Đánh giá sự hiện diện của một số chỉ tiêu vi sinh vật trên thịt bò tại hệ thống satrafoods

Nguồn thịt nếu không được quan tâm bảo quản đúng cách thì chất lượng thịt bị giảm sút từ đó ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng có trong thịt và cũng có thể là nguyên nhân gây ra ngộ độc th

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là đồ án của tôi trong thời gian qua Những kết quả và các

số liệu trong đồ án được thực hiện tại tại Trung Tâm Thí Nghiệm Khoa Công nghệ sinh h c - Thực ph m - Môi trường, trường Đại H c Công Nghệ TP.HCM, không sao chép bất kỳ nguồn nào khác Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường

về sự cam đoan này

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016

Người thực hiện đồ án

Trần Thị Thanh Thảo

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành đồ án này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy ThS Huỳnh Văn Thành đã dùng hết tri thức và tâm huyết của mình truyền đạt lại vốn kiến thức quý báu cho em, Thầy luôn quan sát, nhắc nhở, tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp

Em chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong Khoa Công nghệ sinh h c - Thực

ph m - Môi trường, Trường Đại H c Công Nghệ TP.HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm em h c tập Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình h c không chỉ là nền tảng cho quá trình thực hiện đồ án mà còn là hành trang

để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin

Cuối cùng em kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong

sự nghiệp cao quý

ii

MỤC LỤC Trang

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

1.4 Phạm vi nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu về thịt bò 3

2.1.1 Cấu trúc mô cơ 4

2.1.2 Cấu trúc của mô mỡ 5

2.1.3 Cấu trúc mô liên kết 5

2.1.4 Tính chất vật lý - hóa lý cơ bản của thịt bò 6

2.2 Quy trình giết mổ gia súc 9

2.2.1 Quy trình giết mổ 9

2.2.2 Các giai đoạn chính của quy trình 9

2.3 Các tác nhân gây bệnh trên thịt bò 12

2.3.1 Tác nhân vật lý 12

2.3.2 Các tác nhân hóa h c 12

2.3.3 Các tác nhân sinh h c 12

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Địa điểm thực hiện 18

3.1.2 Thời gian 18

3.2 Vật liệu 18

3.2.1 Mẫu 18

3.2.2 Hoá chất và môi trường 18

3.2.3 Dụng cụ 18

3.2.4 Thiết bị 19

iii

3.3 Bố trí thí nghiệm 20

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quan 21

3.4 Phương pháp thí nghiệm 20

3.4.1 Phương pháp thu mẫu 20

3.4.2 Phương pháp bảo quản mẫu 21

3.4.3 Phương pháp đánh giá cảm quan 22

3.4.4 Phương pháp xác định các chỉ tiêu vi sinh vật 22

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 36

4.1 Kết quả đánh giá cảm quan 36

4.2 Kết quả định lượng TPC 51

4.3 Kết quả định lượng Coliforms 44

4.4 Kết quả định tính E.coli 45

4.5.Kết quả định lượng Staphylococcus aureus 49

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

TrangBảng 2.1 Thành phần hóa h c của một loại thịt bò 8 Bảng 3.1 Mã hóa mẫu tại 10 Satrafoods 21 Bảng 3.2 Yêu cầu cảm quan của thịt tươi

(TCVN 7046-2009 Thịt tươi – Yêu cầu kỹ thuật) 22 Bảng 4.1 Kết quả đánh giá cảm quan mẫu tại 10 Satrafoods 37 Bảng 4.2 Chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí trong thịt bò

(Theo TCVN 7046-2009) 50

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Bò Brahman … 3

Hình 2.2 Bò Sindhi đỏ 4

Hình 2.3 Sơ đồ sản xuất thịt bò 9

Hình 2.4 Phân loại thịt bò 11

Hình 2.5 E.coli 12

Hình 2.6 Staphylococcus aureus 15

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 20

Hình 3.2 Sơ đồ định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 24

Hình 3.3 Sơ đồ định lượng Coliforms 27

Hình 3.4 Quy trình định tính E.coli 31

Hình 3.5 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus 34

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí so với TCVN (Mẫu 1 đến mẫu 5) 43

Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí so với TCVN (Mẫu 6 đến mẫu 10) 44

