Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia mercescens SH1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

Nhưng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã được nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng như cách tổng hợp bằng phương pháp hóa học, bởi người ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sả

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Hồ Thị Bích Phương MSSV: 1151100246 Lớp: 11DSH04

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường đại học Công nghệ TP.Hồ Chí Minh Các số liệu và kết quả là trung thực, chưa ai công bố

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước quý thầy cô

và nhà trường

Tp Hồ Chí Minh, tháng 8, năm 2015 Sinh viên thực hiện

Hồ Thị Bích Phương

LỜI CẢM ƠN Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuôi

dạy con thành người và là người thầy đầu đời của con Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững

chắc nhất của con, là người giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động

viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống

Với lòng biết ơn sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Khoa

Công nghệ sinh học – Môi trường – Thực phẩm, cùng toàn thể Thầy Cô Trường Đại

học Công nghệ TP Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những

kiến thức quý báu về cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ ngày em bước chân vào

giảng đường đại học

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương người đã luôn tận

tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm của

đồ án

Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng

đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công

nghệ sinh học - Môi trường – Thực phẩm, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí

Minh

Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH04 và các bạn làm đồ án tại phòng thí nghiệm

Khoa Công nghệ sinh học - Môi trường – Thực phẩm đã luôn khích lệ, động viên và

giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trường và trong quá trình làm đồ án tốt

nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

SVTH: Hồ Thị Bích Phương

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỤC LỤC BẢNG viii

LỜI MỞ ĐẦU 9

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 12

1.1.1 Hợp chất thứ cấp 12

1.1.2 Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 12

1.2 Tổng quan prodigiosin 15

1.2.1 Khái niệm về prodigiosin 15

1.2.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin 16

1.2.3 Hoạt tính sinh học của prodigiosin 18

1.3 Tổng quan về Serratia marcescens 24

1.3.1 Phân loại Serratia marcescens 24

1.3.2 Đặc điểm của Serratia marcescens 25

1.3.4 Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens 29

1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S marcescens 31

1.4 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin 32

1.4.1 Cơ chế tổng hợp prodigiosin 32

1.4.2 Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin 34

1.4.3 Điều kiện tổng hợp prodigiosin 38

1.4.4 Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin 39

1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens 42

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU45 2.1 Thời gian và địa điểm 45

2.1.1 Thời gian 45

2.1.2 Địa điểm 45

2.2 Vật liệu 45

2.2.1 Nguồn vi sinh vật 45

2.2.2 Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng 45

2.3 Phương pháp nghiên cứu 46

2.4 Bố trí thí nghiệm 47

2.5.1 Khảo sát chủng nuôi cấy 49

2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết 49

2.5.2 Kháng sinh đồ 49

2.6 Xác định điều kiện lên men 49

2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuôi cấy 52

2.7.2 Xác định pH tối ưu cho môi trường lên men 53

2.7.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl 53

2.7.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp đồng nuôi cấy 54

2.7.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của sản phẩm Quorum sensing 55

2.8 Thu hồi sản phẩm thô 56

2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung môi đồng thời khảo sát thể tích lên men 56

2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ 56

2.9 Các phương pháp phân tích 56

2.9.1 Xác định protein có trong mẫu 57

2.9.2 Xác định lipid có trong mẫu 57

2.10 Sắc ký bản mỏng TLC 57

2.11 Phương pháp phân tích 59

2.11.1 Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin 59

2.11.2 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 59

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết 60

3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin 65

3.2.1 Ảnh hưởng của thể tích lên men lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp 65

3.2.2 Xác định vận tốc lắc 67

3.2.3 Kết quả xác định pH tối ưu cho môi trường MT3 69

3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp 71

3.2.5 Kết quả thí nghiệm đồng nuôi cấy 73

3.2.6 Sử dụng dịch trong nuôi cấy 76

3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trường 77

3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ canh trường: dung môi trích ly lên hàm lượng prodigiosin thu hồi 77

3.3.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trường 78

3.4 Xác định thành phần hóa học trong mẫu 84

3.4.1 Phản ứng Biuret’s test 84

3.4.2 Xác định lipid có trong mẫu 86

3.5 Sắc ký bản mỏng TLC 88

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91

4.1 Kết luận 91

4.2 Kiến nghị 92

TÀI LIỆU THAM KHẢO 93

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

EPN: Entomopathogenic nematodes

OD: mật độ quang (Optical Density)

