Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh khiết từ cây nhân trần tía và ứng dụng

HỒ CHÍ MINH --- CÔNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA LẦN THỨ XX NĂM 2018 TÊN CÔNG TRÌNH: NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC ĐỊNH HƯỚNG PHÂN LẬP HỢP CHẤT TIN

ĐOÀN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH

BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH

-

CÔNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA

LẦN THỨ XX NĂM 2018

TÊN CÔNG TRÌNH:

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC ĐỊNH HƯỚNG PHÂN LẬP HỢP CHẤT TINH KHIẾT

TỪ CÂY NHÂN TRẦN TÍA VÀ ỨNG DỤNG

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: Công nghệ Hóa - Dược

CHUYÊN NGÀNH: Dược liệu

Mã số công trình: ………

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH .vii

TÓM TẮT 1

MỞ ĐẦU 2

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Tổng quan về chi Adenosma 6

1.2 Tổng quan về nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.) 8

1.2.1 Đặc điểm hình thái 8

1.2.2 Đặc điểm phân bố 9

1.2.3 Một số thành phần hóa học đã được nghiên cứu 9

1.2.4 Hoạt tính sinh học 13

1.3 Định nghĩa về gốc tự do, stress oxy hóa, chất chống oxy hóa và bệnh tiểu đường 15 1.3.1 Khái niệm về gốc tự do và stress oxy hóa 15

1.3.2 Tác hại của stress oxy hóa 16

1.3.3 Chất chống oxy hóa 18

1.3.4 Bệnh tiểu đường 19

1.4 Hợp chất tự nhiên từ thực vật 19

1.4.1 Terpenoid 19

1.4.2 Steroid 22

1.4.3 Polyphenol 23

PHẦN 2: MỤC TIÊU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Mục tiêu đề tài 26

2.2 Nguyên liệu, dung môi, hoá chất, trang thiết bị 26

2.2.1 Nguyên liệu 26

2.2.2 Dung môi, hoá chất 27

2.2.3 Trang thiết bị 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Xác định độ ẩm 30

2.3.2 Quá trình chiết và thu nhận cao chiết 30

2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng cao thu được 31

2.3.4 Phương pháp định tính các thành phần hóa học từ cao cồn và nước của Nhân trần tía 31

2.3.5 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH 34

2.3.6 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình FRAP 35

2.3.7 Phương pháp ức chế enzym xanthin oxidase 36

2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng chống tăng đường huyết trên mô hình in vivo chuột tăng đường huyết cấp tính 36

2.3.9 Đánh giá trên mô hình in vivo chuột gây tiểu đường bởi streptozocin 38

2.3.10 Phân lập và xác định cấu trúc 41

2.3.11 Xác định độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng 42

2.3.12 Phương pháp xử lý số liệu 43

PHẦN 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 44

3.1 Thử độ ẩm của dược liệu 44

3.2 Khảo sát hàm lượng cao chiết 44

3.3 Định tính các thành phần hóa học trong cây nhân trần tía 45

3.4 Kết quả khả năng kháng oxy hóa trên mô hình DPPH 52

3.5 Kết quả khả năng kháng oxy hóa trên mô hình FRAP 53

3.6 Khả năng ức chế enzyme xanthin oxidase 55

3.7 Ảnh hưởng của dịch chiết nhân trần tía lên lượng đường trong máu 56

3.8 Kết quả đánh giá trên mô hình in vivo chuột gây tiểu đường bởi streptozocin 57

3.9 Phân lập và xác định cấu trúc 58

3.9.1 Phân lập bằng sắc ký cột 58

3.9.2 Khảo sát cấu trúc và độ tinh khiết của chất phân lập được 67

3.10 Đánh giá ảnh hưởng của AB3 lên lượng đường trong máu 70

3.11 Bước đầu nghiên cứu qui trình sản xuất trà túi lọc từ Nhân Trần tía 71

3.11.1 Khảo sát chế độ sấy nguyên liệu 71

3.11.2 Tỷ lệ phối trộn với nguyên liệu phụ 73

3.11.3 Đề xuất quy trình sản xuất trà túi lọc 73

3.11.4 Khảo sát ảnh hưởng của trà túi lọc lên lượng đường trong máu 76

PHẦN 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 78

4.1 Kết luận 78

4.2 Kiến nghị 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

PHỤ LỤC 85

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

13C-NMR: 13C- Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR: 1H-Nuclear Magnetic Resonance

Ac: Acetone

AG: Acid Gallic

ALT: enzyme alanin aminotrasferase

AQ: aqueous (nước)

C, CH, CHCl3: chloroform

CCl4: carbon tetrachloride

db: gam dược liệu khô

DMSO: Dimethyl sulfoxyde

DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EA: Ethyl acetate

EI: Electron Impact Mass Spectroscopy

Et: ethanol (cồn)

FRAP: Ferric ion Reducing Antioxydant Power

H: Hexan

HCTN: hợp chất tự nhiên

IC50: half maximal inhibitory concentration

Me, MeOH: Methanol

TPC: Total Polyphenols Content (Hàm lượng polyphenol tổng số) TPHH: thành phần hóa học

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các thành phần hóa học có trong tinh dầu Adenosma bracteosum Bonati 11

Bảng 1.2 Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học 16

Bảng 1.3 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa DNA 17

Bảng 1.4 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa protein 17

Bảng 1.5 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa lipid 18

Bảng 3.1 Độ ẩm dược liệu 44

Bảng 3.2 Khảo sát hàm lượng cao chiết theo dung môi 44

Bảng 3.3 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học 45

Bảng 3.4 Hình ảnh định tính thành phần hóa học 46

Bảng 3.5 Chỉ số đường huyết mãn tính 21 ngày 57

Bảng 3.6 Các hệ dung môi được sử dụng cho sắc ký cột cao phân đoạn C 59

Bảng 3.7 Kết quả các phân đoạn từ sắc ký cột cao phân đoạn C 62

Bảng 3.8 Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn A3 64

Bảng 3.9 Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn B4 66

Bảng 3.10 Kết quả đo đường huyết của nhóm chuột uống AB3 so với nhóm chuột đối chứng 70

Bảng 3.11 Biến đổi về màu, mùi, vị của Nhân trần tía ở nhiệt độ khác nhau 72

Bảng 3.12 Một số chỉ tiêu vi sinh của trà túi lọc Nhân trần 76

Bảng 3.13 Kết quả lượng đường trong máu của mô hình chuột cấp tính sau 2 giờ thử sản phẩm 77

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 29

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử hoạt tính của mẫu trên chuột tăng đường huyết cấp tính 36

Sơ đồ 2.3 Sơ đồ tạo mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường type 1 38

Sơ đồ 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử hoạt tính của mẫu trên chuột tăng đường huyết mãn tính 39

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất trà túi lọc 74

Hình 1.1 Cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.) 8

Hình 2.1 Chuột được cho uống dung dịch glucose 2g.kg-1 thể trọng 37

Hình 2.2 Chuột được tiêm STZ vào phúc mạc bụng 39

Hình 2.3 Chuột được cho uống cao chiết 40

Hình 2.4 Bảng tra nồng độ đường huyết 41

Hình 3.1 Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của các cao chiết trong thí nghiệm quét gốc tự do DPPH 53

Hình 3.2 Biểu đồ kết quả tác dụng chống oxy hóa của các mẫu thử tại nồng độ 1 mg/ml trong thí nghiệm FRAP 54