Hình 4.3 Mẫu Coliforms âm tính 45

Hình 4.4 Mẫu E.coli trên môi trường EMB 47

Hình 4.5.Thí nghiệm sinh hóa 48

Hình 4.6 Mẫu phân tích Staphylococcus aureus âm tính 50

Trong năm 2015, toàn quốc ghi nhận 171 vụ ngộ độc thực ph m với 4.965 người mắc và 23 trường hợp tử vong, so với năm 2014, số vụ giảm 22 vụ (11,4%),

số mắc giảm 237 người (4,6%) và số tử vong giảm 19 người (45,2%) (http://vesinhantoanthucpham.com.vn) Thịt bò là nguồn chứa nhiều chất dinh dưỡng Thịt bò mùi vị thơm ngon và có giá trị dinh dưỡng cao Tuỳ vào cách chế biến thịt bò thì sẽ mang lại nguồn dinh dưỡng và năng lượng khác nhau, nhưng tốt nhất nên ăn thịt bò bít tết Bởi lẽ, với cách chế biến này sẽ giúp cho các khoáng chất trong đó đạt được hiệu quả tối đa.Vì vậy vấn đề vệ sinh an toàn thực ph m phải được chú tr ng Nguồn thịt nếu không được quan tâm bảo quản đúng cách thì chất lượng thịt bị giảm sút từ đó ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng có trong thịt và cũng

có thể là nguyên nhân gây ra ngộ độc thực ph m

Hiện nay thì các hệ thống cửa hàng thực ph m tiện lợi, siêu thị mini m c lên như nấm.Và đã được các chị em nội trợ tin dùng vì sự thuận tiện, đơn giản, đảm bảo chất lượng và bình ổn giá cả Satrafoods là chuỗi cửa hàng thực ph m tiện lợi, có hệ thống trên 80 cửa hàng ở TP.HCM hoạt động trong ngành bán lẻ, và đang có dự định mở rộng quy mô thị trường ra miền Trung và miền Bắc Với triết lý kinh doanh

sự hài lòng, tin cậy của khách hàng là thước đo hiệu quả cho m i hoạt động Satrafoods luôn nêu cao sứ mệnh bình ổn thị trường, hàng hóa đa dạng về sản

ph m, phong phú về chủng loại

1.2 Mục tiêu của đề tài

Đánh giá sự hiện diện của một số vi sinh vật trên thịt bò tại hệ thống Satrafoods trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh

1.3 Nội dung đề tài

Phân tích và đánh giá dựa trên một số chỉ tiêu vi sinh

- Tiến hành lấy mẫu thịt bò tại hệ thống Satrafoods trên địa bàn TPHCM

- Thông qua sự hiện diện của các vi sinh vật trong các mẫu thịt để đánh giá chất lƣợng

3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệuvề nguyên liệu thịt bò

Bò thịt là một loại bò nhà được chăn nuôi chủ yếu phục vụ cho mục đích lấy thịt khác với bò sữa chuyên phục vụ cho mục đích lấy sữa hoặc các giống bò khác phục vụ cho cày cấy, làm ruộng, vận chuyển Đặc biệt nổi bật của giống bò chuyên lấy thịt là to con, con cái từ 600 - 800 kg, con đực từ 900 - 1300 kg Bò thịt được chăn nuôi để phục vụ cho nhu cầu tiêu thụ thịt ngày càng tăng cao Theo số liệu thống kê, bình quân nhu cầu tiêu thụ là 9kg/ người/ năm, các nước phát triển tỷ lệ thịt bò chiếm 25 - 30% tổng lượng thịt tiêu thụ bình quân đầu người, riêng ở VN là 1,9 kg (năm 2006)

Hình 2.1.Bò Brahman

4

Hình 2.2.Bò Sindhi đỏ

Thịt có cấu trúc rất phức tạp nhưng về cơ bản thành phần thịt bò có thể bao gồm các mô: mô cơ, mô mỡ, mô liên kết, máu, mô thần kinh Trong đó mô cơ, mô

mỡ và mô liên kết theo thứ tự là những thành phần có giá trị dinh dưỡng cao nhất và

được nghiên cứu nhiều nhất

2.1.1 Cấu trúc mô cơ

Mô cơ là một bộ phận quan tr ng của thịt bò nó chiếm khoảng 57 - 62% khối lượng của thịt và chiếm khoảng 35% tr ng lượng của con vật Mô cơ của các loài động vật không chỉ khác nhau về giống loài, giới tính, độ tuổi mà còn phụ thuộc nhiều vào chế độ chăm sóc và trạng thái của động vật sau trước khi giết mổ Mô cơ thường có màu đỏ thẫm hoặc đỏ nhạt, mô cơ của các động vật đực, trưởng thành và lao động nhiều có màu thẫm hơn so với những loài động vật cái, còn non hoặc chỉ

2.1.2 Cấu trúc của mô mỡ

Mô mỡ được tạo thành từ các mô liên kết hình lưới xốp mềm hóa và các tế bào chất béo Trong thịt bò hàm lượng mô mỡ dao động trong khoảng khá rộng từ 2

- 40% và tỉ lệ nghịch với hàm lượng nước trong cấu trúc cơ thịt Lượng chất béo với một tỉ lệ nhất định sẽ làm tăng giá trị cảm quan và giá trị dinh dưỡng của thịt