TLC: Thin Layer Chromatogarphy

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 19

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna,2008) 20

Hình 1.3 Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011) 23 Hình 1.4 Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) 29

Hình 1.5 Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar ở 250C sau 48 giờ (David, 2012) 28

Hình 1.6 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001) 35

Hình 1.7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) 37

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 51

Hình 2.2 Sơ đồ trích ly 54

Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký 61

Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuôi cấy trên môi trường NA 63

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dưới kính hiển vi vật kính 10X .64

Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1 65

Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1 65

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thể tích lên men lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp 69

Hình 3.6 Hàm lượng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc 71

Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH lên sự tổng hợp prodigiosin của S marcescens SH1 73

Hình 3.8 Kết quả hàm lượng prodigiosin khi bổ sung NaCl 75

Hình 3.9 Đồng nuôi cấy Serratia marcescens SH1 và Bacillus sp 77

Hình 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy E coli 78

Hình 3.11 Hàm lượng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trường: dung môi khác nhau 81

Hình 3.12 Canh trường sau khi ly tâm 82

Hình 3.13 Sắc tố đỏ sau khi trích ly với dung môi Etanol:HCl (95:5) 83

Hình 3.14 Vi khuẩn S marcescens được cấy trên môi trường NA 84

Hình 3.15 Hàm lượng prodigiosin so với đối chứng 85

Hình 3.16 Kết quả quét quang phổ của sắc tố canh trường không đun và đun 1000C 86 Hình 3.17 Biuret’s test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thô 87 Hình 3.18 Ninhydrin test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thô ở thí nghiệm đun và không đun canh trường 88

Hình 3.19 Kết quả mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trước và sau khi phun thuốc thử 90

Hình 3.20 Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng hệ dung môi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70 : 40 : 2, v : v :v) 92

Hình 3.21 Sơ đồ quy trình S marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin 93

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1.1 Danh sách một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật 15

Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) 19

Bảng 1.3 Các sản phẩm prodigiosin thương mại hóa (Santa Cruz Biotechnology, Merck Millipore, Biovision incorporated) 25

Bảng 1.4 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010) 29 Bảng 1.5 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các môi trường và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009) 40

Bảng 2.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của máy lắc và chế độ lắc 55

Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh 66

Bảng 3.2 % Hàm lượng prodigiosin tổng hợp so với đối chứng (thí nghiệm A) 69

Bảng 3.3 Hàm lượng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc 70

Bảng 3.4 Kết quả hàm lượng prodigiosin trong mẫu 73

Bảng 3.5 Kết quả hàm lượng prodigiosin khi bổ sung muối NaCl 75

Bảng 3.6 % prodigiosin tổng hợp so với đối chứng 77

Bảng 3.7 Hàm lượng prodigiosin tổng hợp khi bổ sung dịch nuôi cấy 79

Bảng 3.8 % Ảnh hưởng của tỷ lệ canh trường : dung môi trích ly 80

Bảng 3.9 Kết quả hàm lượng prodigiosin trong thí nghiệm 84

Bảng 3.10 Kết quả xác định protein và lipid 91

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn như thực vật, vi sinh vật, động vật

có xương sống và không xương sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất hoạt tính sinh học Một số lượng lớn các loại thuốc đã được phát triển trong ngành y từ các sản phẩm tự nhiên Kể từ khi phát hiện và thành công trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã được sử dụng như một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng Các ứng dụng điều trị của các chất chuyển hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thư (ví dụ doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin)

chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ,… đã được sử dụng trong việc làm thuốc đông y,

mỹ phẩm, thực phẩm, Nhưng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã được nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng như cách tổng hợp bằng phương pháp hóa học, bởi người ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên quy mô lớn và chi phí sản xuất thấp Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu được chú ý đến Chính vì thế so với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh vật ngày càng được quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên

và an toàn dễ sử dụng, sản xuất được quanh năm trong các điều kiện địa lý khác nhau và do sự tăng trưởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản xuất xuống còn chỉ một vài ngày So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật có thể dễ dàng được kiểm soát và dự đoán sản

lượng (Francis, 1987; Taylor, 1984) Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất prodigiosin được biết đến với ý nghĩa quan trọng

