thể t h 25 µl ……… … 29

3 5 Quy trình ịnh lượng GOT trong m u ……… … 34

3 6 Quy trình ịnh lượng GPT trong m u ……… … 35

3 7 Quy trình ịnh lượng Protein trong m u ……… … 35

3 8 Quy trình ịnh lượng reatinin trong m u ……… 36

3 9 Quy trình ịnh lượng urea trong m u ……… 37

3 10 Quy trình ịnh lượng trygly eride trong m u ……… 38

4.1 B ng phân loại các loài nấm hoang dại thu thập ượ ………… 45

4.2 Kh o sát thông tin nấm lớn từ ngư i d n ịa phương ………… … 51

4.3 K t qu ộc tính cấp trong ao nước và cao cồn nấm linh chi tầng… 55 4.4 K t qu ộc tính cấp trong ao nước và cao cồn nấm thượng hoàng …

56 4.5 K t qu ộc tính cấp trong ao nước và cao cồn nấm v n hi … 57

4.6 K t qu ộc tính cấp trong ao nước và cao cồn nấm dai………… 57

4.7 K t qu ộc tính cấp trong ao nước và cao cồn nấm mộ hu … 58 4.8 B ng tổng hợp li u tối a ho huột uống các loại nấm ……… 58

4.9 K t qu nh gi hành vi huột sau 1 ngày uống các loại cao nấm 58

4.10 Tố ộ sinh trưởng của các loài nấm tr n m i trư ng P A ……… 60

4.11 Thành phần dinh dưỡng và dược tính của các loài nấm ………… 65

4 12 Hàm lượng triterpen toàn phần trong nấm linh chi tầng và thượng hoàng ……… 67

4 13 Hàm lượng polysacharide trong nấm linh chi tầng và thượng

hoàng

67

4 14 Hàm lượng ư ng tự do trong nấm linh chi tầng và thượng hoàng 68

4 15 Hàm lượng ư ng khử trong nấm linh chi tầng và thượng hoàng 68

4.16 Trọng lượng chuột trước và sau khi thử cao nấm một th ng …… 69

4.17 Số lượng hồng cầu ……… 69

4 18 Hàm lượng hemoglo in ……… 70

4 19 Hàm lượng hemato rit ……… 70

4.20 Số lượng tiểu cầu ……… 71

4.21 Thể tích trung bình hồng cầu ……… 71

4.22 Huy t sắc tố trung bình hồng cầu ……… 72

4.23 Nồng ộ huy t sắc tố trung bình hồng cầu ……… 72

4.24 Tỷ lệ phân bố hồng cầu ……… 73

4.25 Số lượng bạch cầu ……… 73

4.26 Số lượng bạch cầu hạt trung t nh ……… 74

4.27 Số lượng bạch cầu lympho ……… 74

4.28 Số lượng bạch cầu ơn nh n ……… 74

4 29 Hàm lượng GOT trong huy t tương ……… 75

4 30 Hàm lượng GPT trong huy t tương ……… 75

4 31 Hàm lượng protein toàn phần trong huy t tương ………… …… 76

4 32 Hàm lượng triglyceride trong huy t tương ……… 76

4 33 Hàm lượng creatinin trong huy t tương ……… ………… 77

4 34 Hàm lượng urea trong huy t tương ……… ……… 77

4.35 K t qu gi i phẩu vi thể gan chuột sau 1 tháng thử nghiệm ……… 78

4.36 K t qu gi i phẩu vi thể thận chuột sau 1 tháng thử nghiệm … … 78

4.37 Tố ộ lan tơ nấm dai trên môi trư ng nhân giống cấp một …… 83

4 38 Tơ nấm dai lan 50% và 100% tr n m i trư ng hạt……… 87

4 39 Tơ nấm nấm dai lan 50% và 100% tr n m i trư ng nuôi trồng… 89 4.40 Tố ộ lan tơ nấm Thượng Hoàng tr n m i trư ng nhân giống cấp một ……… 92

4 41 Tơ nấm Thượng Hoàng lan 50% và 100% tr n m i trư ng hạt……

95 4 42 Tơ nấm nấm Thượng Hoàng lan 50% và 100% tr n m i trư ng nuôi trồng……… 98

x

DANH SÁCH HÌNH

2.1 Nấm hương ……… ……… … 4

2.2 Nấm rơm ……… 4

2.3Nấm rơm lụa bạ ……… … 4

2 4 Sơ ồ tổng quát quy trình nuôi trồng các loài nấm ăn ……… … 13

2.5 Vùng trình tự ITS trong NA Ri osome ……… 18

3.1 Chu trình nhiệt của ph n ứng PCR với cặp mồi ITS 1 và ITS 4 … 30

3.2 Sơ ồ bố trí các nghiệm thứ khi x ịnh kh năng kh ng ung thư của dịch cao chi t nấm Thượng Hoàng tr n ĩa 96 gi ng……… 39

4.1 Bào tử và nấm linh chi tầng ……… 59

4.2 Nấm v n hi ……… 60

4.3 Nấm Thượng Hoàng và bào tử ……… 61

4.4 Nấm dai và bào tử ……… 62

4.5 Nấm mộ hu ……… 62

4.6 Biểu ồ sinh trưởng hệ sợi nấm nghiên cứu tr n m i trư ng PDA 69

4.7 Hệ sợi nấm nghiên cứu tr n m i trư ng PDA ngày thứ 7 ………… 70

4.8 Đ p ứng dòng t ào K562 ối với cao chi t của Phellinus sp … 79

4.9 Đ p ứng dòng t ào H T 116 ối với cao chi t của Phellinus sp 81

4.10 Biểu ồ mứ ộ ức ch tăng trưởng của cao chi t nấm Thượng Hoàng lên t bào HTC116 ……… 82

4.11 Biểu ồ tố ộ lan tơ nấm dai tr n m i trư ng nhân giống cấp một 84 4.12 Nấm dai lan tơ sau 3 ngày tr n m i trư ng nhân giống cấp một 84

4.13 Nấm dai lan tơ sau 5 ngày tr n m i trư ng nhân giống cấp một … 85 4.14 Nấm dai lan tơ sau 7 ngày tr n m i trư ng nhân giống cấp một … 86 4.15 Biểu ồ tố ộ lan tơ nấm dai tr n m i trư ng hạt ……… 88

4.16 Tơ nấm dai sau 14 ngày tr n m i trư ng hạt ……… 88

4.17 Biểu ồ tố ộ lan tơ nấm dai tr n m i trư ng nuôi trồng ……… 90

4.18 Tơ nấm dai sau 50 ngày tr n m i trư ng nuôi trồng …… ……… 90

4.19 Quy trình nuôi trồng nấm dai Lentinus squarrosolus ……… 91

4.20 Biểu ồ tố ộ lan tơ nấm Thượng Hoàng tr n m i trư ng nhân giống cấp một ……… 92

4.21 Tơ nấm Thượng Hoàng tr n m i trư ng thạ h sau 3 ngày ……… 92 4.22 Tơ nấm Thượng Hoàng tr n m i trư ng thạ h sau 5 ngày ……… 93 4.23 Tơ nấm Thượng Hoàng tr n m i trư ng thạ h sau 7 ngày ……… 93 4.24 Biểu ồ tố ộ lan tơ nấm Thượng Hoàng tr n m i trư ng hạt … 95 4.25 Tơ nấm Thượng Hoàng sau 6 ngày tr n m i trư ng hạt ………… 96 4.26 Tơ nấm Thượng Hoàng sau 11 ngày tr n m i trư ng hạt ……… 96 4.27 Biểu ồ tố ộ lan tơ nấm Thượng Hoàng tr n m i trư ng nuôi

4.28 Tơ nấm Thượng Hoàng sau 6 ngày tr n m i trư ng nuôi trồng … 99 4.29 Tơ nấm Thượng Hoàng sau 9 ngày tr n m i trư ng nuôi trồng … 100 4.30 Quy trình nuôi trồng nấm Thượng Hoàng ……… 102

xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ALT Alanin Transaminase

AST Aspartat Transaminase

GOT Glutamat Oxalate Transaminase

GPT Glutamat Pyruvat Transaminase

ND Nấm dai

NT Nấm Thượng Hoàng

DNA Deoxyribonucleic Acid

DNS Dinitro Salicylic

ETS External Transcribed Spacer

ITS Internal Transcribed Spacer

KDD M n ưa kh ng ổ sung dinh dưỡng

MCH Huy t sắc tố trung bình hồng cầu

MCHC Nồng ộ huy t sắc tố trung bình hồng cầu

MCV Thể tích trung bình hồng cầu

MS Mã số

NCBI The Nationnal Center for Biotechnology Information

NT Nghiệm thức

PCR Polymerase chain reaction

PDA Potato – Dextrose - Agar

PDD Potato – Glucose – Agar - nước dừa

PDK Potato – Glucose – Agar - khoáng

ppm parts per million

RDW Tỉ lệ phân bố hồng cầu

RNA Ribonucleic Acid

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đ t vấn ề

Trong loài vi sinh vật ó h ượ sử dụng nhi u nhất, gần g i với

on ngư i hơn ph i kể n nấm Nấm là một loài sinh vật nh n thật kh ng

ó hất diệp lụ , sống dị dưỡng Trong hệ thống ph n loại năm giới nấm x p hàng thứ a, ngang với thự vật và ộng vật (Trần Văn M o, 2004

Trồng nấm có lịch sử l u i Trên th giới, từ những năm 1960 n nay ngh trồng nấm ăn và nấm dược liệu ph t triển mạnh và nhanh một cách

toàn diện v nhi u mặt Ở Việt Nam, ngh trồng nấm ng ược phát triển liên

tục từ những năm 1980 với nhi u loài nấm mới ược du nhập Công nghệ s n xuất giống nuôi trồng và ch bi n nấm hiện nay ược du nhập từ Nhật B n, Đài Loan và nước Châu Âu Trong quá trình nghiên cứu và triển khai s n xuất ó sự thay ổi ể phù hợp với i u kiện tự nhiên, xã hội của Việt Nam

