Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate chịu mặn xử lý nitơ trong nước thải chế biến thủy sản

Nhiều chủng VSV có khả n ng th m gi v o hu tr nh nito trong n c, chuyển hóa các hợp chất N nh mon, nitrite, nitr te để phục vụ cho quá trình trao đổi chất, tổng hợp nên các thành phần cấ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Thành Quang Hiền

MSSV: 1151110138 Lớp: 11DSH05

ỜI CAM ĐOAN

Đồ n tốt nghiệp n l ng tr nh nghi n ứu ủ ản th n t i i s h ng

n kho h ủ TS Ngu n Ho i H ng – Kho C ng nghệ sinh h – Th phẩm – M i tr ờng, Tr ờng Đại H C ng Nghệ Tp Hồ Chí Minh

Những kết quả ó đ ợ trong đồ n n ho n to n kh ng s o hép từ đồ n tốt nghiệp ủ ng ời kh i ất kỳ h nh thứ n o C số liệu trí h n trong đồ

n tốt nghiệp n l ho n to n trung th T i xin hịu tr h nhiệm ho n to n về đồ

n tốt nghiệp ủ m nh

TP HCM, ng 5 th ng 8 n m 5

Sinh vi n th hiện

THÀNH QUANG HIỀN

ỜI CẢM N

ời đầu ti n on xin gửi lời ảm n đến mẹ, mẹ đã sinh th nh, ạ ỗ,

u th ng v he hở ho on, mẹ đã lu n ở n on v nh những điều tốt nhất ho on trong h tập ũng nh trong uộ sống

Em xin đ ợ tr n tr ng ảm n qu thầ kho C ng nghệ Sinh h – Th phẩm – M i tr ờng, tr ờng Đại h C ng nghệ TP HCM đã nhiệt t nh giúp đỡ, tru ền đạt những kiến thứ nền tảng, những kinh nghiệm qu u ho em trong suốt

qu tr nh h tập v l m đồ n tốt nghiệp

Đặ iệt, em xin tỏ lòng iết n s u sắ t i TS Ngu n Ho i H ng,

ng ời thầ đ ng kính, đã tận t nh giúp đỡ, h ng n ho em về nội ung ũng nh

kỹ n ng, ph ng ph p, h thứ tiến h nh thí nghiệm để em ó thể ho n th nh

đồ n tốt nghiệp ủ m nh

Em xin h n th nh ảm n thầ Huỳnh V n Th nh v thầ Ngu n Trung Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi ho em trong suốt qu tr nh em th hiện đồ n tại phòng thí nghiệm Kho M i tr ờng v C ng nghệ sinh h , Tr ờng Đại h Kỹ thuật C ng nghệ TP Hồ Chí Minh

Em xin h n th nh ảm n qu thầ trong hội đồng phản iện đã nh thời

gi n đ v nhận xét đồ n tốt nghiệp ủ em

in ảm n nh hị, ạn v em đã động vi n v giúp đỡ em trong khoảng thời gi n em h tập ũng nh l m đồ n tốt nghiệp tại tr ờng

Em xin h n th nh ảm n

Tp Hồ Chí Minh, ng 5 th ng 8 n m 5

n v n t ện

THÀNH QUANG HIỀN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề: 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý ng ĩa đề tài 2

4.1 Ý nghĩa khoa học 2

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

5 P ương p áp ng n ứu 2

CHƯ NG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan nước thải chế biến thủy sản (CBTS) 4

1.1.1 Nguồn phát sinh và đặc tính nước thải CBTS 5

1.2 C u trìn n tơ (N) 11

1.2.1 Giới thiệu về chu trình N tự nhiên 11

1.2.2 Quá trình phản nitrate ở tế bào vi khuẩn 13

1.3 Tổng quan về một số vi khuẩn phản nitrate 20

1.3.1 Pseudomonas stutzeri 20

1.3.2 Paracoccus denitrificans 22

1.3.3 Bacillus azotoformans 23

1.3.4 Thiobacillus denitrificans 23

1.4 Tổng quan p ương p áp p ân lập vi sinh vật [2] 26

1.4.1 Khái niệm 26

1.4.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết 26

1.4.3 Giữ và bảo quản giống 27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Thờ g an và địa đ ểm th c hiện đề tài 29

2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 29

2.2.1 Vật liệu 29

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 29

2.2.3 Hóa chất 29

2.3 Bố trí thí nghiệm : Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau 30

2.4 Ph ng ph p nghi n ứu th c nghiệm 31

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 31

2.4.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng VK có khả năng phản nitrate 31

2.4.3 Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng VK phân lập [8] 34

2.4.4 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm khảo sát khả năng khử nitrate và khử nitrate của các chủng VK phân lập được 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46

3.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng có khả năng phản nitrate: 46

3.1.1 Tăng sinh VK phản nitrate từ nước thải CBTS trên môi trường Giltay NO3 và NO2 -46 3.1.2 Phân lập và làm thuần vi khuẩn từ nước thải CBTS: 47

3.1.3 Tăng sinh VK phân lập được trên môi trường Giltay Nitrate và Giltay Nitrite: 49

3.1.4 Kết quả thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng VK phân lập: 53

3.2 Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ đối với những chủng được tuyển chọn 55

3.2.1 Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite của chủng 7.5 trong 48 giờ 55

3.2.2 Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrite sau 48 giờ đối với chủng 7.1 57

3.3 Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ đối với những chủng được tuyển chọn 60

3.3.1 Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của chủng 7.5 60

3.3.2 Kết quả định lượng N trong mô hình khử Nitrate sau 48 giờ của chủng 7.1 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

1 Kết luận 68

2 Kiến nghị 69

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 S đồ quy trình công nghệ CBTS đ ng lạnh 5

Hình 1.2 S đồ quy trình công nghệ xử l n c thải CBTS điển hình 11

Hình 1.3 Chu trình N trong t nhiên 11

Hình 1.4 Chu trình N thu g n do VK th c hiện 13

Hình 1.5 Quá trình khử nitrate dị hóa và khử nitr te đồng hóa trong chu trình N của VK nhân th c 15

Hình 1.6 C hế quá trình khử nitrate dị hóa (hô hấp kỵ khí) 16

Hình 1.7 C hế quá trình khử nitrate dị hóa amôn hóa 17

Hình 1.8 Hình thái khuẩn lạc Pseudomonas stutzeri 21

Hình 1.9 Hình thái tế bào và khuẩn lạc Paracoccus denitrificans 22

Hình 1.10 Hình thái tế bào Thiobacillus denitrificans 24

Hình 2.1 S đồ tóm tắt bố trí c thí nghiệm 31

Hìn 2.2 Mô hình khảo sát khả n ng hu ển hóa N ở điều kiện khác nhau 39

Hình 3.1 Động h c chuyển hóa N của chủng 7.5 trong mô hình chuyển hóa nitrite 53

Hình.3.2 Động h c chuyển hóa N của chủng 7.1 trong mô hình chuyển hóa nitrite 56

Hình 3.3 Động h c chuyển hóa N của chủng 7.5 trong mô hình chuyển hóa nitrate 58

Hình 3.4 Động h c chuyển hóa N của chủng 7.1 trong mô hình chuyển hóa nitrate 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các thông số ô nhi m tiêu biểu củ n c thải CBTS Việt Nam 4

Bảng 1.2 Tải l ợng ô nhi m n c thải của một số nhà máy CBTS 4

Bảng 1.3 Nồng độ ô nhi m trung bình trong n c thải của một số loại hình CBTS 6 Bảng 1.4 Tiêu chuẩn về hàm l ợng nitrate và nitrite trong n c uống ở mốt số tổ chức 10

Bảng 1.5 Nồng độ methanol sử dụng để khử nitrate hoặc nitrite hoàn toàn 18

Bảng 1.6 Tóm tắt đặc tính hình thái và sinh lý, sinh hóa của các vi khuẩn phản nitrate tiềm n ng 25