Hình 3.3 Biểu đồ kết quả hoạt tính ức chế enzyme xathin oxidase 55

Hình 3.4 Hiệu quả chống tăng đường huyết của cao Et và AQ 56

Hình 3.5 Biểu đồ so sánh chỉ số đường huyết của cao Et và cao AQ với thuốc 57

Hình 3.6 Phân đoạn C được soi dưới UV 254nm và sau khi nhúng TTVS hiện màu 59

Hình 3.7 Mẫu được nạp vào chạy sắc ký cột 61

Hình 3.8 Phân đoạn A3 được soi dưới UV 265nm và sau khi nhúng TTVS hiện màu 63

Hình 3.9 Phân đoạn A3 được nạp vào cột 64

Hình 3.10 Phân đoạn B4 được soi dưới UV 254nm và sau khi nhúng TTVS hiện màu 65

Hình 3.11 Sắc ký cột của phân đoạn B4 66

Hình 3.12 Phân đoạn E1 và E2 sau khi nhúng TTVS hiện màu 67

Hình 3.13 AB3 kết tinh hình kim, màu vàng 68

Hình 3.14 AB3 hiện dưới UV 254nm và sau khi nhúng TTVS hiện màu 68

Hình 3.15 Phổ EI-MS của AB3 69

Hình 3.16 Cấu trúc của hợp chất AB3 70

Hình 3.17 Dịch trích ly nguyên liệu ở các nhiệt độ khác nhau 72

TÓM TẮT

Cây nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati được dùng trong y học cổ truyền để

trị bệnh gan mật nhưng ít có những nghiên cứu về các hoạt tính sinh học khác Mục đích

của nghiên cứu là đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro, in vivo và chống tăng đường

huyết của nhân trần tía từ đó phân lập hợp chất tinh khiết và đề xuất hướng ứng dụng từ loài cây này Các cao chiết chloroform, ethanol và nước của cây được đánh giá trên các mô hình chống oxy hóa FRAP (ferric reducing/antioxidant power), quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) và ức chế enzyme xanthin oxidase Kết quả phân tích cho thấy cao chiết cồn và nước đều có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Các liều thử khác nhau của các cao chiết cồn và nước trên chuột bị tăng đường huyết bằng đường uống cho kết quả ở liều dùng thấp của cao cồn (40 mg/kg) và của cao nước (50 mg/kg) tương đương với nhóm đối chứng

dùng thuốc glibenclamide Trên mô hình in vivo chuột bị gây đái tháo đường bởi

streptozocin (mô hình thử trong 21 ngày) cho thấy cao cồn có khả năng đưa lượng đường trong máu về tương đương với nhóm chứng thuốc và đây cũng là hoạt tính đặc biệt của Nhân trần tía mà chưa có bất kỳ tài liệu nào công bố trước đó

Từ cao cồn, tiến hành kỹ thuật sắc ký và qua nhiều cột sắc ký đã phân lập được hợp chất tinh khiết (được đặt tên là AB3) Khảo sát được một số tính chất của chất phân lập được về cảm quan (hình dạng, màu sắc, ) và qua các sắc ký phổ đồ đã xác định cấu trúc AB3 là 5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-8-yl hexopyranoside Đây là hợp chất tự nhiên có trong Nhân trần tía hiện chưa có công bố khoa học nào đã công bố trước

đó Đánh giá được sự ảnh hưởng của AB3 lên lượng đường trong máu là khá tốt Điều đó cho thấy đây là một hợp chất tiềm năng trong hỗ trợ điều trị bệnh về đường huyết Bước đầu xây dựng được quy trình sản xuất trà túi lọc Nhân trần tía chưa có trên thị trường và đánh giá

ảnh hưởng của sản phẩm lên lượng đường trong máu trên mô hình in vivo cũng cho kết quả

khả quan

Những kết quả thu được trong nghiên cứu chứng minh cây nhân trần tía là nguồn của chất chống oxy hóa tự nhiên, ngăn ngừa gút, bảo vệ gan và chống tăng đường huyết nên có thể hỗ trợ trong điều trị bệnh tiểu đường

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hiện nay do lối sống công nhiệp, ô nhiễm môi trường, con người phải đối mặt với nhiều áp lực, stress, cùng với chế độ ăn uống bất hợp lý, uống nhiều rượu bia, đường, béo; dẫn đến các căn bệnh như viêm gan, tiểu đường ngày càng gia tăng Ngoài ra lạm dụng thuốc và kháng sinh dẫn đến việc vi khuẩn kháng thuốc Vấn đề liên quan đến đường huyết luôn được mọi người quan tâm vì lượng đường trong máu dù tăng hay giảm đi so với mức bình thường thì sẽ tác động không tốt đến sức khỏe Việc tìm kiếm những hợp chất có khả năng điều trị, hỗ trợ các bệnh liên quan đến đường huyết và ít gây tác dụng phụ đang ngày càng được quan tâm nghiên cứu

Xu hướng điều trị hiện nay, những thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên đang được quan tâm Theo kinh nghiệm dân gian, một số cây thuốc đã được dùng trong điều trị và bước đầu cho thấy có hiệu quả tốt, trong đó có Nhân trần tía

2 Tổng quan tình hình nghiên cứu

a Trong nước

Từ rất lâu nhân dân vùng Bắc Bộ đã sử dụng cây Nhân trần Adenosma caeruleum

để dùng làm một loại nước uống có tác dụng giúp thanh nhiệt, giải độc Tuy nhiên ở miền

Nam, dược liệu mang tên Nhân trần chủ yếu là Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati

và có rất ít thông tin khoa học nghiên cứu về loài này, đặc biệt là hoạt tính sinh học Hiện

có nhiều loài trong chi Nhân trần phân bố khắp Việt Nam, nhưng Y học cổ truyền chưa có

sự phân biệt rõ ràng cách sử dụng, chúng thường được xếp vào cùng một loại dược liệu Hiện nay chỉ có một số công trình được thực hiện để khảo sát thành phần hóa học và khả năng giải độc gan của Nhân trần tía:

 Nguyễn Viết Tựu và cộng sự (1975) đã phân tích hàm lượng tinh dầu trong cây

Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati., kết quả cho thấy tinh dầu chiếm 0,25% cây

 Tsankova và cộng sự (1994) đã phân tích thành phần tinh dầu của Adenosma

bracteosum Bonati bằng GS và GC/MS, nhận thấy trong tinh dầu có sự hiện diện của

carvacrol, đây là một tinh dầu kháng khuẩn mạnh và có khả năng chống ung thư

 Dương Thị Mộng Ngọc và cộng sự (2006) chứng minh cao toàn phần phối hợp giữa lá Đinh lăng và Nhân trần tía thể hiện tác động bảo vệ gan trên ba mô hình gây tổn thương gan bằng ethanol, tetraclorua và paracetamol

 Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự (2008) đã phân lập được một số hợp chất polyphenol trong Nhân trần tía, một flavon lạ đã được phân lập và xác định cấu trúc là scutellarein-6-O-glycoside

 Vũ Mạnh Hùng và Bùi Thị Bích Vân (2008) đã xác định khả năng chống nhiễm độc gan do tác dụng phụ của Rifampicin bằng sản phẩm kết hợp giữa cao Nhân trần tía và Tảo Spirulina

b Ngoài nước

Năm 1994, Tsankova và cộng sự đã nghiên cứu về Adenosma bracteosum Bonati nhưng chỉ dừng lại ở khảo sát tinh dầu Adam và cộng sự đã phát hiện ra trong Adenosma

caeruleum R Br có chứa monoterpenoid peroxide vào năm 1992

Nhận thấy các công trình khoa học nghiên cứu về loài cây vẫn còn chưa nhiều, việc khảo sát những hoạt tính sinh học của Nhân trần tía sẽ góp phần vào ngân hàng dữ liệu khoa học về loài cây này và làm tiền đề cho việc tạo các sản phẩm ứng dụng để chữa bệnh cho con người

3 Mục tiêu đề tài

Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.) là một trong số các dược liệu được sử

dụng lâu đời có công dụng thanh nhiệt, chữa các bệnh về gan mật, cho thấy có hiệu quả Trên thị trường cũng đã có một số chế phẩm có nguồn gốc từ Nhân trần tía nhưng đa số

chưa có tiêu chuẩn cụ thể Các nghiên cứu trước đây về A bracteosum chủ yếu về tác dụng

dược lý, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hoá học

Do đó đề tài “Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh

khiết từ cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.) và ứng dụng” được thực

hiện với mục tiêu cụ thể:

 Phân tích sơ bộ thành phần hoá học từ tủa trong dịch chiết cồn của cây Nhân trần tía

 Khảo sát một số hoạt tính sinh học của cây Nhân trần tía

 Chiết xuất và phân lập hợp chất hoá học từ tủa trong cao cồn của cây Nhân trần tía

 Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất tinh khiết từ tủa trong cao cồn của cây Nhân trần tía

 Bước đầu nghiên cứu quy trình tạo sản phẩm ứng dụng từ nguồn nguyên liệu này

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

 Đối tượng:

Toàn cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.)

