Ảnh hưởng của nồng độ brassinolide trong sản phẩm nyro đến bệnh vàng lá gân xanh năng suất và phẩm chất trái quýt đường citrus reticulata blanco tại thị xã long mỹ tỉnh hậu giang

Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ “Ảnh hưởng của nồng độ Brassinolide trong sản phẩm Nyro đến bệnh vàng lá gân xanh, năng suất và phẩm chất trái quýt Đường Citrus reticulata Blanco tại thị xã

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BRASSINOLIDE TRONG SẢN PHẨM NYRO ĐẾN BỆNH VÀNG

LÁ GÂN XANH, NĂNG SUẤT VÀ PHẨM CHẤT

TẠI THỊ XÃ LONG MỸ, TỈNH HẬU GIANG

TRANG KIÊN BUSH

AN GIANG, 04/2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BRASSINOLIDE TRONG SẢN PHẨM NYRO ĐẾN BỆNH VÀNG

LÁ GÂN XANH, NĂNG SUẤT VÀ PHẨM CHẤT

TẠI THỊ XÃ LONG MỸ, TỈNH HẬU GIANG

TRANG KIÊN BUSH MSHV: CH165803

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 TS TRẦN SỸ HIẾU

2 GS TS TRẦN VĂN HÂU

AN GIANG, 04/2019

Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ “Ảnh hưởng của nồng độ Brassinolide trong sản phẩm

Nyro đến bệnh vàng lá gân xanh, năng suất và phẩm chất trái quýt Đường (Citrus

reticulata Blanco) tại thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang”, do học viên Trang Kiên

Bush thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Trần Sỹ Hiếu và GS TS Trần Văn Hâu Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo

thông qua ngày 20 tháng 04 năm 2019

LỜI CẢM TẠ Kính dâng

Cha Mẹ đã sinh ra con và hết lòng nuôi con khôn lớn nên người và ăn học thành tài

Xin tri ân sâu sắc

Thầy Trần Sỹ Hiếu và Thầy Trần Văn Hâu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh

nghiệm, giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu cho em trong suốt thời gian

thực hiện và hoàn thành đề tài

Quý Thầy Cô Trường Đại học Cần Thơ và Trường Đại học An Giang, đặc biệt là

quý Thầy Cô Khoa Nông nghiệp và Tài nguyên thiên nhiên đã truyền đạt những

kiến thức quý báu cho em hoàn thành khóa học Thầy Nguyễn Văn Chương với vai

trò là cố vấn học tập đã tận tình giúp đỡ em, tạo điều kiện tốt trong suốt thời gian

học tập

Xin chân thành cảm ơn

Quý Thầy Cô và các Anh Chị làm việc tại Bộ môn Khoa học cây trồng đã giúp đỡ,

tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt luận văn này Đặc biệt là cô Huỳnh Lê Anh Nhi

đã tận tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Gia đình chú Trần Văn Bạch, ấp 8, xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tình Hậu Giang đã

nhiệt tình hợp tác và giúp đỡ con hoàn thành thí nghiệm

Tập thể lớp Cao học Khoa học cây trồng Khóa 3 đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong

quá trình học tập và trải nghiệm suốt khóa học

Xin trân trọng gửi đến mọi người lời chúc sức khỏe, hạnh phúc và thành công!

An Giang, ngày 30 tháng 04 năm 2019

Người thực hiện

TRANG KIÊN BUSH

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu trong công

trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng Những kết luận mới về khoa học của công

trình này chưa được công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào khác

An Giang, ngày 30 tháng 04 năm 2019

Người thực hiện

TRANG KIÊN BUSH

LÝ LỊCH KHOA HỌC

I LÝ LỊCH SƠ LƢỢC

Họ và tên: Trang Kiên Bush

Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 28/6/1991

Nơi sinh: Vị Thủy, Hậu Giang

Quê quán: xã Vĩnh Thuận Tây, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang

Dân tộc: Kinh

Di động: 0944.446.165 E-mail: trangkienbush1991@gmail.com

II QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO

1 Đại học

Hệ đào tạo: Chính quy Thời gian đào tạo từ năm 2010 đến năm 2013

Nơi học: Đại học Cần Thơ Ngành học: Nông học

Chuyên ngành: Nông học, Khóa: 36

TRANG KIÊN BUSH, 2018 “Ảnh hưởng của nồng độ Brassinolide trong sản

phẩm Nyro đến bệnh vàng lá gân xanh, năng suất và phẩm chất trái quýt Đường (Citrus reticulata Blanco) tại thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang” Luận văn tốt

nghiệp Thạc sĩ Khoa học Cây trồng, Khoa Nông nghiệp và Tài nguyên thiên nhiên,

Trường Đại học An Giang 67 trang Cán bộ hướng dẫn: TS Trần Sỹ Hiếu và GS

TS Trần Văn Hâu

TÓM LƢỢC

Nghiên cứu được tiến hành để xác định ảnh hưởng của Brassinolide (BR) đến bệnh vàng lá gân xanh, năng suất và phẩm chất của trái quýt Đường tại thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang Thí nghiệm được tiến hành từ 8/2017 đến 10/2018, gồm 5 nghiệm thức là các nồng độ BR: 0,05 μΜ (0,5 mL Nyro); 0,10 μM (1,0 mL Nyro) và 0,15

μM (1,5 mL Nyro) mỗi nghiệm thức pha với 18 lít nước, phun cho 6 cây, nghiệm thức đối chứng dương (ZnSO4 + MnSO4 nồng độ 5.000 ppm) và nghiệm thức đối chứng âm (nước) Các nghiệm thức được phun định kỳ 2 tuần/lần cho đến khi thu hoạch trái (12 tháng) Thí nghiệm được bố trí theo thể thức ngẫu nhiên hoàn toàn, 6 lần lặp lại, mỗi lặp lại tương ứng với một cây Sự hiện diện của vi khuẩn

“Candidatus Liberibacter asiaticus” trong lá được xác định bằng phương pháp PCR

với cặp mồi đặc hiệu Định lượng tinh bột trong lá bằng dung dịch iod cũng được dùng để chẩn đoán bệnh Kết quả cho thấy nghiệm thức phun BR nồng độ 0,15 μM định kỳ 2 tuần/lần trong 12 tháng có tỷ lệ bệnh VLGX (2,3%), chỉ số bệnh VLGX (5,9%) thấp nhất, mật số vi khuẩn ở mức không phát hiện được bằng PCR và hàm lượng tinh bột trong lá thấp nhất (0,73 mg/g) Cây quýt Đường xử lý BR nồng độ 0,15 μM có năng suất cao nhất (28,4 kg/cây), kích thước trái và phẩm chất trái cao hơn so với nghiệm thức đối chứng âm và các nồng độ còn lại

Từ khóa: Brassinolide, điện di DNA, tinh bột, quýt Đường, vàng lá gân xanh

TRANG KIEN BUSH, 2018 “Effect of Brassinolide concentrations available in

„Nyro‟ foliar fertilizer on the citrus greening, yield and fruit quality of “Duong” mandarin (Citrus reticulata Blanco var Duong) grown in Long My district, Hau Giang province” Master thesis of Crop science College of Agriculture and Natural Resources An Giang University, 67 pages Supervisor: Dr Tran Sy Hieu and

Prof Dr Tran Van Hau

ABSTRACT

The study was conducted to determine the effects of Brassinolide (BR) concentrations on the citrus greening, yield and quality of “Duong” mandarin in Long My town, Hau Giang province A field trial was conducted from August 2017

to October 2018 There were 5 treatments including BR concentrations of 0.05 μM (0.5 mL of Nyro); 0.10 μM (1.0 mL Nyro) and 0.15 μM (1.5 mL Nyro) of each solution mixed with 18 liters of water, sprayed with 6 plants; positive control (ZnSO4 + MnSO4 5,000 ppm) and negative control treatment (water) The experiment was arranged in a completely randomized design with six replications, one tree for each replicate BR treatments were applied every two weeks until fruits

were harvested (12 months) The presence of “Candidatus Liberibacter asiaticus”

was determined by PCR using specific primers Leaf samples were collected before and after the experiment Quantification of leaves in iodine solution was used to diagnose the disease The results showed that spraying BR at 0.15 μM periodically twice a week for 12 months resulted in the lowest disease incidence (2.3%), disease index (5.9%) and undetectable level of bacterial titer as shown by PCR The latter was confirmed by the lowest concentration of starch in leaves (0.73 mg/g) Moreover, trees treated with BR 0.15 μM possessed higher yield (28.4 kg/tree), fruit size and fruit quality than these of the other treatments

Key words: Brassinolide, Citrus greening, DNA electrophoresis, “Duong”

mandarin, Starch

2.5.1 Lịch sử phát hiện, phân bố, tác nhân gây bệnh vàng lá gân xanh và ký chủ

2.5.3 Nghiên cứu các biện pháp quản lý bệnh vàng lá gân xanh 16

2.6.3 Vai trò của Brassinosteroids trong quá trình sinh trưởng 20 2.6.4 Vai trò của Brassinosteroids trong các quá trình phát triển 20 2.6.5 Một số nghiên cứu liên quan đến Brassinosteroids và Brassinolide 21 2.6.6 Cơ chế tác động Brassinosteroids đến bệnh vàng lá gân xanh trên cây có

3.4.2 Định lượng tinh bột trong lá bằng phản ứng iod - tinh bột 34

4.4 Kết quả chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh 45

4.8.2 Hàm acid tổng số (g/L) và vitamin C (mg/100 g) trong thịt trái 54

DANH SÁCH BẢNG

2.1 Diện tích và sản lượng quýt của một số nước và khu vực trên thế

2.3 Diện tích và sản lượng quýt ở đồng bằng sông Cửu Long năm

2.4

Kết quả điều tra khả năng chống chịu của giống/dòng cây có múi

thuộc họ Rutaceae đối với VLGX ở phía Nam, Việt Nam

(Nguyễn Văn Hòa và cs., 2012)

11

2.5

Kết quả xác định sự hiện diện của bệnh vàng lá gân xanh hại cây

có múi trên cùng một mẫu bệnh bằng sinh học phân tử tại Viện

Bảo vệ thực vật năm 2010 - 2012

12

2.6

Khả năng gây bệnh của vi khuẩn “Candidatus Liberibacter

asiaticus” trên một số chủng loại cây thuộc họ Rutacea tại Viện

Bảo vệ thực vật năm 2011

13

2.7 Tỷ lệ của các loài cây có múi dương tính với bệnh vàng lá gân

xanh chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR (Shokrollah và cs., 2009) 13 2.8