Bảng 2.1 Độ đụ m i tr ờng v l ợng khí sinh ra của các m u m i tr ờng sau khi t ng sinh VK ph n lập 32

Bảng 2.2 Ph ng ph p định tính nồng độ nitrite trong m u 33

Bảng 2.3 Ph ng ph p định tính nồng độ nitrate 33

Bảng 2.4 Ph ng ph p định tính nồng độ amoni: 33

Bảng 2.5 Trình t tiến h nh định l ợng NO3- 41

Bảng 2.6 Trình t tiến h nh định l ợng NO2- 42

Bảng 2.7 Trình t tiến h nh định l ợng NH4+ 44

Bảng 3.1 Kết quả định tính N s u 5 ng t ng sinh n c thải CBTS trên môi tr ờng Giltay 46

Bảng 3.2 Kết quả phân lập VSV từ n c thải CBTS 48

Bảng 3.3 Kết quả định tính tr n m i tr ờng Giltay Nitrite sau 5 ngày 49

Bảng 3.4 Kết quả định tính tr n m i tr ờng Giltay Nitrate sau 5 ngày 49

Bảng 3.5 Kết quả thừ nghiêm sinh hóa của các chủng VK phân lập 51

Bảng 3.6 Kết quả định l ợng N trong mô hình khử Nitrite của chủng 7.5 sau 48 giờ 52

Bảng 3.7 Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrite của chủng 7.1 sau 48 giờ 55

Bảng 3.8 Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrate của chủng 7.5 sau 48

giờ 58

Bảng 3.9 Kết quả định l ợng N trong mô hình khử nitrate của chủng 7.5 sau 48

giờ 61

N c thải của công nghiệp CBTS chứa các thành phần ô nhi m hữu ó nguồn gốc từ động vật, nh protein v lipi Ngo i r , n c thải này còn có hàm

l ợng BOD, COD và Nitrate khá cao V i ph ng ph p xử l hó l , ph ng pháp xử lý hóa h ,… ó thể xử lý hiệu quả đ ợ COD v BOD nh ng v n h xử

lý triệt để đ ợ l ợng Nitr te ó trong n c thải

Hiện n , ph ng ph p sinh h c trong xử l n c thải sau chế biến đ ợc các doanh nghiệp CBTS quan tâm và áp dụng rất nhiều N c thải CBTS chứa

l ợng chất hữu o, phân hủy sinh h c b i các vi sinh vật Sử dụng ph ng pháp sinh h c trong xử l n c thải có thể khắc phụ đ ợc một vấn đề mà các

ph ng ph p xử lý hóa lý, hóa h th ờng gặp phải là vấn đề tái ô nhi m sau xử lý

Nhiều chủng VSV có khả n ng th m gi v o hu tr nh nito trong n c, chuyển hóa các hợp chất N nh mon, nitrite, nitr te để phục vụ cho quá trình trao đổi chất, tổng hợp nên các thành phần cấu trúc của tế o ũng nh tổng hợp các chất cần ho qu tr nh sinh tr ởng và phát triển của chúng D v o đó, nhiều chủng VSV có khả n ng hu ển hó N đ ợc sử dụng trong nhiều lĩnh v nh ng nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp th c phẩm, đặc biệt là công nghiệp chế biến thủy sản Để ó đ ợc những ứng dụng trên, việc phân lập và tuyển ch n các chủng VSV mong muốn là một phần quan tr ng trong việc nghiên cứu ũng nh tạo

ra chế phẩm sinh h c có giá trị ứng dụng vào xử l n c thải

Từ những sở trên, th c hiện đề tài “P ân lập và tuyển chọn vi khuẩn

phản nitrate chịu mặn xử lý n tơ trong nước thải chế biến thủy sản” v i mong

muốn sẽ ch n đ ợc các chủng vi khuẩn có khả n ng xử lý hiệu quả nhất, để kết hợp tạo nên một chế phẩm sinh h c phù hợp v i n c thải chứa nguồn N cao, góp phần nâng cao hiệu quả xử lý và bảo vệ m i tr ờng trong ngành CBTS

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển ch n các chủng VK có khả n ng xử lý nitrate và nitrite trong điều kiện có nồng độ muối cao từ n c thải từ công ty CBTS

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và tuyển ch n các chủng VK có khả n ng xử lý nitrate và nitrite trong điều kiện có nồng độ muối cao từ n c thải chế biến thủy sản

- Định l ợng khả n ng xử lý nitrite của các chủng vi khuẩn tuyển ch n

- Định l ợng khả n ng xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn tuyển ch n

- Ph ng ph p định tính khả n ng khử nitrate, nitrite của các VK phân lập

đ ợc

- Th c hiện một số th c nghiệm sinh hó nh : nhuộm gram, OF, MR-VP,

In ol, C t l se, i động đối v i các chủng phân lập đ ợc, từ đó tu ển

ch n chủng VK mong muốn, loại VSV không mong muốn

- Th c hiện bố trí thí nghiệm khảo sát khả n ng phản nitrate của chủng VK

đã tu ển ch n

Ph ng ph p thu thập và xử lý số liệu:

- Ghi nhận số liệu từ các thí nghiệm khảo sát theo từng thời điểm

- Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel

- Xử lý thống kê bằng phần mêm Statgraphic Centurion XV Các số liệu

s u đó đ ợ ph n tí h ANOVA v đ ợc trắc nghiệm phân hạng LSD v i

mứ nghĩ , 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nước thải chế biến thủy sản (CBTS)

N c thải nh m CBTS đ ợ đặ tr ng ởi h m l ợng ô nhi m chất hữu

v N cao Nồng độ BOD ≥ 1000mg/l và tổng N ≥ 120mg/l Tỉ lệ COD/BOD5nằm trong khoảng 1,1 - 1,3, cho phép xử l n c thải theo ph ng ph p sinh h c đạt hiệu quả cao

Bảng 1.1 Các thông số ô nhi m tiêu biểu củ n c thải CBTS Việt Nam

Bảng 1.2 Tải l ợng ô nhi m n c thải của một số nhà máy CBTS

Công suất (TSP/ngày)

6 Cty XNK thủy sản An Giang 8 - 12 1028 900 - 40 10

7 Cty CBTSXK Nha Trang 4 – 6 420 533 810 54 17

10 Cty XNKTS Quảng Ninh 4 – 6 - - 1347 189 47

1.1.1 Nguồn phát sinh và đặc tính nước thải CBTS

1.1.1.1 Nguồn phát sinh

Trong sản xuất thủy sản, n c thải ở các khâu chế biến chiếm 85% - 90% tổng l ợng n c thải, 10 % - 15% còn lại l n c thải sinh hoạt của công nhân trong nhà máy Nguồn gây ô nhi m ở khâu chế biến ản :

- S hế nguyên liệu: rửa, phân loại, mổ, rã đ ng…

- Các quá trình chế biến: ng m, t h x ng, ắt khúc, phile, làm sạch, luộ …

- Quá trình vệ sinh thiết bị, nh x ởng và vệ sinh của công nhân

C c sản xuất ản ó ph t sinh n c thải tại nh m CBTS đ ợc thể hiện trên hình 1.1

Hình 1.1 S đồ quy trình công nghệ CBTS đ ng lạnh (Lê Minh Nguyệt, 2003)