Một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp

sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene)

Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005) Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lãnh vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997)

Sớm nhận thấy được lợi rất quan trọng của hợp chất prodigiosin được tách từ

việc nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, Nguyễn Hoàng Anh Kha đã thu nhận sắc

tố đỏ prodigiosin từ việc nuôi cấy trong môi trường peptone glycerol đạt 10,575 mg/ml sắc tố ( ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2014) Sau đó ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) đã khảo sát trong quá trình lên men thu prodigiosin, môi trường huyền phù đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lượng prodigiosin là 248,4% so với môi trường peptone glycerol là 100% Cũng trong ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) kết luận môi trường MT3 chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton và 1% dầu hướng dương, tỉ

lệ cấy giống 3%, lắc 180 vòng phút trong 24 giờ đầu sau đó giảm còn 150 vòng/phút

là môi trường và điều kiện tối ưu nhất để tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin Nhưng quá trình lên men còn ở quy mô sản xuất nhỏ 20 ml/bình và còn nhiều yếu tố cần cải thiện

Dựa trên cơ sở này đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Serratia mercescens SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ

2 Mục tiêu đề tài

Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng như

phương pháp thu hồi sắc tố thô

3 Nội dung đề tài

Khảo sát chủng Serratia marcescens xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng

sinh đồ

Cải tiến điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin: tăng thể

tích lên men, ảnh hưởng của vận tốc lắc, pH nuôi cấy, nồng độ muối % NaCl, thử áp dụng phương pháp đồng nuôi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung dịch nuôi cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing

Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thô từ canh trường nuôi cấy

4 Ý nghĩa khoa học

Áp dụng các kiến thức về công nghệ lên men sản xuất hợp chất thứ cấp vào tổng hợp prodigiosin

Xem xét khá năng sử dụng chủng Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến

trùng EPN vào sản xuất prodigiosin qua kháng sinh đồ khác biệt với chủng phân lập từ bệnh phẩm

Góp phần vào việc tăng quy mô và nồng độ sản phẩm prodigiosin tổng hợp bằng phương pháp lên men

5 Ý nghĩa thực tiễn

Cung cấp sản phẩm prodigiosin thô cho nghiên cứu tinh sạch và khảo sát hoạt tính sinh học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

1.1.1 Hợp chất thứ cấp

Hợp chất thứ cấp là chất được tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lượng phân

tử nhỏ, thường được gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trường xung quanh

Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất được vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp

1.1.2 Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

Vi sinh vật đã được sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học như thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị Có sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên Các thành phần, chẳng hạn như hợp chất thứ cấp, được xem là

tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học như động vật, thực vật hoặc vi sinh vật Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật được sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến

cá, ví dụ như để tăng màu hồng của cá hồi nuôi Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên

có tiềm năng thương mại để sử dụng như chất chống oxy hóa Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn) Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh

vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009) Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997)

Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất

cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams và cộng sự, 1971a) Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp

(Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật nhƣ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình Bảng 1.1 tóm tắt

về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật

Bảng 1.1 Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật

Ức chế tạo polymer vách tế bào vi khuẩn,

ức chế hấp thu amino acid và protein, ức chế tạo enzyme

chuyển pyruvate vào chu trình Creb…

Steptomyces

venezuelae

Chloramphenicol Ức chế đối với bệnh

lỵ, sốt cao, sốt phát ban

Ức chế đặc hiệu sinh tổng hợp protein vi khuẩn liên quan đến

trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide

Streptomyces

erythraeus

Erythromycin Chữa bệnh do tụ cầu

khuẩn streptococcal gây ra

ức chế vi khuẩn Gram

âm và Gram dương

khuẩn Gram âm và Gram dương

1.2.1 Khái niệm về prodigiosin

Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc

trưng của vi khuẩn Serratia marcescens Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc

từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu Prodigiosin được tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991)

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, được sản xuất bởi các vi khuẩn

như Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các

xạ khuẩn Gram dương, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006) Hình 1.1 trình bày cấu trúc hóa học của

các hợp chất đại diện của prodigiosin

Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)

1.2.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin

Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin đƣợc tổng

hợp bởi Serrattia marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962) Do sự

tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo,

mà cấu trúc của prodigiosin dần đƣợc nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000)

trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006; Williamson và cộng sự, 2006)

Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams, 1972; Gerber, 1975) Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc

Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước Prodigiosin có thể tan tương đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafari và cộng sự, 2006)

Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)

Loài Tên sắc tố Danh pháp prodigiosin Trọng lượng

phân tử và công thức

2,10-Nonano-6- Methoxy-prodigiosene

methoxyprodigiosene

Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể

kháng một số vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes,

mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, Tuy nhiên, hoạt động kháng

khuẩn của prodigiosin đối với các vi khuẩn Gram dương lại cao hơn so với các vi khuẩn Gram âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012)

1.2.3.2 Hoạt tính chống tế bào ung thư

Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng

tế bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng sự,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 2010) Vì khả năng gây độc chọn lọc này, prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thư Các hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh lần đầu tiên bằng những ác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7 hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999) Một mô hình khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn, bằng cách

nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này

đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế

Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin chủ yếu là do ảnh hưởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đường prodigiosin gây sự tự hủy của các

tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011) Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin

được mô tả cụ thể như sau:

Hình 1.3 Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011)

Quá trình acid hóa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng của quá trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004) Acid hóa nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình tự hủy trong tế bào HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tương tự như prodigiosin gây ra sự tự hủy ở tế bào ung thư ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005)

Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đường tự hủy của ty thể bằng cách điều hòa tính thấm của màng ty thể bên ngoài Tăng tính thấm của màng ty thể bên ngoài sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c, nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy Prodigiosin được biết là tác nhân gây ra sự kích thích quá trình tự hủy của protein BCL-2 BAX trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004) Tương tự như vậy, các nghiên cứu cũng đã chứng minh trước đó undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự hủy BCL-XL nhưng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và cộng sự, 2007)

Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase Survivin hoặc XIAP

và cộng sự, 2006; Altieri, 2008) Một nghiên cứu trước đó của các tác giả thấy rằng

cả survivin và XIAP đều được giảm đi bởi sự có mặt của undecylprodigiosin trong

tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007)

Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thư, prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thư bằng cách gây ra quá trình ngừng chu kỳ tế bào ở nồng độ không gây độc cho tế bào Để làm điều này, undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997) Tương tự như vậy, prodigiosin gây ra ngừng tăng trưởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách giảm phosphoryl hóa Rb thông qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2

và cyclin A-CDK2, cũng như bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003) Một nghiên cứu gần đây của SotoCerrato và cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào cách prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1

Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu dẫn đế sự tử vong do bệnh ung thư và làm tăng nhu cầu về thuốc chống di căn Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã được chứng minh trong một mô hình khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự, 2005)

Cơ chế hoạt động chống di căn của prodigiosin có thể là do tác dụng ức chế của nó trên các tế bào di căn và xâm nhập, có thể thông qua quá trình down-regulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và cộng sự, 2005)

Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng

tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận, buồng trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu Ức chế tăng sinh tế

bào cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dòng

tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

Ngoài ra, prodigiosin cũng được tìm thấy gây độc tế bào ung thư phổi và các

tế bào biểu mô kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng thuốc (Llagostera và cộng sự, 2005)

1.2.3.3 Hoạt tính ức chế miễn dịch

Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mô tả bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và

metacycloprodigiosin trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự

ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế bào lympho B (Han và cộng sự, 2001) Sau đó, hoạt động ức chế miễn dịch đã được chứng minh cho các chất tương tự prodigiosin khác như: undecylprodigiosin, cPrG,

MAMPDM, nonylprodigiosin,…

Bảng 1.3 Các sản phẩm prodigiosin thương mại hóa (Santa Cruz Biotechnology,

Merck Millipore, Biovision incorporated)

STT GIÁ THÀNH

SẢN PHẨM

ĐỘ TINH SẠCH

Hoạt động như một mTORC1 và mRTOC2 ức chế chất phát triển phức tạp Chỉ sử dụng cho nghiên cứu, không sử dụng cho người

Độ hòa tan: Hòa tan trong ethanol, methanol, DMF hoặc DMSO.Tan trong nước hạn chế Bảo quản: ở nhiệt độ -20°C Điểm nóng chảy: 151-152ºC