Chuột bạch albino chủng swiss

 Phạm vi nghiên cứu của đề tài:

Đề tài tiến hành nghiên cứu chứng minh các hoạt chất sinh học có trong cao chiết cây Nhân trần tía có khả năng chống oxy hóa, quét gốc tự do giúp làm ổn định đường huyết trên mô hình động vật bị tăng đường huyết cấp tính và trên mô hình động vật bị đái tháo đường do streptozocin từ đó phân lập được hợp chất tự nhiên có trong Nhân trần tía Khảo sát và đề xuất quy trình tạo sản phẩm trà túi lọc Nhân trần tía, nhằm đưa loài cây này vào ứng dụng thực tiễn

5 Ý nghĩa đề tài

 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Chứng minh nhân trần tía có hoạt tính giúp làm ổn định đường huyết trên mô hình động vật bị tăng đường huyết cấp tính và trên mô hình động vật bị đái tháo đường do

streptozocin mà chưa có công trình nào nghiên cứu trước đó (cả các tài liệu trong và ngoài nước)

Phân lập được hợp chất tinh khiết có hoạt tính từ Nhân trần mà chưa có tài liệu nào công bố về thành phần hoạt chất này có trong cây nhân trần

 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Nguyên liệu cây Nhân trần tía có khả năng kháng oxy hóa, giúp ổn định đường huyết,

hỗ trợ trị bệnh tiểu đường cũng như ngăn ngừa một số bệnh do stress oxy hóa Vì thế việc tạo ra sản phẩm trà túi lọc của đề tài cũng có những hoạt tính này nên có thể nâng cao sức khỏe cho người dùng Những nghiên cứu của đề tài cũng định hướng tạo ra các sản phẩm khác (thực phẩm chức năng hoặc thuốc) từ Nhân trần tía giúp nâng cao sức khỏe con người chống lại nhiều bệnh tật do stress oxy hóa đặc biệt là giúp hỗ trợ ngăn ngừa về bệnh đường huyết Ngoài ra sản phẩm ứng dụng từ nguồn nguyên liệu này còn có hiệu quả kinh tế vì dễ tìm, rẻ tiền và an toàn, góp phần tăng thu nhập cho những người dân trồng loài dược liệu này

 Tính mới, tính sáng tạo

Chứng minh được hoạt tính sinh học mới từ Nhân trần tía thông qua mối liên hệ giữa chống oxy hóa và bệnh tiểu đường Định hướng sinh học từ các phân đoạn khác nhau từ đó chọn ra phân đoạn tốt nhất để phân lập được hợp chất tinh khiết có hoạt tính Đồng thời, việc tạo sản phẩm trà túi lọc có sự phối hợp với cỏ ngọt (là loại thực vật có khả năng tạo vị ngọt gấp nhiều lần đường mía và cũng có khả năng ngăn ngừa và hỗ trợ tiểu đường) vừa có tính tạo vị ngọt dễ chịu vừa có tính chất phối hợp với nguyên liệu chính là Nhân trần tía trong việc ngăn ngừa cũng như hỗ trợ trị bệnh tiểu đường

Những nghiên cứu của đề tài còn mở ra việc tạo nhiều loại sản phẩm khác nhau từ nhân trần ( tạo một số thực phẩm chức năng như kẹo, siro… hoặc thuốc) góp phần nâng cao sức khỏe cho con người

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về chi Adenosma

Phân loại theo hệ thống phân loại thực vật có hoa của A.L.Takhtajan (1987) nhưng lược

bỏ cấp phân bộ và không phân thành liên bộ thì chi Adenosma và Nhân trần tía có vị trí phân loại như sau:

Giới thực vật (Plamac) MQ

Phân giới Thực vật bậc cao (Cormobionta)

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Phân lớp Hoa môi (Lamiidase)

Bộ Hoa mõm sói (Scrophulariales)

Họ Hoa mõm sói (Scrophulsriaceae)

Chi Adenosma

Loài Nhân trần tía( A bracteosum

Bonati.)

Chi Adenosma sp (hay còn được gọi là Chi Tuyến hương, Nhân trần) được xếp vào

Họ Scrophulariaceae Là loài cỏ mọc hằng năm, có mùi thơm, có khoảng 15 loài phân bố ở khu vực Bắc Á, Đông Nam Á, Trung Quốc và quần đảo Thái Bình Dương

Theo Phạm Hoàng Hộ (1999) và Đỗ Tất Lợi (2004), Việt Nam có sự phân bố của

nhiều loài trong chi Adenosma sp bao gồm:

- Adenosma annamensis Yam (Tuyến hương Trung bộ) Cây thân cỏ cao khoảng

30 – 40 cm, phiến lá xoăn và có lông thưa, có hoa ở nách lá, mọc chủ yếu ở Quảng Nam và

Đà Nẵng

- Adenosma bracteosum Bonati (Tuyến hương lá bắc, Nhân trần tía) Thân và cành

có màu tím đỏ, cụm hoa nằm ở ngọn có những lá bắc lợp lên nhau, dạng màng, trong suốt Mọc nhiều ở miền nam Việt Nam và rãi rác ở Campuchia, Lào

- Adenosma caeruleum R Br (Nhân trần nam, Hoắc hương núi, Tuyến hương lam)

Thân thảo cao tới gần 1 m Lá phía dưới mọc đối, lá phía trên có khi mọc so le, hình trái xoan nhọn Thân màu tía hay lam, chia 2 môi, nhị 4, bầu có vòi nhuỵ hơi dãn ra ở đỉnh Quả

nang dài hình trứng, có mỏ ngắn nở thành 4 van Hạt nhiều, bé, hình trứng Mùa hoa quả tháng 4 – 9 Phân bố nhiều ở miền bắc Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Thái Lan

- Adenosma hirsuta (Miq.) Kurz (Tuyến hương phún) Thân thảo cao hơn 1 m, có

nhiều lông, lá hình bầu dục, hai mặt lá nhiều lông Mọc nhiều ở vùng Tây Nguyên, rãi rác

ở Đông Nam Bộ

- Adenosma indiana (Lour.) Merr (Nhân trần hoa đầu, Nhân trần bồ bồ, Tuyến

hương Ấn) Thân hình trụ, cành non mang nhiều lông về sau nhẵn, lúc đầu thân màu xanh sau chuyển sang màu tím nhạt, chiều cao cây 70 cm đến 100 cm Lá mọc đối, phiến lá hình mác, đầu nhọn, mép lá có răng cưa, gân lá hình lông chim, mặt trên mang nhiều lông hơn mặt dưới, chiều dài lá 5 cm – 8 cm, rộng lá 2 cm – 4 cm Rễ thuộc loại rễ chùm, có nhiều lông tơ nhỏ màu trắng, rễ dài 10 cm – 18 cm Hoa nhỏ, màu tím, mọc tụ tập thành đầu nang, đài có lông với hai môi, môi trên nguyên, môi dưới xẻ bốn Tràng cánh hợp với hai môi, môi trên xẻ bốn, môi dưới nguyên, bốn nhị có hai chiếc dài, hai chiếc ngắn Quả thuộc loại quả nang nằm gọn trong đài hoa Nhiều hạt nhỏ, hình trứng thuôn, có nhiều gai, màu cánh

gián Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr phân bố chủ yếu ở Ấn Độ, Myanma, Nam

Trung Quốc, Campuchia, Lào, Việt Nam, Thái Lan

- Adenosma javanica (Bl.) Kds (Tuyến hương java) Loài cỏ cứng, bò dưới mặt đất,

nhánh dài 0,2 - 0,4 m Lá có phiến tròn, thon, dài 1 - 5 cm, có lông phún Hoa mọc ở nách

lá Mọc rãi rác một số nơi ở Việt Nam như Quảng Ninh, Kon Tum [3],[14]

Trong đó ba loài Adenosma bracteosum Bonati., Adenosma caeruleum R Br.,

Adenosma indiana (Lour.) Merr là mọc phổ biến nhất ở Việt Nam Mặc dù cả ba loài này

đã dùng từ lâu trong Y học cổ truyền như một loại dược liệu giúp giải độc, mát gan nhưng lại có rất ít công trình nghiên cứu về chúng Chỉ mới có một số công trình nghiên cứu về

thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của Adenosma caeruleum (De Abreu và cộng sự,

2009; Adam và cộng sự, 1992; Nguyễn Hoàng Tuấn, 2000) và thành phần hóa học loài

Adenosma indiana (Dương Hồng Nhung, 2015) Hiện tại loài Adenosma bracteosum chỉ

mới dừng lại ở việc khảo sát thành phần tinh dầu (Tsankova và cộng sự, 1994) và một số hợp chất polyphenol (Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự, 2008) [4],[10],[11],[18],[23],[43]

1.2 Tổng quan về nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.)

Loài: Adenosma bracteosum Bonati

Tên gọi khác: Nhân trần tía, Nhân trần Tây Ninh, Tuyến hương lá bắc

Hình 1.1 Cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.)