Kết quả giám định một số nhóm triệu chứng bệnh vàng lá gân

xanh trên cây quýt Đường bằng kỹ thuật PCR tại Viện Bảo vệ

Đặc tính nông học của cây quýt Đường làm vật liệu thí nghiệm ở

thời điểm trước khi thí nghiệm tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ,

tỉnh Hậu Giang, 2018

35

4.2

Tỷ lệ lá bệnh (%) VLGX trên cành ở các thời điểm quan sát dưới

ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên cây quýt

Đường tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

36

4.3

Chỉ số bệnh (%) VLGX trên cành ở các thời điểm quan sát dưới

ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên cây quýt

Đường tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

37

4.4

Tỷ lệ (%) cành ra đọt non ở các thời điểm quan sát dưới ảnh

hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường

tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

38

4.5

Chiều dài (cm) đọt non ở các thời điểm quan sát dưới ảnh hưởng

của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường tại xã

Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

39

4.6

Tỷ lệ (%) đọt non nhiễm bệnh VLGX ở các thời điểm quan sát dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên cây quýt Đường tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang,

41

4.8

Chiều rộng lá (cm) ở các thời điểm quan sát dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

42

4.9

Diện tích lá (cm2) ở các thời điểm quan sát dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

43

4.10a

Độ khác màu (E) lá ở các thời điểm quan sát dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

44

4.10b

Chỉ số b* của lá ở các thời điểm quan sát dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

45

4.11

Tỷ lệ ra hoa và tỷ lệ đậu trái dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

48

4.12

Tổng số trái/cây, khối lượng trái và năng suất trái ở thời điểm thu hoạch dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

49

4.13

Đường kính (cm), chiều cao (cm) trái, dày vỏ và trọng lượng vỏ trái ở thời điểm thu hoạch dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

50

4.14

Tỷ lệ (%) trái lệch tâm và trái khô đầu múi dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường khảo sát ở thời điểm thu hoạch trái tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

51

4.15

Sự thay đổi màu sắc (E, L, a, b) vỏ trái dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường khảo sát ở thời điểm thu hoạch trái tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

53

4.16

Một số chỉ tiêu phẩm chất trái dưới ảnh hưởng của các nồng độ Brassinolide khác nhau trên quýt Đường khảo sát ở thời điểm thu hoạch trái tại xã Long Trị, thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

55

DANH SÁCH HÌNH

2.1 Sơ đồ hệ thống phân loại Họ Rutaceace (Bùi Huy Đáp,

2.2a và b Triệu chứng gân xanh (vàng lá gân xanh) (a) và Triệu chứng

2.3a và b Triệu chứng vàng lá gân xanh (a) và Triệu chứng thiếu kẽm

2.4 Rụng trái non (a) và trái méo mó, lệch tâm (b) 15

2.5a và b Triệu chứng lá vàng lốm đốm (a) lá vàng lốm đốm và vàng

2.6 Cấu tạo hóa học Brassinolide, 24-epibrassinolide,

28-homobrassinolide, castasterone, 28-homocastasterone 19

Hàm lượng tinh bột trong lá dưới ảnh hưởng của các nồng

độ Brassinolide khác nhau trên cây quýt Đường tại thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang, 2018

47

4.5

Trái quýt Đường tại thời điểm thu hoạch Trái bị lệch tâm ở nghiệm thức đối chứng âm (A) và trái có tâm đối xứng bình thường ở nghiệm thức Brassinolide nồng độ 0,15 µM (B)

51

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Las “Candidatus Liberibacter asiaticus”

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trên thế giới, sản xuất quýt là một ngành trồng trọt lớn có diện tích hơn 2,3 triệu ha với sản lượng 30,4 triệu tấn/năm mang lại giá trị xuất khẩu hơn 4,6 tỷ Đô la

Mỹ và giá trị nhập khẩu hơn 4,65 tỷ Đô la Mỹ mỗi năm (FAOSTAT, 2017) Cây quýt là cây ăn trái quan trọng trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta, trong đó quýt Đường được trồng phổ biến nhiều nơi và có giá trị kinh tế cao (Nguyễn Bảo Vệ &

Lê Thanh Phong, 2011) Năm 2017, tổng diện tích quýt ở Việt Nam là 17.990 ha với 12.800 ha đang cho trái đạt sản lượng 172.606 tấn/năm, tập trung chủ yếu ở Đồng bằng sông Cửu Long với diện tích 5.100 ha đạt sản lượng 97.400 tấn/năm chiếm 60,2% tổng sản lượng của cả nước, diện tích sản xuất tập trung ở các tỉnh Đồng Tháp (1.632 ha), Hậu Giang (1.299 ha), Tiền Giang (510 ha), (Tổng cục thống kê, 2017) Hậu Giang là tỉnh nằm ở trung tâm tiểu vùng Tây sông Hậu, thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) Tính đến năm 2017, Hậu Giang có diện tích hơn 1.300 ha chuyên canh quýt Đường đứng thứ 2 trong vùng ĐBSCL (sau Đồng Tháp), trong đó diện tích đang cho trái là 1.092 ha với sản lượng 13.417 tấn/năm, tập trung chủ yếu ở Long Mỹ (800 ha), trong đó xã Long Trị là 216 ha cho sản lượng 5.000 - 6.000 tấn mỗi năm, riêng Hợp tác xã quýt Đường Long Trị chiếm gần 104 ha (UBND tỉnh Hậu Giang, 20161)

Quýt Đường Long Trị có trái to, vỏ mỏng, mọng nước, vị ngọt thanh và thơm,

là một loại trái cây đặc sản tỉnh Hậu Giang được nhiều người ưa chuộng, thương lái khắp nơi tìm đến mua để vận chuyển đi tiêu thụ ở các vùng miền trong cả nước Hiện nay, đã có hợp tác xã sản xuất quýt Đường theo tiêu chuẩn VietGAP tại xã Long Trị giúp xã viên có kỹ thuật trồng, chăm sóc theo hướng khoa học, giảm chi phí đầu tư, nâng cao chất lượng, sản lượng và độ an toàn của nông sản, mở ra hướng tiêu thụ mới khi liên kết với các doanh nghiệp để bao tiêu, quảng bá rộng rãi loại trái cây đặc sản này với người tiêu dùng Tuy nhiên, một trong những trở ngại đối với mở rộng diện tích, nâng cao chất lượng quýt Đường Long Trị là bệnh vàng

lá gân xanh,… làm cho sản lượng cũng như chất lượng trái giảm đáng kể, gây thiệt hại kinh tế rất lớn Theo thống kê của Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Hậu Giang (20162) diện tích quýt Đường Long Trị bị nhiễm bệnh vàng lá gân xanh

khoảng 172 ha (80% diện tích quýt Đường ở xã Long Trị) Hiện nay, một số người dân dùng thuốc kháng sinh tiêm chích cho cây quýt để trị bệnh vàng lá gân xanh Tuy nhiên, chưa có công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam công bố hiệu quả trị bệnh vàng lá gân xanh bằng cách này, bên cạnh đó hàm lượng kháng sinh tồn dư trong cây có thể sẽ vượt ngưỡng cho phép và ảnh hưởng đến sức khỏe con người

sau khi sử dụng trái Trần Thế Tục và cs (1995) cho rằng có nhiều loại sâu bệnh

gây hại trên cây quýt, trong đó bệnh vàng lá gân xanh (VLGX) là gây hại nghiêm trọng nhất Gần đây, việc sử dụng chất kích thích sức đề kháng của cây quýt kết hợp với các chất vi lượng để duy trì và phục hồi đối với cây bị nhiễm bệnh VLGX đang

được áp dụng và mang lại hiệu quả cao (Gottwald và cs., 2012) Brassinosteroid

(BRs) là nhóm hormone thực vật có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây trồng, ngoài ra BRs còn ảnh hưởng đến các quá trình phát triển khác nhau như sự nảy mầm của hạt, sự phát sinh rễ, sự ra hoa, sự lão hoá, quá trình rụng và chín, các BRs còn làm tăng sức đề kháng cho thực vật chống lại các stress phi sinh học và kháng

bệnh (Rao và cs., 2002) Kết quả nghiên cứu cho thấy, mật độ vi khuẩn “Candidatus

Liberibacter asiaticus” (Las) trong các cây có múi giảm đáng kể sau khi phun qua lá với epibrassinolide (EBR) trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng (Canales và

cs., 2016) Ngoài ra, đây là hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên được chiết từ thực vật

và được sử dụng với liều lượng thấp, an toàn với môi trường và không lưu tồn dư lượng độc tố trên nông sản (Nguyễn Minh Chơn, 2010)

Nhằm giải quyết được các yêu cầu phòng chống bệnh vàng lá gân xanh, để duy trì năng suất và phẩm chất trái vùng trồng quýt Đường ở Hậu Giang, việc thực

hiện đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ Brassinolide trong sản phẩm Nyro đến bệnh

vàng lá gân xanh, năng suất và phẩm chất trái quýt Đường (Citrus reticulata Blanco) tại thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang” mang tính thời sự cấp thiết

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định được hiệu quả của nồng độ Brassinolide trong sản phẩm Nyro 0.01SL phun qua lá lên tỷ lệ và chỉ số bệnh vàng lá gân xanh, năng suất và phẩm chất quýt Đường

1.3 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu

- Tác nhân gây bệnh VLGX: vi khuẩn “Candidatus Liberibacter asiaticus”

- Hoạt chất Brassinolide trong sản phẩm Nyro 0.01SL của công ty TNHH TM

& SX Ngọc Yến

- Đề tài được tiến hành trên quýt Đường có độ tuổi trung bình 5 - 6 năm trồng tại thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Đề tài nghiên cứu hiệu quả của Brassinolide đối với bệnh vàng lá gân xanh,

và mức độ ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng trái quýt Đường

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xác định sự hiện diện (dương tính hay âm tính) của vi khuẩn gây bệnh vàng

lá gân xanh trên cây quýt Đường

- Xác định được nồng độ phun Brassinolide đến bệnh vàng lá gân xanh và khả năng phục hồi trên cây quýt Đường ở tỉnh Hậu Giang

- Xác định được nồng độ phun Brassinolide ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng trái của cây quýt Đường ở thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang

1.5 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của nồng độ phun Brassinolide đến tỷ lệ bệnh vàng lá gân xanh, năng suất và phẩm chất trái quýt Đường ở thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm những tài liệu khoa học, phục vụ cho công tác giảng dạy cũng như nghiên cứu trên cây quýt Đường ở nước ta