Lượng mô mỡ, vị trí tích lũy, thành phần, màu sắc, mùi vị và các tính chất khác của mô mỡ phụ thuộc nhiều vào giống loài, tuổi, giới tính, mức độ béo của vật nuôi và điều kiện nuôi dưỡng Thành phần hóa h c của mô mỡ chủ yếu là lipid và các dẫn xuất (chiếm 70 - 90%) Ngoài ra còn có chứa protein (chiếm 0.5 - 7.2%), nước (chiếm 2 - 21%), sắc tố, enzyme và các vitamin tan trong dầu

2.1.3 Cấu trúc mô liên kết

Trong cơ thể, mô liên kết được phân bố rộng rãi, có tác dụng liên kết các bộ phận lại với nhau, tham gia vào quá trình trao đổi chất và thực hiện nhiệm vụ bảo vệ

cơ thể Mô liên kết được cấu thành từ ba phần là chất nền, cấu trúc hình sợi và dịch mô.Mô liên kết được hình thành trên cơ sở từ các sợi colagen và sợi eslatin, trong

đó sợi colagen là cấu trúc quan tr ng nhất

Hàm lượng mô liên kết phụ thuộc vào giống loài, mức độ béo, tuổi, giới tính,

bộ phận cơ quan nhưng thường không vượt quá 12% khối lượng của súc thịt Thành phần hóa h c trung bình của mô liên kết được thể hiện như

Nước: 62 - 74%

ta có những cơ sở bổ ích trong việc tính toán các quá trình bảo quản như nhiệt lạnh Một số tính chất vật lý quan tr ng được xét

- Khối lượng riêng

Khối lượng riêng của thịt bò thay đổi theo rất nhiều yếu tố như giống loài, giới tính, độ tuổi… Nhưng quan tr ng nhất là hàm lượng chất béo trong thịt và vị trí của súc thịt Khối lượng riêng trung bình ở 150C của thịt bò khử mỡ là 1.02 - 1.07kg/l, của chất béo là 0.95 - 0.97kg/l và của xương là 1.13 - 1.3kg/l

- pH

pH là một trong những chỉ tiêu quan tr ng trong việc đánh giá chất lượng của thịt tươi pH ở từng loài vật nuôi thay đổi theo từng giống loài, độ tuổi, giới tính, chế độ dinh dưỡng, vị trí từng súc thịt của vật nuôi pH trung bình của thịt bò tươi

có tính acid yếu đạt khoảng 6.5 - 6.9

Các yếu tố ảnh hưởng đến pH của thịt cũng như sự thay đổi pH của thịt trong suốt quá trình bảo quản sẽ được nghiên cứu nhiều hơn trong các phần sau này

- Một số tính chất cảm quan của thịt bò

 Màu sắc thịt bò

Màu sắc của thịt tươi do cấu trúc, thành phần của cơ thịt và hàm lượng chất béo trong đó quyết định Màu sắc của thịt không chỉ do giống loài, tuổi tác, giới tính quy định mà còn phụ thuộc nhiều vào cách thức chăn nuôi và loại thức ăn mà bò sử dụng Màu của mỡ bò gây ra bởi sự có mặt của các sắc tố caroten có nhiều trong mỡ của bò, do vậy nó thường có màu vàng đặc trưng Màu sắc của tổ chức cơ thịt do

7

lượng hemoglobin và myoglobin của tổ chức cơ thịt quyết định Tuy nhiên Hb chủ yếu có trong máu, và sau khi quá trình giết mổ ta đã xã máu do vậy, lượng Hb trong thịt bò là không đáng kể, do vậy màu sắc của cơ thịt chủ yếu do Mb quyết định, ba dạng là Mb, oxyMb, và MetMb Màu sắc thịt của bò trưởng thành thường đậm hơn

so với bò còn non Màu sắc của thịt còn chịu ảnh hưởng của sắc tố thực vật trong thức ăn của chúng, bò ăn loài thực vật có màu nào thì thịt thường có màu đó Thịt

bò đực có màu hồng tươi trong khi thịt bò cái lại có màu hồng sẫm Bò làm việc, vận động càng nhiều thì thịt càng có màu sẫm hơn