(Nguyễn Hữu Đống và ctv, 2000)

Việt Nam là một nước nông nghiệp, ồng th i có nhi u i u kiện cho việc phát triển ngh trồng nấm, ặc biệt là các tỉnh phía Nam Với y u tố nguyên liệu, lao ộng dồi dào và th i ti t, khí hậu gần như ổn ịnh quanh năm, nấm có thể ược cung cấp suốt bốn mùa (Trung tâm Unesco phổ bi n ki n thứ văn hóa giáo dục cộng ồng, 2004)

Việt Nam là ất nước nhi u rừng núi với nguồn tài nguyên sinh họ a dạng Đặc biệt vào m a mưa ó rất nhi u loại nấm ăn phát triển Tuy nhiên, việc khai thác và thuần hóa các giống nấm hoang dại ngoài thiên nhiên của vùng rừng n i nướ ta hưa ược chú trọng Đồng Bằng Sông Cửu Long ược thi n nhi n ưu i ó v ng rừng núi Thất Sơn, kh hậu mát mẻ quanh năm với rất nhi u loại nấm ăn và nấm dược liệu có giá trị nhưng hưa ược nghiên cứu nuôi trồng Đứng trước việc thay ổi khí hậu toàn cầu việc b o tồn nguồn tài nguyên quý giá này là việc cần ph i làm ngay Vì vậy, việc tìm ki m, thu thập, nghiên cứu ặ iểm sinh học và quy trình nuôi trồng của một số loài nấm hoang dại có giá trị dinh dưỡng và dược liệu là cần thi t ể ti n tới việc thuần hóa và s n xuất các giống nấm mới nhằm tiêu thụ trong nước và xuất khẩu, óng góp vào kinh t của ịa phương Xuất phát từ những lý do trên, luận án

“Sưu tầm, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi trồng hai loài nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại ở vùng Thất Sơn, An Giang” ược thực hiện

1.2 M c tiêu và n i dung nghiên cứu

1.2.1 M c tiêu

Đưa vào nu i trồng một loài nấm ăn và một loài nấm dược liệu thu thập hoang dại ở v ng Thất Sơn, An Giang

1.2.2 N i dung nghiên cứu

Nghiên cứu ược thực hiện với 4 nội dung chính:

(1) Nội dung 1: Sưu tầm một số loài nấm lớn ở vùng Thất Sơn An Giang, i u tra mẫu nấm có thể sử dụng từ ngư i d n ịa phương, ịnh danh mẫu nấm ược chọn dựa trên hình thái bên ngoài

(2) Nội dung 2: X ịnh ộc tính cấp, phân lập giữ giống nấm trên môi trư ng P A, ịnh danh phân tử các loài nấm không chứa ộc tính

(3) Nội dung 3: X ịnh thành phần dinh dưỡng, dược tính các loài nấm hoang dại có giá trị X ịnh một số thành phần dược tính quan trọng trong hai loài nấm dược liệu, ph n t h ộ t nh n trư ng diễn và thử tác dụng nấm trên t ào ung thư m u và ung thư ại trự tràng ối với nấm dược liệu hoang dại mới

(4) Nội dung 4: Nghiên cứu quy trình công nghệ nu i trồng hoàn hỉnh hai loài nấm ược chọn

1.4 Những óng góp mới ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Luận án mang tính mới là nghiên cứu v hai loài nấm hoang dại hiện

diện ở ịa phương là nấm dai Lentinus Squarosolus và nấm Thượng Hoàng

Phellinus sp Trong ó nấm dai là loài nấm ăn hoàn toàn mới ược nhân giống

nuôi trồng thành công từ loài nấm hoang dại ngoài thi n nhi n i u này hướng

n việc từng ước xây dựng thương hiệu nấm ăn thuần chủng Việt Nam Luận n ng nu i trồng thành công nấm Thượng Hoàng là loài nấm dược liệu

có giá trị ao kh ng g y ộ t nh n trư ng diễn trên chuột thử nghiệm Đi u này mang nghĩa khoa học to lớn và mang nghĩa ao ho ộng ồng, vì y

là loài nấm hoang dại lần ầu ti n ược thu thập, phân lập và nghiên cứu Đặc biệt nấm Thượng Hoàng có kh năng g y ơ h ti n phân hủy t bào trên dòng t ào ung thư ại trự tràng Đi u này hứa hẹn một nghĩa to lớn trong việ hỗ trợ i u trị bệnh ung thư nói hung và ệnh ung thư ại trực tràng nói riêng

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Giới nấm gồm những sinh vật nhân thự , ơn ào hoặ a ào, ấu trúc dạng sợi, phần lớn thành t bào chứa kitin, không có lục lạp, không có lông và roi Nấm có hình thức sinh s n hữu tính và vô tính nh bào tử Nấm là sinh vật

dị dưỡng, sinh dưỡng bằng hấp thụ các chất qua b mặt t bào, khác với thực

vật là tự dưỡng và ộng vật là nội tiêu hoá qua ống tiêu hoá Nấm lớn theo

nghĩa hẹp, mà mọi ngư i dễ nhận thấy ngoài thi n nhi n hay ược nuôi trồng,

ti ng Anh là mushroom Trên th giới, mushroom có thể ược hiểu khác nhau

t y ất nước và dân tộc Hiện nay, có thể tạm chấp nhận một ịnh nghĩa :

“nấm lớn theo nghĩa hẹp là nấm lớn với qu thể phân biệt rõ, có thể mọc trên mặt ất hay dưới mặt ất và ủ to ể thấy ược bằng mắt thư ng và thu hái

bằng tay” ( hang and Miles, 2004)

2 1 1 2 Đ c iểm sinh học

Hình thái: Nấm lớn có cấu tạo ăn n gồm hai phần: hệ sợi tơ nấm và

qu thể Phần nhi u qu thể các nấm lớn rất a dạng: hình dù với m nấm và

cuống nấm (hình 2.1), có bao ngoài (hình 2.2), giống vỏ sò như nấm sò, hình

cúp uốn nhăn, dạng cầu, dùi cui nhỏ (hình 2.3), dạng giống lỗ tai như nấm tai mèo Trên thực t , khó mà kể h t các hình dạng của các nấm lớn Màu sắc của nấm lớn ng rất khác nhau: trắng, x m, vàng, n u ỏ, en, t m,… ấu trúc mà ngư i ình thư ng gọi nấm, thực chất là qu thể hay tai nấm của loài nấm Phần sinh dưỡng của loài nấm, ược gọi là hệ sợi tơ nấm, bao gồm một hệ các sợi mãnh nhỏ dài như sợi chỉ mọ lan ra ất, compost, khúc gỗ hay ơ hất trồng nấm Sau một th i gian tăng trưởng và dưới những i u kiện thuận lợi,

hệ sợi tơ nấm trưởng thành có thể s n sinh ra qu thể là tai nấm (Nguyễn Thị

Chính và ctv, 2005)

Sinh lý, sinh hóa: Nhóm nấm lớn ặc biệt này òi hỏi các nguồn dinh

dưỡng dồi dào hơn và i u kiện m i trư ng (nhiệt ộ, ẩm ộ, thông khí,

pH, ánh sáng, ) phức tạp hơn ể hình thành qu thể, so với việc tạo các bào tử

vô tính ở vi nấm Nguồn dinh dưỡng chủ y u cho nấm lớn là các chất xơ lignocellulose của thực vật Đi u ặc biệt là các nấm lớn, giống các loài nấm khác nói chung, có thể ti t ra các enzyme mạnh (như ellulase, ligninase, , phân rã các vật liệu lignocellulose thành các chất dinh dưỡng dễ hấp thu Nguồn ar on và nitrogen trong ơ hất ó nghĩa quan trọng thư ng nh giá qua tỷ lệ C/N

Hình 2.1: Nấm hương

(hình dù)

Hình 2.2: Nấm rơm (có bao ngoài)

Hình 2.3: Nấm rơm lụa bạc (dùi cui nhỏ)

(3) Nấm ộc như nấm Amanita phalloides

(4) Nhóm nấm hỗn hợp hay “ nấm kh ” số lượng lớn các nấm còn lại

hưa x ịnh rõ ược giá trị sử dụng

Kiểu phân loại này chỉ có giá trị tương ối Nhi u loại nấm lớn tuy không

ăn ượ , nhưng ó gi trị tăng lực và y học (Chang and Miles, 2004)

2 1 1 3 Định danh các lo i nấm lớn

Để ịnh danh nấm lớn, cần dựa vào các khóa phân loại Tuy nhiên không

ph i loài nấm hoang nào c ng có trong khóa phân loại Mẫu nấm tươi vừa thu hái là tốt nhất ho ịnh danh và dựa vào khóa phân loại mà x ịnh theo các

ặc tính chủ y u sau:

(1 K h thước, màu sắ , ộ chắc của m và uống nấm

(2) Cách gắn các phi n vào cuống

(3) Màu bào tử có số lượng lớn

5

(4) Các thử nghiệm hóa học

Số lượng các loài nấm lớn i t ượ th ng o n năm 2000 là 14.000, chi m kho ng 10% tổng số các loài nấm lớn dự ki n ó tr n Tr i ất Trong số ó kho ng 2000 loài ược dùng làm thứ ăn, kho ng 200 loài