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu bổ sung thêm giải pháp quản lý bệnh vàng lá gân xanh trên cây quýt Đường cho nông dân ứng dụng Phục hồi vườn quýt Đường bị nhiệm VLGX, cải thiện năng suất và phẩm chất trái

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 GIỚI THIỆU VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Bệnh vàng lá gân xanh là bệnh hại quan trọng nhất trên cây quýt ở các vùng trên thế giới Tuy nhiên, trên đồng ruộng, triệu chứng bệnh biểu hiện với mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào từng chủng loại cây quýt, nguồn gốc cây giống, môi giới truyền bệnh, tuổi cây khi bị nhiễm bệnh, chủng vi khuẩn gây bệnh cũng như phụ thuộc vào kỹ thuật trồng trọt, đốn tỉa, chăm sóc Bệnh làm giảm năng suất, chất lượng, tuổi thọ của cây và rất khó phòng trừ (Bové, 2006; Su & Chen, 1991)

BRs là nhóm hormone thực vật có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây trồng Ngoài ra, cung cấp BR cho cây quýt trong suốt thời kỳ ra hoa làm tăng tỷ lệ đậu trái, nếu cung cấp trong giai đoạn trái phát triển thì giảm rụng trái sinh lý và tăng

chất lượng trái (Iwahori và cs., 1990) Kết quả nghiên cứu điều trị bệnh VLGX với BRs của Canales và cs (2016) cho rằng việc áp dụng EBR làm giảm đáng kể mật số

vi khuẩn gây ra bệnh VLGX trên cây có múi và có thể cung cấp một công cụ hữu ích trong một chương trình quản lý tổng hợp Các kết quả cho thấy rằng EBR có hiệu quả kích thích một loạt các gen phòng vệ trong cây có múi gồm Superoxide dismutase (SOD); Glutathione peroxidase (GPX1); Chitinase (CHI1); Beta - 1, 3 glucanase; Phenylalanine ammonia - lyase (PAL); Allene oxide synthase (AOS); acid hydroperoxide lyase (HPL) Mức biểu hiện cao của cả ba gen HPL, AOS và PAL có thể là nguyên nhân của sự gia tăng khả năng kháng bệnh chống lại vi khuẩn

Las ở cây có múi có phun EBR trong nghiên cứu của Canales và cs (2016) Do đó,

việc áp dụng phun BR có thể sẽ giúp giảm bệnh đối với cây bị bệnh VLGX đảm bảo năng suất và phẩm chất trái quýt Đường

2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI QUÝT ĐƯỜNG

2.2.1 Nguồn gốc và phân bố

Các tác giả (Bùi Huy Đáp, 1960; Haa, 1984; Reuther, 1973; Trần Thế Tục,

1967; Wakana, 1998 & Reuther và cs., 1978) cho rằng cây quýt có nguồn gốc ở

miền Đông Nam châu Á, trải dài từ Ấn Độ qua Himalaya, Trung Quốc xuống vùng quần đảo Philippine, Malaysia, miền Nam Indonesia hoặc kéo đến lục địa châu Úc Các giống quýt hàng hóa có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản hoặc Đông Nam châu Á, riêng quýt Satsuma có nguồn gốc hoàn toàn ở Nhật Bản (Nguyễn Bảo Vệ &

Lê Thanh Phong, 2011) Quýt (Citrus reticulata): cây cao chừng 2,5 m, lá xanh sẫm

nhỏ, cuống lá có cánh hẹp Trái dẹt khi chín màu da cam, có 9 - 13 múi, dễ bóc vỏ

và chia múi Hạt phôi màu xanh lục Có 4 nhóm phụ là Quýt chịu rét: trồng nhiều ở nam Nhật Bản, loại này thường chín sớm và không có hạt; Quýt Kinh: trái to, vỏ

5

dày, khó bóc vỏ thấy trồng nhiều ở Việt Nam, Thái Lan, Campuchia; Quýt Ponkan: gồm các loại trồng nhiều ở Đông Nam Á, có tên gọi khác nhau (Việt Nam có cam Đường Canh, cam Giàng, quýt Bộp Bố Hạ ) Các giống này vỏ đều dễ bóc, trái to

và ngọt (Tanaka, 1954; Trần Thế Tục, 1995) Vào năm 1805, Abraham Hume đã đem cây quýt đầu tiên đến trồng ở nước Anh và sau đó phổ biến ở vùng Địa Trung

Hải (Tanaka, 1954) Trần Thượng Tuấn và cs (1999) cho rằng cây quýt Đường

không biết được trồng ở ĐBSCL từ bao giờ và có phải nhập từ Thái Lan hay không,

vì quýt Đường trước đây được gọi là quýt Xiêm do trái lúc còn non ít chua nên người dân Chợ Lách chở cây giống đem bán nên gọi là quýt Đường

(Nguyễn Minh Châu và cs., 2012) Nguyễn Bảo Vệ và Lê Thanh Phong (2011) cho rằng cây quýt Đường (còn gọi là quýt Xiêm), quýt Đường có tên khoa học là Citrus

reticulata Blanco thuộc chi Citrus, nhóm nhỏ Eucitrus, họ Rutaceae và họ phụ

Aurantioideae Việc nghiên cứu phân loại quýt đã được các nhà nghiên cứu thực vật

học tiến hành từ hơn 200 năm trước Lần đầu tiên Line (1753) được trích dẫn bởi

Bùi Huy Đáp (1960) đã sắp xếp và đưa giống Citrus vào hệ thống thực vật học Ở lần xuất bản đầu tiên trong tác phẩm " Species Platarium" ông đã chia giống citrus thành hai loài đó là: Ctrus medica (L) và Citrus aurantium (L) (Hình 2.1) Tác phẩm được hoàn thành vào lần xuất bản thứ hai (1763) với loài bổ sung "Citrus

trifloliata " Có thể mô tả hệ thống phân loại theo sơ đồ sau:

Họ Rutaceae Họ phụ Aurantioideae (250 loài)

(2) Tộc Citreae (1) Tộc Clausenae

2.3 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT QUÝT

2.3.1 Trên thế giới

Theo số liệu thống kê của FAO, năm 2016 tổng diện tích trồng quýt trên thế giới là hơn 2,6 triệu ha với sản lượng hơn 32,7 triệu tấn, trong đó châu Á là vùng sản xuất quýt lớn nhất với hơn 2 triệu ha (chiếm 77,97% tổng diện tích quýt trên thế giới) đạt hơn 22,1 triệu tấn (chiếm 68,7%) Ở khu vực châu Á, Trung Quốc là quốc gia đứng đầu trong khu vực và cả trên thế giới với diện tích quýt là 1,73 triệu ha và sản lượng quýt là 17,31 triệu tấn; đứng thứ hai là Tây Ban Nha với diện tích hơn

164 ngàn ha, sản lượng hơn 2,9 triệu tấn (Bảng 2.1) Sản phẩm quýt mang lại giá trị kinh tế cao, năm 2016 cả thế giới nhập khẩu hơn 4,99 triệu tấn với giá trị gần 4,7 tỷ

Đô la Mỹ; xuất khẩu gần 5,1 triệu tấn với giá trị mang lại hơn 4,4 tỷ Đô la Mỹ Đứng đầu về sản lượng và giá trị xuất nhập khẩu quýt trên thế giới là khu vực châu Á: nhập khẩu hơn 1,3 triệu tấn với giá trị hơn 996 triệu Đô la Mỹ; xuất khẩu hơn 1,89 triệu tấn với giá trị hơn 1,57 tỷ Đô la Mỹ (FAOSTAT, 2017)

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng quýt của một số nước và khu vực trên thế

giới năm 2016 Vùng/Quốc gia Diện tích

(ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (tấn)

chạp do trình độ dân trí không đồng đều giữa các vùng, dịch hại diễn biến phức tạp (Nguyễn Văn Luật, 2006)

Bảng 2.2 Diện tích, năng suất và sản lƣợng quýt ở Việt Nam năm 2017

Vùng/địa điểm Diện tích thu

hoạch (ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lƣợng (tấn)

Bảng 2.3 Diện tích và sản lƣợng quýt ở đồng bằng sông Cửu Long năm 2017

Tỉnh/Thành Diện tích thu

hoạch (ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lƣợng (tấn)

Đồng Tháp 1.632,0 32,4 52.819,7 Hậu Giang 1.092,0 12,3 13.417,1 Tiền Giang 510,0 25,8 13.170,0

2 4 ĐẶC ĐIẾM SINH HỌC VÀ THỰC VẬT CỦA CÂY QUÝT ĐƯỜNG 2.4.1 Rễ

Rễ quýt Đường thuộc loại rễ nấm (Micorhiza), nấm Micorhiza sống cộng sinh

trên lớp biểu bì của rễ, có vai trò như những lông hút ở các cây trồng và thực vật khác, cung cấp nước, muối khoáng và một lượng nhỏ chất hữu cơ cho cây, cây cung cấp hydrate cacbon cho nấm (Trần Thế Tục, 1990) Do những đặc điểm trên mà quýt không ưa trồng sâu, vì rễ quýt chủ yếu là rễ bất định, phân bố rất nông (10 - 30 cm), phân bố tương đối rộng và tập trung ở tầng đất mặt

2.4.2 Thân, cành

Đào Thanh Vân và cs (2000) cho rằng cành của quýt gồm các loại cành chính

đó là cành mẹ, cành dinh dưỡng, cành trái Sự phân loại này theo chức năng của từng loại cành Mối liên hệ giữa các loại cành và các đợt đọt khá khăng khít Cành dinh dưỡng có thể trở thành cành mẹ, hoa mọc ở mầm bất định trên thân chính hoặc cành dinh dưỡng cao tuổi làm cho tuổi của cành mẹ, của cành trái có độ dao động lớn Quýt Đường là cây tiểu mộc, cao 2 - 4 m, có gai xanh (Phạm Hoàng Hộ, 2003) Khi cây quýt Đường được 5 năm tuổi có chiều cao trung bình là 4,1 m (Trần

Thượng Tuấn và cs., 1999) và có những cây có chiều cao từ 5 - 5,5 m (Trần Thế Tục và cs., 1998) Cây quýt Đường có mật độ cành thưa, mọc thẳng đứng nên tán có dạng elip (Trần Thượng Tuấn và cs., 1999) Trần Thế Tục và cs (1998) cho rằng

quýt Đường có tán thưa, hướng ngọn và phân cành nhiều, chiều rộng tán là 2,5 m

2.4.3 Lá

Lá quýt Đường thuộc loại lá đơn, phần lớn mép lá có hình răng cưa, lá có eo Bình quân trên mặt lá có từ 400 - 500 khí khổng/mm2 Cây quýt trưởng thành thường có từ 150.000 - 200.000 lá, tương ứng với tổng diện tích khoảng 200 m2