 Mùi vị của thịt bò

Mùi vị của thịt bò phụ thuộc vào giống vật nuôi, mức độ chất béo, giới tính, lứa tuổi và tình hình chăn nuôi của các loài động vật Mùi vị của thịt bò còn phụ thuộc vào chuồng trại chăn nuôi và cả loại thức ăn mà bò đã ăn Chuồng trại có mùi hoặc thức ăn của chúng có mùi đặc trưng thì thịt của chúng cũng có mùi tương tự như vậy Đặc biệt khi bò sử dụng kháng sinh nếu không có đủ thời gian cách ly thì thịt của chúng vẫn còn tồn tại kháng sinh và có mùi này Thịt của bò đực, trưởng thành thường có mùi vị nồng hơn, đặc trưng hơn so với bò cái hoặc chưa trưởng thành Mùi vị chủ yếu do những acid béo, chất béo dễ bay hơi gây ra nhưng nếu để lâu thịt có mùi đặc trưng ngoài không khí hoặc nơi thoáng gió thì mùi này có thể giảm hoặc bị mất đi

 Độ mềm của thịt

Độ mềm của thịt phụ thuộc vào các nhân tố của động vật khi còn sống và cả khi chết Khi còn sống độ mềm của thịt phụ thuộc vào giống loài, giới tính, lứa tuổi, cách thức liên kết của mô cơ Khi chết độ mềm của thịt phụ thuộc vào cách thức giết mổ, gây ngạt, cách thức mổ thịt Người ta cũng thấy rằng, độ mềm của thịt cũng

là một yếu tố có thể di truyền, tính chất này được di truyền qua con đực và khả năng

di truyền ở bò đạt khoảng 65 - 70% Độ mềm của thịt cũng phụ thuộc vào giá trị pH của thịt, pH càng gần điểm đẳng điện thì cấu trúc của cơ thịt càng bền chặt và độ mềm của nó càng giảm Ngoài ra các chất phụ gia cũng có ảnh hưởng khác nhau đến độ mềm của thịt mà ta sẽ được khảo sát trong những phần sau Thịt bò là một

2.1.4.2 Tính chất hóa học của thịt bò

Bảng 2.1.Thành phần hóa h c của một loại thịt bò

Trong thành phần hóa h c của thịt bò ta chú ý đến chất ngấm ra Đây là những chất rất dễ rút chiết hay trích ly ra khỏi mô cơ, chiếm khoảng 1.5 - 2.3% mô

cơ, có ý nghĩa quan tr ng tạo nên hương vị, mùi thơm đặc trưng của thịt bò Thành

hệ thần kinh của con vật làm cho con vật bị ngất xỉu, không kêu, không giãy giụa trong thời gian ngắn đủ tiến hành quá trình ch c tiết Dòng điện của thiết bị gây choáng là dòng điện xoay chiều không có trung tính trên cả hai đầu dây ra, do đó rất

an toàn cho người sử dụng, sẽ không có hiện tượng bị điện giật nếu chạm một dây trong hai dây của thiết bị

Bất kỳ phương pháp gây choáng nào cũng là yếu tố gây stress nghiêm tr ng cho con vật Do vậy khi gây choáng cần lưu ý không để con vật giãy nhiều, thời gian gây choáng nhanh chính xác và hiệu quả, đảm bảo con vật bị hôn mê tuyệt đối

2.2.2.2 Cắt tiết

Mục đích của việc lấy tiết là làm chết con vật và duy trì chất lượng thịt sau khi giết mổ Việc lấy tiết phải được thực hiện ngay sau khi làm choáng, thời gian từ lúc làm choáng đến khi lấy tiết không được quá một phút Cách làm dùng dao chuyên dụng cắt đứt mạch máu chính, máu từ cơ thể con vật ra dụng cụ chứa Lúc đầu ta sẽ bỏ đi một ít, sau đó sẽ lấy máu đến một mức nào đó rồi ngưng vì máu sau cùng thường là máu đen Thời gian lấy tiết khoảng 4 - 6 phút

2.2.2.3 Lấy nội tạng

Việc lấy nội tạng cần phải tiến hành c n thận, vết cắt phải bằng nhẵn, giữ nguyên cấu trúc của nội tạng Thời gian lấy nội tạng không nên kéo dài do thịt có thể bị ảnh hưởng mùi từ các chất bay hơi có mùi hôi trong nội tạng Cần tránh làm

vỡ nội tạng vì sẽ làm nhiễm vi sinh vào thịt Sau khi lấy nội tạng, thịt cần được rửa qua một lần nước để làm sạch máu trong khoang ngực và bụng Dàn treo và móc

Có thể xẻ bằng phương pháp thủ công hay máy

- Xẻ bằng phương pháp thủ công: người công nhân dùng dao dài, lớn xẻ

d c xương sống Xẻ thịt phải đảm bảo mỹ quan của vết xẻ, mảnh thịt vì vậy yêu cầu công nhân phải có tay nghề cao

- Xẻ bằng máy: máy xẻ thịt có lưỡi dao to đặt thẳng đứng theo chiều treo thịt Khi xẻ thịt, người công nhân sẽ cầm cán dao đưa vào để xẻ thịt Xẻ bằng máy thì vết xẻ thịt ít bị sai phạm