Ngoài các nguồn gây ô nhi m trên thì các hoạt động đóng hộp nh kh u rót

n c sốt, n c muối, dầu gia vị ũng góp phần gây ô nhi m đ ng kể Đối v i hoạt động sản xuất bột cá và dầu cá thì nguồn gây ô nhi m l n c máu từ khâu bốc dỡ, bảo quản cá, ép cá và thời điểm dòng thải đậm đặc nhất l kh u l t m n ng ng

và VK gây bệnh, v.v Các chất thải ó đặc tính d n hỏng và d thất thoát theo

đ ờng đi ủa dòng thải N c thải trong CBTS ó h m l ợng chất hữu o v trong đó ó ầu, protein, chất rắn l lửng và chứ l ợng photphat và nitrate cao Dòng thải từ CBTS còn chứa những m u vụn thịt, x ng ngu n liệu chế biến, máu, chất béo, các chất hoà tan từ nội tạng ũng nh những chất tẩy rửa và các tác nhân làm sạ h kh Trong đó ó nhiều hợp chất khó phân hủy Mứ độ ô nhi m

củ n c thải tùy thuộc vào s có mặt của một số yếu tố, nh ng qu n tr ng nhất là

ph ng ph p hế biến và loài thủy sản đ ợc chế biến sau :

Nhìn chung, hầu hết n c thải củ nh m CBTS đều có chung đặc điểm

- Có h m l ợng các chất hữu ạng d phân huỷ sinh h c cao Giá trị BOD5 th ờng l n, o động trong khoảng 300 – 2000 mg/l, giá trị COD nằm trong khoảng 500 – 3000 mg/l

- H m l ợng l n các protein và chất inh ỡng, thể hiện ở 2 thông số tổng Nit (5 – 200 mg/l) và tổng Photpho (10 – 100 mg/l)

1.1.1.3 Tác động của nước thải CBTS đến môi trường nước

Nh đã tr nh , n c thải CBTS ó h m l ợng các chất ô nhi m cao, nếu

kh ng đ ợc xử lý sẽ gây ô nhi m nghiêm tr ng nguồn n c mặt v n c ngầm xung quanh

Đối v i nguồn n c ngầm tầng n ng, n c thải CBTS có thể thấm xuống đất

và gây ô nhi m mạ h n c ngầm Các chất hữu v VSV g ệnh có trong nguồn n c ngầm nhi m gây cản trở cho việc xử l th nh n c sạch cung cấp cho sinh hoạt

Đối v i các nguồn n c mặn, các chất ô nhi m ó trong n c thải CBTS sẽ làm suy thoái chất l ợng n , t động xấu đến m i tr ờng và thủy sinh vật Trong

n c thải CBTS chứa các chất nh onh r t, protein, hất béo là các chất hữu

bị phân hủy, nên khi xả vào nguồn n c t nhiên sẽ làm giảm nồng độ oxy hòa tan vốn có, do VSV sử dụng để phân hủy các chất hữu ó trong n c thải Nồng độ ox hò t n i 50% bão hòa gây ảnh h ởng xấu t i s phát triển của các loài thủy sinh và làm giảm khả n ng t làm sạch của nguồn n c, d n đến giảm chất l ợng n c cấp cho sinh hoạt và công nghiệp Ngoài ra, các chất l lững trong

n c thải CBTS l m ho n đục hoặ ó m u ng n ản ánh sáng chiếu sâu vào

lòng thủy v c, ảnh h ởng t i quá trình quang hợp của tảo, rong r u g t động tiêu c đến tài nguyên thủ sinh, đồng thời gây mất mỹ qu n ho òng n c và gây bồi lắng lòng sông, cản trở s l u th ng tr n l u v c Về mặt vi sinh, n c thải CBTS chứa nhiều VK gây bệnh và trứng giun sán là những tác nhân gây nên dịch bệnh ở ng ời nh : ệnh lỵ, th ng h n, ại liệt, nhi m khuẩn đ ờng tiết niệu và tiêu chảy cấp tính…

Trên hết l t động của các hợp chất N v photpho nh g hiện t ợng phì ỡng trong hệ sinh th i n c, làm cạn kiệt ox trong n , g độc v i hệ sinh vật

n , l m n c ngầm ô nhi m nitrate, ảnh h ởng t i sức khỏe cộng đồng

- Hiện t ợng ph ỡng trong n l o thừa chất inh ỡng d n t i s phát triển bùng nổ của các loài tảo và VSV, còn g i là hiện t ợng tảo nở hoa Khi đó mật độ thuỷ sinh vật trong hồ rất đặ l m ho n ó độ màu và

độ đục cao Ngoài ra khi một l ợng l n tảo chết đi sẽ cần l ợng oxy l n

t ng ứng để phân huỷ d n đến h m l ợng ox hò t n trong n c bị cạn kiệt, làm chết các sinh vật sống trong n c

- Theo tài liệu « H ng d n về chất l ợng n c uống » của Tổ chức Y tế thế

gi i ũng nh Ti u huẩn 1329/2002 (Bộ Y tế) không xem amoni là chất gây hại cho sức khỏe on ng ời mà xếp amoni vào nhóm các chất g t động xấu về mặt cảm quan (mùi, vị) trong n c Bên cạnh đó, moni òn l ếu tố cản trở trong công nghệ xử l n c cấp Thứ nhất : nó làm giảm tác dụng của clo là tác nhân sát trùng chủ yếu áp dụng ở nh m n c Việt Nam, do phản ứng v i clo tạo thành monocloamin là chất sát trùng thứ cấp hiệu quả kém lo h n lần Thứ hai : amoni cùng v i một số vi l ợng trong n c (hữu , phốt pho, sắt, m ng n…) l “thứ n” để VK phát triển, gây hiện

t ợng “kh ng ổn định sinh h ” ủa chất l ợng n c sau xử l N c có thể

bị đụ , đóng ặn trong hệ thống d n, chứ n N c bị xuống cấp về các yếu tố cảm quan

- Khi nồng độ moni trong n c cao sẽ rất d dàng tạo r nitrite Trong thể động vật, nitrite và nitrate có thể biến thành N-nitroso - là tiền chất có tiềm

n ng g ung th Mặc dù bằng chứng dịch t h h đầ đủ về tác hại đối

v i con ng ời Ủ n h u Âu qu định mức tối đ ủ nitr te trong n c uống là 50 mg/l, Mỹ là 45 mg/l, Tổ chức sức khoẻ thế gi i: 100 mg/l, tiêu chuẩn 1329/2002 (Bộ Y tế) đã đề ra mức gi i hạn 3 v 5 mg/l đối v i nitrite

v nitr te t ng ứng nhằm ng n ngừa bệnh mất sắc tố máu (meth emoglo in emi ) đối v i trẻ s sinh i 3 tháng tuổi v ung th tiềm

t ng Độc tính củ nitrite đ ợc mô tả nh s u (Sharat và cộng s , 1994)

Chứng máu Methaemo- globinaemia (hội chứng xanh xao trẻ em) :

Trong thể, nitrite (hoặ nitr te i tác dộng của một số VK đuờng ruột chuyển thành nitrite) kết hợp v i hồng cầu (hemoglo in) trong m u s u đó hu ển thành methemoglobin, cuối cùng chuyển thành methemoglobinamin Methemoglobinamin là chất ng n ản việc liên kết và vận chuyển oxy, gây bệnh thiếu oxy trong máu và sinh ra bệnh máu trắng:

4HbFe2+O2 + 4 NO2- + 2H2O → 4H Fe3+OH- + 4NO3- + O2Bệnh nhân khi bị ngộ độc nitrite sẽ có những triệu chứng nh nhức đầu, hồi hộp, hoa mắt, nôn mử … s u đó n đến hôn mê và có thể gây tử vong Hiện t ợng

n đặc biệt thấy rõ ở trẻ em Trẻ em mắc chứng bệnh n th ờng xanh xao và d bị

đe a đến cuộc sống đặc biệt là trẻ i 6 tháng tuổi

R2-NH + HNO2 → H2O + R2N-NO (pH<4)

Các amin bậ trong m i tr ờng axit yếu ở pH = 3 - 6 v i s có mặt của ion nitrite chúng d dàng phân huỷ thành aldehyd và amin bậc hai Sau dó amin bậc hai tiếp tục chuyển thành nitrosamin

Do độc tính cao của các hợp chất chứa N (amoni, nitrite, nitrate) nên việc loại bỏ húng trong n c thải ó h m l ợng N cao là việc quan tr ng, để loại bỏ

