So sánh và chọn lọc các quy trình pcr phát hiện vi khuẩn corynebacterium diptheriae

Ở Việt Nam, thời kỳ chưa thực hiện tiêm vắc xin bạch hầu trong Chương trình tiêm chủng mở rộng TCMR thì bệnh bạch hầu thường xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh, đặc biệt là ở các thàn

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CAM ĐOAN

Khóa luận tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của THS Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy (Chuyên viên nghiên cứu phòng Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn dịch, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh)

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của mình

TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đỗ Khánh Như

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ con trong 22 năm qua, cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hướng và ủng hộ con đường học tập của em

Em xin cảm ơn Thạc sĩ Võ Thị Trang Đài, Thạc sĩ Phạm Thị Hoan đã tận tâm chỉ dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Thạc sĩ Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy người luôn nhiệt tình giúp

đỡ em, luôn định hướng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn em thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này.

Đồng thời, xin cảm ơn đến chị Nguyễn Hoàng Vân Anh, anh Nguyễn Gia Kỳ, bạn Phạm Trần Diệu Huyền, Trương Khánh Duy, Lê Thị Thùy Trang, Hồ Thị Thu Trang đã hổ trợ mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất cả các bạn trên phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt quá trình làm thí nghiệm.

Em xin chân thành cảm ơn !

TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đỗ Khánh Như

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

Phần I: MỞ ĐẦU 1

Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu 3

2.1.1 Tác nhân gây bệnh 3

2.1.2 Cơ chế gây bệnh 4

2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới 5

2.1.5 Biện pháp phòng bệnh 8

2.2 Corynebacterium Diphtheriae 10

2.2.1Hình thái và cấu trúc 10

2.2.2Tính chất nuôi cấy 11

2.2.3Đặc điểm sinh hóa 12

Phần III: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 16

3.1 Vật liệu nghiên cứu 16

3.1.1Dụng cụ cần thiết 16

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 18

3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.3 Khảo sát nồng độ của mồi trong phản ứng Real time PCR 21

3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR 22

3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR 22 3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR 23

PHẦN IV: KẾT QUẢ 24

4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng PCR: 24

4.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR: 25

4.3 Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng Realtime PCR 26

4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR 27

4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR 27

4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR 28

PHẦN V: KẾT LUẬN 31

Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHẦN VII: PHỤ LỤC 34

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884

(bên trái) 11

Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980 14

Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010 15

Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới 15

Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015 16

Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dươngC.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm Xanh methylene (Nguồn: public health image library-PHLI) 18

Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert (Nguồn: public health image library-PHLI) 18

Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc trên môi trường HA (bên trái) (Nguồn: public health image library-PHLI) 19

Hình 2.8: Thử nghiệm Elek 21

Hình 4.1: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi DT1, DT2 32

Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 không bổ sung MgCl2 32

Hình 4.3: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 33

Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi DT1, DT2 33

Hình 4.8: Kết quả khảo sát nồng độ mồi trong Realtime PCR 34

Hình 4.9: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò trong Realtime PCR 35

Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu trong Realtime PCR 35

Hình 4.11: Kết quả khảo sát độ nhạy trong Realtime PCR 36

Hình 4.12: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu trong Realtime PCR 36

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu 19

Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype 20

Bảng 3.1: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng PCR 25

Bảng 3.2: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR 26

Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu 26

Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2 28

Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2 28

Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2 29

Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2 29

Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR 30

Bảng 3.9: Thành phẩn phản ứng của phản ứng Realtime PCR 30

Bảng 4.1: Kết quả chạy trên 39 mẫu 37

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Bệnh bạch hầu do khuẩn C Diphtheriae gây ra Biểu hiện lâm sàng thông

thường nhất là nhiễm trùng khu trú ở niêm mạc hô hấp, với đặc điểm là màng giả xuất hiện ở nơi nhiễm trùng Một số vi trùng có thể tạo ra độc tố, do đó nếu nhiễm độc tố, bệnh có thể diễn tiến nặng với nhiều biến chứng như viêm cơ tim, viêm dây thần kinh, viêm thận trong đó biến chứng tim gây tử vong rất cao Trong thế chiến thứ II ở Na Uy, chỉ trong vòng 2 năm sau khi Đức xâm lược số trường hợp nhiễm bệnh tăng lên đến 50000 ca [3] Ở Việt Nam, thời kỳ chưa thực hiện tiêm vắc xin bạch hầu trong Chương trình tiêm chủng mở rộng (TCMR) thì bệnh bạch hầu thường xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh, đặc biệt là ở các thành phố có mật độ dân cư cao Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm

2000 Nhưng đến năm 2015 ở tỉnh Quảng Nam dịch lại xuất hiện, phát hiện 2 ca

dương tính với vi khuẩn C.diphtheriae Năm 2016 trong vụ dịch Bình Phước phát

hiện 5 ca trong đó có 1 ca tiếp xúc dương tính với khuẩn [15]

Phương pháp nuôi cấy đang là “ Tiêu chuẩn vàng” trong phòng thí nghiệm tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian do không phải lúc nào các sinh vật sống cũng còn trong mẫu bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu

Để phân biệt các chủng bạch hầu sinh độc tố và không sinh độc tố bằng các phương

pháp nuôi cấy truyền thống là rất khó, vì C.diphtheriae và C.ulcerans giống nhau

đến 95% axit amin và nucleotic Thử nghiệm Elek cũng là một trong những phương pháp phát hiện được độc tố bạch hầu Nhưng vì tình hình bệnh ngày càng ít

đi và các sinh hóa phẩm dùng cho thử nghiệm này chỉ sử dụng riêng biệt mà lại không tận dụng được nhiều nên thử nghiệm này hiện nay ít được dùng đến hơn [13]

Sự phát triển của sinh học phân tử - phương pháp PCR giúp ích rất nhiều trong việc nghiên cứu, chữa trị cũng như kiểm soát bệnh bạch hầu Ưu điểm của phương pháp PCR là có thể phát hiện chính xác chủng bạch hầu sinh độc tố chỉ trong thời gian ngắn, độ đặc hiệu cao Để đáp ứng nhanh nhu cầu phát hiện, chẩn đoán và chữa trị, Real time – PCR ra đời rút ngắn hơn nữa thời gian xét nghiệm bệnh do chỉ thực

hiện một phản ứng cho ra kết quả chính xác vi khuẩn gây bệnh và loại bỏ được bước điện di sản phẩm của PCR chuẩn Realtime-PCR sử dụng mẫu dò giúp đọc được kết quả chính xác ngay sau khi phản ứng kết thúc Trên cơ sở đó, đề tài “ So

sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn C.diphtheriae gây bệnh bạch

hầu ” được thực hiện nhằm khảo sát chọn lọc ra phương pháp PCR phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng xét nghiệm Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu

Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884 (bên trái)

18 giờ, vượt nhanh sự phát triển của các loại vi khuẩn kèm theo Dựa trên hình thái học của cụm vi trùng trên thạch tellurite, dựa vào phản ứng lên men và khả năng tán huyết, vi khuẩn Bạch hầu được chia làm 4 biotype: mitis, intermedius, gravis và belfanti [1]

Sức đề kháng của vi khuẩn ở ngoài cơ thể rất lớn Trên các đồ vật, trực khuẩn bạch hầu sống vài ngày, trong những điều kiện thuận lợi (được chất nhày trong họng bảo vệ) vi khuẩn sống được vài tuần Trên đồ vải vi khuẩn sống được 40-50 ngày,trên cát sống được đến 100 ngày, trên các đồ chơi bằng gỗ chúng sống được 3 tháng, trên quản bút mà học sinh ngậm vào miệng đã phát hiện thấy trực khuẩn bạch hầu sau 15 ngày [1]

Tác nhân gây bệnh bạch hầu rất nhạy cảm với bất kì yếu tố hóa lý nào, ánh sáng mặt trời giết chúng sau vài giờ, ánh sáng khuếch tán giết trong vài ngày Ở nhiệt độ 60oC chúng chết sau 10 phút, dưới tác dụng của dung dịch clorua thủy ngân 1% hoặc phenol 5% chúng chết sau 1 phút [1]