Tuổi thọ lá 2 - 3 năm tuỳ theo vùng sinh thái, vị trí và tình trạng sinh trưởng của cây

và cành mang lá, vị trí của cấp cành (Lê Đình Sơn, 1993) Bộ lá trên cành trái và cành mẹ có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nâng cao năng suất của quýt Đường Wakana (1998) cho rằng quýt Ôn Châu có năng suất cao thì ít nhất phải có từ 40 lá cho một trái Ở cây quýt 9 tuổi cần phải có ít nhất 2,3 m2 lá để sản xuất 1 kg trái

(Mingdu & Li, 1989) Trần Thượng Tuấn và cs (1999) cho rằng lá quýt Đường

thuộc lá đơn, không rụng theo mùa, phiến lá có màu xanh, dạng lá hình mác Chiều dài lá trưởng thành khoảng 8,4 cm và chiều rộng lá khoảng 4,2 cm Cuống lá ngắn với chiều dài trung bình 3,3 mm, cánh lá hẹp đôi khi không rõ

2.4.4 Hoa

Quýt Đường phân hoá hoa từ sau khi thu hoạch đến trước khi nảy đọt Xuân đa

số từ tháng 11 đến đầu tháng 2 năm sau Hoa quýt phần lớn có mùi thơm Xét về

hình thái có 2 loại hoa: hoa phát triển đầy đủ và hoa dị hình (Swingle & Reece, 1967) Hoa cây cam quýt thuộc loại hoa đơn hay chùm, mọc từ nách lá, thường là hoa lưỡng tính Hầu hết các loại cây có múi đều tự thụ, tuy nhiên cũng có loài thụ phấn chéo như một số loài quýt Sự thụ phấn chéo sẽ làm tăng năng suất nhưng trái

sẽ có nhiều hột (Trần Văn Hâu, 2009) Bustan và Goldschmidt (1998) được trích

dẫn bởi Trần Thượng Tuấn và cs (1999) chỉ ra rằng ở thời kỳ hoa nở có sự phát triển

các bộ phận của hoa ngoại trừ bầu noãn Thời gian từ khi trổ hoa đến khi trái chín khoảng 9 tháng và có thể neo trái đến tháng thứ 10

120 g (Trần Thế Tục và cs., 1998) Nguyễn Minh Châu (2009) cho rằng trái quýt

Đường vỏ mỏng có màu vàng xanh khi chín và dễ bóc, trọng lượng 123 g/trái, tép màu vàng cam, nhiều nước, vị ngọt không chua, mùi thơm Trần Thượng Tuấn và

cs (1999) cho rằng vỏ trái có khối lượng khoảng 15 g và chiếm 13,2% trọng lượng

trái, tinh dầu ở vỏ trái ít the và ít đắng Lượng nước trái quýt Đường nhiều, có màu cam, thơm, ngon, nước trái có độ Brix là 9%, trị số pH là 3,6 và múi dai, thịt trái có màu cam, mềm, con tép lớn, lượng dịch trái nhiều, thơm ngon

2.4.6 Hột

Trần Thượng Tuấn và cs (1994) cho rằng hình dạng, kích thước, trọng lượng,

số lượng, hột trong trái và mỗi múi thay đổi nhiều tùy giống Ở Quất (Fortunella

sp.), hột nhỏ nhất, kế đến là chanh, quýt, cam, lớn nhất là bưởi Số lượng hột trong mỗi múi có từ 0 - 6 hột Có loại cho nhiều hột như bưởi, có thể có từ 80 - 100 hột mỗi trái Quýt Đường trung bình có 13,2 hột/trái, nặng 2,8 g và chiếm 2,5% trọng lượng trái, hột nhiều phần nào ảnh hưởng đến chất lượng trái Hột màu vàng nhạt, dạng cầu, dài 11,9 mm, rộng 8,2 mm, vỏ hột láng, tử diệp và phôi đều có màu trắng

xanh và mỗi hột trung bình có khoảng 2 phôi (Trần Thượng Tuấn và cs., 1999) Khi

nẩy mầm, từ hột mọc ra rễ cái to khỏe và rễ nhánh xuất hiện khi rễ cái dài khoảng 8

- 10 cm, các rễ lông thì phát triển ít, trục thượng diệp và 2 lá mầm đầu tiên được thành lập trên mặt đất (Nguyễn Bá Phú, 2013)

2 5 NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH TRÊN QUÝT ĐƯỜNG

2.5.1 Lịch sử phát hiện, phân bố, tác nhân gây bệnh vàng lá gân xanh và

ký chủ rầy chổng cánh

Bệnh vàng lá gân xanh là bệnh hại quan trọng và gây hại nặng nề nhất đối với nghề trồng quýt trên thế giới (Bové, 2006; Su & Chen, 1991) Trên cơ sở kết quả nghiên cứu sự lan truyền của bệnh qua mắt ghép, cành chiết và qua côn trùng môi

giới là rầy chổng cánh Diaphorina citri vào năm 1967 nguyên nhân gây bệnh đã

được kết luận là do virus gây ra Các tác giả còn cho rằng vi rút gây bệnh VLGX cùng loài với virus gây bệnh “stubborn” nhưng là các dòng khác nhau (Fraser và

cs., 1966; Salibe & Cortez, 1968) Sau khi đã xác định được triệu chứng stubborn

do một loài mycoplasma có tên là Spiroplasma citri gây ra (Saglio và cs., 1973), các

tác giả cũng đã cho rằng mycoplasma là tác nhân gây bệnh VLGX Trong những

nghiên cứu tiếp theo Garnier và cs (1984a; 1984b) đã phát hiện được lớp vách dày

bao quanh tế bào, màng tế bào chất dày hơn từ 7 - 10 nm Từ các đặc điểm cơ bản này đã cho phép các tác giả xác định tác nhân gây bệnh VLGX là vi khuẩn Vi

khuẩn gây bệnh VLGX là Candidatus Liberibacter thuộc α - Proteobacteria, họ

Eubacteria Vi khuẩn được lan truyền qua mắt ghép, cành chiết và qua côn trùng

môi giới là rầy chổng cánh Diaphorina citri ở châu Á và rầy Trioza erytrea ở châu

Phi, bệnh có nhiều tên gọi ở các nước khác nhau như Huanglongbing, đọt vàng,

greening, thoái hóa mạch dẫn (Jagoueix và cs., 1994; 1996)

Ở Việt Nam, bệnh vàng lá gân xanh (VLGX) được ghi nhận từ những năm

1960 (Trung và cs., 2005) Kết quả điều tra năm 1990 - 1994 do Viện Bảo vệ thực

vật tiến hành cho thấy bệnh gây hại cây có múi (cam, quýt, bưởi, chanh) ở tất cả các vùng miền với tỷ lệ cây bị bệnh từ 16,7 - 100%, mức độ bị bệnh tùy thuộc vào điều kiện canh tác, phương pháp nhân giống và kỹ thuật phòng trừ sâu bệnh, các vùng trồng cam quýt bị bệnh từ 54,2 - 82,5%, bệnh VLGX gây hại trên cam, quýt nặng

hơn trên bưởi (Hà Minh Trung và cs., 2003; Vien và cs., 2012) Nguyễn Văn Hoà

và cs (2012) đã thu thập được 130 nguồn cây thuộc họ cây có múi tại các vùng sinh

thái Việt Nam và nhập nội Bước đầu đánh giá sơ bộ tính chống chịu bệnh VLGX của tập đoàn cây có múi trong điều kiện đồng ruộng Kết quả được đánh giá bằng phương pháp iod và quan sát triệu chứng Các giống thuộc nhóm cam, chanh và quýt mẫn cảm với bệnh VLGX, các giống bưởi và tắc ít mẫn cảm hơn (Bảng 2.4)

Rầy chổng cánh Diaphorina citri là loại rầy có kích thước dài 3,2 - 3,5 mm, toàn

thân màu xám tro, hơi phớt xanh Rầy non và rầy trưởng thành chích hút dịch trên cây, lá non, lá bánh tẻ Thời gian phát triển của trứng từ 4 - 12 ngày, rầy non từ 10 -

35 ngày, rầy trưởng thành vũ hóa sau 6 - 7 ngày thì đẻ trứng Rầy trưởng thành sống

được từ 50 - 60 ngày (Đường Hồng Dật, 2003) Hà Minh Trung và cs (1995) đã

nghiên cứu sự lan truyền bệnh VLGX qua mắt ghép và qua côn trùng môi giới, một

cá thể rầy chổng cánh (RCC) mang nguồn bệnh chích hút trên cây quýt Ponkan 3 ngày đã truyền được bệnh với tỷ lệ 3/10 cây bị bệnh Với 10 cá thể rầy trên cây sau lây nhiễm và tỷ lệ cây bị bệnh là 5/10 cây, nếu 20 rầy tỷ lệ nhiễm là 6/10 cây Triệu chứng đều biểu hiện sau lây nhiễm ở tháng thứ 6 và 7 Lê Thị Thu Hồng (2000) đã khẳng định bệnh VLGX là bệnh hại quan trọng, đồng thời cũng lan truyền qua phương pháp nhân giống vô tính Skelley và Hoy (2004) đã sử dụng phương pháp

nhân nuôi rầy chổng cánh trên cây nguyệt quế (Murraya paniculata L.), cây không

bị nhiễm bệnh do môi giới hoặc ghép lây bệnh Hall và Richardson (2012) đã nuôi

RCC trên cây nguyệt quế và cây Citrus macrophylla Wester, một số loài là ký chủ tốt cho RCC bao gồm: Citrus reticulata Blanco, Bergera koenigii L., Citrus maxima (Burm.) Merr., Citrus medica L., Citrus taiwanica và Citrus aurantiifolia (Christm.)