đ ợc mối nguy hại khá l n ho m i tr ờng, đặc biệt là bảo vệ sức khỏe cộng đồng

S u đ l qu định về h m l ợng nitr te v nitrite trong n c uống của một số tổ chức

Bảng 1.4 Tiêu chuẩn về hàm l ợng nitrate và nitrite trong n c uống ở mốt số tổ

D v o đặ tr ng ủ n c thải CBTS, quy trình xử l n c thải thông dụng th ờng đ ợc áp dụng tại các nhà máy CBTS Việt Nam gồm ng đoạn sau:

- Tiền xử lý hay xử l s ộ: Tách rác, lắng cát, cân bằng, tách dầu

- Xử l s ấp hay xử lý bậc 1: Xử lý kỵ khí trong bể UASB

- Xử lý thứ cấp hay xử lý bậc 2: Xử lý hiếu khí trong bể Aeroten

Hình 1.2 S đồ quy trình công nghệ xử l n c thải CBTS điển hình

1.2 C u trìn n tơ (N)

1.2.1 Giới thiệu về chu trình N tự nhiên

Chu kỳ N là một qu tr nh m theo đó N đ ợc chuyển đổi qua lại giữa các dạng hợp chất hóa h c của nó Chuyển đổi này có thể đ ợc th c hiện cả hai quá trình sinh h c và phi sinh h c Quá trình quan tr ng trong chu trình N bao gồm: s

cố định N, khoáng hóa, quá trình nitrate hóa và khử nitrate

Hình 1.3 Chu trình N trong t nhiên

S chuyển hoá củ N trong m i tr ờng phụ thuộc vào nhiều yếu tố ảnh

h ởng nh : pH, s phân tầng n c, nhiệt độ, độ mặn Việc cung cấp N vào các chu trình vật chất trong t nhiên phụ thuộc nhiều vào quá trình phân huỷ sinh h c

các hợp chất chứa N trong môi tr ờng S tr o đổi và phân huỷ sinh khối khác nhau

đ ng kể giữ n i sống, kích cỡ và hoạt động sống của các quần xã VSV và nấm

Tỷ lệ trung bình của C:N trong sinh khối VSV xấp xỉ 10:1; Th c vật có tỷ lệ C:N là 40+8 : nghĩ l ó s thiếu hụt N; Động vật duy trì tỷ lệ C:N gần bằng tỷ lệ của VSV phân huỷ, gây phân hủ nh nh Trong đất, tỷ lệ C:N ổn định nhất là ~10 Theo Begon (1990), khi một chất ó h m l ợng N < 1.2+ 3% đ ợc bổ sung vào đất thì bất kỳ ion NH4+ n o ũng đ ợc hấp thụ, còn khi các chất ó h m l ợng N > 8% đ ợc bổ sung bởi các ion NH4+ ó xu h ng đ ợc giải phóng

Nit trong m i tr ờng tồn tại ở nhiều dạng hóa h c khác nhau bao gồm N hữu nh moni (NH4+), nitrite (NO2-), nitrate (NO3-), nit xit (N2O), nitric ôxit (NO), hoặc nit v nh khí N (N2) Các quá trình trong chu trình N chuyển đổi N

từ một dạng này sang dạng khác Một số qu tr nh n đ ợc tiến hành bởi các VK,

qu qu tr nh đó hoặ để chúng lấ n ng l ợng hoặ để tích tụ N thành một dạng cần thiết cho s phát triển của chúng Việc chuyển hóa N hữu gồm 4 gi i đoạn:

- Cố định đạm: cố định N phân tử ngoài không khí thành NH3 i tác dụng của hệ enzyme nitrogenase và hydrogenase kết hợp N2 v i H2 Sinh vật có khả n ng ố định đạm là VK và vi tảo, đặc biệt là VK sống cộng sinh trong nốt sần h đậu nh Azoto ter e e v Rhizo i e e

- Amoni hóa: thủy phân protein và oxy hóa các axit amin thành NH4+ bằng enzyme protease do VK Actinomycetes và nấm tạo ra

- Nitrate hóa: gồm có nitrite hóa và nitrate hóa Nitrite hóa: oxy hóa NH3,

NH4+ thành NO2- bởi chủng VK Nitrosomonas; Nitrate hóa: NO2- đ ợc oxy hóa tiếp do chủng VK Nitrobacter thành NO3-

- Khử nitr te : trong điều kiện m i tr ờng ít hoặc không có oxy (ngập úng, cặn lắng ) sẽ di n ra quá trình khử nitr te Trong đó NO3- đ ợc các VK sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng (chất gây oxy hoá) và chuyển hóa thành các chất trung gi n nh NO2-, NO, N2O và cuối cùng khử thành N2 trả lại cho khí

quyển Quá trình này xả r o VK nh Pseudomonas denitrificans, Bacillus spp ,…

Do mụ ti u đề tài, sinh viên th c hiện đề tài chỉ tìm hiểu sâu về quá trình phản nitrate, các phần còn lại của chu trình N sẽ hạn chế trình bày

1.2.2 Quá trình phản nitrate ở tế bào vi khuẩn

Phản nitrate là một trong những quá trình chính củ hu tr nh N o VK đảm nhiệm v đ ợc khái niệm là quá trình khử NO3- thành khí N2 theo 4 gi i đoạn bản sau: NO3- → NO2- → NO (k) → N2O (k) → N2(k), thông qua các phản ứng: khử nitrate hô hấp, khử nitrite hô hấp, khử NO hô hấp và khử N2O hô hấp Trong đó

NO2-, NO, N2O là các sản phẩm trung gian và mỗi gi i đoạn củ qu tr nh đ ợc xúc tác bởi 1 hệ enzyme khác nhau Quá trình khử nitrate dạng này g i l “khử nitrate dị

hó ”

Hình 1.4 Chu trình N thu g n do VK th c hiện (Walter G Zumft, 1997)

Nh đã tr nh ở trên , số l ợng VK có thể th c hiện quá trình phản nitrate hoá khá phong phú Có ít nhất 14 chủng VK đ ợc biết là có khả n ng phản nitrate

hoá Ví dụ: Bacillus spp., Pseudomonas spp., Methanomonas denitrificans, Paracoccus denitrificans, Spirillum, Thiobacillu denitrificans

Phần l n VK phản nitrate hoá là VK dị ỡng tức là chúng cần nguồn C hữu (met nol, xit eti , met n, xit itri ) để tổng hợp tế bào, chỉ có một số ít VK phản nitrate hoá là VK t ỡng, sử dụng nguồn C v để tổng hợp tế bào Ví dụ:

loài Thiobaccillus denitrificans có khả n ng ox ho l u huỳnh nguyên tố lấ n ng

l ợng và sử dụng nguồn C từ CO2 hoà tan hoặc HCO3- để tổng hợp tế bào

Hầu hết VK phản nitrate hoá là VK hô hấp kỵ khí tuỳ nghi (trừ Pseudomonas

hoặc NO3- làm chất nhận điện tử cuối cùng trong quá trình hô hấp Có thể giải thích

nh s u:

Khi có mặt O2, VK sẽ sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng trong quá trình hô hấp, g i là hô hấp hiếu khí, khi nguồn O2 cạn kiệt VK sử dụng NO3- hoặc

có thể là NO2- nh hất nhận điện tử cuối cùng cho quá trình hô hấp, g i là hô hấp

kỵ khí C hế củ qu tr nh l t ng t nhau, s khác nhau duy nhất giữa hô hấp hiếu khí và hô hấp kỵ khí là enzyme xúc tác cho s vận chuyển điện tử O2 phải

đ ợc loại trừ để tạo điều kiện cho quá trình khử nitrate di n ra Nếu cả O2 và NO3cùng có mặt thì VSV sẽ u ti n sử dụng O2 làm chất nhận điện tử, do hô hấp hiếu khí sinh ra nhiều n ng l ợng h n h hấp thiếu khí