2.1.2 Cơ chế gây bệnh

Người là nguồn bệnh duy nhất của vi khuẩn Bạch hầu Bệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc thân mật giữa bệnh nhân hoặc người mang vi trùng qua các chất tiết đường hô hấp hoặc qua các chất dịch ở sang thương ngoài da có chứa vi trùng gây bệnh, và trong rất ít trường hợp bệnh có thể lây qua đồ chơi của trẻ

Độc tố ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ, gây ảnh hưởng lên tất cả toàn tế bào cơ thể nhưng tác động chủ yếu trên cơ tim, trên thần kinh và trên thận Liều độc tố nhỏ hơn 0.1mg/kg có thể gây chết với các động vật nhạy cảm [5]

2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới

Theo một số tác giả Mỹ (Youmans và cộng sự 1975) bệnh thường xảy ra ở phía nam Hoa Kỳ, tại đây số đông người dân sống trong điều kiện thiếu vệ sinh

và cơ sở vật chất Môi trường sống không đủ vệ sinh tạo điều kiện thuận lợi cho các bệnh về hô hấp phát triển, người dân đa phần không được dùng vắc xin Bệnh cũng thường xảy ra ở nơi có khí hậu ẩm ướt dễ dàng cho sự phát triển bạch hầu da [3]

Thời kỳ tiền vắc xin, bạch hầu là một căn bệnh giết người hàng đầu trên thế giới Trong những năm 1940-1950, việc áp dụng phổ cập tiêm chủng cho trẻ

em ở trẻ sơ sinh đã được loại bỏ hầu hết các bệnh bạch hầu ở đa số các nước công nghiệp hóa Ở các nước đang phát triển, mức tiêm chủng cao của trẻ sơ sinh với ba liều vắc xin bệnh đậu mùa - bạch hầu (DTP) đã đạt được sau khi thực hiện Chương trình Mở rộng Chương trình Tiêm chủng Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) vào những năm 1970 [12]

Tại Belarus, Estonia, Latvia, Lithuania, Nga và Ukraine, tỷ lệ mắc bệnh bạch hầu ở người nhỏ hơn 15 tuổi dao động từ 64% đến 82% Người lớn 40-49 tuổi có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong rất cao, ở một số quốc gia, nhóm tuổi này chiếm gần một nửa số người chết Trẻ em và thanh thiếu niên ở độ tuổi đi học cũng có tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt là ở Liên bang Nga Tuy nhiên, những nhóm tuổi này có tỉ lệ tử vong thấp, số bệnh nhân tử vong xảy ra chủ yếu ở trẻ

em không được tiêm vắc xin đầy đủ Tại Moldova, các nước thuộc khu vực Caucasus (Armenia, Azerbaijan và Georgia), Trung Á (Kyrgyzstan, Tajikistan, Turkmenistan và Uzbekistan) và Kazakhstan, tỷ lệ người lớn bị bệnh dao động

từ 38% đến 59% [12]

Năm 1990, dịch bệnh bạch hầu đã tái hiện ở Liên Bang Nga, phần lớn là ở người lớn Trong giai đoạn 1991-1993, đại dịch lan rộng nhanh chóng, vào cuối năm 1994, do sự bất cập trong các biện pháp y tế cộng đồng, tất cả các Quốc gia Mới độc lập (NIS) và các quốc gia Baltic của Liên bang Cộng hòa Xã hội Chủ nghĩa Liên Xô (Liên Xô cũ) đều xảy ra dịch Dịch bệnh đạt đỉnh điểm vào năm 1994-1995, với tỷ lệ hàng năm là 17 ca / 100.000 dân và tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là 73 ca / 100.000 dân ở Tajikistan năm 1995 Từ năm 1990 đến năm

1998, 1157.000 trường hợp và 5000 trường hợp tử vong được công bố ở các quốc gia thuộc Liên Xô cũ, chiếm 180% số ca tử vong do bệnh bạch hầu ở người Ba phần tư các trường hợp được công bố từ Liên bang Nga Đây là vụ dịch bệnh bạch hầu lớn nhất kể từ những năm 1950, bắt đầu thời kỳ tiêm chủng bạch hầu mở rộng [12]

