Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu

20 Bảng 3.2 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác ở Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau .... Không có sự khác biệt về mặt thống kê khả năng tiết en

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Mai Châm Sinh viên thực hiện : Trần Thị Ngọc Hạnh MSSV: 1151110125 Lớp: 11DSH01

TP Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố HCM nói chung và các anh chị công tác tại phòng Vi sinh nói riêng, đã tạo điều kiện cho

em tham gia làm đồ án tốt nghiệp tại đây.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Lê Thị Mai Châm, chị Nguyễn Thị Thùy Dương đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp của em tại Trung tâm

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM và quý thầy cô đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức cần thiết, bổ ích để chúng em có thể hoàn thành tốt quá trình học tập của mình Cuối cùng em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn đồng hành và ủng hộ

em trong suốt quá trình này

XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN

TP.HCM, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện

Trần Thị Ngọc Hạnh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của cá nhân Các kết quả và

số liệu trong đồ án là trung thực

Người cam đoan

Trần Thị Ngọc Hạnh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Vòng đời 3

1.1.3 Cấu tạo trứng của tuyến trùng 4

1.1.4 Cấu tạo thành cơ thể con cái của tuyến trùng 5

1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum 5

1.2.1 Phân loại 5

1.2.2 Điều kiện sống 6

1.2.3 Đặc điểm hình thái 7

1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng 8

1.2.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào 8

1.2.6 Độc tố của P lilacinum 10

1.2.7 Quá trình kí sinh 11

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 12

2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu 12

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị 12

2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu 12

2.2.3 Hóa chất 14

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase của nấm P lilacinum 16

2.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng xâm nhập trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp của nấm P lilacinum 18

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P lilacinum 20

3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease 20

3.1.2 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm P lilacinum 26

3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp của các chủng nấm P lilacinum 30

3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp của các chủng nấm P lilacinum 31

3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên tuyến trùng cái Meloidogyne spp. 36

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

4.1 Kết luận 39

4.2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở

Vũng Tàu 12

Bảng 3.1 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất rừng ở

Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau 20

Bảng 3.2 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác ở

Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau 22

Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease của các chủng P lilacinum phân lập từ đất

rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau 25

Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất rừng ở Vũng

Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau 26

Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất canh tác ở Vũng

Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau 27

Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase của các chủng P lilacinum phân lập từ đất

rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau 30

Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp của các chủng

nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu 32

Bảng 3.8 Mức độ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp của các chủng

P lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời

gian khác nhau 35

Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh trên con cái Meloidogyne spp của các chủng nấm P

lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu 36

Bảng 3.10 Mức độ ký sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne spp của các chủng P

lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian

khác nhau 38

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm P lilacinum phân

lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian 24

Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm P lilacinum phân

lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian 29

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh khối trứng trung bình của các chủng nấm P lilacinum

phân lập ở đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau 34

Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp trung bình của các chủng nấm

P lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau.

37

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh thực vật 3

Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng cái Meloidogyne sp 5 Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường

PDA 7

Hình 1.4 Hình thái cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P lilacinum 7

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin 11 Hình 3.1 Vòng phân giải casein của chủng PB 2.10 trong các khoảng thời gian 24

giờ; 48 giờ và 72 giờ 21

Hình 3.2 Vòng phân giải casein của chủng PB 1.1, PB 1.10, PB 3.1 ở 48 giờ 21 Hình 3.3 Vòng phân giải casein của chủng KL 5.3 và KL 6.2 và KL 5.2 ở 72 giờ 24

Hình 3.4 Vòng phân giải casein của các chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng và

đất canh tác sau 24 giờ , 48 giờ, 72 giờ 25

Hình 3.5 Vòng phân giải chitin của chủng PB 3.3 sau 24 giờ , 48 giờ , 72 giờ 27 Hình 3.6 Vòng phân giải chitin của chủng HT 5.1 sau 24 giờ , 48 giờ, 72 giờ 29

Hình 3.7 Quá trình khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp bị nấm P lilacinum ký

sinh hình dạng khối trứng ban đầu, nấm tiếp xúc khối trứng, khối trứng bị kí sinh 33

Hình 3.8 Quá trình tuyến trùng cái Meloidogyne spp bị nấm P lilacinum ký sinh

hình dạng con cái ban đầu, nấm bắt đầu ký sinh, con cái bị kí sinh 37

Meloidogyne spp trực tiếp trên đĩa Petri

Kết quả, tất cả các chủng nấm Purpureocillium lilacinum đều có khả năng

tiết enzyme ngoại bào và khả năng tiết enzyme protease mạnh hơn so với chitinase Đối với enzyme chitinase, đường kính vòng phân giải cơ chất tối ưu nhất đạt được sau 48 giờ Các chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh là PB 3.3, HT 5.1, KL 6.2

và KL 5.3 Đối với enzyme protease thì các chủng nấm khảo sát có khả năng tiết mạnh nhất sau 72 giờ Các chủng có khả năng phân hủy casein mạnh là PB 2.10, PB 1.3, KL 5.3 và KL 6.2 Không có sự khác biệt về mặt thống kê khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh tác Kết quả thử nghiệm ký sinh tuyến trùng cho thấy, tất cả các chủng nấm khảo sát PB 1.1, PB 1.3,

PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3 đều có thể ký sinh con cái Meloidogyne spp nhanh và

mạnh hơn so với khối trứng của nó

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Tuyến trùng ký sinh trên thực vật gây ra thiệt hại đáng kể về mặt kinh tế đối với nhiều loại cây trồng có giá trị thương nghiệp Hàng năm, tuyến trùng gây tổn thất 11% năng suất các loại cây ngũ cốc, rau ăn lá, chuối, khoai mì, dừa, khoai tây,

củ cải đường, mía đường, khoai lang, làm giảm 15% năng suất các loại cây trồng kinh tế quan trọng (Agrios, 2005) Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, tuyến trùng phát triển khá mạnh và gây tác hại nặng nề cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều vùng, đặc biệt là rau và các loại cây công nghiệp trong đó có cây hồ tiêu Cây hồ tiêu là cây công nghiệp dài ngày, có giá trị kinh tế, được trồng ở nhiều nơi và có giá trị xuất khẩu cao trên thế giới Diện tích đất canh tác ở Vũng Tàu chiếm 9047 ha, trong đó có khoảng gần 0,5% diện tích đất trồng bị nhiễm bệnh nguyên nhân là do tuyến trùng gây nên Việc dùng thuốc hóa học để tiêu diệt tuyến trùng hại thực vật kéo theo các tác động tiêu cực đến môi trường và an toàn sức khỏe cho con người

và vật nuôi Bên cạnh đó, nó còn tăng tính kháng thuốc của sâu hại, làm cho việc phòng trừ ngày càng khó khăn hơn Vì vậy, hiện nay người ta đang tìm kiếm các tác nhân sinh học để sử dụng thay thế một phần hoặc hoàn toàn thuốc hóa học trong kiểm soát tuyến trùng gây hại Do đó việc nghiên cứu tìm ra các chủng nấm có khả năng ký sinh tuyến trùng là vấn đề đang được quan tâm hiện nay

Nấm Purpureocillium đã được chứng minh có khả năng ký sinh tuyến trùng

hiệu quả và sống hoại sinh trong vùng rễ nhiều loại cây trồng Chúng đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phân lập hay xác

định khả năng ký sinh tuyến trùng của nấm Purpureocillium còn rất hạn chế đặc

biệt là các chủng nấm được phân lập ở vùng Đông Nam Bộ Do đó, năm 2014, Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp Hồ Chí Minh đã xác định sự phân bố của nấm này ở các hệ sinh thái đất (đất tự nhiên-đất rừng, đất canh tác-đất trồng) ở vùng này Kết quả cho thấy nấm xuất hiện ở hầu hết các vùng, trong đó có hệ sinh thái rừng ngập mặn ở Vũng Tàu Việc xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm này là rất cần thiết có thể giúp ích trong việc kiểm

soát bệnh do tuyến trùng gây ra trong tương lai Do đó dẫn đến lý do chọn đề tài:

“Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng

của một số chủng nấm Purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất

canh tác ở Vũng Tàu”

Mục tiêu nghiên cứu: So sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào, xâm nhập con cái

và khối trứng Meloidogyne spp của các chủng nấm Purpureocillium lilacium (P lilacinum) phân lập được từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Đây là nghiên cứu đầu tiên về xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào cũng

như kí sinh tuyến trùng của các chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng ngập mặn và đất canh tác ở Vũng Tàu Từ đó, xác định được hệ sinh thái đất (đất rừng

hay đất canh tác) tồn tại những chủng nấm P lilacinum có đặc tính tốt.

Ý nghĩa thực tiễn

So sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và khả năng xâm nhập tuyến trùng

của các chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác giúp chọn lọc được chủng nấm kí sinh tuyến trùng hiệu quả nhằm ứng dụng chúng để phòng trừ tuyến trùng gây hại cây trồng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp

1.1.1 Phân loại

Meloidogyne spp là tuyến trùng ký sinh thực vật Chúng tồn tại trong đất ở

nơi có khí hậu nóng hay có mùa đông ngắn Khoảng 2000 loài thực vật bị nhiễm loại tuyến trùng này, nó chiếm 5% trong nguyên nhân gây mất mùa trên thế giới (Sasser, 1985) Ấu trùng xâm nhập vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, hấp thụ chất dinh dưỡng của thực vật Gây ra hiện tượng chết ở cây con và giảm năng suất ở cây trưởng thành khi xâm nhập vào cây Phân loại theo Goeldi (1889) như sau:

Tuyến trùng rễ bắt đầu vòng đời ở giai đoạn trứng phát triển thành ấu trùng tuổi 1 Giai đoạn này ấu trùng sống trong túi trứng và lột xác chuyển sang giai đoạn

ấu trùng tuổi 2 Ấu trùng ở thời kỳ này có thể bắt đầu xâm nhập vào rễ thực vật, chúng tấn công vào chóp rễ rồi đi vào các gian bào Ấu trùng di chuyển đến các tế bào đang phân chia để tạo vị trí lấy thức ăn bằng cách tiêm dịch tiết của tuyến thực quản vào trong các tế bào rễ Những dịch được tiết ra này là nguyên nhân gây ra sự thay đổi các chức năng sinh lý của tế bào ký sinh Ấu trùng tuổi 2 chưa có cơ quan sinh sản Giống với giun tròn, tuyến trùng rễ trải qua 4 giai đoạn ấu trùng, trong mỗi giai đoạn chúng lột xác giống như côn trùng Nhờ vậy ấu trùng có một vài nét tương đồng với tuyến trùng đực và cái ở giai đoạn trưởng thành Ở giai đoạn tuổi 4, là quá trình từ ấu trùng chuyển sang dạng hình cầu ở con cái trưởng thành hay dạng giun của con đực trưởng thành có thể nhìn thấy rõ ràng hơn Con cái trưởng thành có thể

đẻ từ 500 đến hơn 1000 trứng

Chiều dài của vòng đời tuyến trùng rễ khác nhau tùy theo mỗi loài, nhưng ngắn nhất là trong khoảng 2 tuần Các loài ở những vùng lạnh hơn thì vòng đời sẽ dài hơn Trứng của tuyến trùng có thể ở nguyên trong rễ hay lẫn vào trong đất Trứng nở một cách ngẫu nhiên, không cần tiếp xúc với các dịch chiết ở rễ Trong điều kiện thuận lợi, trứng có thể tồn tại trong đất ít nhất trong vòng 1 năm (Mitkowski và cộng sự, 2003)

1.1.3 Cấu tạo trứng của tuyến trùng

Tuyến trùng cái đẻ trứng vào chất nền gelatin được sản xuất bởi 6 tuyến trực tràng, và được tiết ra trước và trong suốt quá trình đẻ trứng Hình dạng chất nền ban đầu là ống thông qua các lớp ngoài của mô rễ bao quanh trứng, tạo thành một lớp bảo vệ chống mất nước bằng cách duy trì một mức độ ẩm cao quanh trứng (Bird, 1887)

Cấu tạo của trứng tuyến trùng: lớp vỏ trứng là phần bền nhất của trứng tuyến trùng, có vai trò trong việc chống lại các tác nhân bất lợi về mặt hóa học và sinh học (Wharton, 1980) Vỏ trứng của tuyến trùng có thể bao gồm từ một đến năm lớp tùy thuộc theo từng bộ tuyến trùng Cấu trúc thường thấy nhất của vỏ trứng gồm: lớp

trong cùng là lớp lipid, một lớp chitin ở chính giữa (thành phần chính) và lớp màng vitelline ở ngoài cùng (Bird và cộng sự, 1976) Lớp chitin đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra một cấu trúc bền vững để bảo vệ cho lớp lipid trong cùng Lớp lipid bao gồm một chuỗi màng lipoprotein và dày nhất trong khoảng 0,02 – 0,04

µm, có vai trò trong việc chống thấm để bảo vệ trứng khỏi các tác nhân hóa học bất lợi (Wharton, 1980) Nếu lớp chitin bị loại bỏ thì lớp lipid cũng dễ dàng bị phá hủy

1.1.4 Cấu tạo thành cơ thể con cái của tuyến trùng

Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng cái Meloidogyne sp

(Nguồn: www.lsuagcenter.com )

Con cái của tuyến trùng Meloidogyne spp hình cầu với cổ ngắn chứa kim hút

(nên gần giống với hình quả lê), diều giữa và tuyến thực quản (Mitkowski và cộng

sự, 2003) Thành cơ thể của tuyến trùng cái được bao bọc bởi lớp cutin chứa rất ít

chitin mà chủ yếu là protein và collagen (Watson, 1965) Lớp cutin Meloidogyne incognita dày khoảng 1,5 µm bao gồm lớp vỏ, lớp trung gian và lớp cơ bản Lớp vỏ

được phân tối thiểu thành 5 lớp và có dộ dày khoảng 0,1 µm, lớp giữa thì khoảng 0,4 µm và lớp cơ bản là 0,5 µm (Baldwin và cộng sự, 1975)