ượ d ng làm dược liệu ở vùng Viễn Đ ng Ri ng ở Trung Quố , ước tính có kho ng 1500–2000 loài nấm ăn và dược liệu với 981 loài ượ ịnh danh (Shu-Ting Chang, 2008) Cần bi t rằng, 1% các nấm lớn ghi nhận trên th giới

là nguy hiểm n u ăn, thậm chí một số g y ộc ch t ngư i Đ n năm 2002, 92 chủng loại nấm lớn ược thuần hóa, mà 60 trong số này ược nuôi trồng ể

bán ra thị trư ng (Mau et al., 2001)

2.1.2 Giá trị dinh dƣỡng v y dƣ c của nấm ăn

2.1.2.1 Giá trị dinh dƣỡng

Nấm ăn là một món ăn qu kh ng chỉ vì thơm ngon mà òn vì ó gi trị dinh dưỡng ao Độ ẩm cố ịnh của nấm tươi dao ộng trong kho ng 70–95%, còn nấm khô thì ở mức 10–13% Hàm lượng protein của nấm trồng ở mức từ 1,75 n 5,9% trọng lượng tươi, ó thể lấy giá trị trung ình hàm lượng protein ủa nấm trồng kho ng 3,5–4,0 trọng lượng tươi Hàm lượng protein

ủa ủ hành là 1,4% trọng lượng tươi, ắp i là 1,4% trọng lượng tươi Vậy protein ở nấm trồng gấp 2 lần củ hành và ắp i So s nh với hàm lượng protein ở thịt heo là 9–16%, ở thịt ò là 12–20%, thịt gà là 18–20%, ở là 18–20% và sữa là 2,9–3,3% trọng lượng tươi X t v trọng lượng khô, nấm ăn thư ng chứa 19–35% protein, so với 7,3% ở gạo, 12,7% ở lúa mì, 38,1% trong

ậu nành và 9,4% ở ngô Như vậy, tỷ lệ protein thô ở nấm ăn thấp hơn thịt ộng vật, nhưng ao hơn phần lớn thực phẩm khác, kể c sữa Hơn nữa,

protein của nấm ăn hứa ủ 9 loại acid amin không thay th (Chang and

Miles, 2004)

Nấm ăn hứa nhi u vitamin không kém ở thực vật, như vitamin 1 (thiamin), B2 (riboflavin), vitamin C, vitamin PP (niacin), vitamin D, ti n vitamin A (carotene), với lượng khá cao Trong 140 loài nấm ăn ược phân tích ở Nhật B n có tới 118 loài có chứa bình quân 0,126 mg vitamin B2/100 g nấm, 47 loài có chứa bình quân 1,229 mg vitamin B2/100 g nấm Vitamin B12 vốn không có trong thứ ăn thực vật nhưng lại có chứa khá nhi u trong nấm

Agaricus bisporus, A.campestris, Morchella spp… (Ng Anh, 2005 Nấm ăn

ng hứa khá nhi u các nguyên tố khoáng (K, Na, Ca, Fe, Al, Mg, Mn, Cu,

Zn, S, l, P, Si… với hàm lượng thư ng vào kho ng 7% trọng lượng khô Như vậy, nấm có nhi u vitamin và khoáng chất không kém rau qu (Chang

and Miles, 2004)

Trong những năm gần y, một hướng nghiên cứu mới là tìm cách xử lý

ơ hất trồng ể tăng gi trị Ví dụ, nấm giàu selenium có thể trồng bằng cách

bổ sung sodium selenite vào compost Ngoài giá trị dinh dưỡng cao, các loại

nấm ăn òn ó màu sắc, mùi vị ộ o và ặc tính k t cấu hấp dẫn ngư i

ăn ( hang and Miles, 2004)

2.1.2.2 Giá trị y dƣ c

Từ lâu, các tính chất y dược của nấm thu h t sự chú ý của các nhà nghiên cứu Trong số 14.000–15.000 nấm lớn trên th giới, kho ng 400 có các tính chất y dược bi t ượ , nhưng dự ki n kho ng 1800 loài có ti m năng v các tính chất y dược Nhi u công trình nghiên cứu và ài o n u tính chất y dược này của nấm, ví dụ như hiệu qu ối với áp huy t cao và thận, u bi n miễn dịch và các hoạt tính chống khối u của các phức hợp protein-polysaccharide polysaccharide–protein complex (PSPC) từ nuôi hệ sợi tơ nấm (Liu, 2007) và các hoạt tính chống khối u của các lectin từ nấm ăn

(Chang and Miles, 2004) Nhi u loại nấm trồng thể hiện các tác dụng y dược

như:

Nấm mỡ (Agaricus bisporus) có chứa hợp chất ức ch enzyme aromatas

làm tăng trưởng khối u, và ngăn ngừa ượ ung thư v (Nguyễn L n ng, 2002)

Nấm kim châm (Flammulina velutipes) có chứa Flammulin, có tác dụng

hiệu qu từ 80-100% tr n u ng (sar oma 180 và ung thư iểu bì Các nhà trồng nấm kim châm ở tỉnh Nagano có tỉ lệ ung thư rất thấp so với cộng ồng

(Nguyễn Thị Hồng Nụ và ctv, 2005)

Nấm hương (Lentinula edodes) từ l u ược coi có tác dụng làm tăng lực,

có chất Lentinan làm gi m cholesterol máu và phòng chống ung thư (Trịnh

Tam Kiệt, 2011) Polysaccharide khác trong nấm hương ng hống lại

sar oma 180 và ung thư iểu bì, chất aritadenin làm gi m cholesterol máu

(Nguyễn L n ng, 2002

Nấm rơm (Volvariella volvacea) có chứa chất có phân tử lượng kho ng

10kDa có tác dụng hạ huy t p, t ộng như serotonin (Nguyễn L n ng, 2002)

Nấm mèo (Auricularia spp.) có tác dụng hiệu qu từ 80-90% trên ung

thư iểu bì và sarcoma 180 Polysaccharide trong nấm mèo tan trong nước làm

gi m ư ng huy t của chuột tiểu ư ng do di truy n (Nguyễn L n ng, 2002)

Nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) có tác dụng chủ y u kích thích hệ

miễn dịch, phòng chống ung thư dạ dày, ung thư phổi di ăn Hợp chất

Erinacin trong nấm hầu thủ k h th h t i sinh trưởng neuron, có kh năng

i u trị não suy, bệnh Alzheimer, tăng tr nhớ, phục hồi chấn thương thần kinh

do ột quị (Nguyễn L n ng, 2002

2.1.2.3 Bổ sung dinh dƣỡng dƣ c vào khẩu phần ăn

7

Trong những năm gần y, nghi n ứu s u hơn v thành phần hóa

họ , ặ t nh dinh dưỡng và chứ năng ủa nấm, ph t hiện nhi u hợp chất hoạt tính sinh học có giá trị y dược Chúng có thể dùng làm các phụ gia

bổ sung cho thực phẩm chứa t nh n kh ng ung thư, kh ng virus, tăng

ti m lực miễn dịch, gi m cholesterol, và b o vệ gan Các chất mới này, ược gọi là dinh dưỡng dược nấm, tức là thức ăn ó t dụng phòng và trị bệnh (Chang, 1999) và nấm ăn là thực phẩm chứ năng hất dinh dưỡng dượ này ược chi t tách từ hệ sợi tơ nấm hoặc từ qu thể và là một cấu phần quan

trọng của công nghiệp công nghệ sinh học nấm ang mở rộng (Chang and

Miles, 2004) C qu thể và hệ sợi tơ nấm u s n sinh ra các chất y dược hoặ dinh dưỡng dượ tăng ư ng miễn dịch tổng quát, mà chủ y u là polysa haride, triterpene, protein i u bi n miễn dịch Mặc dù hầu như tất c các loài nấm và thực phẩm có polysaccharide trong vách t ào, nhưng một số chứa các polysaccharide cho hiệu qu ặc biệt trong làm chậm sự ti n triển khối u và nhi u bệnh khác, gi m bớt tác dụng phụ của phóng xạ và hóa trị liệu Nhi u nghiên cứu ở h u Á, ặc biệt ở Trung Quốc và Nhật B n, ghi nhận sự kéo dài cuộc sống của các bệnh nhân bị ung thư hịu các trị liệu nói trên kèm uống hay tiêm chi t suất nấm (Mizuno, 1995; Liu, 1999 theo Chang

and Miles, 2004) Ngoài ra, nh tăng ư ng hệ miễn dị h, hất hi t suất

nấm này òn giúp gi m bị nhiễm các bệnh khác

2.1.3 Nấm ăn v sự phát triển nông nghiệp bền vững

2.1.3.1 Sử d ng có hiệu quả sinh kh i lignocellulose

Hiện nay, dân số th giới hơn 6 tỉ, mà sẽ ti p tụ gia tăng trong th kỷ

21 này Hai thách thức lớn ặt ra cho nhân loại theo hai hướng ối ngược: Gia tăng nguồn thực phẩm với số lượng lớn hơn và hất lượng tốt hơn Gi m thiểu

ô nhiễm m i trư ng và các hậu qu của hiệu ứng nhà kính (Chang and Miles,

2004)

Tuy nhiên, th giới có khối lượng khổng lồ nguồn vật liệu lignocellulose

là b n vững, tương tự năng lượng mặt tr i Vật liệu lignocellulose ở dạng sinh khối, ước tính có khối lượng n 1,09 x 1011 tấn kh hàng năm tr n mặt ất

S n lượng rơm rạ ng ốc trên th giới trong năm 1999 ướ ạt 3570 x 106 tấn

kh , tương ương năng lượng mặt tr i cố ịnh trong sinh khối lignocellulose

là 3020 x 1018 Joule ( ơn vị năng lượng , mà on ngư i cần chuyển ổi thành

s n phẩm hữu ích (Chang and Miles, 2004)