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Theo Dược Điển Việt Nam III (2002), Đỗ Tất Lợi (2004) và Phạm Hoàng Hộ (1999) thì cây Nhân trần tía thuộc loại cây thân thảo, rất thơm, cao 20 – 30 cm; ít phân nhánh Thân có 4 cạnh, nhẵn hoặc có lông tuyến rải rác Cành màu tím đỏ Lá cây có hình phiến thon, dài 2 – 2,5 cm, rộng 6 – 8 mm, nửa ôm thân, mép hơi có răng nhọn ở nửa trên, mặt dưới có ít lông và có tuyến, khi khô rất dễ rụng Cụm hoa Nhân trần tía có hình trụ, mọc ở đầu cành Đài hoa có 5 lá đài hình tim nhọn, kích thước không đều, rời nhau, có lông rậm

và có tuyến ở mép Tràng hoa cao 5 mm, màu lam, có lông rải rác ở mặt ngoài, môi trên

tròn, môi dưới dài bằng môi trên và chia thành 3 thùy hình trứng Cây có quả dạng quả nang, hình trứng, đôi khi thuôn dài, cao 3mm Quả không lông, màu nâu và có nhiều hạt [1],[3],[14]

1.2.2 Đặc điểm phân bố

Nhân trần tía đang được trồng và mọc hoang tại Campuchia, Lào và miền nam Việt Nam Cây thường mọc vào mùa mưa trên đất sét ẩm, các bờ ruộng ở độ cao 300-800 m Cây thường mọc thành đám có khi tới hàng chục mét vuông trên những bãi đất bằng dưới chăn đồi, trong thung lũng hay những đám ruộng cao bỏ hoang Ở những nơi đất ít dinh dưỡng thì cây chỉ cao 15 cm đã thấy có hoa và quả Cây mọc tốt trên đất có phèn ở vùng thấp và dọc đường đi một số nơi từ Kontum, Đắk Lắk tới Tây Ninh, Thành phố Hồ Chí Minh (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004) [2]

Nhân trần tía chỉ gặp vào thời gian từ giữa mùa mưa đến đầu mùa khô hằng năm Cây bắt đầu mọc vào tháng 6 và ra hoa vào khoảng tháng 10 - 11, tàn lụi vào tháng 12 Cây

ưa táng, ưa ẩm và có thể chịu được khô hạn sau khi đã ra hoa, kết quả Sau khi quả già, toàn

cây tàn lụi So với các loài khác thuộc chi Adenosma sp., thì Nhân trần tía có vòng đời

ngắn hơn, chỉ tồn tại 5 - 6 tháng nên mức độ khai thác và sử dụng ít hơn

1.2.3 Một số thành phần hóa học đã được nghiên cứu

a Chi Adenosma

 Adenosma caeruleum

Adenosma caeruleum R Br có chứa monoterpenoid peroxyde (Adam, 1992),

betulinic acid, arbutin, aucubin, β-sitosterol, stigmasterol, campesterol, adenosmoside, crenatoside, verbascoside, cistanoside F, campneoside I, campneoside II, apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside, apigenin 7-O β-D-glucopyranoside (De abreu, 2009) [18],[23]

Năm 1975, Lê Tùng Châu và cộng sự phân tích trong Adenosma caeruleum R.Br có

saponin triterpenoid, flavonoid, acid nhân thơm, coumarin và tinh dầu Cả cây có 1% tinh dầu, hoa có 1,86% tinh dầu tỷ trọng 0,8042 (25o) nD=1,4705 (20o) [3],[8]

 Adenosma indiana

Năm 1939, F Guichard và J Clemensat phân tích loài Adenosma Indiana (Lour.)

Merr dưới định danh Nhân trần và thấy 1,67% kali nitrat, một saponin có chỉ số bọt 2.600, một glucoside tan trong aceton, ete, không tan trong nước, khoảng 0,7% tinh dầu Tinh dầu

của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr lỏng, màu vàng, mùi hăng gần giống như mùi long

não và bạc hà, vị nóng; tan trong methanol, ethanol, chloroform và các dung môi hữu cơ khác Thành phần chủ yếu của tinh dầu 20% hợp chất oxy tan trong dung dịch reorcin Chỉ

số acid 1,4; chỉ số xà phòng hóa 11,5; chỉ số acetyl hóa 38; chỉ số iot 121,4

Năm 1950, P.V Nair và cộng sự đã chưng cất được từ loài Adenosma Indiana

(Lour.) Merr 1% tinh dầu và đã phân tích thấy có 5L.monoterpen và 2D.secquiterpen trong

đó có 38,5% cineol Ngoài ra còn thấy saponin triterpenoid, flavonoid, acid nhân thơm, coumarin và tinh dầu [3]

Vào năm 2015, Dương Hồng Nhung đã phân lập được từ Adenosma Indiana (Lour.)

Merr các hợp chất 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl triacontanoat, β-sitosterol glucosid, acid betulinic [4]

b Cây Nhân trần tía

 Tinh dầu:

Nguyễn Viết Tựu và cộng sự phân tích thấy trong Adenosma bracteosum Bonati có

0,25% tinh dầu, màu vàng sẫm, tỉ trọng 0,890, chỉ số khúc xạ 1,496, sắc ký khí thấy 19 peak trong đó có 5 peak lớn cineol khoảng 18% [3]

Tsankova và cộng sự (1994) đã phân tích tinh dầu của Adenosma bracteosum Bonati

bằng GS và GC/MS thấy một số hợp chất chính gồm thymol (25.6%), linalool (13.1%) và (E)-β-farnesene (9.5%) Ngoài ra còn có sự hiện diện của carvacrol, đây là một tinh dầu kháng khuẩn mạnh và có khả năng chống ung thư (Can Baser, 2008; Đỗ Huy Bích và cộng

sự, 2004) [2],[21]

Bảng 1.1 Các thành phần hóa học có trong tinh dầu Adenosma bracteosum Bonati

được scutellarein-6-O-glycoside hiện diện trong Nhân trần tía Adenosma bracteosum

Bonati của Việt Nam [10]

1.2.4 Hoạt tính sinh học

a Hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Adenosma sp

Lê Tùng Châu và Nguyễn Viết Tựu (1975) đã có một số nghiên cứu về hoạt tính sinh

học của những loài thuộc chi Adenosma sp ở Việt Nam.[3],[8]

Bao gồm:

- Tác dụng trên gan mật: các loài thuộc chi Adenosma sp có tác dụng làm tăng tiết

dịch mật, thúc đẩy quá trình bài xuất dịch mật Đồng thời giúp bảo vệ tế bào gan, tăng cường chức năng giải độc của gan, phòng chống tích cực tình trạng gan nhiễm mỡ Nhân trần bồ bồ có tác dụng sinh học học mạnh hơn Nhân trần nam

- Tác dụng chống viêm: các loài thuộc chi Adenosma sp có tác dụng giải nhiệt, giảm

đau, chống viêm Tác dụng chống viêm ở giai đoạn cấp tính mạnh hơn mãn tính Thử nghiệm trên 3 mô hình (mô hình kaolin, mô hình u hạt, mô hình teo tuyến ức), kết quả Nhân trần nam và Nhân trần bồ bồ có tác dụng kháng viêm trên cả 3 mô hình

- Tác dụng kháng khuẩn: dịch chiết từ các loài thuộc chi Adenosma sp có khả năng

ức chế một số vi khuẩn Cao cồn và cao nước của Nhân trần bồ bồ có tác dụng ức chế sự phát triển của các khuẩn Shigella dyseteriae, Shigella shigae, Staphylococus aureus 209 P

và Streptococcus hemolyticus S84 Khả năng kháng khuẩn của Nhân trần nam kém hơn Nhân trần bồ bồ, nhất là với trực khuẩn lỵ Nhưng Nhân trần nam ức chế mạnh hơn với Staphylococus và Streptococcus

- Tác dụng trên tuần hoàn: làm hạ huyết áp, điều chỉnh rối loạn lipit máu, cải thiện lưu lượng tuần hoàn nuôi tim và não

- Ứng dụng trên lâm sàng: các loài thuộc chi Adenosma sp được sử dụng để điều trị các bệnh viêm gan, truyền nhiễm cấp tính thể vàng da, vàng da tán huyết do thương hàn ở trẻ sơ sinh, giun chui ống mật, rối loạn lipit máu, thiểu năng mạch vành, viêm loét miệng, nấm da