1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum

1.2.1 Phân loại

P lilacinum được mô tả lần đầu bởi nhà nghiên cứu nấm người Mỹ Charles Thom vào năm 1910, dưới tên gọi Penicillium lilacinum (Thom, 1910) Phân loại giống với chủng Penicillium amethystinum của Wehmer và Spicaria rubidopurpurea

của Aoki (Thom, 1974) Năm 1974, Robert A Samson chuyển tên Penicillium lilacinum thành Paecilomyces (Samson, 1974) Các ấn phẩm được xuất bản trong những năm thập niên 20, chỉ ra rằng chi Paecilomyces không phải là một đơn ngành (Inglis và cộng sự, 2006), và có họ hàng gần với các chủng Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis và Nomuraea atypicola Chi mới Purpureocillium được tạo ra để giữ sự phân loại này (Sung và cộng sự, 2007) là tên

chung dùng để chỉ các loại nấm sản sinh bào tử tím (Luangsa-Ard và cộng sự, 2011)

P lilacinum được phân loại là nấm sinh sản vô tính bằng bào tử theo loài

Isarioidea, và đã được chấp nhận ở khắp nơi trên thế giới, do dạng sinh sản hữu tính

hiếm khi được tìm thấy Phân tích phát sinh loài cho thấy P lilacinum phân lập được

có mối quan hệ gần với Trichoderma, Gliocladium và Hypocrea hơn các loài Paecilomyces kí sinh côn trùng khác trong bộ Hypocreales (Inglis và cộng sự, 2006)

Nấm này được phân loại theo Samson và cộng sự (2011) như sau:

Nấm P lilacinum là nấm sợi hoại sinh phổ biến, đã được phân lập từ một loạt

các môi trường sống như đất trồng trọt, đất bỏ hoang, rừng đồng cỏ, sa mạc, trầm tích ở cửa sông và bùn thải Nó cũng được tìm thấy trên trứng của tuyến trùng và con cái của tuyến trùng gây nốt sần ở rễ cây Bên cạnh đó, nó cũng được tìm thấy ở vùng rễ của nhiều loại cây trồng

Nhiều loài có thể phát triển trên một phạm vi nhiệt độ rộng trong khoảng từ

8oC đến 38o

C và phát triển tối ưu ở nhiệt độ từ 26oC đến 30o

C Nấm này có thể chịu

được một khoảng pH rộng và có thể phát triển trên nhiều loại môi trường tự nhiên (Samson, 1974; Anderson và cộng sự, 1995)

1.2.3 Đặc điểm hình thái

Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA

(Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) Khuẩn lạc của P lilacinum trên môi trường thạch Malt tăng trưởng khá nhanh

đạt đường kính 5 – 7 cm trong vòng 14 ngày ở 25o

C (77oF), gồm dạng nền bông với

hệ sợi nấm dinh dưỡng tăng trưởng nhanh, ban đầu màu trắng nhưng khi hình thành bào tử thì chuyển sang màu tím Mặt khác, có một số chủng đôi khi không có màu nhưng thường thì đều có màu tím (Samson, 1974)

Hình 1.4 Hình thái cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P lilacinum

(Nguồn: http://thunder-house4-yuri.blogspot.com/2012_06_01_archive.html)

P lilacinum tạo thành một hệ sợi nấm dày đặc sản sinh ra cuống bào tử đính

Sợi nấm sinh dưỡng có vách trơn, trong suốt, rộng từ 2,5 – 4 µm Cuống bào tử được sinh ra từ các sợi nấm cơ chất, hoặc những sợi nấm dinh dưỡng, dài khoảng

400 – 600 µm Thể bình phình ra ở gốc và thon dần về phía ngọn Bào tử trần được

sinh ra tạo thành chuỗi dài, ở phía cuối thể bình gắn trên cuống bào tử Bào tử nảy mầm khi có đủ độ ẩm và dinh dưỡng thích hợp Bào tử trần có dạng elip đến hình thoi, có vách trơn hơi nhám Không xuất hiện bào tử đảm (Samson, 1974)

1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Nấm không có diệp lục tố nên cần cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (dị dưỡng) sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong trứng và

tuyến trùng Meloidogyne spp.) hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ Do trứng và tuyến

trùng là nguồn hữu cơ phức tạp nên nấm sẽ tiết ra enzyme ngoại bào (protease, chitinase) để phân giải các chất khó hấp thụ thành những chất đơn giản dễ sử dụng (Nguyễn Văn Bá và cộng sự, 2005)

1.2.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào

Vỏ trứng được cấu tạo từ 3 lớp khác biệt và thành phần chính gồm protein và chitin, đã tạo thành cấu trúc dạng sợi nhỏ chứa glycoprotein ở dạng vô định hình (Perry, 2002) Chitinase và proteases đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình xâm nhập vào vỏ trứng, và tác động vào sự phân hủy của vỏ trứng (Morton, 2003; Segers, 1996) Nấm có khả năng tiết enzyme ngoại bào (đặt biệt là enzyme protease, chitinase và collagenase) có ảnh hưởng nhiều trong việc ký sinh lên trứng của tuyến trùng (Huang, 2004)