Đ ó nhi u chi n lượ kh nhau ược phát triển ể sử dụng nguồn lignocellulose khổng lồ tạo ra hàng năm th ng qua iện pháp nông lâm nghiệp và công nghiệp thực phẩm Nhưng iện pháp có giá trị hơn là trồng nấm, vì nấm ó nhi u loại enzyme phân rã lignocellulose tạo ra nấm có giá trị kinh t cao, lại gi m ô nhiễm m i trư ng Hơn th nữa, gần y s n xuất nấm

y dược và các chất có hoạt tính sinh học làm giá bán nấm tăng ao ng kể

Sự phân rã sinh học của nấm nh các enzyme không những làm các ph liệu ược phân rã nhanh gi m ô nhiễm m i trư ng, mà òn ó t ộng bồi hoàn sinh học ơ hất sau trồng nấm làm giàu chất hữu ơ ho ất, thậm chí phân bón hữu ơ sạch cho cây trồng

2.1.3.2 Trồng nấm với phát triển nông nghiệp bền vững

Nông nghiệp b n vững là một hệ thống trong ó on ngư i tồn tại và sử dụng những nguồn năng lượng kh ng ộc hại, ti t kiệm và t i sinh năng lượng, sử dụng nguồn tài nguyên phong phú của thiên nhiên mà không phá hoại những nguồn tài nguy n ó Góp phần tích cực vào bồi hoàn sinh học những hệ sinh th i ị suy thoái Việc tận dụng những ph phụ liệu của nông nghiệp ể s n xuất ra thực phẩm sẽ góp phần ng kể vào phát triển nông nghiệp b n vững Nguồn ph th i của nông nghiệp rất lớn, n u bi t tận dụng làm nguyên liệu trồng nấm, sau khi thu hoạch nấm, ủ h ng ể làm phân vi sinh sẽ ược nhi u lợi ích Thứ nhất, có s n phẩm giá trị ao ể thu hoạch Thứ hai, không gây ô nhiễm m i trư ng Thứ ba, bã sau trồng nấm lại có thể thành nguồn phân hữu ơ rất tốt ối với ất (Nguyễn L n ng, 2002 Trồng nấm góp phần phát triển nông nghiệp b n vững một cách tích cực

2.2 Sự phát triển nghề trồng nấm

2.2.1 Lịch sử phát triển nghề trồng nấm ăn v nấm dƣ c liệu

Khởi ầu từ th kỉ thứ VI, ngư i ta i t trồng một số loại nấm ể ăn

mặ d kĩ thuật òn th sơ Theo tài liệu của Chang and Miles (2004), nấm

mèo ược trồng ầu tiên ở Trung Quốc, nấm kim h m ược trồng vào kho ng năm 800-900, nấm hương ược trồng vào năm 1000 sau ng Nguy n (Nguyễn L n ng, 2002 Năm ầu nuôi trồng nhi u loại nấm thực phẩm và dược liệu ượ liệt k trong ng 2 1 như sau

Auricularia auricula

(nấm mèo)

Thực phẩm, dược liệu

Từ năm 600 Trung Quốc

Flammulina

velutipes (kim châm)

Thực phẩm Từ năm 800 Trung Quốc

Lentinula edodes

(nấm hương

Thực phẩm, dược liệu

Từ năm 1000 Trung Quốc

Hericium erinaceus

(hầu thủ)

Thực phẩm, dược liệu

Từ năm 1960 Trung Quốc

Agaricus brasiliensis

(nấm th i dương

Thực phẩm, dược liệu

Từ năm 1970 Nhật

(nguồn: Shu-Ting Chang, 2008) Nhìn chung, công việ thăm dò và nghi n ứu cách trồng nấm thực sự phát triển mạnh và rộng khắp trong những thập kỉ qua, nhất là trong 20 năm trở lại y Hiện nay, trên th giới có kho ng 60 loài nấm ang ược nuôi trồng với mụ h thương mại, với 20 loài ược nuôi trồng quy mô công nghiệp

2.2.2 Sự phát triển nghề trồng nấm trên thế giới

2.2.2.1 Sản lƣ ng nấm trồng trên thế giới

Thị trư ng nấm trên th giới vào năm 2001 ạt doanh số trên 40 tỉ USD Thị trư ng nấm gồm 3 loại chủ y u: nấm ăn, h phẩm nấm y dược và

nấm hoang dại (Chang and Miles, 2004) S n xuất nấm trồng trên th giới gia

tăng một cách ổn ịnh nh sự óng góp ng kể từ nướ như Trung Quốc,

Ấn Độ, Ba lan, Hungary, và Việt Nam B ng 2.2 minh họa sự gia tăng nh y

vọt s n lượng nấm trồng từ năm 1960 n 2002 (Chang and Miles, 2004)

B ng 2.2: Tổng s n lượng nấm trồng trên th giới từ năm 1960 n 2002 Năm S n lượng (tấn tươi Năm S n lượng (tấn tươi

1978

1981

1.060.000 1.257.000

1997

2002

6.158.000 12.250.000

(nguồn: hang and Miles, 2004)

Doanh số thị trư ng nấm y dượ và hất ổ sung vào thứ ăn ủa chúng trên toàn th giới kho ng 1,2 tỉ US năm 1991 và 3,6 tỉ US năm 1994 (Chang, 1996 theo Chang and Miles, 2004) Năm 1999, ước tính 6,0 tỉ USD Doanh số thị trư ng chỉ riêng các s n phẩm dinh dưỡng dược gốc nấm linh chi

năm 1995 ước tính 1628,4 triệu USD (Chang and Buswell, 1999 theo Chang

and Miles, 2004) Nấm hương nổi ti ng ng ó doanh thu tương tự Chín

mươi hín phần trăm s n phẩm kể trên s n xuất ở nước châu Á và Âu,

chỉ dưới 0,1% ở Bắc Mỹ (Chang and Miles, 2004)

Tóm lại, s n lượng nấm trên toàn th giới tăng li n tục từ năm 1960 n nay, ặc biệt tăng vọt: năm 1981 là 1 257 200 tấn, n năm 1997 tăng thành 6.158.400 tấn, gấp hơn 4,5 lần trong 16 năm; gấp i trong 5 năm 1997 – 2002

từ 6.158 triệu tấn lên 12.250 triệu tấn/năm ( hang and Miles, 2004)

2.2.2.2 Sự thay ổi cơ cấu sản lƣ ng các loài nấm trồng

Trong quá trình phát triển, trồng nấm không những gia tăng v số lượng,

mà òn a dạng hóa chủng loài làm thay ổi ơ ấu s n lượng loài ược trồng B ng 2 3 (năm 1981-1997) và b ng 2.4 (2003-2004) ph n nh sự gia

tăng s n lượng nấm trên toàn th giới với chi ti t cho từng loài (Akanuma et

al., 2006) B ng 2.3 cho thấy trong những năm 1990 trở v trước, nấm mỡ Agaricus bisporus chi m ưu th , có s n lượng lớn nhất trong các loài nấm

trồng Nó ược trồng quy mô công nghiệp ở nước tiên ti n như Mỹ (thứ nhất), Pháp (thứ hai), Hà Lan, Anh, S n lượng nấm mỡ tăng li n tục qua các năm, nhưng tỉ lệ tương ối so với các nấm khác gi m dần Năm 1981, nó chi m 71,6% tổng s n lượng; con số này gi m dần, n năm 1997 òn 31,8%

B ng 2.3: S n lượng nấm trồng phổ bi n trên th giới năm 1981-1997

x 1000 tấn tươi (%)

x 1000 tấn tươi (%)

x 1000 tấn tươi (%)

x 1000 tấn tươi (%) Nấm mỡ

Agaricus

bisporus

900,0 (71,6%)

1.227,0 (56,2%)

1.420,0 (37,8%)

1.846,0 (37,6%)

1.955,9 (31,8%)

Nấm hương

Lentinula

edodes

180,0 (14,3%)

314,0 (14,4%)

393,0 (10,4%)

826,2 (16,8%)

1.564,4 (25,4%)

11

Nấm ào ngư

Pleurotus spp

35,0 (2,8%)

169,0 (7,7%)

900,0 (23,9%)

797,4 (16,3%)

875,6 (14,2%)

Nấm mèo

Auricularia

spp

10,0 (0,8%)

119,0 (5,5%)

400,0 (10,6%)

420,1 (8,5%)

485,3 (7,9%) Nấm rơm

Vovariella

volvacea

54,0 (4,3%)

178,0 (8,2%)

207,0 (5,5%)

298,8 (6,1%)

180,8 (3,0%)

Nấm kim châm

Flammulina

Velutipes

60,0 (4,8%)

100,0 (4,6%)

143,0 (3,8%)

229,8 (4,7%)

284,7 (4,6%)

Ng n nhĩ

Tremella spp -

40,0 (1,8%)

105,0 (2,8%)

156,2 (3,2%)

130,5 (2,1%)

54,8 (1,1%)

74,2 (1,2%)

Các nấm khác 1.2

(0,1%)

10,0 (0,5)

139,4 (3,7%)

238,8 (4.8%)

518,4 (8,4%)

Tổng s n lượng 1.357,2

(100,0)

2.182,0 (100,0)

3.763,0 (100,0)

4,909,3 (100,0)

6.158,4 (100,0)

% gia tăng theo

Trung Quốc Nhật B n Hoa Kỳ

Nấm ào ngư Pleurotus spp

Nấm hương Lentinula edodes

Nấm mỡ Agaricus bisporus

Nấm mèo Aurilaria spp

Nấm rơm Volvariella volvacea

Nấm Kim châm Flammulina

2.468.000 2.228.000 1.330.400 1.654.800 197.400 557.700

5.210

>200.000 110.185 84.356 25.068 45.805

1.803 3.428 383.636 2,3 2,2 22,7

N Linh chi Ganoderma spp

N Phục linh Wolfiporia cocos

Các nấm khác

183.300 30.500 242.500 171.500 24.900 177.800 52.200 114.100 92.900 32.200 42.000