- Độc tính cấp: Nhân trần nam và Nhân trần bồ bồ không gây độc

Guichard và Clemensat (1939) đã nghiên cứu tác dụng của diệt giun của Nhân trần nam và Nhân trần bồ bồ Tinh dầu và nước cất từ Nhân trần bồ bồ có tác dụng diệt giun đất, giun đũa và giun móc Giun đất sau khi tiếp xúc với thuốc sẽ quằn quại trong vòng 10 – 15 phút rồi chết, còn giun đũa phải sau 2 – 3 giờ mới chết Thí nghiệm trên giun đũa của lợn (Ascarissuum) sơ bộ thấy Nhân trần nam có tác dụng tốt

Nguyễn Bích Thu và cộng sự (2010) đã chứng minh Nhân trần nam Adenosma caeruleum có khả năng các dòng tế bào ung thư phổi A54, ung thư vú MCF-7, ung thư gan HepG2 và dòng tế bào fibrosarcoma người HT 1080 bằng phương pháp MTT; với chỉ số IC50 2,0 - 3,3 µg/ml.[3]

b Hoạt tính sinh học của Nhân trần tía

Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati đã được dùng trong y học cổ truyền để

phòng ngừa và chữa trị các bệnh lý về tiêu hóa và gan mật Đây là loại thực vật gây được

sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới do khả năng phòng chống viêm gan, chữa viêm gan virus, bảo vệ gan trước các hóa chất hóa độc hại (Nguyễn Đức Hạnh, 2008).[10]

Cây thường được sử dụng trong dân gian với tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, lợi mật, tiêu độc, lợi tiểu, chữa cảm cúm, táo bón, bệnh vàng da Tác dụng tăng tiết mật thí nghiệm trên chuột lang cho thấy dịch chiết Nhân trần tía làm tăng tiết mật 24,7% so với lô đối chứng Độc tính cấp cho chuột uống với liều 3000 mg/kg thể trọng dịch chiết nước không thấy chuột lang chết Chữa viêm gan virus trên lâm sàng Bệnh viện Chợ Quán thành phố Hồ Chí Minh đã dùng Nhân trần tía chữa trị viêm gan virus cho các bệnh nhân, kết quả số bệnh nhân khỏi hẳn là 24%, số bệnh nhân có chuyển biến khá và tốt là 46,6% (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004).[2]

Nguyễn Minh Đức và cộng sự (2007) đã chứng minh công thức phối hợp cao Diệp

hạ châu, cao Nhân trần tía, cao Rau má và cao Nghệ không những ức chế sự tăng hàm lượng MDA ở các tế bào gan bị tổn thương mà còn có tác dụng làm giảm sự tăng hoạt độ các transaminase GOT và GPT trong tổn thương gan gây ra bởi CCl.[13]

Protecliv là một sản phẩm thuốc được bào chế từ 50% cao Nhân trần tía và 50% Tảo Spirulina có tác dụng chống nhiễm độc gan do tác dụng phụ của Rifampicin và các dẫn xuất Rifampicin (INH và RIF) ở các bệnh nhân phải điều trị bệnh lao bằng các loại thuốc này (Vũ Mạnh Hùng và Bùi Thị Bích Vân, 2008).[16]

Cao toàn phần phối hợp giữa lá Đinh lăng và Nhân trần Tây Ninh thể hiện tác động bảo vệ gan trên ba mô hình gây tổn thương gan bằng ethanol, tetraclorua và paracetamol (Dương Thị Mộng Ngọc và cộng sự, 2011).[5]

1.3 Định nghĩa về gốc tự do, stress oxy hóa, chất chống oxy hóa và bệnh tiểu đường

1.3.1 Khái niệm về gốc tự do và stress oxy hóa

Gốc tự do là các phân tử hay nguyên tử có lớp ngoài cùng chỉ chứa điện tử độc thân

Vì chỉ có một điện tử đơn l nên gốc tự do luôn ở trạng thái bất ổn và tìm cách chiếm lấy điện tử của các nguyên tử khác Các gốc tự do hoạt động chứa oxy là các dẫn xuất dạng khử của oxy phân tử (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009).[6]

Các “gốc tự do” hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (Reactive Oxygen Species - ROS và Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng

khử của oxy và nitơ phân tử Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các “gốc tự do” và các dẫn xuất không phải gốc tự do Các “gốc tự do” là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều điện tử độc thân Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxyde, nitroperoxyde là tiền chất của các gốc tự do

Bảng 1.2 Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học (Wallace, 1997; Puri, 2014) [37],[46]

Nguồn gốc phát sinh gốc tự do:

Nguồn nội sinh: Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý như quá trình hô hấp ở tế bào, hoặc các quá trình bệnh lý như quá trình viêm nhiễm, hoặc bởi hệ thống enzyme thân oxy hóa (prooxydant enzyme), ion kim loại chuyển tiếp… trong cơ thể

Nguồn ngoại sinh: Ngoài những yếu tố nội sinh, gốc tự do còn được hình thành trong cơ thể bởi các yếu tố ngoại sinh như sự ô nhiễm môi trường, bức xạ, khói thuốc lá, sử dụng thuốc giảm đau quá liều, uống nhiều rượu bia…

Khi nồng độ thấp, các gốc tự do là các tín hiệu làm nhiệm vụ điều hoà quá trình chết theo chu trình của tế bào (apoptosis), kích hoạt các yếu tố phiên mã cho các gen tham gia vào quá trình miễn dịch, kháng viêm, điều hoà các gen mã hóa cho các enzyme chống oxy hóa Khi nồng độ cao, các gốc tự do gây ra sự phá hủy các đại phân tử sinh học dẫn đến nhiều bệnh nghiêm trọng

Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxy hóa gây tác động xấu đến cơ thể sinh vật

1.3.2 Tác hại của stress oxy hóa

a Tác động lên DNA

Hydroxyl là gốc tự do có khả năng phá hủy DNA mạnh nhất, thường là qua con đường biến đổi các base hay phân cắt chuỗi DNA Sợi đôi DNA bị bẽ gãy sẽ gây ra hiện tượng chết tế bào Bản thân superoxyd không tương tác với DNA nhưng có khả năng khử

Fe3+ thành Fe2+ xúc tác phản ứng Fenton, khởi đầu cho sự phá hủy DNA Mặt khác, gốc perhydroxyl có thể lấy đi nguyên tử 5’-hydrogen từ vòng deoxyribose và cơ chế này có thể chuyên biệt cho phản ứng của HOO● (Dix và cộng sự, 1996).[26]

Bảng 1.3 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa DNA (Cooke và cộng sự, 2003)[22]

Da Viêm da phân bào; Vẩy nến da; Ung thư da

và methionin do cả hai chứa nguyên tử sulfur linh hoạt, hầu như tất cả các tác nhân oxy hóa đều có thể oxy hóa hai acid amin này Trong khi ở các acid amin khác, sự oxy hóa cần các điều kiện nghiêm ngặt hơn Cách oxy hóa hiệu quả nhất là tấn công thông qua xúc tác kim loại ở các vị trí chuyên biệt, trong đó các dạng khử của kim loại chuyển vị liên kết với protein sẽ khử H2O2 thành dạng trung gian hoạt động (Shacter, 2000).[40]

Bảng 1.4 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa protein [40]

Carbonyl; Glutamine synthetase Lão hóa; Alzheimer; Thiếu máu cục bộ

Protein thủy tinh thể Đục thủy tinh thể

Một số protein chưa biết Lão hóa; Parkinson; Xơ vữa động mạch;

Viêm phổi mãn tính

c Tác động lên lipid

Sự oxy hóa lipid bị gây ra bởi nhiều tác nhân và sự cân bằng giữa các tác nhân này bao gồm một hệ thống dựa trên dung môi, nồng độ và thành phần acid béo, nhiệt độ, áp suất oxy, đặc biệt là các nguồn hydrogen (Denisov, 2005).[25]

Bảng 1.5 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa lipid (Adibhatla, 2010)[18]

Bệnh

Thần kinh Azheimer; Parkinson; Teo cơ; Đa xơ cứng; Tâm thần phân liệt;

Tổn thương dây thần kinh cột sống

Tim mạch Xơ vữa động mạch; Nhồi máu cơ tim

Thận Phù hạch bạch huyết mãn tính; Viêm thận mãn tính

Gan Gan nhiễm mỡ; Xơ gan; Ung thư gan; Kháng insulin

ngoại vi; Nhiễm virus viêm gan C Một số cơ quan khác Viêm; Tiểu đường; Ung thư; Lão hóa