P lilacinum có khả năng tiết enzyme serine protease và chitinase để tham gia

vào quá trình phá hủy vỏ trứng của tuyến trùng (Morgan và cộng sự, 1984; Khan và

cộng sự, 2004) Nhiều enzyme được tiết bởi P lilacinum đã được nghiên cứu Enzyme serine protease cơ bản có khả năng phân hủy sinh học trứng Meloidogyne hapha (Bonants và cộng sự, 1995) Một chủng P lilacinum đã được phân lập và

nghiên cứu có khả năng tiết enzyme protease và chitinase làm mỏng vỏ trứng tuyến

trùng Meloidogyne javanica để cho móc xâm nhiễm có thể đâm xuyên qua vỏ trứng

(Khan và cộng sự, 2004)

Enzyme protease

Enzyme protease (còn gọi là peptidase hay proteinase) là nhóm enzyme có khả năng phân giải protein Đó là quá trình chuyển hóa protein bằng cách cắt các liên kết peptide (-CO-NH-) liên kết các acid amin trong một chuỗi polypeptide Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin proteinase - những proteinase chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng Cysteine proteinase - chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng Aspartic proteinase - chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động Các aspartic thường hoạt động mạnh ở pH trung tính Metallo proteinase - được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)

Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994) Bước 1 - hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine Bước 2 (khử acyl hóa) phức hệ acyl-enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme

Enzyme chitinase

Chitinase là enzyme thủy phân liên kết glycoside trong chitin (Jolles, 1999) Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, 1-4-β- chitobiosidase, N-acetyl-β- D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase Endochitinase là enzyme phân cắt

nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn olygosaccharides Chitin chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer chitobiose N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin

1,4-β-từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D- glucosamine Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân

tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3]

từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2, β-N-acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc) Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên

cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm (Lê Thị Huệ, 2010)

methylbutyl]carbomoyl]-3-methyl-butyl]carbomoyl]propan-2-ycarbomoyl]-2-hydroxy-3-methyl-butul] [(E.4S)-4-methylhex-2-enoyl]pyrrolidin-2-carboxamide (Nevalainen và cộng sự, 1977)

carbomyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo-nonyl]-4-methyl-1-Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B Tùy từng loài

khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin Các hợp chất chuyển hoá thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin

1.2.7 Quá trình kí sinh

Nấm xâm nhập vào trứng và con cái của tuyến trùng thông qua chất nền gelatin của trứng và lỗ sinh dục hay cổ của tuyến trùng cái Một khi vào bên trong, sợi nấm sẽ phân nhánh và đâm xuyên qua bề mặt vỏ trứng Chỗ phình ra ở đầu sợi nấm sẽ tạo ra những đĩa áp tiếp xúc với bề mặt trứng Móc xâm nhập được tạo nên bên dưới sợi áp sẽ đâm xuyên và mọc bên trong vỏ trứng Trứng bị xâm nhiễm sẽ phình ra và biến dạng Sau đó, lớp màng vitelline chia thành ba vùng, xuất hiện một lượng lớn không bào và lớp lipid hầu như biến mất (Esser và cộng sự, 1993) Khi sợi nấm đã xâm nhập vào trứng, nó nhanh chóng tiêu diệt các ấu trùng bên trong trước khi tiến ra khỏi vỏ trứng rỗng để sản sinh bào tử đỉnh và mọc về phía các trứng liền kề Ở con cái trưởng thành giai đoạn bị nhiễm nấm là khi sợi nấm tiến vào lỗ sinh dục hoặc hậu môn (Jatala và cộng sự, 1979)

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 4 – tháng 8 năm 2015

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Vi sinh – Trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu

2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu

Vật liệu: Khối trứng và tuyến trùng cái Meloidogyne spp được thu nhận từ rễ

cây

Đối tượng: 38 chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở

Vũng Tàu do Phòng Công nghệ Vi sinh của Trung Tâm Công nghệ sinh học cung cấp.