49.100 145.900 571.700

29.882 1.821

~300

0,9 42,5

33,0 2,7 130,0

(nguồn: Akanuma et al., 2006)

2.2.3 Sự phát triển nghề trồng nấm ở Việt Nam

Theo xu hướng chung trên th giới, trồng nấm ở Việt Nam ng ph t triển nhanh và mạnh, c v quy mô nuôi trồng, nhi u chủng loài mới, lẫn nhi u nghiên cứu v nấm ăn và nấm dược liệu Do vậy ược coi là một trong 4

nước phát triển nhanh ngh trồng nấm (Chang and Miles, 2004)

Trồng nấm ở nướ ta trong 20 năm gần y (kho ng năm 1990 n năm 2010) từ s n xuất gia ình hình thành một ngh sinh sống của nhi u gia ình Ở mi n Bắ nước ta, nh sự hỗ trợ của Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật thuộc Viện Di truy n nông nghiệp, trồng nấm ược triển khai khắp các tỉnh, mà một số nơi tr n toàn huyện Ở mi n Nam, một số vùng trồng nấm tập trung hình thành như Đức Trọng (L m Đồng , Long Kh nh (Đồng Nai), Bình Chánh (TPHCM), Long An, Huyện Lai Vung (Đồng Tháp) và Thốt Nốt (Hậu Giang)

13

Lượng nấm ược s n xuất nhi u nhưng hưa thống k ược chính xác số lượng Trướ y, ở thị trư ng chỉ có nấm rơm và nấm mèo, sau ó ó th m nấm ào ngư và hiện nay trên 10 loài nấm ược bán ở siêu thị và các chợ S n lượng nấm ở Việt Nam năm 2012 ước tính: Nấm rơm ~20 000 tấn tươi, nấm

ào ngư ~1 800 tấn tươi, nấm mỡ ~300 Tấn tươi, nấm mèo (mộ nhĩ ~5 500 tấn khô, nấm hương ~50 tấn khô, nấm linh chi ~25 tấn khô (Lê Xuân Thám

và ctv 2013) Sự gia tăng ặc biệt ối với nấm ào ngư và nấm hương do:

Nấm ào ngư ó nhi u loài ược nuôi trồng, dễ trồng ở quy m gia ình và công nghiệp, năng suất cao rất thích hợp cho phát triển nông nghiệp b n vững Nấm hương là thực phẩm chứ năng ó gi trị dinh dưỡng dược cao và một phần ược chi t thành các ch phẩm y dược Nhi u loài nấm mới ược nuôi trồng và s n lượng gia tăng rất nhanh Nói chung nấm trồng ngày càng có vai trò lớn hơn trong i sống on ngư i

2.3 Công nghệ trồng nấm

2 3 1 Sơ ồ khái quát quy trình trồng nấm

Hình 2 4: Sơ ồ tổng quát qui trình nuôi trồng các loại nấm ăn

(nguồn: Akanuma et al.,2006)

Ngh trồng nấm nh ứng dụng các ti n bộ khoa học mà nó có những ước ti n nh y vọt Công nghệ trồng nấm sử dụng nhi u kỹ thuật và ki n thức

v vi sinh vật: khử trùng, nuôi cấy giống thuần, l n men ơ hất, tạo i u kiện cho vi sinh vật có lợi phát triển và hạn ch các vi sinh vật có hại, Các nghiên cứu khoa học góp phần thuần hóa các chủng nấm mới ưa vào nu i trồng,

kh o s t ặ iểm sinh họ , x ịnh giá trị dinh dưỡng và y dược, làm

th nào khống ch i u kiện khác nhau, mà chủ y u là các y u tố môi trư ng như nhiệt ộ, ộ ẩm, nh s ng, th ng kh , ể nấm trồng ra ược nhi u

qu thể (Phạm Thành Hổ, 2004)

2.3.2 Meo gi ng nấm

Trong s n xuất nấm, meo giống giữ vai trò quan trọng hàng ầu Dù ch

bi n nguyên liệu tốt, hăm só kĩ àng nhưng giống nấm xấu thì năng suất không cao hoặc tệ hơn kh ng ó nấm mọ Trước khi trồng cần chọn chủng nấm thích hợp với i u kiện ịa phương, mà trước tiên là nhiệt ộ cho ra qu thể và nguồn nguyên liệu hủ y u từ ph phẩm n ng nghiệp ph i nhi u Nấm ra các tai nấm chỉ khi nào nó ược phát triển từ hệ sợi tơ nấm Đống rơm rạ ẩm có nấm mọ khi trong ó ó sẵn hệ sợi tơ nấm hoặc bào tử

n y mầm tạo ra hệ sợi tơ hỗ nào không có hệ sợi tơ hoặc bào tử thì không có nấm mọc lên Meo giống nấm ược s n xuất ể cung cấp ho ngư i trồng thực chất là hệ sợi tơ nấm thuần chủng ược nuôi bằng m i trư ng tự nhiên hay nhân tạo khử tr ng ể cấy vào ơ hất trồng nấm làm giống khởi ầu

Để tạo ra meo giống nấm gồm ước chủ y u: giống gốc từ ống nghiệm hoặc hộp Petri  meo giống cấp I (meo hạt lúa hoặc gạo)  meo giống cấp II (meo hạt lúa, meo cọng, meo ó rơm, m n ưa  meo giống cấp III (meo s n xuất gieo trực ti p vào ơ hất trồng nấm) (Phạm Thành Hổ, 2009)

2.3.3 Chế biến nguyên liệu th nh cơ chất trồng nấm

ăn ứ vào sự phân rã nhi u ít nguyên liệu an ầu d ng làm ơ hất cho trồng nấm có thể gồm hai loại chủ y u:

Nguyên liệu th hưa hoặc ít bị phân rã như rơm rạ, bã mía, mụn xơ dừa, mạt ưa, lõi ắp, lá chuối khô, lụ ình kh , th n y ậu, thân cây gỗ Phần lớn các loài nấm trồng, như nấm rơm, nấm mèo, ào ngư, nấm hương, linh hi,…, sử dụng nguồn nguyên liệu này với quy trình ch bi n ơn gi n

Nguyên liệu tương ối bị phân hủy mạnh như ph n ngựa, phân bò, phân gà, mà khi ủ ti p với rơm rạ, m a,… sẽ tạo n n ơ hất gọi là compost

thành hất mùn Compost dùng chủ y u trồng các loại nấm mỡ Agaricus

Tuỳ từng loại nấm trồng mà chọn loại nguyên liệu Nguyên liệu thô không ph i khúc gỗ ược xử l ể thành ơ hất qua ước: Thấm nước

ưa v ộ ẩm thích hợp, bổ sung thêm chất dinh dưỡng như m, ắp, ur ,

15

AP… Hoặ ho vào ống ủ hoặ ho vào vật chứa như khay, ịch và khử trùng Sau ó óng m hoặ ho vào khay… Tuỳ từng loại nấm và phương pháp nuôi trồng th h hợp

Ch bi n compost cho nuôi trồng nấm mỡ Agaricus Quá trình ch bi n

compost có th i gian kéo dài, kèm mùi hôi thối của nguyên liệu và gồm nhi u pha Trong pha I của quá trình thực hiện ngoài tr i, nguyên liệu an ầu chất thành ống ượ o trộn và tưới nước theo chu kỳ Trong pha I này, các vi sinh vật thực hiện sự ph n r an ầu ối với nguyên liệu Pha này thư ng thực hiện xong trong 9–12 ngày, khi nguyên liệu (như rơm rạ) trở nên m m dẻo, màu n u ậm và có kh năng giữ nướ Thư ng ammonia bốc mùi mạnh Pha II lên men trong nhà (indoor fermentation) là khử trùng Pasteur (pasteurization), khi mà các sinh vật không mong muốn bị loại bỏ Quá trình khử trùng Pasteur này thực hiện trong phòng ược thổi hơi nướ nóng vào ể giữ nhiệt ộ không khí ở 60oC trong ít nhất 4 gi Nhiệt ộ sẽ hạ xuống n

50oC trong 8-72 gi phụ thuộc vào compost Carbon dioxide CO2 duy trì ở 1,5-2% và mức ammonia gi m xuống dưới 10 ppm nh vào sự thổi hơi nướ ở nhiệt ộ trung ình (50o n 60o và duy trì th i gian dài Ti p theo pha II tạo ompost, ơ hất ược làm lạnh xuống 30oC thích hợp cho meo Agaricus

bitorquis hoặc 25oC thích hợp cho meo Agaricus bisporus (Chang, 1999)

2.3.4 Gieo meo và ủ lan tơ

Sau khi khử tr ng xong, ể nguội, ti n hành gieo meo Có nhi u h ể gieo meo tuỳ theo phương ph p trồng và loại nấm:

(1) Gieo meo cụm: Thư ng các cụm meo cách nhau 10-15 cm theo chi u dọc

(4) Gieo meo từng lớp: R i meo theo từng lớp ơ hất cách nhau giữa lớp meo

tr n và dưới kho ng 5-10 m Đối với các bị h m n ưa thì ấy meo hạt phía trên miệng bịch, n u dùng meo cọng thì cắm sâu cọng meo thẳng từ miệng bịch xuống y (Phạm Thành Hổ, 1992 - 1994)