Swingle

Bảng 2.4 Kết quả điều tra khả năng chống chịu của giống/dòng cây có múi thuộc họ

Rutaceae đối với VLGX ở phía Nam, Việt Nam (Nguyễn Văn Hòa và cs., 2012)

Tên khoa học Tên giống Mức độ nhiễm

Ghi chú: +: Ít mẫn cảm; ++: Trung bình; +++: Nặng; ++++: Rất nặng, -: không lộ triệu chứng

Chẩn đoán và giám định bệnh vàng lá gân xanh: Dưới kính hiển vi điện tử

quan sát được vi khuẩn có lông cứng, kích thước 350 - 550 nm x 600 - 1500 nm, vách tế bào có 2 lớp, độ dầy từ 20 - 25 nm Hình dạng của vi khuẩn thường có hình gậy, thon dài (Huang, 1987) Phương pháp PCR đã được ứng dụng cho kỹ thuật

chẩn đoán tác nhân gây bệnh (Jagoueix và cs., 1996) Hajivand và cs (2009) cho

rằng bệnh có thể được chẩn đoán dựa theo các dạng triệu chứng trên đồng ruộng Tuy nhiên các dạng triệu chứng bệnh sẽ thay đổi trên từng giống khác nhau, mặt khác sự thể hiện của triệu chứng bệnh còn phụ thuộc vào số lượng của vi khuẩn có

trong cây Khi số lượng vi khuẩn trong cây thấp, mặc dù đã bị nhiễm bệnh cây vẫn không biểu hiện triệu chứng, nên không phát hiện được bệnh Số lượng vi khuẩn gây bệnh được xác định cao nhất ở quýt Ponkan, sau đó là Tankan tangor Phương pháp chẩn đoán nhanh và đơn giản với bệnh VLGX, đã phát hiện tinh bột trong lá cây có múi bằng phản ứng tinh bột - iốt, do tinh bột tích lũy bất thường trong lá bị nhiễm VLGX (Schneider, 1968) Kết quả phân tích định lượng tinh bột trung bình

của ba giống cam quýt (Citrus depressa, Citrus reticulata, Citrus oto) cho thấy, có

hàm lượng tinh bột trong lá bị nhiễm VLGX cao hơn rất nhiều so với trong lá khỏe

mạnh (Takushi và cs., 2007) Chamberlain và Irey (2008) đã so sánh xét nghiệm

thực địa dựa trên phản ứng tinh bột với kết quả từ real - time PCR trên 1.759 cây cam quýt có triệu chứng nghi ngờ bệnh VLGX, kết quả có 85% các mẫu dương tính với real - time PCR so với 78% dương tính đối với thử nghiệm tinh bột, iod phản ứng với tinh bột tạo màu xanh đậm Do đó, khuyến cáo rằng thử nghiệm tinh bột nên được coi là một công cụ hữu ích để chẩn đoán VLGX trên thực địa, nhưng không phải là một phương pháp thay thế cho PCR

Ở Việt Nam, trong giai đoạn 1991 - 1992, sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử

đã khẳng định bệnh vàng lá cây quýt ở nước ta là bệnh VLGX châu Á, RCC là môi

giới truyền bệnh (Hà Minh Trung và cs., 1995) Kết quả phân tích của Lê Mai Nhất

(2014) cho thấy bệnh VLGX đã đã gây hại nặng trên hầu hết tất cả các loài cây có múi điều tra (Bảng 2.6), tuy nhiên mức độ nhiễm bệnh giữa các loài là rất khác nhau, tỷ lệ mẫu bị nhiễm bệnh VLGX trong số mẫu điều tra từ 60,0 đến 86,0%

trong đó quýt Đường là cao nhất (Bảng 2.5) Nguyễn Thị Ngọc Trúc và cs (2002)

chỉ ra rằng hàm lượng DNA của vi khuẩn Las ở quýt Đường thì cao hơn cam và bưởi, do đó tỷ lệ mẫn cảm với bệnh của quýt Đường là lớn nhất, kế đến là cam và

bưởi Một thí nghiệm ở Malaysia của Shokrollah và cs (2009) cũng chỉ ra rằng hầu

hết các loài cây có múi đều bị nhiễm bệnh VLGX, trong đó quýt Đường có tỷ lệ nhiễm bệnh VLGX cao nhất (100%) sau 6 tháng truyền bệnh, kế đến là cam (83,3%), quất, chanh và cam chua nhiễm nhẹ hơn (Bảng 2.7)

Bảng 2.5 Kết quả xác định sự hiện diện của bệnh vàng lá gân xanh hại cây có múi trên cùng mẫu bệnh bằng sinh học phân tử tại Viện Bảo vệ thực vật năm 2010 - 2012

Chủng loại

cây có múi Tên khoa học

Tổng số mẫu phân tích

Tỷ lệ (%) mẫu

bị bệnh

Quýt Đường Citrus reticulata 50 86,00

Chanh ta Citrus aurantifolia 15 66,67

Bảng 2.6 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn “Candidatus Liberibacter asiaticus” trên

một số chủng loại cây thuộc họ Rutacea tại Viện Bảo vệ thực vật năm 2011

Tên tiếng Việt Tên khoa học

Kết quả phân tích PCR sau thời gian LBNT Tỷ lệ

(%)

1 tháng 3 tháng 5 tháng

Ghi chú: +: Dương tính với bệnh VLGX;

-: Âm tính với bệnh VLGX; LBNT: Lây bệnh nhân tạo

Bảng 2.7 Tỷ lệ của các loài cây có múi dương tính với bệnh vàng lá gân xanh chẩn

đoán bằng kỹ thuật PCR (Shokrollah và cs., 2009)

STT Tên khoa học Tên tiếng Việt Tỷ lệ (%) mẫu

dương tính

2.5.2 Triệu chứng bệnh vàng lá gân xanh

Triệu chứng của bệnh VLGX trên cây quýt Đường được Hà Minh Trung và cs

(1995) mô tả và ghi nhận, trên đồng ruộng lá cây quýt Đường bị bệnh VLGX biểu hiện nhiều triệu chứng khác nhau như:

- Phiến lá bị biến màu vàng, chỉ còn gân lá và các mô xung quanh gân lá còn xanh (Hình 2.2a), triệu chứng này rất giống với hiện tượng thiếu Mangan (Mn) trên cây và được gọi là triệu chứng vàng lá gân xanh khác với triệu chứng gân trong thể hiện ở bệnh Tristeza (Hình 2.2b) Bệnh rất phổ biến ở các vùng trồng cây có múi Cây bị bệnh thường lùn nhỏ, tán lá không đều, lá nhỏ, Lá bị biến vàng loang lổ hoặc phiến lá vàng, gân lá xanh Bệnh xuất hiện ban đầu trên các lá sau đó lan ra cành, cuối cùng toàn cây bị vàng lá (Đường Hồng Dật, 2003)

(a) (b)

Hình 2.2 Triệu chứng gân xanh của bệnh vàng lá gân xanh (a); triệu chứng gân trong

của bệnh Tristeza (b) (Hà Minh Trung và cs., 1995)

- Hầu hết phiến lá và gân biến màu vàng chỉ còn lại một vài điểm xanh xen kẽ giữa nền vàng, lá mới ra vàng, nhỏ và uốn cong (Hình 2.3a), triệu chứng này giống với thiếu kẽm (Hình 2.3b) Lá già có màu xám nhạt, cong vẹo, gân lá bị sưng, triệu chứng này giống với thiếu bo (B) Lá bệnh rụng sớm, cành bệnh trở nên trơ trụi, dần dần khô chết Trên hoa, trái: hoa ra trái vụ, trái nhỏ, tâm trái bị vẹo, nhiều hạt bị lép

Rễ kém phát triển hơn là cây bình thường

Hình 2.3 Triệu chứng bệnh vàng lá gân xanh (a) và triệu chứng thiếu kẽm (b) (Lê Mai

Nhất, 2014)

- Hong và cs (2009) chỉ ra rằng ở vùng nhiệt đới triệu chứng bệnh vàng lá

gân xanh xuất hiện quanh năm trên lá Phiến lá bị đổi màu từng phần, lá lốm đốm xanh vàng, gân xanh, lá vàng, cong giống như triệu chứng thiếu kẽm Bệnh không ảnh hưởng tới mô gỗ nhưng ảnh hưởng đến mô libe, sự vận chuyển đường ở diệp lục và nhu mô đến các phần trên cây bị bệnh Cành có thể bị khô, chết Triệu chứng lốm đốm được cho là một triệu chứng điển hình, sau đó lá chuyển sang màu vàng rõ rệt Cây bị bệnh thường cho trái méo mó (Nguyễn Minh Châu, 2001) Khi cây bị

nhiễm bệnh VLGX, lá ở một số cành chuyển sang màu vàng và cuối cùng cây sẽ bị

chết trong một vài năm, khi lá cây bệnh chuyển màu vàng cành cây bệnh bị chết

khô (Nguyễn Minh Châu và cs., 2012) Lê Thị Thu Hồng (2000) cho rằng khi cây

quýt Đường bị bệnh VLGX thì các hàm lượng trong cây bị giảm theo (Kẽm là

77,13%; Can xi là 28,91%); nhưng hàm lượng Na, Fe và Al lại tăng cao Trái quýt

Đường bị bệnh giảm trọng lượng 66,93%, độ Brix giảm 0,04%

Hình 2.4 Rụng trái non (a) và trái méo mó, lệch tâm (b) (Lê Thị Thu Hồng, 2000)

Kết quả nghiên cứu của Lê Mai Nhất (2014) chỉ ra rằng với nhiều nhóm triệu

chứng của bệnh VLGX trên cây quýt Đường cho thấy sự phong phú và đa dạng của

bệnh Các dạng triệu chứng bệnh VLGX trên quýt Đường được phân loại thành

từng nhóm triệu chứng điển hình đồng thời được tác giả phân tích bằng sinh học

phân tử, kết quả các nhóm triệu chứng được tác giả mô tả như sau: Trên lá: lá vàng

lốm đốm; vàng lá cục bộ trên từng cành/cây; lá vàng lốm đốm và vàng lá cục bộ

Trên cành: khô cành, chết cây, lá vàng Trên trái: cây ra hoa, kết trái, trái chín

ngược (chín từ phía trên cuống trái chín xuống), ít nước và bị xơ (Bảng 2.8; Hình

2.5a - d)

Bảng 2.8 Kết quả giám định một số nhóm triệu chứng bệnh vàng lá gân xanh trên cây

quýt Đường bằng kỹ thuật PCR tại Viện Bảo vệ thực vật năm 2010 - 2012

STT Nhóm triệu chứng trên cây quýt Đường Tổng số mẫu

phân tích

Tỷ lệ mẫu bị bệnh (%)

2 Vàng lá cục bộ trên từng cành/cây 15 100

3 Lá vàng lốm đốm và vàng lá cục bộ 20 100

5 Trái bị bệnh VLGX (cây ra hoa, kết trái,

trái chín ngược, ít nước và bị xơ) 8 100

(a) (b)

Hình 2.5 Lá vàng lốm đốm (a); Lá vàng lốm đốm và vàng lá cục bộ (b); Khô cành (c)

và triệu chứng trái chín ngƣợc (d) (Lê Mai Nhất, 2014)