-C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O (Go’ = - 2,870 kJ/1mol Glucose)

5 C6H12O6 + 24 NO3- + 4H+ → 3 CO2+ 12N2 + 42H2O (Go’= - 2,670 kJ/1mol Glucose)

C6H12O6 + 3 NO3- + 6H+ → 6CO2 + 3 NH4+ + 3H2O (Go’ = -1,870kJ/1mol Glucose)

Các VSV cần N để tổng hợp protein là thành phần cấu trúc của tế bào và

NH4+ là nguồn N VSV có thể sử dụng tr c tiếp để tổng hợp Trong tr ờng hợp không sẵn có nguồn NH4+, VSV có khả n ng khử NO3- thành NH4+ để sử dụng Khi

đó một phần N đã đ ợc chuyển vào trong tế bào, quá trình khử N dạng n đ ợc

g i l “khử nitr te đồng ho ”

1 C hế quá trình phản nitrate

Tìm hiểu sâu về quá trình phản nitr te, th hế của quá trình di n ra theo hai mụ đí h hính:

- Tổng hợp n ng l ợng cho quá trình hô hấp kỵ khí, g i là khử nitrate dị hóa

- Chuyển hóa NO3- thành NH4+ để tổng hợp nên cấu trúc tế bào, g i là khử nitr te đồng hóa

Hình 1.5 Quá trình khử nitrate dị hóa và khử nitr te đồng hóa trong chu trình N

của VK nhân th c (Walter G Zumft, 1997)

Khử nitrate dị hóa

Trong khử nitrate dị hóa, xả r đồng thời hai quá trình khử nitrate hóa (denitrificans) và amôn hóa (ammonification) Cả h i đều chuyển hóa NO3- thành

NO2- v sinh n ng l ợng ở điểm khởi đầu thông qua quá trình hô hấp kỵ khí

- Khử nitrate tiếp tục các quá trình khử liên tiếp NO2- → NO (k) → N O (k)

và cuối cùng tạo ra N2, v i s xúc tác của các enzyme khử đ ợc mã hóa tổng hợp bởi các gen: Nap, Nar (hô hấp khử nitrate), Nir (hô hấp khử nitrite), Nor (hô hấp khử oxit nitric), Nos (hô hấp khử oxit nito) S u đ l s đồ quá trình khử nitrate dị hóa ở tế bào VK

Hình 1.6 C hế quá trình khử nitrate dị hóa (hô hấp kỵ khí)

Trong m i tr ờng kỵ khí O2 vắng mặt, để tiếp tục duy trì s sống VSV buộc phải t m t nh n kh để thay thế O2 th c hiện quá trình hô hấp, và các tác nhân

đó hầu hết là các nguyên tử chứa O2 nh NO3-, SO42+, … Trong m i tr ờng có nhiều ion NO3- thì qu tr nh đ ợc di n r nh s u:

Ion NO3- đ ợc hấp thụ qua màng ngoài tế o v đ ợc chuyển hóa thành các dạng khác nhau tại khoảng không gian ngoại vi bào (periplasm) Ở đ , oxit ủa

N lần l ợt đóng v i trò nh hất nhận điện tử cuối cùng thay cho O2, để tạo nên nấc

th ng điện hóa qua màng sinh chất trong quá trình hô hấp kỵ khí của tế bàoVK Sau mỗi phản ứng chuyển hóa, phân tử oxy dần đ ợc lấy ra khỏi oxit N để phục

vụ cho quá trình hô hấp của tế bào và cuối cùng là tạo ra N2 thải ra bên ngoài

- Khử nitrate dị hó m n hó : qu tr nh n òn đ ợc g i là quá trình khử độc tế bào

Hình 1.7 C hế quá trình khử nitrate dị hóa amôn hóa

Khi nồng độ nitrite trong tế o VK t ng o, ó thể g độc cho tế bào vì thế trong tế bào VK xả r hế khử độc nitrite cho tế bào bằng cách chuyển hóa nitrite thành NH4+ và NH3 Hai hợp chất này có thể phục vụ cho quá trình nitrate hóa Enzyme xúc tác chuyển hóa NO2- thành NH4+ do gen NrfA mã hóa, NO2- thành

NH3 do hệ gen phức tạp NrfHA mã hóa

Khử n trate đồng hóa

Khử nitr te đồng hó đ ợc di n ra v i mụ đí h tạo ra NH4+ là nguồn N cho quá trình tổng hợp tế bào của VK Enzyme xúc tác cho s chuyển hóa nitrite thành amoni và amoniac là do gen NirA và NasB mã hóa

Cả h i hế khử nitrate dị hóa và khử nitr te đồng hó , đầu đều khử nitrate

về nitrite nh ng enz me xú tác là khác nhau Ở khử nitr te đồng hóa enzyme xúc tác do gen Nas mã hóa, trong khi khử nitrate dị hó l o gen N r/N p mã hó Nh vậy, trong quá trình phản nitrate chỉ có quá trình khử nitrate dị hóa – hô hấp nitrate

kỵ khí m i ó nghĩ xử lý N trong n c thải Đó l sở để tiến hành phân lập chủng VK mong muốn Nghĩ l hủng VK đó ó khả n ng khử nitrate và khử nitrite hoàn toàn, tạo thành các phân tử khí N2O, NO, tốt nhất là tạo ra khí N và không hoặc ít tạo ra amoni Vì nếu l ợng amoni tạo ra nhiều sau quá trình xử lý thì

việc ứng dụng VK đó v o xử l n c thải kh ng òn nghĩ , ng ợc lại còn làm cho

n c ô nhi m nghiêm tr ng h n

1.2.2.2 Các yếu tố ảnh h ởng đến quá trình phản nitrate

Các yếu tố ảnh h ởng mạnh mẽ đến quá trình phản nitrate đã đ ợc tìm hiểu

và nghiên cứu là: nguồn cung cấp C, điều kiện m i tr ờng kỵ khí (s vắng mặt của oxy phân tử và s hiện diện của ion nitrate), s hiện diện của VK có khả n ng phản nitr te, điều kiện thích hợp cho s phát triển của VK

 Nguồn cung cấp carbon v n ng l ợng (C hất):

Để quá trình khử nitrate xảy ra hoàn toàn thì nguồn cung cấp n ng l ợng và carbon (C) phải l n h n nồng độ ion nitrate hoặ nitrite, đ l ếu tố quan tr ng quyết định quá trình phản nitrate Khi nồng độ ox trong m i tr ờng giảm thấp, các

VK kỵ khí tùy nghi hay kỵ khí có s chuyển đổi về hệ thống enzyme từ việc sử dụng oxy làm chất nhận điện tử sang có thể sử dụng ion nitrate hoặc nitrite là chất nhận điện tử Quá trình hô hấp kỵ khí di n ra phức tạp h n h hấp hiếu khí nên nguồn C v n ng l ợng cần phải nhiều h n Việc khử nitrate hoàn toàn hoặc loại bỏ tất cả các ion nitrite và các ion nitrate di n ra khi tỷ lệ giữa nguồn cung cấp C và

n ng l ợng v i ion nitrate hoặc ion nitrite vào khoảng 3: , trong n c thải tỷ lệ này

có thể là 3:1.05 Nguồn C v n ng l ợng VK phản nitrate sử dụng th ờng là các hợp chất hữu phân hủy sinh h nh : meth nol, xit xeti , glu ose, eth nol,

… Trong đó, xit eti v meth nol l h i hợp chất th ờng sử dụng nhiều nhất

NO3- + 0,85CH3COOH + H+ → , C5H7O2N + 0,45N2 + 1,2CO2 + 2,1H2O

NO3- + 1,8CH3OH + H+ → , 65C5H7O2N + 0,47N2 + 0,76CO2 + 2,44H2O

Meth nol l hất đ ợ u ti n sử dụng nhiều h n, o meth nol l hất d

hò t n, nh nh hóng đi v o n trong tế o VK v ũng dàng bị chuyển hóa

Bảng 1.5 Nồng độ methanol sử dụng để khử nitrate hoặc nitrite hoàn toàn (A)