Hình 2.4 Phân loại thịt bò

 Các chất ô nhiễm trong công nghiệp và môi trường như: dioxin, các chất

phóng xạ, các kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, asen, cadimi…)

 Các chất hoá h c sử dụng trong nông nghiệp: thuốc bảo vệ thực vật, động

vật, thuốc thú y, chất tăng trưởng, phân bón, thuốc trừ giun sán và chất hun khói

 Các hóa chất sử dụng trong sát trùng tiêu độc chuồng trại (Formaldehyde,

NaOH, Chlorine, Phenol…)

 Các chất kháng sinh sử dụng để điều trị bệnh trong chăn nuôi

 Các chất kích thích tăng trưởng cho vật nuôi

2.3.3 Các tác nhân sinh học

2.3.3.1 Vi khuẩn E.coli

a Đặc điểm chung

Hình 2.5 E.coli

E.coli là loài sống hội sinh trên nhiều cơ thể vật chủ như con người, động vật

và các loài vật hoang dã Nó rất phổ biến trong tự nhiên, chúng có mặt từ chất thải

13

từ phân nhiễm vào thực ph m và nguồn nước (S.Zhao et al., 2011) Năm 1885, Escherich đã quan sát được có hai loại vi sinh vật hiện diện trong phân, một trong

số chúng được đặt tên là Bacterium coli (B.coli, ngày nay vẫn thường g i là

Escherichia coli) và được đưa ra khái niệm về sự hiện diện của E.coli trong nguồn

nước ngụ ý là nguồn nước đang bị ô nhiễm (b n) (Melita Stevens, Nicholas Ashbolt

và David Cunliffe, 2005)

Escherichia coli là một dạng vi khu n rất phổ biến trong đường tiêu hóa của

gia súc Trong thịt bò chế biến xác định E.coli từ chất ô nhiễm từ phân Mức độ

E.coli trong thịt bò có thể tăng hoặc giảm theo quá trình hay hình thức chế biến,

cũng như mức độ từ phân nơi gia súc sống Trên thế giới, quá trình giết mổ gia súc

không đảm bảo cũng được xem là nguyên nhân chính gây nhiễm E.coli vào các sản

ph m gia súc (Bell, R.G, 1997)

b Đặc tính nuôi cấy

E.coli m c dễ dàng trên môi trường dinh dưỡng thông thường hoặc môi

trường ch n l c ở nhiệt độ 37oC dưới điều kiện hiếu khí (James P Nataro và James

B Kaper, 1998) Trên môi trường thạch thông thường sau 24 giờ hình thành những khu n lạc tròn, ướt không trong suốt màu tro trắng nhạt hơi lồi đường kính 2 - 3mm Nuôi lâu khu n lạc có màu nâu nhạt mở rộng ra (Lưu Hữu Mãnh, 2009) Trên

môi trường TBX, khu n lạc của vi khu n E.coli có màu xanh bóng đường kính

khoảng 1 - 2 mm Trong môi trường nước thịt phát triển tốt làm môi trường rất đục,

có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trường,

có mùi phân thối (Lưu Hữu Mãnh, 2009)

c Sức đề kháng

Vi khu n E.coli không chịu được nhiệt độ cao Nhiệt độ thấp nhất là 8 -

15oC, cao nhất trong khoảng 40 - 50oC Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khu n này là 37oC Ở 60oC vi khu n E.coli chết trong vòng 15 phút và chết ngay ở

100oC Trong môi trường đất và nước, vi khu n E.coli có thể tồn tại được vài tháng Các chất sát trùng thông thường có thể tiêu diệt được E.coli như Acide phenic,

biclorua thủy ngân, formol, hydroperoxide 1% diệt được sau 5 phút (Lưu Hữu

14

Mãnh, 2009) Độc tố Shinga toxin-producing Escheriachia coli (STEC) có thể là nguyên nhân gây ra những hội chứng đặc biệt nghiêm tr ng cho con người bao gồm bệnh tiêu chảy, chảy máu đường ruột đe d a tính mạng của con người, hội chứng urea huyết (HUS: haemolytic- uraemic syndrome) (Everlon Cid Rigobelo, Fernando Antonio de Ávila, 2012) Sự lan truyền của STEC có thể là do nhiễm độc thực

ph m, nhiễm độc nước hoặc là do giữa người với người Bò là vật chủ kí sinh của vertorotoxin-producing Escherichia coli (STEC), trong khi đó các loài như bò, nai,

ngựa, chó và các loài chim cũng là vật chủ chứa E.coli đầy rủi ro (Bell, R.G, 1997)