1.3.3 Chất chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể (Jovanovic và Simic, 2000) Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe; vô hoạt oxy đơn) (Singh và Rajini, 2004) Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người được cung cấp bởi hai nguồn bên trong và bên ngoài Các chất

chống oxy hóa bên trong bao gồm các protein (ferritine, transferrine, albumine, protein sốc nhiệt) và các enzyme chống oxy hóa (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase) Các chất chống oxy hóa bên ngoài là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường thức ăn và đó chủ yếu là các hợp chất tự nhiên Các chất này có nhiều trong rau và quả Chúng được coi là các chất chống oxy hóa tự nhiên Việc sử dụng nhiều rau quảlà con đường đơn giản và hữu hiệu nhất để tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009).[6], [31], [41]

1.3.4 Bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường là một nhóm các bệnh lý chuyển hóa đặc trưng bởi tăng Glucose máu do khiếm khuyết tiết insuline, khiếm khuyết hoạt động insuline, hoặc cả hai Tăng Glucose máu mạn tính trong đái tháo đường sẽ gây tổn thương, rối loạn chức năng hay suy nhiều cơ quan, đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu

Đối với đại số đông những người bình thường khỏe mạnh, họ có chỉ số đường huyết theo mức chuẩn như sau:

 Đường huyết bình thường trong cơ thể trước bữa ăn trong khoảng 4 mm (4 mmol/l đến 4,9 mmol/l hoặc 72 mg/dl)

 Đường huyết bình thường trong cơ thể 2h sau bữa ăn có thể tăng tạm thời lên cao nhất đến mức 7,8 mmol/l (140 mg/dl)

Chỉ số lượng đường trong máu ở trạng thái cơ thể phục hồi trong khoảng 4,4 – 6,1 mmol/l (82-110 mg/dl)

1.4 Hợp chất tự nhiên từ thực vật

Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của Nhân trần tía, nhận thấy thành phần chủ yếu của loài này terpenoid, steroid và polyphenol (Lê Hoàng Khải, 2016), do đó xin được giới thiệu thông tin sơ bộ về các nhóm họp chất này.[7]

1.4.1 Terpenoid

a Định nghĩa và phân loại

Terpenoid (hay isoprenoid) là một nhóm các hợp chất tự nhiên (HCTN) hình thành

do sự kết hợp của các đơn vị isopren mang 5C, chiếm số lượng lớn (>35000 chất) trong các nhóm HCTN và có cấu trúc rất đa dạng Tùy theo số đơn vị isopren có trong phân tử, người chia thành các nhóm hemi- (1 đơn vị isopren và 5C), mono- (2 đơn vị và 10C), sesqui- (13 đơn vị và 15C), di- (4 đơn vị và 20C), sester- (5 đơn vị và 25C), tri- (6 đơn vị và 30C), tetra- (8 đơn vị và 40C) và polyterpenoid (>8 đơn vị isopren và >40C) (Nguyễn Diệu Liên Hoa và Phạm Đình Hùng, 2015).[9]

b Nguồn gốc và ứng dụng

Terpenoid được tìm thấy rộng rãi với số lượng lớn trong thực vật bậc cao, ở tất cả

bộ phận của cây như hoa, lá, hạt, rễ , gỗ và cũng xuất hiện ở rêu, tảo, địa y, đĩa tiễn Một số nguồn gốc từ động vật (đặc biệt là côn trùng) và vi khuẩn

Mono- và sesquiterpenoid là thành phần chính của tinh dầu, dễ bay hơi và có mùi thơm, tìm thấy trong nhựa cây Tuy nhiên các di- và sesquiterpenoid tồn tại ở dạng glycosid hay ester với acid béo thì không bị lôi cuốn theo hơi nước Di- và triterpenoid có trong nhựa cây và không bị lôi cuốn theo hơi nước Sesterterpenoid hiếm gặp Tetraterpenoid chủ yếu

là các sắc số tự nhiên, tiêu biểu nhất là carotenoid

Terpenoid từ lâu đã được dùng trong mỹ phẩm, xà phòng, hương liệu, dược phẩm, chất khử trùng Terpenoid sở hữu khả năng kháng oxy mạnh, nhờ đó chúng có khả năng bảo vệ cơ thể khỏi sự tác động của stress oxy hóa, nhất là một số căn bệnh như viêm gan, thận, thần kinh, bệnh tim mạch, ung thư, tiểu đường, lão hóa Trong phạm vi đề tài xin được giới thiệu một hoạt tính sinh học tiêu biểu của nhóm chất này

Kháng khuẩn: trong chi Nhân trần có sự hiện diện của p-cymen, carvacrol, thymol

là các monoterpenoid một vòng; carvacrol, thymol là 2 chất kháng khuẩn mạnh được dùng làm thuốc sát khuẩn trong nha khoa Một thành phần khác là camphor thuộc dạng monoterpenoid hai vòng, có mùi thơm và thể hiện khả năng kháng khuẩn, được dùng trong nước hoa Cơ chế chính được cho terpenoid đã làm rối loạn thành phần màng tế bào vi khuẩn, dẫn đến sự thay đổi tính thấm và làm rò rĩ tế bào chất, ngoài ra sau khi xâm nhập

vào trong tế bào vi khuẩn, các hợp chất này tiếp tục gây hư hại các cấu trúc sinh học của vi khuẩn (Trombetta, 2005).[42]

Chất chống oxy hóa: những hợp chất monoterpenoid trong cấu trúc có nhóm methylene như terpinolene, α-terpinene, β-terpinene và sabinene có tính kháng oxy hóa mạnh; những monoterpenoid có cấu trúc phenol như thymol và carvacrol cũng thể hiện khả năng kháng oxy hóa Khả năng kháng oxy hóa khả quan nhất là ở nhóm tetraterpenoid, thể hiện mạnh nhất ở các carotenoid (α-carotene, β-carotene, lutein, zeaxanthin, β-cryptoxanthin, lycopene), (Gonzalez-Burgos và Gomez-Serranillos, 2012).[29]

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng hỗ trợ điều trị tiểu đường của terpenoid thông qua việc làm giảm stress oxy hóa Nhiều báo cáo thu được kết quả khả quan trên mô hình động vật mang gen tiểu đường và mô hình chuột gây độc bằng alloxan

và streptozotocin Nhiều nghiên cứu dịch tễ học cũng được tiến hành, tập trung vào chế độ

ăn giàu carotenoid Ở những monoterpenoid, nổi bật là catapol với khả năng bảo vệ não khỏi bệnh tật trong khi mắc bệnh đái tháo đường, aucubin tác động lên tuyến tụy để điều khiển bệnh, loganin và morroniside làm giảm hoạt động của ROS, logarin bảo vệ gan khỏi tác động của bệnh tiểu đường Những sesquiterpenoid như costunolide, eremanthin thể hiện khả năng chống stress oxy hóa trong mô hình chuột streptozocin thông qua cơ chế làm tăng các enzyme chống oxy hóa như SOD, CAT, GPx và các chất chống oxy hóa phi enzyme như GSH Một số triterpenoid như arjunolic acid và glycyrrhizin, ginsenoside là những hợp chất chống lại bệnh tiểu đường rất mạnh Carotenoid một lần nữa thể hiện khả năng dược

lý, một nhóm bệnh nhân tiểu đường type 2 cho cho sử dụng chế độ ăn giàu caraotenoid lycopene đã làm giảm nguy cơ tim mạch cho những bệnh nhân này Trên mô hình chuột tiểu đường type 2, astaxanthin giúp giảm stress oxy hóa gây ra bởi nồng độ đường cao (GonzalezBurgos và Gomez-Serranillos, 2012).[29]

Chống tế bào ung thư: betulinic acid là một triterpenoid tiêu biểu có trong chi

Adenosma sp., betulinic acid được biết tới như là một chất ức chế u ác tính trên người, qua

thực nghiệm đã chứng minh được betulinic acid có khả năng phá hủy tế bào trong các hệ thống ung thư (Fulda, 2009) Safe và cộng sự (2012) đã đặt ra một số cơ chế chống ung

thư của terpenoid như khả năng loại gốc tự do, làm giảm tác nhân gây ung thư và tác động lên thụ thể hạt nhân và cặp thụ thể G-protein tế bào ung thư.[28],[39]