Hoạt động như một kháng sinh Chỉ sử dụng cho nghiên cứu, không

sử dụng cho điều trị ở người

Nguồn: Serratia marcescens

Xuất hiện: rắn, màu đỏ đậm Lưu trữ dài hạn: -20°C

Độ hòa tan: Hòa tan trong ethanol, methanol, DMF hoặc DMSO Tan trong nước hạn chế

Đóng gói khí trơ

Một ứng dụng hợp chất tế bào thẩm thấu có hiển thị ức chế miễn dịch và chống khối u đặc tính không phân biệt tình trạng p53 và kháng đa thuốc

Một trong những vi sinh vật tổng hợp prodigiosin và analog được nghiên cứu

nhiều nhất là Serratia marcescens

1.3 Tổng quan về Serratia marcescens

1.3.1 Phân loại Serratia marcescens

Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan

với nhau về hình thái và trình tự DNA Trong đó, loài điển hình của chi

Serratia là Serratia marcescens

Theo Bizio (1823), Serratia marcescens được phân loại như sau:

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gramma proteobacteria

Bộ: Enterobacteriales

Chi: Serratia

Loài: Serratia marcescens

1.3.2 Đặc điểm của Serratia marcescens

1.2.2.1 Đặc điểm sinh lý

Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi Serratia marcescens có hình que, đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 –

và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012)

Hình 1.4 Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011)

Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar được mô tả

là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính

là sắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc Các sắc tố của Serratia marcescens

thường bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012)

Hình 1.5 Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar ở

Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trường thạch, tạo

thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8%), các cụm tế bào này có chiều dài từ 530 μl

Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học

1.3.2.2 Đặc điểm sinh hóa

Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trường có oxy hoặc trong trường hợp không có oxy Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men

để lấy năng lượng và nhờ có các enzyme như superoxide dismutase, calatase, peroxidase,… bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trường oxy hóa

Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004) Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào như nuclease,

protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997) Một số đặc điểm sinh hóa của

Bảng 1.4 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010)

acid, không sinh khí và

1.3.2.3 Đặc điểm phân bố

Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nước, trong đất, trong thực

vật, côn trùng, cũng như trong ống tiêu hóa của người và động vật có xương sống

Trong nước và đất: đã có 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông

và Serratia marcescens chiếm 75% Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể đóng

một vai trò quan trọng trong chu trình sinh địa hóa của kim loại, thông qua việc khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng như hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964)

Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn

trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ưu thế Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối

với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006)

Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm,

nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001)

Gần đây, người ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006) Và trong báo

cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữ

Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae

1.3.4 Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens

1.3.4.1 Sắc tố

Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin được tổng hợp từ vi

khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), được biết đến như là một yếu tố

đặc biệt, nhưng chỉ xuất hiện trong một số chủng Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008)

Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin được sản xuất bởi biogroup

A1 và A2/6, nó không được sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT (Grimont, 1977) Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thường gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont,

1977; Williams và Qadri, 1980) Một số gene mã hóa sinh tổng hợp prodigiosin đã

được biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự, 1984) Các dòng

được tạo thành này có khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc tổng hợp giai đoạn MAP ở bên ngoài (Francine và Patrick, 2006) Prodigiosin được biết đến là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào

T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể người, có thể chúng sẽ không

tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997)

Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic semialdehyde acid, được sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự, 1988) Enzyme

này được cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a, đã bị mất khả năng phát triển

trên các hợp chất thơm, để có thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006)

sự (1961)

Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease,

chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,

Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng như kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước,… (Joshi và cộng sự, 1989)

Serratia marcescens có khả năng tiết ra các loại enzyme: Protease thủy phân casein Đây là đặc điểm phân biệt Serratia marcescens từ 438 chủng vi khuẩn đường ruột và tập hợp Pseudomonadaceae Tương tự như vậy, một protease khác là gelatinase

phân hủy gelatin, một loại protein không đầy đủ mà thiếu tryptopan

1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S marcescens

Cảm biến định mức (quorum sensing) là một quá trình truyền tín hiệu gian bào qua đó vi khuẩn nhận diện mật độ tế bào và điều chỉnh sự biểu hiện gen một cách tương ứng Tế bào vi khuẩn sản sinh ra những phân tử tín hiệu để tập hợp lại xung quanh chúng như việc gia tăng quần thể Khi sự tập trung của tín hiệu vượt quá ngưỡng của nó, thì việc đánh dấu hành trình được bắt đầu và phản ứng sinh lý được sắp đặt sẽ được thực hiện thông qua quần thể này Quorum sensing sẽ điều chỉnh nhiều quá trình