Ủ tơ nấm: Nấm lớn gồm 2 phần chủ y u: qu thể hay tai nấm là ơ quan

sinh s n và hệ sợi tơ nấm là bộ phận sinh dưỡng So với thực vật thì tương ứng với qu và th n y Tương ứng với i u này, trồng nấm ó 2 giai oạn: Nuôi

hệ sợi tơ nấm phát triển tốt như trồng y ủ lớn mới ra nhi u trái tốt ược và tạo i u kiện cho nấm mọc ra qu thể như y sinh tr i o vậy, ủ tơ nấm tốt cho lan nhanh, choáng h t khối ơ hất, ó nghĩa rất quan trọng cho s n lượng nấm Tuy nhiên, quá trình ủ lan tơ kh ng òi hỏi nghiêm nhặt các y u tố

m i trư ng như l hình thành qu thể Khi cấy meo vào luống nấm, những sợi tơ này mọc lan ra Trong lúc mọc lan ra các nhánh ngang gặp nhau nối lại thành mạng lưới Nh tạo mạng nối mà hệ sợi tơ nấm thành một khối thống nhất Các chất bên trong khối hệ sợi có thể thông với nhau, di chuyển từ chỗ này tới chỗ khác Hiện tượng tạo mạng nối và sự di chuyển các chất bên trong sợi tơ nấm ó nghĩa ặc biệt ối với trồng nấm Khi trồng nấm ai ng thấy

là nấm ra trên b mặt, nhưng năng suất thì phụ thuộc vào c khối ơ hất bên trong Sở dĩ như vậy là vì các sợi tơ nấm nằm s u trong rơm rạ hút chất dinh dưỡng chuyển ra ngoài ể tạo ra các tai nấm Gần như hình thành một nguyên tắc là s n lượng nấm phụ thuộc vào khối nguyên liệu em trồng, ít phụ thuộc

b mặt chỗ nấm mọc ra (Phạm Thành Hổ, 2004)

2 3 5 Chăm sóc v thu h i

Khi tơ nấm lan ầy khối ơ hất, dưới những i u kiện m i trư ng nhất ịnh, khác nhi u với giai oạn ủ lan tơ, nụ nấm sẽ xuất hiện và lớn dần thành qu thể Nghệ thuật trồng nấm thể hiện nhi u nhất ở khâu có tính chất quy t ịnh thành bại của toàn bộ quá trình trồng nấm Ở giai oạn này, con ngư i bằng việ hăm só ó nhi u t ộng trực ti p hơn ể tạo các y u tố

m i trư ng thuận lợi nhất cho sự hình thành qu thể nấm c v số lượng lẫn chất lượng Ti n hành tưới và thu hái qu thể (Võ Thị Phương Khanh và Phạm Thành Hổ, 1998)

Giai oạn này cần lưu một số i u kiện m i trư ng như sau:

Nhiệt ộ: Nhiệt ộ có nh hưởng lớn ối với sự hình thành qu thể nấm trồng, là y u tố giới hạn nhất ịnh ối với nấm trồng Đa số loài nấm trồng có

gố v ng n ới, có loại như nấm rơm hỉ trồng ược ở vùng nhiệt ới Cần phân biệt nhiệt ộ nuôi hệ tơ nấm và nhiệt ộ ra qu thể, mà a số có nhiệt ộ

ra qu thể thấp hơn nu i tơ V dụ: Nấm rơm Vovariella volvacea nu i tơ ở 35

- 40oC ra qu thể ở 35 - 40oC; nấm ào ngư Pleurotus eringii nu i tơ ở 20 -

30oC và ra nấm ở 15 - 20oC Nhi u loài nấm ào ngư gố n ới ra qu thể ở nhiệt ộ 25 – 35oC, chủng nấm hầu thủ chịu nhiệt ng hình thành qu thể ở nhiệt ộ này

Ẩm ộ: Sợi tơ nấm thi u nước dễ bị khô ch t Mỗi loài cần ộ ẩm nhất ịnh ể sợi tơ tăng trưởng và ra qu thể Trong trồng nấm cần phân biệt: (1) Độ ẩm ơ hất nguyên liệu là ộ ẩm trong ơ hất sau khi ược thấm nướ ơ hất quá khô hoặc quá ẩm u bất lợi cho hệ sợi tơ nấm Độ ẩm thích hợp ở kho ng 65-80%

(2) Độ ẩm tương ối của không khí trong kho ng 70-95% ối với a số nấm trồng Cần ph i giữ ộ ẩm không khí tốt: kh ng kh ủ ẩm, hơi nước ít

bố hơi ra Độ ẩm ược duy trì nh tưới nước, mà tốt nhất là tưới phun sương,

ít nh hưởng hệ sợi tơ nấm (Võ Thị Phương Khanh và Phạm Thành Hổ, 1998)

17

Ánh sáng: Mỗi loài nấm trồng có ph n ứng khác nhau với ánh sáng Nấm

mỡ Agaricus bisporus hoàn toàn không cần ánh sáng trong suốt quá trình

trồng từ ủ lan tơ n ra qu thể Ánh sáng cần một giai oạn ngắn cho nấm rơm ể tạo nụ, mà nh s ng hoàng h n ng ủ cho nấm rơm ra qu thể Tuy nhiên, nhi u nấm kh như nấm rơm lụa bạc, nấm hương, u cần ánh sáng

ể ra qu thể

Thông khí: Trong qu trình tăng trưởng, sợi tơ nấm hô hấp tạo ra nhi u thán khí (CO2), ph n ứng của các loại nấm kh nhau ối với nồng ộ CO2 khác nhau Hầu h t các loài nấm trồng u cần thông khí mạnh trong giai oạn

ra qu thể Nấm rơm trồng ngoài tr i, việc thông thoáng cho nấm không thành vấn Nấm ào ngư ần thông khí mạnh ể ra qu thể

Độ chua pH: Trong quá trình phát triển của nấm m i trư ng thay ổi theo tính chua Một số chất bổ sung vừa có tính chất i u hoà ẩm vừa làm bớt

ộ hua như ột thạch cao CaSO4, v i mịn CaCO3…Độ hua an ầu có

nh hưởng n các vi sinh vật có trong nguyên liệu và có thể nh hưởng c

n dinh dưỡng, n các vi sinh vật gây nhiễm hoặc cạnh tranh Trong qu trình phối trộn ơ hất trồng nấm thư ng ổ sung a O3, CaSO4 hoặ aO ể tăng ộ pH

Việc thu hái nấm phụ thuộc vào chủng loài và thị hi u ngư i tiêu dùng

Ví dụ, nấm rơm thu h i ở giai oạn hình trứng trước khi nứt bao; nấm hương hái lúc màng trắng dưới m nấm vừa tách khỏi mép qu thể; nấm linh chi thu

l m nấm cứng toàn bộ mặt tr n óng như nh verni và ó nhi u bụi bào

tử Đa phần nấm tiêu thụ ở dạng tươi (kể c nấm mèo), số khác vừa tươi vừa dạng kh như nấm mèo, nấm hương và một số như nấm linh chi chủ y u ở dạng khô Nấm mỡ và nhi u loài nấm kh ượ làm ồ hộp (Phạm Thành

Hổ, 2004)

2 4 Định danh nấm ăn v nấm dƣ c liệu

Sự lựa chọn trình tự DNA dùng cho việc nhận diện các loài nấm òi hỏi sự khác biệt của các trình tự sao cho ta có thể phân biệt ược dòng phân lập ở cấp

ộ loài hay giống của h ng Gene m hóa v ng ri osomal RNA m b o ược yêu cầu này Gene là một phần thi t y u của sự sống t bào và các vùng gen có sự khác biệt v trình tự giữa các loài Mặt khác, các gene tồn tại với một số lượng lớn trong genome gi p tăng ộ nhạy của các kiểm tra chẩn o n Tổng quan v r NA và ITS:

Sơ lượ v v r NA: r NA là nhóm gen m hóa rRNA ủa ri osome, óng vai trò quan trọng trong nghi n ứu quan hệ ph t sinh loài r NA

ượ quan t m nghi n ứu vì r NA là một gen ó nhi u n sao và ặ iệt

không mã hóa cho protein nào (Guarro et al., 1999)

n sao ủa gen nằm li n ti p tr n một lo us và li n quan mật thi t tới

qu trình ti n hóa Hơn nữa, ri osome hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và ó

ng nguồn gố ti n hóa Phần lớn ph n tử r NA tương ối o tồn n n ượ xem là ơ sở ể tìm ra sự tương ồng và kh iệt khi so s nh sinh vật

kh nhau primer thi t k dựa tr n những oligonu leotide ó t nh o tồn

ao ượ sử dụng ho tất sinh vật nhằm khu h ại v ng tương ương

d ng trong so s nh Ngoài ra, nhi u oạn mồi và mẫu dò ng ượ thi t k dựa tr n v ng kh ng o tồn d ng trong ph t hiện và ịnh danh vi sinh vật

(Van de Peer et al., 1996) Các rDNA 5,8 S, 18 S, và 25 S phiên mã thành các

ti n rRNA ri ng rẽ, nằm xen kẽ với v ng phi n m n trong (ITS và vùng phiên mã bên ngoài ( TS Giữa nhóm gen gồm nhi u n sao lặp lại

là v ng kh ng phi n m ó một r NA 5 S thư ng kh ng ó vị tr ố ịnh và

ó hi u sao m ngượ với gen òn lại, r NA 5 S thư ng hỉ ó ở nh n,

kh ng ó ở ty thể ủa một số loài nấm K h thướ ủa mỗi v ng lập lại nằm

trong kho ng 7,7 – 24 kbp (Guarro et al., 1999; Leo Antony et al., 2012)

r NA 18 S thư ng ượ quan t m nghi n ứu; r NA 5,8 S ó k h thướ rất nhỏ và t ó sự i n ổi song rRNA 5S là thành phần kh ng thể thi u