1.4.2 Steroid

a Định nghĩa, phân loại

Steroid là một nhóm HCTN quan trọng, phân bố rộng rãi trong động vật, thực vật và

vi sinh vật Cholesterol là steroid tiêu biểu nhất Khi biến đổi, đặc biệt trên mạch nhánh, cholestrol tạo thành các hợp chất có hoạt tính quan trọng như acid mật, vitamin D, kích thích tố Nhiều steroid tự nhiên, một lượng lớn steroid tổng hợp và bán tổng tổng hợp có hoạt tính sinh học hữu ích nên được sử dụng nhiều trong y học Mặc dù có cùng khung sườn, hoạt tính sinh học của các steroid rất khác nhau, có lẽ một phần là do sự hiện diện của các nhóm định chức gắn lên sườn steroid và một phần là do hóa học lập thể của các vòng dung hợp

Steroid là các triterpenoid biến đổi, chứa hệ bốn vòng có khung gonan Steroid trong

tự nhiên được chia thành các nhóm chính như sau sterol (zoosterol, phytosterol và mycosterol), acid mật, nội tiết tố giới tính, corticosteroid, vitamin D, glycosid tim, saponin steroid Các sterol từ thực vật được gọi chung là phytosterol, trong đó ergostrol và stigmasterol là hai sterol thực vật chính (Nguyễn Diệu Liên Hoa và Phạm Đình Hùng, 2015).[9]

b Nguồn gốc và ứng dụng

Những phytosterol như β-sitosterol, campesterol, stigmasterol and cycloartenol được tìm thấy nhiều trong dầu olive, dầu phộng, dầu nành, hạt dẻ , hạt vừng, hạnh nhân… Chúng từ lâu được biết đến như một chất giúp làm ngăn chặn các vấn đề về tim mạch, béo phì, tiểu đường (Nguyễn Diệu Liên Hoa và Phạm Đình Hùng, 2015).[9]

Yosida và cộng sự (2003) đã chứng minh khả năng chống oxy hóa của β-sitosterol, campesterol, stigmasterol Mặc dù cơ chế không được giải thích đầy đủ nhưng qua thực nghiệm các phytosterol đều có khả năng loại gốc tự do mạnh.[50]

Các phytosterol có khả năng ngăn chặn nhiều loại ung thư khác nhau, như ung thư phổi (Mendilaharsu và cộng sự, 1998), ung thư dạ dày (De Stefani và cộng sự, 2000), ung

thư vú, dạ dày (Awad và Fink, 2000) Cơ chế chính của chúng tác động lên các tế bào ung thư được Woyengo và cộng sự (2009) mô tả như sau:

+ Phytosterol làm giảm sự sản sinh các chất gây ung thư và có khả năng loại bỏ các gốc tự do, kích hoạt các enzyme chống oxy hóa, superoxide dismutase và glutathione peroxidase, làm giảm sự hư hại tế bào

+ Kích thích quá trình apoptosis (chương trình tự chết tế bào) bằng cách kích thích tăng hoạt động của caspase-3 (một loại enzyme pro-apoptosis họ MAPK) Một cơ chế khác

là phytosterol giúp thúc đẩy quá trình apoptosis bằng cách hạ thấp mức cholesterol trong máu Việc giảm mức cholesterol trong máu có thể giúp tăng quá trình apoptosis Cholesterol trong máu cao có sự liên quan đến bệnh ung thư, Oadir và Malik (2008) ghi nhận ở phụ nữ

bị ung thư vú có nồng độ tryglyceride, cholesterol và LDL-cholesterol cao hơn so với người bình thường; chúng sẽ tích tụ trên màng tế bào, làm thay đổi tính chất của màng tế bào; ngoài ra cholesterol còn làm giảm quá trình apoptosis của tế bào

+ Ngăn chặn di căn và sự hình thành mạch của tế bào ung thư Sự tạo mạch của tế bào ung thư nhằm lấy dinh dưỡng để phát triển và di căn là nguyên nhân chính gây tử vong bởi ung thư Campesterol và β-sitosterol được Awad và cộng sự (2001) chứng minh là có khả năng làm giảm quá trình di căn của tế bào ung thư.[19],[24],[32],[47]

1.4.3 Polyphenol

a Định nghĩa, phân loại

Đây là nhóm hợp chất lớn trong các nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật Các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8000 hợp chất phenol tự nhiên Đặc biệt trong cấu trúc của nhóm này trong phân tử có vòng 6C (vòng benzen) gắn trực tiếp một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH) Vì vậy chúng là những alcol bậc 4 và được đặc trưng bởi tính acid yếu

Dựa vào thành phần chính và cấu trúc phenol, người ta chia chúng thành 3 nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol Phân loại này dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó là C6 là nhóm phenyl, C1 là nhóm methyl, C2 là nhóm acetyl, C3 là nhóm thế có 3 carbon, C4 là nhóm thế có 4 carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1 (acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3

(acid hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4 (naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2-C6(stilbene, anthraquinone), C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6-C3)2 (lignan, neolignan), (C6-C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ)

Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trùng hợp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng

b Nguồn gốc, ứng dụng

Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ cấp so với động vật vì chúng không thể lẫn trốn đươc kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này Các phenol còn có vai trò quan trọng trong hình thành các sắc tố của hoa như đỏ, xanh, tím… Đặc tính chống oxy hóa hay tạo phức với kim loại; tạo ra các tín hiệu thông tin giữa phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác với sinh vật khác; polyphenol còn là các tác nhân che chắn tia

tử ngoại (UV) từ mặt trời Khả năng chống tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàn toàn Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi hợp chất phenol không chỉ bảo vệ chống lại các yếu tố sinh học mà còn tham gia quá trình điều hòa ở cấp độ phân

tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa

c Flavonoid

Flavonoid là một trong các nhóm polyphenol thường gặp ở thực vật, với hơn 4500 hợp chất, được phân loại thành các nhóm flavanol, flavanone, flavon, isoflavone, catechin, anthocyanin, proanthocyanidin Phần lớn chúng dễ tan trong nước, tạo màu vàng nên được gọi là “flavonoid” (flavus – tiếng Latin, có nghĩa là màu vàng), một sắc tố xanh đỏ tím hoặc không màu cũng được sắp xếp vào nhóm flavonoid nếu chúng có chung đặc điểm cấu tạo hóa học Flavonoid là sản phẩm của con đường acid shikimic, chúng có khung carbon chung là C6-C3-C6

 Tính chất sinh học

Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú Các cơ chế hóa học của chúng có nhiều điểm còn chưa sáng tỏ, tuy nhiên cơ chế đóng vai trò quyết định là tác dụng chống oxyl hóa Nhờ đó flavonoid có thể triệt tiêu gốc tự do có hại trong cơ thể, giúp

cơ thể động vật và con người phòng chống bệnh tật

- Flavonoid có khả năng kiềm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi gốc

tự do Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tọa hóa học của từng chất flavonoid cụ thể Do bản chất cấu tạo polyphenol nên flavonoid ở trong

tế bào thực vật hoặc ở trong cơ thể động vật chịu tác động của các biến đổi oxy hóa khử, tồn tại ở dạng hydroxyl, semiquinone Semiquinone hoặc quinone là những gốc tự do bền vững, gọi là gốc phenoxyl, kí hiệu ArO* Chúng có thể nhận điện tử và hydrogen từ chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinone Các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý để triệt tiêu chúng

- Sự có mặt của các nhóm hydroxyl nhân thơm của các flavonoid cũng như các polyphenol làm cho chúng có khả năng tương tác với protein Tương tác này có thể làm hoạt hóa hay ức chế hoạt động của enzyme Tác dụng của flavonoid lên các enzyme là một trong những cơ sở hóa sinh để định hướng cho việc sử dụng các chất flavonoid để chữa bệnh

- Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định flavonoid có khả năng chống ung thư Các flavonoid có tác dụng kiềm hãm các enzyme oxy hóa, kìm hãm quá trình đường phân, quá trình hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn chế sự phá vỡ cân bằng các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào; ngăn ngừa hoặc trì hoãn một số bệnh mãn tính và thoái hóa như ung thư, bệnh tim mạch, viêm khớp, lão hóa, đục thủy tinh thể, giảm trí nhớ, đột quỵ, bệnh Alzheimer, viêm, nhiễm trùng (Pham-Huy và cộng sự, 2008).[36]