Bảng 2.1 Các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở

Môi trường cảm ứng enzyme chitinase

K2HPO4.3H2O 1,4 g

CaCl2.2H2O 0,4 g

MgSO4.7H2O 0,41 g

Cách chuẩn bị chitin huyền phù 1%: 1g bột vỏ tôm được cho dần vào 20 ml

HCl đậm đặc, để ở 4oC và khuấy đều qua đêm Thêm vào hỗn hợp 200 ml ethanol lạnh (-20oC) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm Ly tâm hỗn hợp ở 5000 vòng/ phút, trong 20 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi pH trung tính Thêm nước cất vào tủa cho đến thể tích 100 ml (Dai và cộng sự, 2011)

Môi trường Water Agar (WA)

Cách pha: Hòa tan KI trong cối với 5 - 10 ml nước cất Thêm Iod tinh thể vào

và nghiền cho đến khi hòa tan hoàn toàn Cho dung dịch nghiền vào cốc đong và thêm nước cất đến 300 ml Bảo quản trong lọ màu và chỉ trong vòng 30 ngày trước khi sử dụng (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase

của các chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu

- So sánh khả năng xâm nhập con cái và khối trứng Meloidogyne spp của các

chủng nấm P lilacinum này

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase của nấm

P lilacinum

Nguyên tắc

Đối với enzyme protease: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung

casein 1%, nấm sẽ tiết ra enzyme protease phân giải casein thành các amino acid Các dạng amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 10%, chỉ có casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 10%

Đối với enzyme chitinase: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung

chitin, nấm sẽ tiết ra enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc

mạch ngắn hơn và N-acetyl- D- glucosamine Các dạng này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm sợi Phương pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp chitinase chứ chưa xác định chính xác hoạt độ chitinase (Lê Thị Huệ, 2010)

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 38 chủng nấm khảo sát Thực hiện trên đĩa Petri chứa môi trường có chứa cơ chất cảm ứng enzyme cần khảo sát và lặp lại 3 lần cho mỗi chủng nấm ứng với mỗi mốc thời gian khảo sát (24, 48, 72 giờ)

Thực hiện

Cấy nấm từ ống giống vào môi trường thạch PDA trong đĩa Petri bằng phương pháp cấy điểm rồi đem ủ trong 7 ngày Sau đó, cấy chuyển nấm từ môi trường PDA qua môi trường thạch WA trong đĩa Petri đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày để sợi nấm phát triển Tiếp theo, đổ môi trường đã hấp khử trùng có chứa cơ chất cảm ứng phù hợp với enzyme cần khảo sát vào đĩa Petri (9 ml môi trường / đĩa) và để nguội

Sử dụng dụng cụ khoan thạch 5 mm để đục các tản thạch có chứa tơ nấm trên môi trường WA, rồi dùng dao cấy chuyển các tản thạch này vào môi trường có chứa cơ chất cảm ứng bằng phương pháp cấy úp ngược đĩa thạch để tránh hiện tượng phát tán bào tử ra xung quanh môi trường Đem ủ ở nhiệt độ phòng, rồi nhỏ thuốc thử phù hợp với từng loại enzyme cần khảo sát (TCA 10% đối với enzyme protease và lugol đối với enzyme chitinase) sau 24, 48, 72 giờ để xác định vòng phân giải cơ chất

Chỉ tiêu theo dõi

Đo đường kính khuẩn lạc (d, mm) và đường kính vòng phân giải cơ chất (D, mm) sau các khoảng thời gian 24, 48, 72 giờ sau khi cấy

Xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm dựa vào hiệu D -

d (mm)

Đối với enzyme protease:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nghiệm thức là số chủng

nấm P lilacinum có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh ở hai vùng và được lặp

lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức Mỗi lần lặp lại tiến hành trên 3 - 4 con cái hay khối trứng đặt trong đĩa Petri chứa môi trường WA mềm

Thực hiện

Theo phương pháp cải tiến của Stirling và West (1991), thu nhận trứng và con cái từ các nốt sần của rễ tiêu Rửa qua trứng và con cái vài lần bằng nước cất đã được hấp khử trùng để loại bỏ chất bẩn, rồi đặt chúng lên khăn giấy vô trùng Sử dụng dụng cụ khoan lỗ thạch đục các tản thạch có chứa sinh khối nấm đã được nuôi cấy sau 7 ngày trên môi trường PDA sao cho các tản nấm được đục nằm trên cùng một vòng tròn để nấm trên các miếng thạch được tương đồng với nhau Rồi, dùng dao cấy chuyển các tản nấm lên môi trường WA mềm chứa trong đĩa Petri đã chuẩn

bị trước đó Đồng thời, đặt các khối trứng hoặc con cái xung quanh tản nấm này Đem để ở nhiệt độ phòng và tiến hành quan sát để kiểm tra khả năng ký sinh (Stirling và cộng sự, 1991)

Chỉ tiêu theo dõi

Tính số con cái hay khối trứng bị nấm ký sinh sau mỗi 24 giờ Thí nghiệm này

sẽ kết thúc khi có một chủng nấm ký sinh hoàn toàn số con cái hay khối trứng trong một thí nghiệm Dùng thuốc nhuộm LPCB để quan sát sự xâm nhập của sợi nấm vào trứng và con cái

Xác định khả năng ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm theo công thức: Tỷ

lệ con cái hay khối trứng được ký sinh trên tổng số con cái hay khối trứng có trong một đĩa Theo đó,