Từ năm 1980 đến năm 2011 ở Mỹ đã xảy ra 55 ca Năm 1990 dịch xảy ra ở Liên xô cũ gây tổn thất nghiêm trọng về người Năm 1994 bệnh xảy ra ở 15 quốc gia độc lập từ Liên Xô có 157.000 ca mắc và hơn 5,000 ca tử vong, nguyên nhân dẫn đến hậu quả này là do điều kiện sống của người dân không được bảo đảm, vắc xin chưa được phổ cập rộng rãi [12]

Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980

Diphtheria - United States 1940-1980

Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010

(http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/dip.html)

Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới

2.1.4 Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam

Trước khi có chương trình tiêm chủng, bệnh bạch hầu là bệnh của trẻ em, thỉnh thoảng gây dịch lẻ tẻ, do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm 2000 [15]

Đến năm 2015 bạch hầu lại xuất hiện ở Quảng Nam trong đó phát hiện hai

ca dương tính với khuẩn C.diphtheriae Năm 2016 dịch xảy ra ở Bình Phước 5

ca được xác định, 1 ca tiếp xúc dương tính với khuẩn C.diphtheriae

Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015

2.1.5 Biện pháp phòng bệnh

Đối với người nhiễm bệnh:

Bệnh xảy ra chủ yếu của trẻ nhỏ Lứa tuổi càng tăng sự nhạy cảm với bệnh càng giảm Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nếu thiếu miễn dịch bạch hầu [3] Nguy hiểm nhất là bệnh đe dọa các trẻ em nhỏ tuổi (từ 1 đến - 4 tuổi) Nhất thiết phải cách ly ở bệnh viện, ở cách li riêng biệt, khi xác định chuẩn đoán bằng xét nghiệm, nhân viên phải đeo khẩu trang, trang bị bảo hộ

an toàn Nếu điều trị sớm và đúng cách thì tỉ lệ tử vong rất thấp Phải dùng

huyết thanh chống bạch hầu ngay từ ngày đầu tiên của bệnh (trước ngày thứ 6)

Những người mang vi khuẩn không sinh độc tố có thể trở lại tập thể

và sinh hoạt như bình thường Bắt buộc phải khử trùng trong thời kì phát bệnh và thời kì khỏi bệnh, năng rửa cổ họng cho người bệnh Trước đây, người ta dùng nhiều loại thuốc (huyết thanh khô giải độc tố, trypallavis, sulfamide) nhưng không mang lại kết quả tốt, trẻ em vẫn mang vi khuẩn hàng tháng Hiện nay người ta dùng penicillin hoặc tyrotricin cho kết quả tốt hơn Chất tyrotrixin không tan trong nước, cho nên thường dùng với nước, trong glycerine hoặc trộn tyrotrixin bột với natri bitmutbazic [6] Phải khử trùng buồng và đồ vật bằng cloramin 0.5% trong 1 giờ, khử trùng bát đũa bằng cloramin 1% và đồ vải bằng cloramin 5% trong một giờ rưỡi.( Ramon, 1944)

Đối với người tiếp xúc với ca bị nhiễm bệnh:

Tất cả những người tiếp xúc với người bệnh đều phải xét nghiệm 2 lần cách nhau 2 ngày, lấy bệnh phẩm trước khi dùng thuốc súc miệng Nếu xét nghiệm có kết quả dương tính (có trực khuẩn bạch hầu sinh độc tố) thì phải theo dõi ít nhất là 7 ngày kể từ khi đưa người vào bệnh viện [6]

Tiêm ngừa phòng bệnh

Phải tiêm chủng đúng độ tuổi quy định và tiêm mũi nhắc lại cho trẻ

em Ngày nay người ta tiêm giải độc tố bạch hầu hoặc vắc xin phối hợp bạch hầu – ho gà hoặc vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – thương hàn, hay là vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – ho gà Trong chương trình tiêm chủng

mở rộng, chúng ta sử dụng vắc xin tam liên DPT có kết quả rất tốt, đến năm

2000 tỷ lệ mắc chỉ còn 0.14/100000 dân

2.2 Corynebacterium Diphtheriae

Phân loại khoa học

2.2.1Hình thái và cấu trúc

C.diphtheriae là trực khuẩn Gram dương, đường kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ

1-8µm, mảnh , cong hoặc hình chùy, không di động, không sinh bào tử, không

có vỏ, không có nha bào

Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dương C.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm

Xanh methylene (Nguồn: public health image library-PHLI)

Nhuộm Gram C.diphtheriae có hình trực khuẩn bắt màu Gram dương, hình

hơi cong, có một đầu nhỏ xếp thành hình chữ V, T, Y hay như hình hàng rào Khi nhuộm Albert vi khuẩn có hình dài, thân bắt màu xanh nhạt, có 2-3 hạt màu

đỏ tím, 2 đầu to hơn bắt màu xanh đậm.

Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert

(Nguồn: public health image library-PHLI)

2.2.2Tính chất nuôi cấy

Trực khuẩn Bạch hầu ưa các môi trường có máu, huyết thanh đông và pepton, thích hợp với pH trung tính hoặc hơi kiềm, nhiệt độ môi trường là 370C vì vậy các môi trường nuôi cấy và phân lập phải có đủ các điều kiện trên Trên môi trường thạch máu thường, khuẩn lạc mọc sau sau 24h, nhỏ, màu trắng, có thể quan

sát được tan huyết Môi trường chọn lọc cho C.diphtheriae là môi trường thạch

máu có tellurite ở 35-370C/24-48 giờ Khuẩn lạc nhỏ li ti, bắt màu xám đen

C.diphtheriae mọc sau 12-18 giờ trên môi trường huyết thanh đông Loffle, ở điều

kiện 370C (một số vi khuẩn khác mọc chậm hơn) Khuẩn lạc nhỏ, trơn, hơi đục, đường kính 1-2 mm, dễ tan trong nước muối đẳng trương

Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc trên môi trườngHA (bên trái) (Nguồn: public health image library-PHLI)

2.2.3Đặc điểm sinh hóa

Cần phân biệt bạch hầu với giả bạch hầu, dựa vào sự lên men hai loại đường glucose và sacarose, khả năng làm tan hồng cầu cừu [5]

Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu

C.diptheriae

C.hoffmanni

C.cutis

+ +

-

- +

-

+hoặc-

-

-

Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype

C.diphtheriae Tan máu tế bào

hồng cầu bò

Tan máu tế bào hồng cầu thỏ

Tính chất lên men đường

Gravis Intermedius

Mitis

-

- +

+

- +

+

-

-

2.2.4 Độc tố vi khuẩn

C.diphtheriae chủ yếu sinh ngoại độc tố, gồm có 2 phần: A là độc tố,

B là phần gắn vào các thụ cảm trên tế bào Sau khi B bám vào tế bào, quá trình phân giải protein xẩy ra giúp cho phần A xâm nhập vào tế bào, tại đó

ức chế quá trình tổng hợp chuỗi acid amin của protein

Độc tố bạch hầu ức chế sự tổng hợp protein ở tất cả các tế bào có nhân điển hình bằng việc gắn ADP vào yếu tố kéo dài 2 (EF-2) làm cho các

ribosom sẽ dịch xuống bộ ba tiếp theo để đọc mã trên RNA thông tin

Độc tố này được mã hóa bởi phage ly giải, phage này tích hợp vào trong DNA của vi khuẩn Độc tố là một protein [6]

Các chủng vi khuẩn đều sinh độc tố (ngoại độc tố), có trọng lượng phân tử 62kDa Việc sản sinh độc tố phụ thuộc vào sự có mặt của thực khuẩn thể gây ly giải mang gen mã hóa độc tố (tox +) Nó tác động lên tế bào vật chủ giải phóng gen độc tố và sản sinh độc tố Sự sản sinh độc tố tăng khi cơ thể vật chủ thiếu yếu tố sắt