d Tính gây bệnh

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) là một nguyên nhân gây chảy máu đường ruột Nó đe d a đến tính mạng của con người, phần tiếp sau quan tr ng nhất hội chứng tăng urea huyết (HUS), đó là kết quả của độc tố Shiga toxin (Stx) được sinh ra từ vi khu n Nó tác động đến các cơ quan nhạy cảm, lên các tế bào như

tế bào thận, não và các tổ chức cơ quan khác (Gyles CL, 2007) Động vật được nuôi

và động vật hoang dã là nguồn bệnh của EHEC O157:H7 (Blanco 1993, De Rycke, 1997), nhưng động vật mang mầm bệnh chính là loài nhai lại khỏe mạnh, trâu, bò

sơ sinh (Madigan M.T; Martinko J.M, 2003) Thịt bị dính b n từ phân trong quá

trình giết mổ cũng là nguyên nhân truyền E.coli O157: H7 (Islam MA et al., 2008)

từ 0.1-50% Thêm vào đó các gene mang độc lực cũng được báo cáo (Abong’o BO

et al., 2009; Chapman PA et al.,1997 Cadrirci O et al., 2010)

2.3.3.2.Coliforms

a Đặc điểm chung

Coliforms bao gồm một nhóm lớn nhiều loại vi khu n hiện diện hoặc tìm

thấy trong tự nhiên Thường thì chúng hiện diện trong đất thịt trong nước và trên da,

một lượng lớn Coliforms cũng tìm thấy trong chất thải của con người và động vật

Đa số Coliforms không gây hại cho người, nhưng thỉnh thoảng cũng gây bệnh và một ít có thể là nguyên nhân gây ngộ độc nước uống Coliforms được mô tả là tất cả

các vi sinh vật hiếu khí và kị khí không bắt buộc, Gram âm, không hình thành nha bào, vi khu n hình que, lên men đường lactose sinh khí và hình thành acid trong

15

vòng 48 giờ ở 35oC hoặc tất cả các vi sinh vật hiếu khí và kị khí không bắt buộc, Gram âm, không hình thành nha bào, vi khu n có hình que, khu n lạc phát triển có màu đỏ bóng loáng ánh kim trong 24 giờ ở 35oC trên môi trường Endo có chứa lactose

Coliforms thường được quan tâm tìm hiểu và xem chúng như “vi sinh vật chỉ

thị” bởi vì dựa vào sự hiện diện của chúng để biết được nguyên nhân gây bệnh Hơn

thế nữa sự hiện diện của Coliforms trong nước sẽ không đảm bảo sự an toàn cho

nguồn nước, chất thải động vật, hệ thống tự hoại

b Đặc tính nuôi cấy

Coliforms lên men đường lactose sinh acide, sinh hơi ở 24oC trong 24 - 48 giờ trong môi trường canh thang BGBL và lauryl sulfate

2.3.3.3.Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Hình 2.6.Vi khu n Staphylococcus aureus

a Đặc điểm chung

Năm 1880, Staphylococcus được phát hiện lần đầu bởi Clifton (Ogston A, 1984) Staphylococcus không có khả năng di động, không hình thành nha bào,

Gram dương, cầu khu n hiếu khí, dưới kính hiển vi chúng có dạng lầy nhầy

Staphylococcus aureus có dạng hình cầu, đường kính khoảng 1µm, chúng thường tụ

h p lại thành từng cụm do thuộc loài Staphylococcus Staphylococcus aureus thuộc

loại Gram dương, cầu khu n với đường kính 1 - 1,3µm Khi quan sát dưới kính hiển

vi Staphylococcus aureus tập trung lại từng cụm, giống như chùm nho

16

Staphylococcus aureus sản sinh ra độc tố enterotoxin rất bền với nhiệt độ, độc tố tồn

tại với nhiệt độ 100oC từ 30 - 700 phút (The Food Safety File: Staphylococcus

aureus, 2008)

b Đặt tính nuôi cấy

Loài được đặt tên là aureus, thường m c cho khu n lạc màu vàng khi m c trên môi trường chất rắn, thỉnh thoảng cho phản ứng coagulase âm tính (CoNs: coagulase negative), nhiều khu n lạc có màu trắng, có thể cho ánh sáng xuyên qua (Howard và Kloos, 1987)

c Sức đề kháng

Staphylococcus aureus là một con đường truyền bệnh có xu hướng phát triển

trên nhiều loại môi trường ức chế bằng kháng sinh (Lowy, 1988) Staphylococcus

aureus sinh trưởng ở pH 4 - 10, tối thiểu 6 - 7 Staphylococcus aureus khi bị đóng

băng, chúng sẽ bị cản trở phát triển và vẫn có sức sống tốt trong các loại thực ph m