ủa nu- LSU- rRNA (nuclear large subunit rRNA), ó vai trò ổn ịnh ấu tr

ri osome và th ẩy qu trình tổng hợp protein (Szymanski et al., 2003);

r NA 25 S mặ d t ó sự i n ổi song lại rất ó nghĩa trong ph n loại

(Guarro et al., 1999)

V ng ITS là v ng ó rất nhi u sự i n ổi, mặ d v ng ITS thư ng

ượ sử dụng trong nghi n ứu ti n hóa ủa vi sinh tuy nhi n phần lớn so

s nh tr n v ng này hỉ thư ng sử dụng ở mứ ộ x ịnh iệt hóa trong

cùng loài (Guarro et al., 1999)

nghi n ứu sinh họ ph n tử nhằm ph n loại nấm tr n ơ sở r NA

ượ ph t triển những năm ầu ủa thập ni n 90 (Bruns et al., 1991)

Sơ lược v ITS (Internal Transcribed Spacer)

Hình 2.5: Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome

(nguồn: renth and Irwin, 2001)

19

Trong hầu h t các sinh vật Eukaryote, gene ribosomal RNA (rDNA) gồm một họ a gene, trong ó n sao ược sắp x p lặp lại liên ti p nhau Mỗi oạn lặp lại gồm một ơn vị phi n m ơn ao gồm một tiểu ơn vị nhỏ 5,8S

và một cấu trúc tiểu ơn vị lớn (chia làm hai phần) là ITS1, ITS2 (Drenth và Irwin, 2001) Cặp mồi ITS4 và ITS5 ng là ặp mồi phổ bi n ược White

et al., (1990) thi t k ể khu h ại oạn gene nằm trong vùng ITS Vùng ITS

có thể ược ứng dụng ể tính toán ột bi n iểm trong quá trình hình thành loài, o lư ng sự giống nhau bên trong trình tự DNA, dùng các phần

m m chuyên dụng tạo ra cây ti n hóa loài không chỉ các loài giống nhau mà còn phân biệt sự khác nhau giữa các loài

Gi i trình tự gene mã hóa ho rRNA và ITS trong ịnh danh nấm: Để

phân loại ược các loài nấm hoang dại, Nguyễn Như hương và ctv (2013

ịnh danh loài nấm khổng lồ thu tại ình ương ằng phương ph p k t hợp giữa phân loại truy n thống và dẫn liệu rRNA 25S với ộ tương ồng là 99%

so với Gen ank Độ tương ồng trình tự rRNA 25S của chủng Macrocybe

gigantea so với dẫn liệu ó v Macrocybe gigantea trong Gen ank là ≈

99%, tương tự k t qu của Amirati (2007); Hong-Min (2008) Tổng hợp các dẫn liệu cho phép xây dựng quan hệ chủng loại phát sinh trong các nhóm gần

g i Từ mô t gi i phẩu hình thái theo Pegler (1998) và Lê Xuân Thám (2001)

k t hợp với gi m ịnh rRNA 25S có thể khẳng ịnh rằng mẫu nấm thu ược ở

L i Thi u, ình ương là loài nấm Macrocybe gigantea

Trần Nh n ng và ctv (2012 d ng phương ph p khu h ại oạn

ITS ằng P R với hai oạn mồi là ITS1 và ITS4 ể gi i trình tự 16 loài nấm

ăn th ng dụng thuộ khu vự Đồng ằng s ng ửu Long K t qu ủa tài là

x lập ượ gi n ồ ph hệ ủa 16 loài nấm này ho thấy mứ tương quan di

truy n giữa loài nấm kh o s t với mứ gắn ó bootstrap ao ho thấy

loài nấm này ó nguồn gố rất gần

2 5 C c phương ph p x c ịnh ho t tính gây c tế b o v cơ chế tác

ng kh ng ung thư của m t s loài nấm dư c liệu

Đ tài “Nghi n ứu tác dụng tăng ư ng miễn dịch, chống oxy hóa và kh năng kh ng ph n ào thực nghiệm của nấm linh hi” do Nguyễn Thị Thu Hương (2012 thực hiện trên chuột thí nghiệm mang lại nghĩa to lớn hứa hẹn cho việc thử nghiệm một số loài nấm hoang dại kh trong i u trị ung thư Theo xu hướng trên th giới ngày nay là quay v sử dụng các s n phẩm có nguồn gốc tự nhi n trong i u trị ung thư thuốc có nguồn gốc tự nhiên an toàn hơn vì ược tạo nên từ những quá trình sinh lý-sinh hóa tự nhiên giống như qu trình sinh l ủa ơ thể on ngư i Nhi u loại ung thư hiện nay không có thuốc tổng hợp ặc trị

Hiện nay mục tiêu của trị liệu ung thư là d ng hất thiên nhiên tác ộng theo nhi u ơ h khác nhau lên dòng t ào ung thư và uối cùng dẫn

n hoạt hóa quá trình apoptosis mà không gây ph n ứng viêm nh hưởng n

t ào ình thư ng xung quanh C m ứng apoptosis trong những dòng t bào hoặc những m ung thư ằng cao chi t từ thực vật là một chi n lược hiệu qu trong hóa trị liệu do thành phần cao chi t thực vật là hỗn hợp của nhi u hoạt chất thiên nhiên có tác dụng bổ trợ cộng lực với nhau làm tăng t dụng i u trị và gi m tác dụng không mong muốn của hoạt chất chính (Simon, 2004) Song song với việc tìm ki m, sàng lọc những hợp chất mới, phương pháp nghiên cứu của hoạt tính của các hợp chất này ng ngày àng ph t triển

i s u vào ơ h t ộng Các hợp chất mới ược sàng lọc bằng phương

ph p nh gi t nh g y ộc t bào trên các dòng t ào ung thư nu i ấy Một

số phương ph p phổ bi n hiện nay như: Phương ph p MTT dimethylthiazol-2-yl -2,5-diphenyl tetrazolium romide ; phương ph p XTT [2,3- is (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl -5-[(phenylamino ar onyl -2H-tetrazolium hydroxide ; phương ph p WST-1 [2-(4-Iodophenyl -3-(4-nitrophenyl -5-(2,4-disulfophenyl -2H-tetrazolium và phương ph p SR (sulforhodamine B); (Simon, 2004)

ượ nh gi ằng phương ph p o mật ộ quang (Simon, 2004)

2.6 Các nghiên cứu có liên quan

2.6.1 Các nghiên cứu về khu hệ nấm ở Việt Nam

Qua các công trình nghiên cứu nấm ở Việt Nam giai oạn 1890 – 1928, tổng cộng có kho ng 200 loài, trong ó 28 loài ph n ố ở Trung bộ và 37 loài

ở Bình Trị Thiên Trong công trình nghiên cứu v nấm với tác phẩm “ y ỏ

mi n nam Việt Nam”, Phạm Hoàng Hộ năm 1960 m t vắn tắt 48 chi, 31 loài nấm Ở mi n bắc Việt Nam, việc nghiên cứu nấm ược bắt ầu vào năm

1954 tại Đại học Tổng hợp Hà Nội với các công trình tiêu biểu của Nguyễn Văn iễn năm 1965 m t 28 loài nấm ăn ược và 10 loài nấm ộc; Trương Văn Năm năm 1965 “Nghi n ứu nấm sống trên gỗ ở l m trư ng Hữu

L ng”; Trịnh Tam Kiệt với tài “ ướ ầu i u tra bộ Aphyllophorales vùng Hà Nội” vào năm 1965 và “Sơ ộ i u tra nghiên cứu các loài nấm ăn

và nấm ộc chính ở một số vùng mi n Bắc Việt Nam” vào năm 1966 (Trịnh

Tam o và Trịnh Tam Kiệt, 2011

21

T nh n năm 1978 ó 618 loài nấm thuộ 150 hi ược ghi nhận ở

mi n Bắc Việt Nam Trong số ó, nổi bật là L ng vào năm 1977 m

t 22 loài trong “Nghi n ứu họ Polyporaceae mi n Bắc Việt Nam” (L

ng, 2003 ; L Văn Liễu (1977) phát hiện với 118 loài trong “Một số nấm ăn

ược và nấm ộc ở rừng” Theo Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt (2011

năm 1978, Trịnh Tam Kiệt công bố “Những dẫn liệu v hệ nấm sống trên gỗ vùng Nghệ An”, m t 90 loài nấm sống trên gỗ; và với ng trình “Nấm ở Việt Nam (tập 1 ”, t gi m t 116 loài nấm thư ng gặp ở Việt Nam Trần Văn M o với tài “Góp phần nghiên cứu thành phần loài và ặ iểm sinh học của một số nấm phá gỗ ở vùng Thanh – Nghệ - Tĩnh” ng ố 239

loài (Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt, 2011 Đ n năm 1991, Phan Huy ục

công bố “K t qu ướ ầu i u tra bộ Agaricales Clements trên một số ịa iểm thuộ ồng bằng Bắc Bộ Việt Nam”, t gi n u danh mụ 56 loài

(Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt, 2011 ng năm 1991, Ng Anh ng ố

ng trình “Nghi n ứu nấm ở Thành Phố Hu ” với 104 loài , “ ẫn liệu ước

ầu v họ Coriolaceae Sing ở Thừa Thiên Hu ” n u danh mục 60 loài và Phan Huy Dục công bố “Nấm phá hoại gỗ thư ng gặp trong rừng nhiệt ới

mi n Bắc Việt Nam”, t gi n u danh lục 39 loài nấm phá hoại gỗ Đ n năm 1994, t gi này công bố “Một số loài nấm hoang dại ược dùng làm

thực phẩm ở Việt Nam” và x ịnh ượ 16 loài (Trịnh Tam o và Trịnh

Tam Kiệt, 2011 ng năm này Phạm Quang Thu nghi n ứu một số ặc

iểm sinh học của nấm lim Ganoderma lucidum ở v ng Đ ng ắc Việt Nam (Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt, 2011 Năm 1995, Trịnh Tam Kiệt và Lê