Chủng vi khuẩn không có thể thực khuẩn sẽ không sản sinh độc tố do vậy không có khả năng gây bệnh Chúng có thể trở thành chủng có độc tố khi

bị nhiễm trùng với thể thực khuẩn có độc tố ly giải

Xác định độc tố vi khuẩn bằng cách tiêm truyền chuột lang, làm phản ứng trung hòa hoặc làm phản ứng Elek [5] Thử nghiệm này dựa trên sự khuếch tán kép của độc tố bạch hầu và kháng độc tố trong môi trường thạch Giấy lọc vô trùng ngâm tẩm chất kháng độc tố bạch hầu được đặc trong môi

trường nuôi cấy Cấy các chủng nghi bạch hầu theo đường thẳng vuông góc

90 ° với dải kháng độc Toxigenic C.diphtheriae được phát hiện bởi vì độc tố

tiết ra từ khu vực tăng trưởng, phản ứng với chất chống độc để tạo thành các dòng precipitin

Hình 2.8: Thử nghiệm Elek

Vi khuẩn nhạy cảm với penicillin nhưng độc tố gây ra các triệu chứng lâm sàng không bị bất hoặt bởi kháng sinh Điều trị và phòng bệnh đều phụ thuộc vào việc trung hòa độc tố Nếu trên lâm sàng có triệu chứng của bạch hầu, cần dùng kháng độc tố Bạch hầu là bệnh cấp tính, đòi hỏi xử lý sớm và nhanh kể trước khi có xét nghiệm [6]

2.3 Phương pháp PCR và Realtime PCR trong nghiên cứu phát hiện bệnh bạch hầu

Phát hiện bệnh bạch hầu phụ thuộc vào việc nuôi cấy C.diphtheriae

và thực hiện thử nghiệm Elek để xác định độc tính là chủ yếu Tuy nhiên, do quá trình bảo quản và vận chuyển số lượng vi khuẩn còn sống không phải lúc nào cũng có trong mẫu bệnh phẩm hoặc thường nằm dưới mức giới hạn phát hiện Do đó các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn phát hiện ra gen độc tố bạch hầu đang là phương pháp phổ biến nhất trong việc chẩn đoán phân tử bệnh bạch

hầu [8] PCR chuẩn phát hiện được C.diphtheriae dù tỉ lệ còn sống của vi

khuẩn trong bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển là rất ít Các nghiên cứu trước đó không đánh giá độ nhạy của PCR, một thời gian sau đó họ mới bắt đầu đánh giá độ nhạy của phương pháp này sau khi vận chuyển và lưu trữ các mẫu lâm sàng trong silica gel một thời gian dài (7-14 tháng) Ở Indonesia một nghiên cứu cho thấy rằng khi bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm trong túi silica gel, 11 trong số 17 bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng đã

được chẩn đoán bằng bạch hầu cổ họng dương tính với C.diphtheriae sau khi

chúng được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần [10] Tỉ lệ tử vong do nhiễm trùng gây ra chủ yếu là do độc tố bạch hầu, vì vậy người dùng cặp mồi DT1 Fw 5’- CGGGGATGGTGCTTCGCG-3’, DT2 Rev 5’-CGCGATTGGAAGCGGGGT-3’ trong phản ứng PCR để phát hiện gen độc

tố Nhưng độc tố bạch hầu ở C.ulcerans và C.diphtheriae giống nhau đến

95% ở nucleotide và acid amin nên PCR chuẩn phải lặp lại đến 2 lần để phân biệt được 2 chủng vi khuẩn này [14]

So sánh giới hạn phát hiện giữa Realtime PCR và các xét nghiệm PCR thường, các thử nghiệm Realtime PCR phát hiện được các nồng độ DNA thấp hơn so với các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn Với sự xuất hiện của công nghệ khuếch đại gen dò huỳnh quang mới, phương pháp này đã có thể cải thiện đáng kể hơn phương pháp PCR chuẩn Mười lăm DNA chiết xuất từ các mẫu bệnh phẩm được thu thập từ năm 1997 đến năm 1998, được lưu trữ