ở -20o

C Sức sống của Staphylococcus aureus chỉ giảm -10oC đến 0 oC

Staphylococcus aureus chỉ bị giết hoàn toàn khi hấp tiệt trùng Pasteur Staphylococcus aureus sinh trưởng được trên cả hai môi trường kị khí và hiếu khí Staphylococcus aureus phát triển trong dãy nước hoạt hóa 0.83 - 0.99 (FDA, 2012)

Vi khu n Staphylococcus aureus ưa nhiệt độ trung bình (nhiệt độ ôn hòa)

Độc tố Staphylococcus aureus sản sinh độc tố (SE: Staphylococcus

enterotoxin) và gây nên đa số các vụ ngộ độc thực ph m (Mentvile và Matthews, 2008; FDA, 2012) Hầu hết các nguyên nhân ngộ độc là do thực ph m chứa độc tố

SE (Agudin et al., 2010) SE sinh ra trong pha tăng trưởng của Staphylococcus

aureus và nó phụ thuộc vào dạng cầu khu n SE của Staphylococcus aureus sẽ bị

ngăn chặn và phá hủy dễ dàng bởi nhiệt và pH thấp

17

Vào những năm 1960, đã có nhiều chứng minh về sử dụng 0,4µg/kg thể

tr ng độc chất enterotoxin B đã gây bệnh (Raj và Bergdoll, 1969) Tuy nhiên, trong những năm gần đây đã có những báo cáo khi sử dụng ít hơn 1,0µg độc chất SE cũng

đủ làm ngộ độc (FDA, 2012) Thật vậy, đã có nhiều sự chỉ dẫn khi tiêu thụ ít hơn 200mg enterotoxin A cũng đủ là nguyên nhân gây ngộ độc cho những cá nhân mẫn cảm (Evenson et al 1988, Asao et al 2003)

- Triệu chứng ngộ độc

Khi gây bệnh chúng không kèm theo một triệu chứng nào trong đường tiêu hóa hoặc trong túi mật và kèm theo sự chảy máu từng cơn theo phân ra ngoài (CFSPH, 2005) Thời gian nung bệnh từ 3 - 4 ngày Thể quá cấp con vật sốt cao, bỏ

ăn, tiêu chảy có máu do độc tố làm chảy máu đường ruột và con vật sẽ chết sau vài ngày Thể cấp tính và thể mãn tính, bệnh do vi khu n gây ra được bắt đầu bằng những triệu chứng sốt con vật ủ rũ, bỏ ăn, các đợt sốt kéo dài khoảng một tuần Tiếp theo là thời kì không sốt vài ngày, rồi lại lại sốt trở lại, con vật tiêu chảy phân có mùi rất tanh, con vật yếu dần (Trát Minh Thụy, 2011)

18

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian

3.1.1 Địa điểm thực hiện

Địa điểm thu mẫu: các hệ thống Satrafoods Thành phố Hồ Chí Minh

Địa điểm phân tích mẫu: Trung Tâm Thí Nghiệm Khoa Công nghệ sinh h c - Thực ph m - Môi trường, trường Đại h c Công Nghệ TP.HCM (HUTECH)

3.2.2 Hoá chất và môi trường

- Môi trường PCA ( Plate Count Agar) ( Đức)

- Môi trường pha loãng mẫu SPW (Saline Peptone Water) (Đức)

- Môi trường BPA (Baird Parker Agar) ( Đức)

- Môi trường TSA ( Tryptone Soya Agar ) ( Đức)

- Môi trường Egg Yolk Tellurite Emusion ( Đức)

- Môi trường EC Broth ( Escherichia Coli Broth) ( Đức)

- Môi trường MR-VP Broth( Đức)

- Môi trường Simmons Citrate Agar ( Đức)

- Canh TryptoneThuốc thử Kovac’s

- Thuốc thử Methylred

- Cồn 70 % và cồn 96 %

- Nước cất

3.2.3 Dụng cụ

19

- Ống nghiệm có nắp

- Đĩa petri vô trùng

- Micro Pipette , Pipette

Đánh giá cảm quan Phân tích vi sinh

Màu sắc Mùi vị Trạng thái TPC E.Coli Coliforms S.Aureus

Đánh giá kết quả

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3.4 Phương pháp thí nghiệm

3.4.1 Phương pháp thu mẫu

Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải vô trùng Các mẫu thịt bò lấy ở các quầy khác nhau thì cho vào từng bao nilon sạch khác nhau, sau khi lấy phải đảm bảo không nhiễm lẫn nhau

21

Bảng 3.1.Mã hóa mẫu tại 10 Satrafoods

1 Satrafoods Nơ Trang Long 1 167A Nơ Trang Long phường

3.4.2 Phương pháp bảo quản mẫu

Sau khi mang về Trung tâm thí nghiệm nếu không phân tích ngay thì mẫu được bảo quản ở 0 - 4oC và thời gian bảo quản không quá 36 giờ