xử lý quan trọng, trong các loài vi khuẩn khác nhau, ví dụ như tính độc hại, sự sản sinh

trao đổi thứ cấp, cộng sinh, sự hình thành bào tử và màng sinh học ( Whitehead et al., 2001) Những hệ thống quorum sensing được nghiên cứu rộng rãi nhất trong khuẩn gram âm là những hệ thống sử dụng phân tử tín hiệu aHSL, trong đó đồng đẳng LuxI tổng hợp nhiều tín hiệu aHSL và những protein điều hòa phiên mã loại LuxR tập hợp tín hiệu cùng loại của chúng ở mật độ tế bào dày đặc và thay đổi sự biểu hiện gen (Labbate et al., 2004; Riedel et al., 2001).

1.4 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin

1.4.1 Cơ chế tổng hợp prodigiosin

Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens, ATCC 274 (Sma 274)

đã được báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001)

Prodigiosin được hình thành qua hai giai đoạn: 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, được gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene Có rất ít thông tin

về con đường sinh tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC, ngoại trừ việc mô tả về phân tử proline kết hợp nguyên vẹn thành một trong những nhóm pyrrole của MBC Quá trình tổng hợp sắc tố này cần có không khí và phân tử oxy (Williams và Qadri, 1980)

Hình 1.6 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia

ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm

màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001) Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để thực hiện thử nghiệm trong các

chất chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể hữu ích đối với việc nghiên cứu

một hệ thống mô hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi khuẩn Tách các phân tử tái tổ hợp mã hóa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin Việc tách trình tự của DNA mã hóa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống nhân

bản vector ở Escherichia coli cosmid đã đƣợc báo cáo (Dauenhauer và cộng sự,

1984)

Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm),

mặc dù nó đã không đƣợc biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn khác thuộc

Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và cộng sự, 2000) Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố,

bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003) Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc

vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp carotovora, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã được thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson

gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và14 protein thể hiện kích thước

và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno và cộng sự, 2001)

1.4.2 Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng sự, 2004) Bản chất màu đỏ tươi của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn (Chidambaram và Perumalsamy, 2009) Nhiều yếu tố, chẳng hạn như: nhiệt độ, pH,

độ oxy hòa tan, ánh sáng, phosphate vô cơ và thành phần môi trường ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự, 1994; Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005)

Quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nhạy cảm với

nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004) Hơn nữa, môi trường thông thường được sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi các

chủng Serratia marcescens là môi trường phức tạp và rất giàu dinh dưỡng

(Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004) Một số chất dinh dưỡng như thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng đối với sản xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự, 1977), adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có tác dụng

ức chế sản lượng prodigiosin

Hình 1.7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi

Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên

các môi trường khác nhau như: môi trường hạt mè, nutrient broth và peptone glycerol broth, Các môi trường cũng được so sánh tốc độ tăng trưởng và khả năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau Các thí nghiệm này cũng giúp quan sát vai trò của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều prodigiosin hơn

khi trên các môi trường như nutrient broth, peptone glycerol broth có hoặc không

có bổ sung đường cũng không thể làm được điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các

loại đường khác do sự giảm pH trong canh trường nuôi cấy Khanafari và cộng sự, 2006) Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon trong quá trình sản xuất sắc tố Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là môi trường này không

có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose làm tăng cường việc sản xuất sắc tố, trong trường hợp sử dụng môi trường sesame broth thì nguồn carbon ở dạng các acid béo Maltose và glucose được thêm vào nutrient broth làm tăng gấp đôi năng suất so với chỉ sử dụng môi trường nutrient broth hoặc peptone glycerol broth Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố được tăng cường trong môi trường peptone glycerol

glycerol như là một nguồn carbon Rõ ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ tăng trưởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

Ngoài ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silica gel vào môi trường

lỏng của Serratia marcescens cũng dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất

prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001) Hơn nữa, prodigiosin thường nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn như SDS và môi trường nuôi cấy cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Feng và cộng sự, 1982; Wei và Chen, 2005)

Bảng 1.5 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các

môi trường và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009)