PHẦN 2: MỤC TIÊU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu đề tài

Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.) là một trong số các dược liệu được sử

dụng lâu đời có công dụng thanh nhiệt, chữa các bệnh về gan mật, cho thấy có hiệu quả Trên thị trường cũng đã có một số chế phẩm có nguồn gốc từ Nhân trần tía nhưng đa số

chưa có tiêu chuẩn cụ thể Các nghiên cứu trước đây về A Bracteosum chủ yếu về tác dụng

dược lý, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hoá học

Do đó đề tài “Nghiên cứu hoạt tính sinh học định hướng phân lập hợp chất tinh khiết

từ cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati.) và ứng dụng” được thực hiện với mục

tiêu cụ thể:

- Phân tích sơ bộ thành phần hoá học từ tủa trong dịch chiết cồn của cây Nhân trần tía

- Khảo sát một số hoạt tính sinh học của cây Nhân trần tía

- Chiết xuất và phân lập hợp chất hoá học từ tủa trong cao cồn của cây Nhân trần tía

- Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất tinh khiết từ tủa trong cao cồn của cây Nhân trần tía

- Bước đầu nghiên cứu quy trình tạo sản phẩm ứng dụng từ nguồn nguyên liệu này

2.2 Nguyên liệu, dung môi, hoá chất, trang thiết bị

2.2.1 Nguyên liệu

a Nguyên liệu thực vật

Toàn cây Nhân trần tía thu hái tại núi Bà Đen, tỉnh Tây Ninh vào tháng 9, năm 2017 Mẫu cây được định danh bởi PGS TS Trần Hợp, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

Cây được thu hoạch lúc sáng sớm

Được bảo quản trong thùng xốp có đục lỗ, tránh ẩm mốc

Sau đó mang đi phơi dưới bóng râm, tránh dưới anh nắng trực tiếp cho đến khi khô

b Nguyên liệu động vật

Chuột bạch chủng Swiss albino, lông trắng sáng toàn thân, khoẻ mạnh, có khối lượng

cơ thể 21 ± 2 g được mua tại Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh Động vật thực nghiệm được nuôi trước thời gian nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn được cung cấp bởi Viện Pasteur

2.2.2 Dung môi, hoá chất

Cồn 96% loại dùng cho thực phẩm

Các dung môi hữu cơ: aceton (Ac), chlorofrom (CF), methanol (MeOH), benzen

(Bz), ethyl acetat (EA), sử dụng loại AR do Trung Quốc sản xuất

Các hoá chất khác: HCl, H2SO4, NaOH, KOH, bột Mg kim loại, FeCl3, vanilin sử dụng loại tinh khiết phân tích

- Vitamin C; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma – Đức)

- Glibenclamide; streptozocin; carbon tetrachloride; ciprofloxacin (Flamingo - Ấn Độ)

- FeCl3, K3Fe(CN)6; CCl3COOH; H3PO4; NaCO3; BaCl2; H2SO4; D- glucose; Đệm phosphate; Đệm acetate

- Dung môi dùng cho phân tích (AR): methanol (Xilong – Trung Quốc); dimethyl sulfoxyde

- DMSO (Xilong - Trung Quốc); chloroform (Việt Nam); ethyl acetate (Xilong - Trung Quốc)

Các hoá chất và thuốc thử khác thông dụng trong phòng thí nghiệm

2.2.3 Trang thiết bị

Phần thực nghiệm của đề tài sử dụng các máy móc, thiết bị chủ yếu tại Phòng Hoá hợp chất thiên nhiên, Viện Công nghệ Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Máy cô quay chân không Rotavapor 05 basic IKA

Tủ sấy Memmert

Bếp cách thuỷ Memmert

Bếp khuấy từ

Cân kỹ thuật OHAUS Voyager Pro, P = 0,01 g, max = 210 g Cân phân tích Pioneer, P = 0,1 mg, max = 210 g

Đèn UV 254/365 nm Spectroline ENF – 240C/FE

Máy đo phổ hồng ngoại Bruker Alpha T

Máy quang phổ UV-Vis U2800 Hitachi

Các thiết bị thông dụng khác trong phòng thí nghiệm

Tủ sấy chân không Salvis

Máy đo đường huyết Benecheck Plus (Đài Loan)

Máy sấy phun SD-Basic

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Ghi chú: cao C: cao chiết chloroform; cao AQ: cao nước (aueous); cao Et: cao cồn

(Ethanol)

Ngâm kiệt trong

Ngâm kiệt trong cồn

Hoạt tính

ức chế enzyme Xathin oxidase

Cao Et Cao AQ

Cao Et trích ly lỏng-lỏng thu cao phân đoạn CHCl3

Qua các sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng

Hợp chất tinh khiết

Phổ MS, NMR (DMSO, HSQC,…) Định danh

Khảo sát ảnh hưởng của hợp chất lên lượng đường trong máu

Bước đầu xây

dựng sản phẩm thực tế

2.3.1 Xác định độ ẩm

Độ ẩm của dược liệu được thực hiện bằng phương pháp Xác định mất khối lượng do làm khô Cụ thể là dùng phương pháp: sấy trong tủ sấy ở áp suất thường theo Dược điển Việt Nam Quyển III, Phụ lục 5.16.[1]

Cách thực hiện Sấy cốc cân ở nhiệt độ 125oC – 130oC trong 1 giờ Cho cốc vào bình hút ẩm 30 phút Dùng cân phân tích có độ chính xác 0,001 g cân khối lượng của cốc Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào cốc cân (đã biết trước khối lượng) Đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 125oC – 130oC trong 1 giờ và cân khối lượng Làm tương tự như vậy cho đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5 mg

Tính toán kết quả Độ ẩm được tính bằng phần trăm theo công thức:

𝑊 = (𝑚𝑏𝑑− 𝑚𝑠𝑎𝑢)

Trong đó:

W: độ ẩm của dược liệu (%)

mbd: Khối lượng ban đầu (g)

msau: Khối lượng sấy (g)

2.3.2 Quá trình chiết và thu nhận cao chiết

Nguyên liệu: toàn cây Nhân trần tía tươi sau khi hái, sẽ được rửa sạch, phơi khô và

nghiền cho đến khi tạo thành bột có kích thước từ d = 1,5 - 2 mm

Chiết:

Mục đích: Chiết các hợp chất có trong cây Nhân trần tía nhờ dung môi ethanol và nước, quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 24 - 48 giờ, trên máy lắc 150 vòng /phút

Cách thực hiện: Ngâm bột cây Nhân trần tía vào dung môi ethanol 96%, dung môi

nước và dung môi Chloroform, tỉ lệ khối lượng và dung môi là 1:10, lắc 24 - 48 giờ với tốc

độ lắc 150 vòng/phút, lặp lại 3 lần

Lọc: Để thu hồi dịch chiết cần phải qua lọc thô để loại cặn bã nguyên liệu lẫn trong

dịch chiết, thu dịch trong để chuẩn bị quá trình thu cao

Cô quay: Nhằm thu hồi dung môi để tái sử dụng Sau khi thu được cao thô từ dịch

chiết nước, dịch chiết cồn và dịch chiết chloroform, toàn bộ cao được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh ở nhiệt độ 10oC - 14oC để tiếp tục dùng cho các thí nghiệm tiếp theo Sử dụng một phần cao thô từ dịch chiết cồn để tiếp tục quá trình chiết phân đoạn

Chiết phân đoạn:

- Cao ethanol thô sau đó được hoà vào lượng nước cất vừa đủ để hòa tan cao và tiếp tục được phân chia bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

- Cho dung dịch cao ethanol vào bình lóng, thêm vào khoảng một thể tích chloroform (CHCl3) với tỉ lệ so với cao chiết là 1:1, lắc nhẹ, chờ cho hỗn hợp phân lớp hoàn toàn Lúc này, nhẹ nhàng tháo van chiết lấy pha CHCl3 nằm dưới, pha nước nằm trên được cho vào bình chứa, lặp lại quá trình này 4 lần

- Đuổi dung môi bằng phương pháp cô quay ở nhiệt độ 45oC, thu được cao phân đoạn CHCl3

- Cao phân đoạn được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng cao thu được

Với mỗi loại dược liệu, sau quá trình chiết xuất ta thu được cao chiết Cân khối lượng các cao thu được trên cân phân tích 4 số Tính toán % cao thu được cho phép ta biết được hiệu quả kinh tế của dược liệu Với mỗi loại dược liệu, % cao được tính theo công thức sau:

Nguyên tắc là dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong dược liệu để tách các hợp chất bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau Sau đó, xác định các hợp chất này bằng