2.5.3 Nghiên cứu các biện pháp quản lý bệnh vàng lá gân xanh

Buitendag và Boembsen (1993) đã cho rằng quản lý phòng trị bệnh VLGX là kết quả của biện pháp phòng trừ tổng hợp gồm: sử dụng cây sạch bệnh, giảm mật độ cây nhiễm, điều tra và chặt bỏ ngay những cành, cây có triệu chứng bệnh và phòng trừ RCC truyền bệnh Cây bị bệnh ở giai đoạn sớm được chăm sóc bằng cách cung

cấp dinh dưỡng hợp lý thì cây cũng cho trái bình thường (Gottwald và cs., 2012)

Bệnh VLGX là tác nhân chính gây thiệt hại năng suất cây có múi ở vùng nhiệt đới

và cận nhiệt đới Bệnh lan truyền nhanh chóng trên đồng ruộng qua RCC Công tác quản lý bệnh VLGX được thực hiện bằng cách sử dụng cây giống sạch bệnh, loại bỏ

nguồn bệnh và ngăn ngừa sự lây nhiễm từ côn trùng môi giới (Su và cs., 2012)

2.5.3.1 Sử dụng cây giống sạch bệnh

Để giải quyết các vấn đề bệnh lây nhiễm qua mắt ghép trên cây quýt Đường ở nước ta cần tuyển chọn cây đầu dòng, tạo cây sạch bệnh bằng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng, kiểm tra bệnh ở cây vi ghép, khảo sát đặc tính kinh tế của cây mẹ vi ghép và phân phối mắt ghép sạch bệnh cho vườn ươm chuyên trách (Ngô Vĩnh Viễn

và cs., 2009; Trung và cs., 2005)

2.5.3.2 Biện pháp canh tác

Đốn tỉa, tạo tán là một trong những công việc cơ bản trong quản lý vườn cây quýt Đường Biện pháp cắt tỉa, đốn cải tạo là để loại trừ ưu thế ngọn cho các đọt bên phát triển theo hướng có lợi về năng suất và chất lượng trái, đảm bảo sinh trưởng cân đối giữa sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực của cây, hạn chế sâu bệnh hại, nâng cao năng suất, mẫu mã trái, quản lý được bộ tán của cây (Nguyễn Minh Châu

và cs., 2012)

2.5.3.3 Biện pháp sinh học trong phòng trừ côn trùng môi giới (Diaphorina citri Kuwayama)

Môi giới truyền bệnh là RCC (Diaphorina citri) phát sinh và gây hại mạnh

vào thời kỳ cây ra đọt non Các nghiên cứu bước đầu ghi nhận tại các tỉnh trồng nhiều quýt ở ĐBSCL cho thấy có 14 loài ong ký sinh (ký sinh bậc 1 và ký sinh bậc

2) có liên hệ với RCC, trong đó có 2 loài ký sinh chính là Diaphorencyrtus

aligarhensis Shaff và Tamarixia radiata (Waterson) với tỷ lệ ký sinh của 2 loài có

thể lên đến 59,3% - 63,9% và tỷ lệ này thường cao trong các tháng mùa hè (Huỳnh

Trí Đức và cs., 1999) Trồng ổi xen trong vườn quýt Đường đã được người dân

huyện Cái Bè - Tiền Giang thực hiện từ năm 2000, tuy chưa xác định được hiệu quả trong việc phòng chống bệnh VLGX nhưng cách trồng này đã tăng thu nhập cho chủ vườn trong giai đoạn kiến thiết cơ bản của vườn Kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu cây ăn quả miền Nam đã chỉ ra rằng sau khi trồng từ 1 đến 1,5 năm cây quýt Đường chưa bị nhiễm bệnh, nhưng sau đó tỷ lệ bệnh này tăng lên tuỳ theo cách

áp dụng các biện pháp quản lý khác nhau (Nguyễn Minh Châu và cs., 2012) Trồng

ổi Xá lỵ vàng với tỷ lệ 1:1 bước đầu có hạn chế RCC và tốt nhất nên trồng ổi ở

xung quanh vườn quýt Đường (Vien và cs., 2012)

2.5.3.4 Biện pháp hóa học trong phòng trừ côn trùng môi giới (Diaphorina citri Kuwayama)

Chiến lược quản lý tổng hợp bệnh trên đồng ruộng chủ yếu dựa vào kiểm soát môi giới truyền bệnh là RCC Quản lý tổng hợp bệnh VLGX được chia làm ba thời

kỳ (Trung và cs., 2000; Nguyễn Minh Châu, 2001): Giai đoạn trước khi trồng: đây

là giai đoạn dọn sạch tàn dư, tiêu hủy nguồn bệnh trên vườn, loại bỏ các cây ký chủ

khác của vi khuẩn gây bệnh và phun thuốc trừ môi giới trên toàn vườn Giai đoạn

vườn kiến thiết cơ bản: Cây giống phải được cấp chứng chỉ sạch bệnh từ các cơ

quan quản lý nhà nước, có độ tin cậy Không được trồng cây giống bằng cành chiết Trước khi trồng có thể sử dụng một trong ba loại thuốc nhóm Neonicotinoids với liều lượng: 0,2 g Imidacloprid/cây; 0,17 g thiamethoxam hoặc 0,19 g Clothianidin pha với 20 mL nước; phun dung dịch thuốc lên mặt đất xung quanh thân cây giống Các loại hoạt chất này có tác dụng lưu dẫn vào cây trong thời gian dài và có khả

năng diệt môi giới ngay trong giai đoạn sau trồng Nên lựa chọn thời vụ để trồng

cây giống phù hợp Giai đoạn vườn kinh doanh: Cần cắt tỉa tạo tán, phun thuốc trừ

nấm, kiểm soát rầy chổng cánh Quách Thị Ngọ và cs (2008) cho rằng dùng nước

thuốc Confidor 100SL tưới vào gốc cam, pha 2 mL với 48 mL nước tưới cho 1 cây cam để trừ RCC mang lại hiệu quả cao, khoảng cách giữa hai lần dùng thuốc là 2,5

tháng Để hạn chế mật độ RCC trên đồng ruộng cần xử lý thuốc vào thời kỳ cây

hình thành đọt non khoảng 1 - 2 cm bằng thuốc Applaud, Mipcin 0,2% và thuốc Sherpa 0,07% cho hiệu quả phòng trừ cao và hiệu lực của thuốc kéo dài (Hoàng

Chúng Lằm, 1996) Xử lý với dung dịch (ZnSO4+MnSO4) 5.000 ppm ở dạng EDTA

3 lần, lần thứ 2 cách lần thứ nhất 1 tuần và lần thứ 3 cách lần thứ 2 là 8 tuần trên cây quýt Đường giúp đọt hồi phục triệu chứng VLGX tốt (Nguyễn Thị Minh Châu

& Nguyễn Bảo Vệ, 2005)

2.6 TỔNG QUAN VỀ BRASSINOSTEROIDS VÀ BRASSINOLIDE 2.6.1 Nguồn gốc Brassinosteroids

Cho đến gần đây, người ta vẫn cho rằng các quá trình sinh trưởng chính ở thực vật được kiểm soát bởi 5 loại hormone thực vật đó là auxins, cytokinins, gibberellins, abscisic acid và ethylene Báo cáo đầu tiên về sự tồn tại của hormone thực vật mới được xuất bản ở Nhật năm 1968 (Abe & Marumo, 1991; Marumo và

cs., 1968;) Từ 430 kg lá tươi của loài Distylium racemosum Sieb et Zucc, một loài

cây thường xanh ở Nhật tách được 3 yếu tố A1 (751 μg), A2 (50 μg), B (236 μg) Cả

3 yếu tố này hoạt động mạnh hơn IAA trong thí nghiệm về độ nghiêng của lá lúa Tuy nhiên giới hạn về phương tiện kĩ thuật lúc đó đã không cho phép người ta xác định về mặt hoá học các hợp chất đó Sau đó người ta tách được một chất từ phấn

hoa cây cải dầu Brassica napus L thúc đẩy sự sinh trưởng ở thực vật (Mandava và

cs., 1978; Mitchell và cs., 1970; Steffens, 1991) Chất này được gọi là „brassins‟ và

tác giả đề nghị rằng brassins có thể là một hormone thực vật mới Thí nghiệm ở đốt thứ hai của cây đậu được dùng để phát hiện và kiểm tra các hợp chất có hoạt tính sinh học Các brassin làm dài đốt thứ hai khoảng 155 mm ở liều 10 μg, những cây không xử lý thì chỉ dài 12 mm

Việc tách hormone mới và làm rõ cấu trúc của nó là một nhiệm vụ khó khăn Một chương trình đặc biệt được bắt đầu bởi bộ nông nghiệp U.S vào 1974

(Steffens, 1991) từ 227 kg hạt phấn cây cải dầu (Brassica napus L.) được thu thập

bởi ong chiết xuất được một hợp chất chưa được biết trong tự nhiên Vào năm 1979, Grove và cộng sự phân tích bằng tia X các tinh thể được chiết xuất từ 40 kg hạt phấn cây cải dầu chỉ ra đó là lactone steroid có cấu trúc hoá học là brassinolide Hai

năm sau, castasterone được tìm thấy trong túi mật côn trùng loài Castanea crenata

spp Ngày nay có hơn 40 steroid được tách từ nguồn tự nhiên và nhóm hợp chất này được gọi là brassinosteroids và được xem như là nhóm hormone thực vật thứ 6

2.6.2 Đặc tính của Brassinolide (BR)

Phạm Phước Nhẫn (2013) cho rằng có khoảng 60 chất thuộc nhóm Brassinosteroids (BRs) được phát hiện trên 27 loài thực vật bậc cao như từ các loại cây song tử diệp, đơn tử diệp, khỏa tử và tảo BRs cũng được tìm thấy trong nhiều

bộ phận khác nhau của thực vật như túi phấn, lá, hoa, hột đọt, mụn lá và thân Brassinolide (BR) là C28 - BR và castasterone thể hiện hoạt tính sinh học cao nhất trong các BRs được phát hiện (Hình 2.6) (Nguyễn Như Khanh & Cao Phi Bằng, 2008) Nhiều thí nghiệm như đột biến bất hoạt BR, đột biến thiếu BR hoặc xử lý các chất ức chế sinh tổng hợp BR cho thấy BRs là nhóm hormone thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật BRs thực hiện vai trò của nó thông qua một loạt các phản ứng với sự tham gia của các protein trung gian nhằm điều hòa sự biểu hiện các gen thực hiện các quá trình sinh lý trong cơ thể và đáp ứng lại với các biến đổi

của môi trường (Rao và cs., 2002) Chất điều hòa sinh trưởng thực vật brassinolide