Xu n Th m o o “Những nghiên cứu v họ nấm Linh

chi Ganodermataceae Donk ở Việt Nam”, hai t gi n u danh lục 43 loài

nấm Linh hi, trong ó ó 10 loài mới ghi nhận cho lãnh thổ Việt Nam và biên

soạn huy n san “Nấm Linh chi Ganodermataceae Donk – nguồn dược liệu quý ở Việt Nam” (Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt, 2011 Năm 1996, Trịnh Tam Kiệt và Ngô Anh báo cáo v họ nấm Linh chi Ganodermataceae Donk ở

mi n Trung Việt Nam tại hội nghị quốc t v nấm tại Nhật B n với 30 loài Linh hi, trong ó ó 20 loài mới ghi nhận lần ầu tiên cho khu hệ nấm ở mi n

Trung Việt Nam (Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt, 2011 ng năm ó,

Ngô Anh nghiên cứu thành phần loài nấm sống trên gỗ ở Thừa Thiên Hu công bố 172 loài nấm, trong ó ó 6 loài mới ghi nhận lần ầu cho khu hệ nấm

Việt Nam (Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt, 2011 Năm 1998, Ng Anh và

Lê Thứ o o “ ẫn liệu ướ ầu v họ Hymenochaetaceae Donk ở Thừa

Thiên Hu ” với 39 loài, trong ó 10 loài mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt

Nam (Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt, 2011 ng năm này, Ng Anh o

cáo tổng k t tài nghiên cứu cấp ơ sở “Nghi n ứu khu hệ nấm (Macrofungi) ở Thừa Thiên Hu ” với 272 loài nấm, trong ó 46 loài mới ghi

nhận cho khu hệ nấm Việt Nam (Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt, 2011

Năm 1998 Trịnh Tam Kiệt công bố ặ iểm khu hệ nấm Việt Nam

“ harakteristika der Gro pilzflora Vietnams” và danh mục khu hệ nấm Việt Nam “Preliminary he klist of ma rofungi of Vietnam” với 837 loài nấm ở

Việt Nam ược công bố và ghi nhận (Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt,

2011) Hội nghị Sinh học toàn quốc ở Hà Nội vào năm 1999 Ng Anh o o

“Nghi n ứu họ nấm linh chi (Ganodermataceae) ở Thừa Thiên Hu ” gồm 35

loài thuộc 2 chi Ganoderma và Amauroderma, trong ó 10 loài mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam” (Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt, 2011

Theo Trịnh Tam o và Trịnh Tam Kiệt (2011 Hội nghị Sinh học Quốc

Gia, những vấn ơ n trong nghiên cứu sinh họ vào năm 2000 t gi Trịnh Tam Kiệt, Ng Anh, Grafe và orfelt ông bố “Những dẫn liệu bổ sung v thành phần loài và hoá các hợp chất tự nhiên của khu hệ nấm Việt Nam”, trong ó t gi ng ố 65 loài mới của khu hệ nấm Việt Nam

và báo cáo v các hợp chất tự nhi n ược nghiên cứu ở 25 loài nấm Việt Nam, trong ó hơn 10 ấu trúc mới v các hợp chất tự nhiên ở nấm Việt Nam

ượ x ịnh L ng (2001 ng ố “Thành phần loài của

chi Hexagonia Fr ở v ng T y Nguy n” gồm 5 loài, trong ó Hexagonia

rigida Berk là loài mới cho khu hệ nấm Việt Nam Hội th o quốc t sinh học

năm 2001 tại Hà Nội ó o o như: Ng Anh với ng trình “Sự a dạng

v công dụng của khu hệ nấm ở Thừa Thiên Hu ” gồm 326 loài trong 6 nhóm nấm có ích và có hại; Phan Huy Dụ o o “Nấm (Macromyces) ở vư n Quố Gia Tam Đ o Vĩnh Ph ” ng ố 41 loài, 17 họ trong 2

lớp Ascomycetes và Basidiomycetes; Trịnh Tam Kiệt và Henrich Dorfelt báo

o “ taxon mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam và nghĩa ủa hệ thống sinh thái của h ng” ng ố 9 loài mới cho lãnh thổ Việt Nam Tổng

k t cho n năm 2001 ó 1250 loài thuộc khu hệ nấm Việt Nam ược công

bố

2.6.2 Các nghiên cứu về nấm ăn v nấm dƣ c liệu ở Việt Nam

Nấm hương Lentinula edodes là một thực phẩm chứ năng Năm 1994,

nấm hương ược nghiên cứu hoàn chỉnh qui trình s n xuất trên mạt ưa ao

su Năm 1998, nấm hương ược lai giữa chủng Cao Bằng và chủng nhập từ Nhật, tạo ược chủng lai chịu nhiệt (25-30oC) phù hợp i u kiện khí hậu Việt Nam (Phạm Thành Hổ, 2002)

Linh chi là một loài nấm y dượ , ược nuôi trồng từ những năm 1990 và nhi u tác gi nghi n ứu một số thành phần và hoạt chất sinh học và ti m năng i u trị một số bệnh (Nguyễn Thị h nh, 2005 Ngoài ra, òn thăm dò

t ộng bột sinh khối và bào tử (Trịnh Tam Kiệt, 2011 , t nh a dạng di

truy n (Nguyễn Thị Hồng Nụ et al., 2005)

Nấm hầu thủ ( ầu khỉ) Hericium erinaceus ng là thực phẩm chứ năng

có giá trị cao Cổ Đức Trọng thuộc Trung tâm Nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu (Bộ Y t ) trồng thử nghiệm thành công dòng nấm hầu thủ chịu nhiệt

23

do ông chọn ra tại ình ương, TP H M và thực hiện dự n “S n xuất

thương phẩm dòng nấm hầu thủ chịu nhiệt (Hericium erinaceus) tại Thành

Phố Hồ h Minh” ự n ược nghiệm thu th ng 11 năm 2007 với k t qu chủ y u: s n xuất ược 16.000 kg nấm tươi, tương ương 1 600 kg nấm khô

và xuất khẩu 200 kg nấm khô (Cổ Đức Trọng, 2007)

Nấm rơm lụa bạc Volvariella bombycina, mà trên th giới hưa ó th ng

báo v kỹ thuật trồng, từ những năm 1990 ược phân lập ở Việt Nam, ược nghiên cứu ặ iểm sinh học và trồng thành công ở quy mô 400 bịch phôi

u cho ra qu thể (Phạm Thành Hổ, 2002) (Tran Thị Kim Dung, Pham Thanh

Ho, 2009)

Các loài nấm ăn và dược liệu kh như nấm ào ngư Nhật Pleurotus

eringii (nấm i gà , nấm ngọc trâm Hypsizygus spp, v n hi… ng ược

nghiên cứu

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PH P NGHI N CỨU

3 1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian v ịa iểm

Th i gian: Từ năm 2014 n năm 2017

Địa iểm: Mẫu nấm ược thu thập ở vùng rừng núi An Giang, nuôi trồng tại An Giang, x ịnh ộc tính, giá trị dinh dưỡng, dược chất và ịnh danh phân tử tại Đại học Cần Thơ

3.1.2 Nguyên vật liệu

Các mẫu nấm lớn thu từ vùng rừng núi An Giang

Mạt ưa ao su thu mua tại ình Phước

Phụ gia phối trộn: trấu, lúa, gạo lứt, nước dừa, bột bắp, cám, gi ậu xanh

3.1.3 Hóa chất

Acetic acid (Tây Ban Nha), Ethanol (Việt Nam), Glacial acetic acid (Trung Quốc), HCl (Trung Quốc), H2SO4 ặc (Trung Quốc), NaOH (Trung Quốc), Phenol (Trung Quốc), D-Glucose (Trung Quốc), Saccharose (Trung Quốc), Pepton (Trung Quốc), Methanol (Trung Quốc), Vanillin (Trung Quốc), Olenolic acid (Trung Quốc), Perchloric acid (Trung Quốc), Dextrose (Trung Quốc), MgSO4.7H2O (Trung Quốc), Yeast extract (Trung Quốc), K2HSO4(Trung Quốc) và một số hóa chất cho các thí nghiệm sinh học phân tử.Hóa chất m i trư ng phân lập giống nấm: D-Glucose, dịch chi t nấm men, Pepton,

Agar, saccharose, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaCO3, ure, DAP (Diamoni Phosphate)

Hóa chất d ng ể trích DNA: Dung dịch Lysis Buffer ly trích (100 mM Tris, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% w/v CTAB), dung dịch TE 0,1 X, ethanol 70% và 96%

Hóa chất dùng kiểm tra sự hiện diện của DNA: Agarose, dung dịch TE 1X, Ethidium Bromide, Loading buffer

Hóa chất P R: Taq polymerase, Đoạn mồi, BiH2O, MgCl2, dNTPs, Buffer

3.1.4 Thiết bị và d ng c

ể i u nhiệt (Memmert, Đứ , p un (Alma, Nhật , n ph n t h (Sartorius, Đứ , lò vi sóng (LG, Hàn Quố , m y o pH ( ute h, Malaysia ,

m y quang phổ (Thermo Genesis UV10, USA , m y ly t m (Hermle, Đứ ,

m y lắ (New runswi k s ientifi , USA , m y vortex (Velp, Ý , nồi khử

tr ng nhiệt ướt (P i International, Ý , tủ ng lạnh (Hitsuji, Nhật , tủ lạnh (Sanyo, Nhật , tủ sấy ( inder, Đứ M y iện di, thi t ị P R, tủ sấy, tủ cấy,