Tỷ lệ ký sinh trên 75%: ký sinh mạnh

Tỷ lệ ký sinh từ 50 - 75%: ký sinh khá

Tỷ lệ ký sinh từ 25 - 50%: ký sinh trung bình

Tỷ lệ ký sinh nhỏ hơn 25%: ký sinh yếu

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Tính hiệu D-d và tỷ lệ ký sinh tuyến trùng bằng chương trình Excel 2007 Sau

đó xử lý số liệu bằng phần mềm xử lý thống kê SAS 9.0 Phân loại số liệu theo LSD0,05

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P lilacinum

3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease

Để đánh giá sơ bộ khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu, ta sử dụng phương pháp 2.3.1 Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2

Bảng 3.1 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất rừng ở

Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau

Dựa vào bảng kết quả 3.1, có thể thấy các chủng nấm phân lập ở đất rừng Vũng Tàu đều có khả năng tiết enzyme protease Xét theo thời gian, thấy không có

sự khác biệt về khả năng tiết enzyme ngoại bào ở 48 giờ và 72 giờ Ở thời gian đầu nuôi cấy, các chủng nấm này phân hủy cơ chất yếu nên vòng phân giải chỉ đạt 6,481

mm do đây là giai đoạn thích nghi khi nấm mới vừa được cấy vào môi trường có chứa cơ chất cảm ứng nên lượng enzyme được tiết ra để phân giải casein còn ít Xét riêng theo từng chủng, có thể thấy PB 2.10 có khả năng tiết enzyme protease mạnh nhất, tiếp theo là chủng PB 1.3 và yếu nhất là chủng PB 2.9 Và chủng PB 2.10 cũng là chủng có khả năng phân giải cao nhất sau 48 và 72 giờ Ngoài ra ở 48 giờ chủng PB 1.1 và PB 1.10 cũng tiết enzyme mạnh Nhìn chung, chủng PB 3.3 phân hủy cơ chất yếu nhất ở 24 giờ

Hình 3.1 Vòng phân giải casein của chủng PB 2.10 trong các khoảng thời gian 24 giờ

(A); 48 giờ (B) và 72 giờ (C)

Hình 3.2 Vòng phân giải casein của chủng PB 1.1 (A), PB 1.10 (B), PB 3.1 (C) ở 48 giờ

Bảng 3.2 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác ở

Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau

HT 1.3 7,687l-y 10,290a-d 7,333m-b 8,437B-E

HT 2.1 5,370e-k 6,066z-i 6,790s-e 6,076KLM

HT 2.2 6,197y-h 7,013p-d 7,530l-z 6,913H-K

HT 2.3 8,373f-s 7,223n-b 10,363a-d 8,653ABC

HT 3.1 7,507a-z 9,600b-h 6,967q-e 8,024C-G

HT 3.2 6,943q-e 4,370jk 4,500ijk 5,271M

HT 3.3 8,553e-q 10,370a-d 6,950q-e 8,624A-D

Hình 3.3 Vòng phân giải casein của chủng KL 5.3 (A) và KL 6.2 (B) và KL 5.2 (C) ở 72

giờ

Biểu đồ 3.1 Vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm

P lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian

Theo biểu đồ 3.1, nhìn chung, có thể thấy ở các mốc thời gian khảo sát, vòng phân giải casein trung bình của các chủng phân lập từ đất canh tác lớn hơn so với đất rừng nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê Nguyên nhân là

do khả năng tiết enzyme ngoại bào protease giữa các chủng trong cùng một vùng không đồng đều Cụ thể, ở thời gian 24 giờ có 3,45% các chủng phân lập từ đất canh tác có khả năng tiết enzyme mạnh, 37,93% có khả năng tiết enzyme khá và không có chủng nào tiết enzyme yếu Trong khi đó, hầu hết các chủng phân lập từ đất rừng có khả năng phân hủy cơ chất ở mức độ khá (bảng 3.3) Sự khác biệt này

có thể là do các chủng nấm phân lập từ đất canh tác đã quen với môi trường có chứa các hợp chất có bản chất protein Ở mốc thời gian 48 giờ, số chủng nấm phân hủy

cơ chất ở mức độ mạnh, khá, trung bình tương đương nhau ở cả hai vùng Tuy nhiên, tỷ lệ phần trăm số chủng tiết enzyme ở mức độ yếu ở đất canh tác ít hơn so với đất rừng Ở 72 giờ, hầu hết các chủng phân lập ở đất rừng có khả năng tiết enzyme khá và không có chủng nào tiết enzyme yếu Trong khi đó, khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng ở đất canh tác yếu hơn so với thời gian 48 giờ Sự khác biệt này có thể là do các chủng nấm phân lập từ đất canh tác đã quen với môi trường có chứa cơ chất bản chất là protein nên khi phát triển qua một thời gian nấm