(C28H48O6) - một lactone steroid tự nhiên được phát hiện vào năm 1979, thuộc nhóm chất brassinosteroids - hormon thực vật thế hệ thứ sáu đóng vai trò quan trọng

trong sự sinh trưởng và năng suất cây trồng (Nguyễn Minh Chơn và cs., 2005)

Brassinolide có khả năng giúp cây trồng tăng tính chống chịu các tác nhân sinh học

như sâu bệnh (Abe, 1989; Khripach và cs., 1999) và phi sinh học như điều kiện môi

trường bất lợi (Davies, 1995) Brassinolide còn giúp cây trồng gia tăng năng suất như ở đậu tăng 45%, rau diếp 25%, kết quả trên các loại lúa nước, lúa mì, lúa mạch, khoai tây bước đầu cũng được ghi nhận (Phạm Phước Nhẫn, 2013)

Hình 2.6 Cấu tạo hóa học Brassinolide, 24 - epibrassinolide, 28 - homobrassinolide,

castasterone, 28 - homocastasterone (Choi và cs ., 1996)

2.6.3 Vai trò của Brassinosteroids trong quá trình sinh trưởng

Sự kích thích sinh trưởng được xem là một vai trò sinh lý quan trọng của các BRs trong thực vật Các nghiên cứu ban đầu với BR được tập trung xung quanh khả năng gây ra sự kéo dài tế bào, sự phồng lên, sự uốn cong và sự phân cắt đốt thứ hai, các hoạt động như thế được gọi là “hoạt tính brassin” Sự kéo dài, sự uốn cong và

sự phân cắt xảy ra khi được cung cấp 0,01 mg BR, thậm chí 0,01 μg cũng gây ra sự phân cắt Các BRs kích thích sinh trưởng mạnh trong các mô sinh dưỡng còn non, thúc đẩy sự kéo dài của đậu tương, đậu Azuki, trụ thượng diệp của đậu Hà lan, hoa

hướng dương, trụ dưới lá mầm cây dưa chuột, cuống hoa của Arabidopsis, bao lá

mầm của lúa mì Các BRs thúc đẩy sự sinh trưởng là do cả 2 quá trình đó là sự phân

chia và sự kéo dài tế bào (Rao và cs., 2002)

Sasse (1997) cho rằng BRs ảnh hưởng đến cả sự mở rộng và sự phân chia tế bào, nhưng việc thúc đẩy sự phân chia tế bào khó xác định Tuy nhiên, một nghiên cứu về ảnh hưởng của epibrassinolide (EBR) lên nguyên sinh chất của cây cải bắp ở Trung Quốc cho thấy tỷ lệ phân chia tế bào được tăng cường EBR làm tăng sự

phân chia tế bào trong các tế bào nhu mô của Helianthus tuberosus (Rao và cs.,

2002) Cosgrove (1997) chỉ ra rằng enzim phân hủy glucose vận chuyển nội bào xyloglucan có thể biến đổi vách tế bào tạo điều kiện cho tế bào lớn lên và hai enzim

này liên quan đến BRs Khi xử lí BRs có sự giãn vách tế bào (Wang và cs., 1993; Zurek và cs., 1994), trụ dưới lá mầm cây bí và các mô bên trong bị ảnh hưởng mạnh nhất (Tominaga và cs., 1994) Sự kéo dài tế bào còn phụ thuộc vào sự cung cấp đầy

đủ các thành phần vách và sự định hướng của vi sợi (tương đồng với sự định hướng của vi ống trong tế bào) BR hoặc BR kết hợp với auxin làm tăng tỷ lệ vi ống nằm ngang (Mayumi & Shibaoka, 1995) Để duy trì các vi ống nằm ngang cần có sự phosphoryl hóa các protein mà các protein này sẽ liên kết các vi ống với màng sinh chất BR gây ra sự kéo dài tế bào theo cách này (Mayumi & Shihaoka, 1995) BR

cũng làm tăng cường khả năng chống chịu bệnh của thực vật (Korableva và cs.,

1991)

2.6.4 Vai trò của Brassinosteroids trong các quá trình phát triển

Sự lão hóa lá và mô lá mầm trong phòng thí nghiệm đôi khi bị chậm lại bởi

cytokinin Trái lại EBR thúc đẩy sự lão hóa (He và cs., 1996) Các tác giả này quan

sát thấy sự tăng cường hoạt động của peroxidase, giảm hoạt động của superoxide dismutase, catalase và tăng nồng độ malondialdehyde, họ đề nghị BRs có thể hoạt động thông qua oxy hoạt hóa “activated oxygen” Tất cả các ảnh hưởng đến sự phát triển là do sự biểu hiện gen gây ra và BR có thể gây ra sự tổng hợp các peptide đặc

biệt (Clouse, 1997) Shock nhiệt: Ảnh hưởng tốt nhất của việc xử lí BRs trong stress lạnh được tổng kết bởi Wilen và cs (1995) và các tác giả này nhận thấy rằng sự

chịu đựng nóng và lạnh đều được tăng cường trong tế bào của loài (Bromus

inermis) Tuy nhiên, xử lí EBR khi hạt nảy mầm không giúp các cây con của loài

đậu bướm chịu đựng shock nhiệt (Vigna aconitifolia) (Upadhyaya và cs., 1991) Ở

lúa, EBR làm tăng sức chống chịu ở nhiệt độ 1 - 5 oC và sự sức kháng cự này liên quan đến sự tăng ATP Các BRs còn làm tăng sức chống chịu với nhiệt độ cao của

lá lúa mì và đồng cỏ Sự chịu đựng của thực vật với nhiệt độ cao là do sự cung cấp các BRs làm xuất hiện sự tổng hợp các polypeptid mới chịu đựng được nhiệt độ cao

(Rao và cs., 2002) Hạn hán: Ở cây lúa mì khi gặp hạn hán người ta xử lí 28-

homobrassinolide (HBR) làm tăng protein hòa tan và thành phần nước tương quan,

làm giảm sự vận chuyển ion (Sairam, 1994) Ngập úng: Xử lí EBR làm tăng sự sinh trưởng của câu đậu xanh non (Cicer arietinum) (Singh và cs., 2006) và làm tăng tại

chỗ hàm lượng nước tương quan, khi bị ngập nước, EBR làm giảm tỉ lệ thoát hơi

nước qua lỗ khí trong cây lúa miến (Xu và cs., 1994) Chịu mặn: Cải thiện sức chịu

mặn dưới 50 mM NaCl sau khi xử lí BRs được xác định ở cây lúa (Takeoka, 1983)

Ở 150 mM NaCl, nó làm tăng tỉ lệ nảy mầm của Eucalyptus camaldulensis (Rao và

cs., 2002) Các BRs còn có khả năng chống lại ảnh hưởng ức chế do độ mặn gây ra

đối với sự sinh trưởng của cây đậu phụng Ở Eucalyptus camaldulensis, việc xử lý

hạt bằng EBR làm tăng sự nảy mầm của hạt dưới điều kiện mặn Tương tự, EBR và HBR làm giảm sự ức chế do mặn gây ra đến sự nảy mầm và sự sinh trưởng ở cây lúa Xử lý hạt với dung dịch các BRs loãng đã cải thiện đáng kể sự sinh trưởng của

các cây họ lúa trong điều kiện mặn (Xu và cs., 1994) BR làm chậm sự rụng lá của

Citrus Sự cung cấp các BRs làm tăng nốt sần và sự cố định nitơ của cây đậu phụng

(Rao và cs., 2002) Tăng năng suất và sản lượng dưa hấu (Wang và cs., 1994), giảm rụng hoa non ở cây có múi, làm trái nhanh chín (Xu và cs., 1994) BRs làm chậm sự rụng lá cây họ citrus (Ronsch và cs., 1993)

2.6.5 Một số nghiên cứu liên quan đến Brassinosteroids và Brassinolide

Meudt và cs (1983) đã sử dụng BR để cải thiện sản lượng rau diếp, củ cải, đậu

và tiêu Phun BR qua lá để cải thiện thật sự sản lượng lúa mì và cây mù tặc, cây lúa, ngô và thuốc lá Việc cung cấp HBR làm tăng sản lượng củ của cây khoai tây Việc cung cấp EBR làm tăng sản lượng ngô, thuốc lá, dưa hấu, dưa chuột và cải dầu BR, EBR và HBR ảnh hưởng lớn đến sự tăng sản lượng đậu phụng và thuốc lá Ở Trung Quốc, HBR được xem như một yếu tố điều hoà sự sinh trưởng thực vật đối với thuốc lá, cây mía đường, hạt cải dầu và trà Ở Nga, EBR là nhân tố điều hoà đối với

cà chua, khoai tây, dưa chuột, tiêu và lúa mạch (Rao và cs., 2002) Xử lý mạ bằng

BR 5 ppm làm tăng 22% trọng lượng tươi và 31,5% trọng lượng khô của hạt

Taebaik cultivar (Lim, 1987) BR còn làm tăng tốc độ sinh trưởng của thực vật,

kích thước rễ, trọng lượng khô của thân và rễ (Kim & Sa, 1989), làm giảm độc tính

của 2,4-D đối với cây non (Choi và cs., 1996) và tăng tỉ lệ hạt chín khi cây sống

trong điều kiện nhiệt độ thấp (Irai và cs., 1991) Ở lúa mạch, BR, HBR và EBR làm

tăng hoạt tính của amylase trong nội nhũ, tăng trọng lượng hạt và tăng sức kháng cự

với môi trường (Prusakova và cs., 1995) Ở ngô (Kwangok), việc dùng BRs làm

tăng khoảng 7% trọng lượng tươi của bông và 11 - 14% trọng lượng khô của hạt

BR thúc đẩy sự phát triển của củ khoai tây, ức chế sự nảy mầm của củ trong thời

gian dự trữ và tăng sức đề kháng với Phytophthora infestans and Fusarium

sulfureum (Kazakova và cs., 1991)