(Michael H Gerardi, 2002) Ion chứa N (A)/(1 mg/l ion chứa N) Tế bào m i N đ ợc dùng tổng hợp tế bào

Đ ều kiện mô trường kỵ khí:

Phân tử oxy hòa tan ức chế quá trình phản nitrate do s cạnh tranh v i các ion nitrate và nitrite trong vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng cho quá trình phân hủy chất hữu

Khi ox đi v o tế bào VK, thì việc sử dụng oxy làm chất nhận điện tử cho quá trình hô hấp sẽ u ti n h n việc sử ion nitrate hoặc nitrite, do việc sử dụng oxy hòa tan mang lại nhiều n ng l ợng và d tổng hợp tế o h n Nồng độ oxy hòa tan

l n h n , - 0,5 O2 mg/l thì làm giảm đ ng kể tố độ của quá trình khử nit ho n toàn

Để quá trình phản nitrate xảy ra thì quá trình nitrate hóa phải xả r , đ l điều kiện tiên quyết cho quá trình khử nitr te Độ l n của nồng độ nitrate hoặc nitrite ít ảnh h ởng đến quá trình khử nitrate Khi nồng độ nitrate > 0,5 mgN/l, thì

s khử nitrate sẽ không phụ thuộc vào nồng độ nitrate

 S hiện diện của vi khuẩn phản nitrate:

Trong quá trình bùn hoạt tính, khoảng 80% VK là VK kỵ khí tùy nghi và có khả n ng khử nitrate Vì trong quá trình này, dung tích hỗn hợp khá l n bao gồm

c hất cần thiết và cả các chất l lững tan hoặc không tan có thể gây ảnh h ởng đến quá trình, nên cần một l ợng l n VK mụ đí h để đảm bảo quá trình khử nitrate

di n ra thuận lợi Có thể bổ sung VK khử nitrate vào quá trình xử lý từ các chế phẩm sinh h đặ tr ng

 Điều kiện thích hợp cho vi khuẩn phát triển:

- pH: Khử nitrate có thể xảy ra trong phạm vi pH rộng 6,5 – 8,5, đ ũng l khoảng pH thích hợp cho quá trình hình thành bông cặn trong gi i đoạn bùn hoạt tính Tố độ khử nitrate sẽ chậm lại khi pH<6,5 hoặc >8,5 Mặt khác, khi giá trị pH<6 không chỉ ức chế quá trình khử nit , m òn ả quá trình nitrate hóa, và việc tạo ra khí N là không thể Khoảng pH tối u ho qu trình khử nitrate là 7,0 – 7,5

- - Nhiệt độ: Khử nitrate xả r nh nh hóng h n ở nhiệt độ t ng v ng ợc lại

sẽ chậm h n khi nhiệt độ giảm, nhiệt độ tối u ho qu tr nh l 4 oC Khử

nitrate bị ức chế trong n c thải ở nhiệt độ < 5oC Khi nhiệt độ t ng th s

hò t n ox trong n c giảm nhiều h n so v i n c có nhiệt độ giảm Vì vậy, oxy hòa tan bị cạn kiệt nh nh h n trong điều kiện n c thải có nhiệt độ cao nên quá trình khử nitrate xảy ra d ng h n

- Bên cạnh các yếu tố trên, thì s vắng mặt hoặc hiện diện ở nồng độ thấp của các hợp chất độc hại trong m i tr ờng khử nitrate là một yêu cầu cần nhắc đến nhằm đảm bảo cho quá trình xảy ra thuận lợi So sánh s nhạy cảm đối

v i chất độc hại giữa VK t ỡng và VK dị ỡng thì ở VK t ỡng ó độ nhạy cảm o h n, n n nếu quá trình nitrate hóa có thể xảy ra trong quá trình bùn hoạt tính, thì hiển nhiên sẽ có quá trình khử nitrate xảy ra

1.3 Tổng quan về một số vi khuẩn phản nitrate

VK phản nitrate phân bố rộng rãi trong t nhiên Phần l n chúng thuộc loại

dị ỡng hó n ng hữu , kỵ khí hoặc kỵ khí tùy nghi

Theo tổng quan về vi khuẩn phản nitrate (denitrifier) trong Prokaryote tập 2, Shapleigh, 2006 liệt kê một danh sách l n các vi khuẩn phẩn nitrate bao gồm vi khuẩn Gr m m v Gr m ng S u đ l một số loài VK có khả n ng phản nitr te đã đ ợc nghiên cứu và có tiềm n ng ứng dụng

1.3.1 Pseudomonas stutzeri

Đ l VK ó khả n ng khử nitrate thành N phân tử trong m i tr ờng hiếu

khí, vì thế Pseudomonas stutzeri đ ợc ứng dụng khá rộng trong m i tr ờng n c

chứa nhiều chất đạm tại các ao hồ nu i tr , s …v đặc biệt trong xử l n c thải đặ tr ng

3 Đặ điểm

Pseudomonas stutzeri là VK gram âm, hình que, di chuyển bằng một c c

ti m m o Kí h th c tế bào: dài 1 - 3 µm, rộng 0,5µm Khuẩn lạc có hình dạng

kh ng ki n định khi đ ợc phân lập tr c tiếp, khuẩn lạc có dạng sần, khô, bám chặc

v i nhau

Pseudomonas stutzeri là VK dị ỡng hó n ng hữu , kh ng ó sắc tố và

có thể t ng tr ởng trong m i tr ờng amylase, maltose, tinh bột, cho kết quả ng

tính v i phản ứng t l se, oxi se, in ol v qu tr nh ox hó nh ng kh ng ph t triển trong gel tin se, kh ng l n men đ ờng glucose, lactose, sucrose và cho kết quả âm tính v i thử nghiệm VP-MR Là VK hiếu khí, phân bố rộng rãi trong t nhi n nh ng đ ợc tìm thấy chủ yếu trong đất v n c Nhiều òng đ ợc phân lập từ các m u bệnh lý Chúng có khả n ng hu ển hóa, làm giảm các chất độc cho môi

tr ờng và các hợp chất có tr ng l ợng phân tử o nh pol eth lene gl ols

D a vào các nghiên cứu gen (trình t 16S rRNA) cho thấy Pseudomonas stutzeri

t ng đồng v i lo i nh Pseudomonas mendocinia, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas pseudoalcaligenes và Pseudomonas balearica

Hình 1.8 Hình thái khuẩn lạc Pseudomonas stutzeri

2.3.1.2 Ứng dụng

Pseudomonas stutzeri là loại VK khử nitrate, không phát quỳnh quang Gần

đ nhiều nhà nghiên cứu khoa h đ ng hú đến khả n ng hu ển hóa chuyên biệt của nó

Một vài dòng có thể chuyển hóa các hợp chất th m nh n phthalene và mathylnapthalenes Hai hợp chất th m n hiện diện nhiều trong dầu thô, là chất có

tiềm n ng g độc P.stutzeri đ ợ đề cập nh một hệ thống khử nitrate vì nó có

khả n ng l m giảm nitrate thành khí N2 Một số loài có khả n ng iến đổi t nhiên,

l đối t ợng thích hợp cho các nghiên cứu về s biến đổi gen trong m i tr ờng

Ở Việt Nam, các chủng VK đị ph ng khử đạm mạnh, phù hợp v i điều kiện sinh th i đị ph ng ó thể ứng dụng vào xử l m i tr ờng n đã đ ợc các

nhà khoa h c nghiên cứu, đặc biệt gần đ nhất l đề tài phân lập VK

Pseudomomas stutzeri có khả n ng khử đạm mạnh trong n c thải ao cá tra ở Đồng

Bằng Sông Cửu ong v đ ng ần đ v o ứng dụng xử l n c thải

1.3.2 Paracoccus denitrificans

1.3.2.1 Đặc điểm

Paracoccus denitrificans là VK gram âm, hình cầu, kh ng i động Tr c

đ đ ợc biết đến v i tên Micrococcus denitrificans, lần đầu ti n đ ợc phân lập vào

n m 9 ởi M Beijerin k, v o n m 969 đổi tên thành Paracoccus denitrificans bởi DH Davis P denitrificans là một sinh vật mô hình cho việc nghiên cứu quá

trình khử N Là VK có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí l n kỵ khí