22

3.4.3 Phương pháp đánh giá cảm quan

Sản ph m động vật phải được làm sạch sẽ, không dính lông, phân và nhiễm các chất b n khác, phải có ph m chất tốt, không có những biểu hiện khác thường và những dấu hiệu bệnh tích Các chỉ tiêu cảm quan đối với thịt tươi được quy định tại bảng 3.2

Bảng 3.2 Yêu cầu cảm quan của thịt tươi(TCVN 7046-2009 Thịt tươi – Yêu cầu kỹ

- Tuỷ bám chặt vào thành ống tuỷ (nếu có)

Màu sắc Màu đặc trưng của sản ph m, không quá sẫm màu hay tái xám

Mùi Đặc trưng của sản ph m, không có mùi lạ

3.4.4 Phương pháp xác định các chỉ tiêu vi sinh vật

3.4.4.1.Phương pháp định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí

a Nguyên tắc

Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực ph m bằng phương pháp đếm số lượng khu n lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng mẫu thành các nồng độ xác định Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy Các khu n lạc được hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như là chúng hình thành từ một tế bào đơn lẻ.Tuỳ theo các yêu cầu

cụ thể trong việc phân tích, các đĩa môi trường sau khi cấy mẫu được ủ ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau Theo yêu cầu của các tiêu chu n của nhiều quốc gia,

24

b Quy trình thực hiện

Hình 3.2 Sơ đồ định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí

c Thuyết minh quy trình

Bước 1: Đồng nhất mẫu và pha loãng

Dùng các dụng cụ như kéo, kẹp đã được khử trùng cân chính xác 10g mẫu vào trong bao PE Tất cả các điều kiện làm việc và thao tác phải tiến hành trong điều kiện

vô trùng Thêm vào lượng mẫu này 90 ml dung dịch pha loãng SPW Sau khi đồng nhất nhận được dung dịch mẫu có độ pha loãng 10-1

Dịch mẫu ngay sau khi đồng nhất được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 90 ml dung dịch pha loãng Saline Pepton Water, tránh tiếp xúc pipet với dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu trong ống nghiệm bằng máy lắc hoặc dùng pipet vô trùng khác hút đảo dịch mẫu lên xuống 5 - 10 lần Dùng pipet đó chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống thứ hai chứa 90 ml dung dịch pha loãng Tiếp tục như vậy sẽ có các dung dịch mẫu với các độ pha loãng

10-2, 10-3, 10-4,10-5

Đếm số khu n lạc xuất hiện trên đĩa

10g mẫu + 90ml SPW, đồng nhất mẫu trong 30s → độ pha loãng

10-3,10-4, 10-5

Cho vào đĩa 1ml mẫu đã pha loãng (mỗi nồng độ 2 đĩa)

Đổ 10 - 15ml môi trường PCA vào mỗi đĩa

Ủ ở nhiệt độ 370

C/48h hoặc 300C/72h

ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C/48h hoặc 300C/72h

A: số lượng vi sinh vật trong 1g mẫu

N: tất cả các khu n lạc trên các đĩa

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu cấy trong một đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng

3.4.4.2 Phương pháp định lượng Coliforms

a Nguyên tắc

Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch ch n l c Sau khi ủ ở 37oC

24 - 48 giờ, đếm số lượng khu n lạc Coliforms điển hình Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng Môi trường ch n l c cho Coliforms là môi trường chứa lactose, đây là

nguồn carbon duy nhất, đồng thời trong môi trường còn chứa muối mật là tác nhân

26

ch n l c cho vi khu n gram âm, chứa các tác nhân chỉ thị các dấu hiệu điển hình khi vi sinh vật trao đổi các thành phần trong môi trường như neutral red, hay crystal violet Khẳng định các dòng vi khu n cho hình dạng khu n lạc điển hình bằng các môi trường

canh ch n l c như Brilliant green bile lactose Số lượng Coliforms được xác định bằng

số lượng khu n lạc điển hình đếm được, hệ số xác nhận và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa

Cho vào đĩa 1ml mẫu đã pha loãng (mỗi nồng độ 2 đĩa)

Đổ khoảng 5ml môi trường TSA vào mỗi đĩa

Đếm khu n lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm và có đường kính

>0.5 mm, xung quanh khu n lạc có vùng tủa của muối mật

Lấy khu n lạc đặc trưng cấy chuyển qua ống EC

Ủ 370C trong 24 giờ

Đổ khoảng 10ml môi trường VRB vào mỗi đĩa

Để ở nhiệt độ phòng 60 – 90 phút cho đông lớp TSA

Ủ 370C trong 48 giờ

Xem kết quả ở ống EC