Ở cây quýt việc cung cấp các BRs ở lá làm tăng số lượng hoa của cây quýt, cung cấp BR cho cây quýt trong suốt thời kỳ ra hoa làm tăng tỷ lệ đậu trái, nếu cung cấp trong giai đoạn trái phát triển thì giảm rụng trái sinh lý, kèm theo sự gia tăng

trọng lượng trái trung bình và chỉ số Brix (Iwahori và cs., 1990) Xử lý BR làm tăng

trọng lượng trái trung bình 5 g/trái cam và hàm lượng đường trong trái tăng trung

bình 0,8% (Wang và cs., 2004) BR làm chậm đáng kể sự rụng lá và rụng trái sinh

lý của cây Calamondin (Citrus madurensis Lour.) (Iwahori và cs., 1990) Sugiyama

và Kuraishi (1989) cho rằng xử lý BR sau hai tháng sau khi cây cam thụ phấn cũng dẫn đến tỷ lệ đậu trái cao hơn Kết quả nghiên cứu cho thấy, áp dụng EBR phun qua

lá làm giảm mật số vi khuẩn Las trong cây có múi, các cây bị ảnh hưởng bởi Las đã được xử lý với EBR ở nồng độ 0,084 μM 15 ngày/lần, sau 3 tháng xử lý giảm mạnh

so với các cây không xử lý và giảm gần 100% ở 12 tháng sau khi xử lý với EBR Bên cạnh đó, EBR kích thích một loạt các gen phòng vệ trong cây có múi với vi khuẩn Las, một số gen phản ứng phòng thủ được kích thích rất cao sau khi xử lý

bằng EBR (Canales và cs., 2016) Ngoài ra, trên cây Citrus unshiu khi áp dụng xử

lý EBR với nồng độ 5 ppm, 50 ngày sau xử lý làm tăng sức đề kháng với bệnh hại trong quá trình bảo quản sau thu hoạch, giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm bệnh sau thu hoạch (trên 78%) Mặt khác, EBR làm tăng khả năng lưu trữ bảo quản và duy trì

được chất lượng của trái quýt (Zhu và cs., 2015) Xử lý BR ở nồng độ 1,5 ppm cho

thấy hiệu quả tốt làm giảm các chất oxi hóa (catalase và peroxidase) trong suốt quá

trình bảo quản trái cam Washington Navel (Citrus sinensis L.), làm giảm đáng kể

ảnh hưởng do nhiệt độ lạnh gây ra, do đó đảm bảo chất lượng trái trong quá trình bảo quản sau thu hoạch (Ghorbani & Pakkish, 2014)

2.6.6 Cơ chế tác động Brassinosteroids đến bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi

BRs tác động đến protein LRR - RLK (leucine - rich repeat receptor - like

kinase) (BRI1) ở màng plasma của tế bào (Kinoshita và cs., 2005) BRs có thể làm

gia tăng tính kháng của cây trồng chống lại nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau

(Khripach và cs., 2003; Krishna, 2003; Nakashita và cs., 2003), vai trò của BRs

trong các đáp ứng của cây trồng khi có sự tấn công của mầm bệnh là rất phức tạp

(Wang, 2012) Canales và cs (2016) đã công bố các kết quả đầu tiên cho thấy khả

năng làm giảm mật số vi khuẩn trong hệ mạch của cây có múi bị nhiễm bệnh vàng

lá gân xanh trong điều kiện trồng trong nhà lưới và cả ngoài đồng

Trên cây có múi, theo Canales và cs (2016), EBR kích ứng một loạt gen có vai trò phòng thủ Số lượng bản sao của gen GPX1 (mã hóa cho enzyme glutathione

peroxidase) đạt đỉnh cao ở thời điểm 1h sau khi phun EBR ở nồng độ 0,084 μM Glutathione peroxidase là một nhóm các enzyme tham gia vào quá trình khử lipid

và hydrogen peroxide (H2O2) để giúp cho tế bào không bị hư hại do các phản ứng oxi hóa Quá trình sản xuất hydrogen peroxide được xem là một trong số các phản ứng đầu tiên của cây trồng chống lại các tác nhân gây ra stress sinh học và phi sinh

học (Sticher và cs., 1997) Ngoài ra, sự biểu hiện của một số gen mã hóa cho các

enzyme có liên quan đến „tính kháng hệ thống hình thành‟ (systemic acquired resistance - SAR) như chitinase và beta 1, 3-glucanase được tăng cường khi xử lý EBR Tương tự, gen mã hóa enzyme allene oxidase synthase (enzyme quan trọng

trong quá trình tổng hợp jasmonic acid (JA)) cũng được kích hoạt (Pieterse và cs., 2003; Turner và cs., 2002) JA là nhân tố thiết yêu trong „tính kháng hệ thống kích ứng‟ (induced systemic resistance - ISR) hoạt (Pieterse và cs., 2003; Turner và cs.,

2002) ISR phụ thuộc vào sự tích lũy đúng lúc của các enzyme như acid hydroperoxide lyase (HPL), allene oxide synthase (AOS), và phenylalanine ammonia lyase (PAL) Một giờ sau khi xử lý EBR, cả 3 gen mã hõa cho HPL, AOS,

và PAL đều có mức biểu hiện cao hơn rõ rệt và sau đó mức biểu hiện cao được duy

trì ở tất cả các thời điểm kháo sát (Canales và cs., 2016) Đối với tính kháng hệ

thống kích ứng (ISR), vai trò của PAL trong sự phòng thủ phổ rộng đã được nghiên cứu rộng rãi, và quá trình phiên mã gen mã hóa PAL đươc kích hoạt bởi con đường truyền tín hiệu JA/ethylene (Conrath, 2006; Pieterse & Loon, 1999; Smith-Becker

và cs., 1998) Mức biểu hiện cao của cả ba gen HPL, AOS, và PAL có thể là nguyên

nhân của sự gia tăng khả năng kháng bệnh chống lại vi khuẩn Las ở cây có múi có phun EBR Điểm đáng chú ý là một lượng lớn các gen có liên quan đến sự phòng thủ và các con đường tổng hợp acid salicylic và acid jasmonic đã được kích ứng bên trong cây có múi bị bệnh VLGX Các gen liên quan đến các đáp ứng đối với acid salycilic cũng đã được kích ứng khi xử lý EBR Theo Wang và Trivedi (2013) Las

có khả năng tổng hợp enzyme salicylate hydroxylase (SahA) có chức năng chuyển đổi acid salycilic thành catechol Theo đó, thực vật được chuyển gen salicylate hydroxylase (NahG) của vi khuẩn sẽ không có khả năng tích lũy acid salycilic, do

đó sẽ không có khả năng biểu hiện các gen hạn chế khả năng gây bệnh

(pathogenesis related gen - PR) và các gen có liên quan đến SAR (Lawton và cs., 1995; Vlot và cs., 2009)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN

- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ tháng 8/2017 đến 10/2018

- Địa điểm: thí nghiệm được bố trí ở vườn quýt Đường tại ấp 8, xã Long Trị,

thị xã Long Mỹ, tình Hậu Giang

Hình 3.1 Bản đồ hành chính thị xã Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang

Các chỉ tiêu phẩm chất trái và định lượng hàm lượng tinh bột trong lá được phân tích tại phòng thí nghiệm Bộ môn Khoa học cây trồng, Khoa Nông nghiệp và chẩn đoán bệnh bằng kỹ thuật PCR thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ

3.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM

3.2.1 Đối tượng

Cây quýt Đường (Citrus reticulata Blanco) 6 năm tuổi được nhân giống bằng

phương pháp chiết, trồng chuyên canh quýt Đường trên nền đất phù sa lên liếp, có mương tưới tiêu, thoát nước tốt

Ghi chú:

- Dụng cụ: Thước kẹp, khúc xạ kế ATAGO của Nhật, cân kỹ thuật OHAUS

CS5000, bình định mức, bình tam giác, tuýp 1,5 mL, tuýp PCR, đầu côn 1000 μL;

250 μL, pipet 1000 μL, pipet 200 μL, pipet 20 μL, găng tay y tế, khẩu trang, chày cối sứ nghiền mẫu

- Trang thiết bị: Các thiết bị phòng thí nghiệm sinh học phân tử như tủ định

ôn, buồng sinh trưởng, máy đo cường độ ánh sáng, cân điện tử, máy ổn nhiệt, 42 máy ly tâm lạnh, máy PCR, máy điện di, hệ thống máy tính gắn máy chụp ảnh soi gel, máy hấp thu quang phổ GENESYS 20 Visible Spectrophotometer (của hãng Thermo, Mỹ)

- Hóa chất: HCl 1%, acid oxalic 1%, 2,6 Dichlorophenol indophenol, nước cất, phenolphetalein 1%, NaOH 0,01N, dung dịch iod 2%…

- Hóa chất tách chiết DNA tổng số: Đệm CTAB (Bio science) 100 mL, β- Mercaptoethanol (Merk), EDTA (Bio science), NaCl 5M, Tris HCl (pH =8), H2O Đệm TE 1X, cồn tuyệt đối lạnh, dung dịch Chlorofom: isoamylalcohol (24:1) (Merk), Isopropanol, dung dịch rửa mẫu ethanol 70%

- Hóa chất điện di: gel Agarose 1,5% (Bio science), đệm TAE 1X, ethidium bromide (Fementas) 10 mg/mL, loading dye 6x

- Hóa chất cho phản ứng PCR: Buffer 10X (PCR) (Famentas), DNA Taq polymerase (Enzymnomic), dNTP (Enzymnomic), nước khử ion

- Cặp mồi đặc hiệu dùng trong chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh sản phẩm

PCR ở 226 bp của Jagoueix và cs (1996) là:

 Mồi xuôi OI1: 5‟ CAC CGA AGA TAT GGA CAA CA 3‟

 Mồi ngược OI2c: 5‟ GAG GTT CTG GTG GTT TTT CTG 3‟

3.3 PHƯƠNG PHÁP

3.3.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức ngẫu nhiên hoàn toàn, có 5 nghiệm thức,

6 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại tương ứng với một cây Các cây được chọn có triệu chứng bệnh vàng lá gân xanh như: cây còi cọc, lá bị vàng ở một số nhánh (phiến lá vàng nhưng các gân chính và gân phụ vẫn xanh, gân lồi lên), lá nhỏ (tai thỏ), đọt non bị héo (Hình 3.2) Đồng thời, các cây được chọn này có thời gian sinh trưởng,

tỷ lệ bệnh và cấp bệnh tương đương nhau, được đánh giá theo Quy chuẩn Việt Nam

về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật gây hại trên cây ăn trái có múi (QCVN01 - 119:2012/BNN-PTNT) và tình trạng bệnh được chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR để bố trí thí nghiệm Các nghiệm thức phun Brassinolide, NT1: 0,5 mL Nyro, NT2: 1,0 mL Nyro, NT3: 1,5 mL Nyro Các nghiệm thức Nyro được pha với