Paracoccus denitrificans l VK ó qu tr nh tr o đổi chất linh hoạt đ ợc tìm

thấ trong đất và bùn hoạt tính, có thể sử dùng cả hai nguồn n ng l ợng v v hữu , từ các hợp chất hữu nh meth nol v meth l mine, hợp chất v nh

h ro v l u huỳnh (thiosulfate) Là VK có khả n ng đảm nhiệm vai trò khử hoàn toàn nitrate thành N phân tử vì chứa cả 3 enzyme quan tr ng trong quá trình khử nitrate

Là VSV phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, thể hiện một chuỗi hô hấp rất

giống v i ty thể ó nh n điển hình P denitrificans đã v v n tiếp tục là chủ đề của

nhiều nghiên cứu sinh hóa và sinh h c chuyển hó n ng l ợng, tính chất ản của chuỗi vận chuyển điện tử hiếu khí Các bằng chứng từ 16S rRNA phân tích chỉ ra

rằng tiền thân tiến hóa của ty thể là một h hàng gần của P denitrificans

Hình 1.9 Hình thái tế bào và khuẩn lạc Paracoccus denitrificans

1.3.2.2 Ứng dụng

Paracoccus denitrificans tạo r h n 5 protein Trong đó ó nhiều protein

và enzyme rất có ích trong các ứng dụng công nghệ sinh h c Một số ứng dụng nh làm chất xúc tác các phản ứng sinh h c, làm màng l vi sinh để loại bỏ N khỏi

n c thải Paracoccus denitrificans có khả n ng khử nitrate thành khí N hiệu quả Trong ứng dụng này, Paracoccus denitrificans kết hợp v i Nitrosomonas europaea

làm giảm amoni thành nitrite Hệ thống n giúp đ n giản hóa quá trình loại bỏ N trong n c thải

Các chủng Paracoccus denitrificans đ ợc phân lập từ bùn hoạt tính có thể

phân hủy một loạt min meth l hó trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí, các chủng thuộc dạng t ỡng hó n ng v ó khả n ng l m giảm các hợp chất C bậc bốn nh imeth lm lon te trong điều kiện khử nitrate kỵ khí Một số chủng có khả n ng khử N hiếu khí, khử hoàn toàn nitrate thành N phân tử trong điều kiện

t ng tr ởng hiếu khí

1.3.3 Bacillus azotoformans

1.3.3.1 Đặc điểm

Bacillus azotoformans là một tr c khuẩn gr m ng, i động v đ ợc tìm

thấ trong đất, có khả n ng khử ho n to n nitr te th nh khí N trong điều kiện kỵ

khí Tế bào B azotoformans có hình bầu dục v i kí h th c 1,4 x 2 - 2,5 µm, sinh

bào tử Phát triển ở pH 6 – 7, nhiệt độ 42 – 460C, ở 40C VK ng ng ph t triển

Bacillus azotoformans có kết quả ng tính v i thử nghiệm oxidase, khử

nitr te v itr te nh ng kh ng ó khả n ng l n men, ph n hủy tinh bột, gelatin, Tween 80 và cho kết quả âm tính v i thử nghiệm VP-MR, catalase, urea, indol 2.3.3.2 Ứng dụng

Tứ đặc tính trên, Bacillus azotoformans đ ợc ứng dụng trong xử l n c

thải chứ N nh n c thải thủy sản, n c thải chế biến thịt v đ ng ó nhiều nghiên

cứu về việc ứng dụng B azotoformans trong lĩnh v c cuộc sống

1.3.4 Thiobacillus denitrificans

1.3.4.1 Đặc điểm

Thiobacillus denitrificans là VK gram âm, tế bào có hình que ngắn (0,5 x 1,0

– 3,0 µm) Là VK t ỡng hó n ng v , trong m i tr ờng kỵ khí tùy ý, có khả

n ng ox hó hợp chất l u huỳnh v nh h rogen sulfi e, thiosulf te để khử các hợp chất N nh nitr te, nitrite đến khí N Điều kiện tối u ho qu tr nh khử N là pH 6,85 ở 32,8oC, trong khi đó điều kiện tốt nhất cho s t ng tr ởng là pH 6,90 ở 29,5oC Thiobacillus denitrificans có thể khử N trong m i tr ờng có chứa

các hợp chất Fe nh FeS2, FeS

Hình 1.10 Hình thái tế bào Thiobacillus denitrificans

VK i động đ ợc bằng một c c tiêm mao, khuẩn lạ tr n m i tr ờng

thạch thiosulfat/ nitrate yếm khí cho màu trắng đục Thiobacillus denitrificans phát

triển chậm, kh ng ó gi i đoạn ổn định rõ r ng Nh ng ph log đạt đ ợc ở gi i đoạn khử N tối đ , 45 mg/l

Mặc dù Thiobacillus denitrificans là một sinh vật kỵ khí tù nghi, nh ng nó

có thể sống trong điều kiện hiếu khí Thiobacillus denitrificans đ ợc tìm thấy trong

đất, ùn, n c ng t, biển trầm tí h, n c thải và bể xử l n c thải trong điều kiện

thiếu khí Thiobacillus denitrificans đ ợc phân lập đầu tiên bởi Beijerin k v o n m

1904

1.3.4.2 Ứng dụng

T denitrificans đ ợc ứng dụng trong việc loại bỏ nitr te thừa trong nguồn

n c ngầm t nhiên Là VK t ỡng đầu tiên và duy nhất có thể oxy hóa uranium (IV), oxit ur nium trong điều kiện kỵ khí tù nghi n n đ ợc dùng khắc phục các

tầng chứ n c bị ô nhi m uranium L VK đ ợc ứng dụng trong xử l n c thải có chứa cả các hợp chất l u huỳnh và N

Bảng 1.6 Tóm tắt đặc tính hình thái và sinh lý, sinh hóa của các vi khuẩn phản

nitrate tiềm n ng

Đặ đ ểm Pseudomonas

stutzeri

Paracoccus denitrificans

bacter xylosoxidans

Achromo-Thiobacilus denitrificans

Bacillus azotofor- mans

Khử nitrate + + + + +

(k x đ = kh ng x định)

1.4 Tổng quan p ƣơng p áp p ân lập vi sinh vật [2]

Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, VSV th ờng tồn tại

ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý,

lý hoá hoặc sử dụng vào th c ti n một lo i n o đó th ần phải đ húng về dạng thuần khiết

1.4.1 Khái niệm

Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể n đầu và

đ về dạng thuần khiết Đ l một kh u ó nghĩ rất quan tr ng trong việc nghiên cứu và ứng dụng VSV VSV ở dạng thuần khiết là giống VSV đ ợc tạo ra từ một tế o n đầu

D a theo nguyên tắc: tách rời các tế bào VSV; nuôi cấy các tế bào trên trong

m i tr ờng inh ỡng đặ tr ng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau

1.4.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết

- Phân lập VSV thuần khiết: cấy chuyền nhiều lần đối v i từng loại khuẩn lạc riêng rẽ, có thể tiến hành cấy ria hoặc cấy trang Chủng thuần khi khuẩn lạ tr n m i tr ờng là cùng một loại duy nhất, có hình thái giống v i khuẩn lạ n đầu Mỗi khuẩn lạ đ n hỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống nh u trong qu n s t i kính hiển

vi Khi th c hiện phải tuân thủ nghiêm túc các yêu cầu về thao tác vô trùng

- Kiểm tr độ tinh khiết của các khuẩn lạc: ch n các khuẩn lạc riêng rẽ

tr n m i tr ờng thạ h, s u đó ph loãng ở các nồng độ cần thiết bằng

n c muối sinh lý vô trùng, tiến hành cấ tr ng đối v i các nồng độ pha loãng Ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp, quan sát nếu khuẩn lạc đồng nhất về màu sắc, hình dạng th đ ợc giữ lại, ng ợc lại khuẩn lạc không thuần nhất thì loại bỏ S thuần khiết của khuẩn lạ đồng nghĩ

v i s thuần khiết của giống

Việc l a ch n nguồn lấy m u ũng kh ần thiết, từ m i tr ờng lấy m u đặc

tr ng t ó thể d dàng phân lập đ ợc chủng VSV mong muốn

Sau quá trình làm thuần chủng VSV phân lập, c kế tiếp có thể là xác định hình thái VSV bằng ph ng ph p nh nhuộm gram, nhuộm bào tử, nhuộm tiêm mao, nhuộm vỏ nhày, Và th c hiện các thử nghiệm sinh hó nh : kiểm tra khả n ng l n men, ox hó tr n m i tr ờng OF, thử nghiệm Indol, VP-MR, Catalase, Oxi se, Citr te,… để từ đó tu ển ch n đ ợc chủng cần phân lập

1.4.3 Giữ và bảo quản giống

- Ph ng ph p ấy chuyền định kỳ: áp dụng cho tất cả các loại VSV

Ph ng ph p n đ n giản, d th c hiện nh ng thời gian bảo quản không lâu, tốn m i tr ờng, thời gian và phẩm chất n đầu của giống

có thể bị th đổi sau mỗi lần cấy chuyền

- Ph ng ph p giữ giống tr n m i tr ờng thạch có l p dầu khoáng: v i yêu cầu các chất dầu kho ng nh p r fin lỏng, v z lin phải trung tính,

độ nh t o, kh ng độc hại v i VSV và vô trùng (hấp 121o

C, 2 giờ; sấy khô trong tủ sấy ở 170oC, 1-2 giờ) Dầu kho ng đ ợc cho lên bề mặt m i tr ờng đã ấy VSV, cách mép trên ống nghiệm 1 m Đối v i VSV kỵ khí cần loại bỏ O2 trong m i tr ờng tr c khi cấy chủng vào

và tiến hành cho l p dầu khoáng vào thật nh nh Ph ng ph p n

kh đ n giản nh ng ó hiệu quả cao nhờ khả n ng l m hậm quá trình biến ỡng và hô hấp, làm cho VSV phát triển chậm lại Ph ng ph p

n kh ng l m m i tr ờng mất n c và khô

- Ph ng ph p giữ giống tr n đất, cát, hạt: Đất và cát l m i tr ờng dùng bảo quản các chủng có khả n ng tạo bào tử tiềm sinh, thời gian bảo quản từ một đến nhiều n m Đất, t s u khi s hế (loại bỏ axit hữu , rửa kỹ, sấ kh , v trùng) th đ ợc cho vào ống nghiệm có VSV đã ph t triển tr n m i tr ờng thạch, lắ đều, cho toàn bộ vào ống nghiệm khác và hàn kín miệng sẽ bảo quản đ ợc rất lâu; Hạt là môi

tr ờng ùng để bảo quản các chủng có dạng sợi sinh bào tử hoặc không Thời gian bảo quản có thể đến một n m Hạt s u khi đ ợc rửa sạch, nấu cho vừa nứt, để ráo, cho vào ống nghiệm và phủ một l p bông thấm n c nấu hạt, cấy giống vào, khi VSV m c dày đặc thì giữ

ở nhiệt độ 15 – 20o

C

- Ph ng ph p đ ng kh : l m mất n c tế bào ở trạng thái t do, làm

ng ng hẳn quá trình phân chia của VSV, nhờ đó giống có khả n ng chịu đ ợc nhiều t động của ngoại cảnh Ph ng ph p n đ ợc áp dụng trong sản xuất, thời gian bảo quản l n đến vài chụ n m

S l a ch n VSV ở gi i đoạn phát triển thích hợp ũng l ếu tố khá quan

tr ng trong việc bảo quản giống

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thờ g an và địa đ ểm th c hiện đề tài

- Thời gian: Từ ngày 21/4/2015 – 21/7/2015

- Đị điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ sinh h c – Th c Phẩm – M i tr ờng tr ờng Đại H c Công Nghệ TPHCM

2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất

2.2.1 Vật liệu

- Nguồn phân lập vi khuẩn: M u n c thải đ ợc thu thập từ bể gom n c thải của công ty chế biến thủy sản Tân Phú Kiên Giang – số 4 đ ờng Minh H ng, ấp Hò H ng, xã Minh Hò , hu ện Châu Thành, tỉnh Kiên Giang

- M i tr ờng Indol (Harley, P et al., 2002)

- Thuốc thử: Griess A, Griess B, Diphenylamine, Nessler (Egorov NS,1986)

- Các hóa chất định l ợng nitrate, nitrite, amon (Nguy n V n Ph c, 2005)

- Bộ thuốc nhuộm Gram: Crystal Violet, Lugol, Fuchsin

2.3 Bố trí thí nghiệm : Các bước thí nghiệm được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau

Khảo sát khả n ng khử NO2trong 48h

-Qu n s t m i tr ờng đục,

sinh khí

Định tính khả n ng khử NO 3- Định tính khả n ng khử NO 2- Định tính khả n ng khử

NH4 (Nessler)

12 ống nghiệm tăng s n đều đục sinh khí, và khử hoàn toàn

NO3- và NO2- trong mô trường

Hình 2.1 S đồ tóm tắt bố trí c thí nghiệm

2.4 P ƣơng p áp ng n ứu th c nghiệm

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu

M u n c thải đ ợc lấy từu bể thu gom của nhà máy CBTS Khuấ đều

tr c khi lấy M u đ ng trong can nh 5 lit đã đ ợc rửa sạ h v đ về phòng thí nghiệm, s u đó tiến h nh ng c phân lập trong vòng 24 giờ

2.4.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng VK có khả năng phản nitrate

2.4.2.1 Phương pháp tăng sinh và phát hiện VSV có khả năng khử nitrate

 P ƣơng p áp tăng s n

T ng sinh tr n m i tr ờng Giltay có chứa nguồn C là acid citric, nguồn N là NaNO3/NaNO2 và một số chất quan tr ng kh M i tr ờng Giltay là một trong những m i tr ờng t ng sinh đặ tr ng ho VK phản nitr te Do trong m i tr ờng Giltay có chứa một l ợng l n Acid Citric (5,46875g/l) nên phải điều chỉnh pH môi

tr ờng về trung tính tr c khi sử dụng

- Để sàng l c các VK phản nitrate có khả n ng hịu mặn bổ sung vào môi

tr ờng 1.5 – 3% NaCl

- M i tr ờng tr n s u khi đ ợc chỉnh pH về khoảng 7 – 7,5 v i KOH 10%

đ ợc phân vào các ống nghiệm (5ml) có ống Durham, nút bông và nắp nh a hoặc nút bông có quấn Parafin, hấp tiệt trùng 121oC/15 phút

- M u lấy về đ ợc pha loãng bằng n c muối sinh lý (0.85%) ở các nồng độ

10-2 – 10-7 Từ mỗi nồng độ, lần l ợt lấy 1ml m u cấy vào ống nghiệm chứa

m i tr ờng Gilt đã tiệt trùng Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Ống đối chứng là

m i tr ờng không cấy m u Ủ ở nhiệt độ phòng (28±2oC) trong 7 ngày