đã điều tiết lượng enzyme vừa đủ để phân giải cơ chất, còn các chủng phân lập từ đất rừng đã qua giai đoạn thích nghi nên phân hủy cơ chất mạnh hơn

Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease của các chủng P lilacinum phân lập từ đất

rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau

Thời gian Vùng lấy mẫu Số chủng Tỷ lệ (%) chủng nấm tiết enzyme

Hình 3.4 Vòng phân giải casein của các chủng P lilacinum phân lập từ đất rừng và đất

canh tác sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C)

3.1.2 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm P lilacinum

Để đánh giá sơ bộ khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ta sử dụng phương pháp 2.3.1 Kết quả thu được tương ứng với bảng 3.3 và 3.4

Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất rừng ở Vũng

Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau

Chủng Vòng phân giải chitin theo thời gian (D-d (mm))

chung, chủng PB 3.3 có khả năng tiết enzyme mạnh nhất và thấp nhất là chủng PB 1.7 Và chủng PB 3.3 cũng phân giải cơ chất mạnh nhất ở 48 giờ, tiếp theo là chủng

PB 2.9 và thấp nhất là chủng PB 3.1 ở 72 giờ

Hình 3.5 Vòng phân giải chitin của chủng PB 3.3 sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C)

Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất canh tác ở Vũng

Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau

Chủng Vòng phân giải chitin theo thời gian (D-d (mm))

Ở bảng 3.5, khi xét theo trung bình, chủng HT 5.1 tiết enzyme chitinase mạnh nhất (7,462 mm), tiếp theo là HT 2.2 (5,177 mm) và thấp nhất là chủng KL 1.4 (2,177 mm) Xét theo thời gian khảo sát, chủng có đường kính vòng phân giải cơ chất lớn nhất là HT 5.1 ở thời gian 72 giờ, tiếp theo là HT 1.1 ở 48 giờ và thấp nhất

là KL 5.2 ở 72 giờ

Hình 3.6 Vòng phân giải chitin của chủng HT 5.1 sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C)

Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm

P lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian

Dựa theo biểu đồ 3.2, nhìn chung, vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm phân lập ở đất canh tác lớn hơn so với các chủng ở đất rừng Tuy nhiên,

sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê là do khả năng tiết enzyme của các chủng trong từng vùng không đồng đều

Sau 24 giờ nuôi cấy, tất cả các chủng phân lập ở đất rừng chỉ tiết enzyme ở mức độ yếu (bảng 3.6) Còn các chủng ở đất canh tác tiết enzyme mạnh đạt 6,89%, trung bình là 44,83% còn lại là ở mức độ yếu Ở 48 giờ, không có chủng nấm nào tiết enzyme yếu Hầu hết các chủng phân lập từ đất canh tác tiết enzyme mạnh, trong khi các chủng ở đất rừng có mức độ tiết enzyme khá Sau 72 giờ, hầu hết các

chủng điều phân giải cơ chất ở mức độ yếu Trong đó, không có chủng nào ở đất rừng tiết enzyme mạnh, còn tỷ lệ các chủng mạnh ở đất canh tác chiếm 10,34%

Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase của các chủng P lilacinum phân lập từ đất

rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau

Thời gian Vùng lấy mẫu Số chủng Tỷ lệ (%) chủng nấm tiết enzyme

Tuyển chọn các chủng P lilacinum có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh

Qua kết quả thu được từ các bảng trên, có thể thấy được các chủng nấm phân lập từ đất rừng hay đất canh tác đều có khả năng tiết enzyme protease và chitinase Tuy nhiên khả năng tiết enzyme protease mạnh hơn so với chitinase

Tiêu chí chọn chủng là phải có khả năng tiết enzyme protease hoặc chitinase mạnh nhất hay tiết hai loại enzyme này đều mạnh Theo đó, các chủng nấm phân lập từ đất rừng được tuyển chọn: PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10 và PB 3.3 Trong đó, chủng tiết enzyme chitinase mạnh nhất là PB 3.3 và chủng tiết enzyme protease mạnh nhất là PB 2.10 Các chủng nấm được phân lập từ đất canh tác được tuyển chọn: KL 5.3, KL 6.2, HT 3.3 và HT 5.1 Trong đó, chủng HT 5.1 có khả năng tiết enzyme chitinase mạnh nhất, chủng KL 5.3 và KL 6.2 tiết enzyme protease mạnh nhất

3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh khối trứng và con cái tuyến trùng

Meloidogyne spp của các chủng nấm P lilacinum

Chúng tôi chọn các chủng nấm PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3, KL 5.3, KL 6.2, HT 3.3 và HT 5.1 có khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và

chitinase mạnh để khảo sát khả năng ký sinh con cái và khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp

3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp của các chủng nấm P lilacinum