So sánh mối liên hệ di truyền giữa các chủng neisessria meningitidis não mô cầu ở khu vực phía nam bằng phương pháp điện di trong trườg xung điện PFGE

29 2.4.3 So sánh kỹ thuật PFGE với các phương pháp phân loại sinh học phân tử khác thường được sử dụng trong nghiên cứu... Ngày nay, mặc dù có kháng sinh điều trị hữu hiệu và vắc

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2

1.3 Phương pháp nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tình hình nhiễm Neisseria meningitidis 4

2.1.1 Tình hình nhiễm N meningitidis trên thế giới 4

2.1.2 Tình hình nhiễm N meningitidis tại Việt Nam 7

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Neisseria meningitidis 9

2.2.1 Phân loại N.meningitidis 9

2.2.2 Hình thái N meningitidis 9

2.2.3 Tính chất nuôi cấy 10

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 11

2.2.5 Đặc điểm dịch tễ 11

2.2.6 Cơ chế và khả năng gây bệnh 13

2.2.6.1 Vật chủ và con đường lây nhiễm 13

2.2.6.2 Các yếu tố độc lực 13

2.2.6.3 Cơ chế gây bệnh 15

2.2.7 Biểu hiện lâm sàng 17

2.2.7.1 Viêm họng 17

2.2.7.2 Nhiễm trùng huyết 17

2.2.7.3 Viêm màng não 19

2.2.8 Điều trị 20

2.2.9 Phòng ngừa 20

2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử phân loại N meningitidis 22

2.4 Kỹ thuật PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): kỹ thuật điện di trong

trường xung điện hay điện di trong trường điện thay đổi 27

2.4.1 Nguyên tắc chung của PFGE 27

2.4.2 Quy trình PFGE 29

2.4.3 So sánh kỹ thuật PFGE với các phương pháp phân loại sinh học phân tử khác thường được sử dụng trong nghiên cứu 33

2.4.3.1 Ưu điểm 33

2.4.3.2 Nhược điểm: 33

2.4.4 Ứng dụng của PFGE trong nghiên cứu dịch tễ học Neisseria meningitidis 34

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 39

3.2 Đối tượng nghiên cứu 39

3.3 Vật liệu - sinh phẩm - môi trường - thiết bị 41

3.3.1 Vật liệu 41

3.3.2 Sinh phẩm - hóa chất 41

3.3.3 Môi trường sử dụng 42

3.3.4 Thiết bị 42

3.4 Phương pháp nghiên cứu 44

3.4.1 Quy trình thực hiện 44

3.4.2 Mô tả quy trình 45

3.4.2.1 Hoạt hóa chủng vi khuẩn và tiến hành định danh sơ bộ bằng phương pháp truyền thống 45

3.4.2.2 Thí nghiệm thực hiện test quy trình PFGE cải tiến 45

3.4.2.3 Thí nghiệm trên các chủng 51

3.4.2.4 Tìm ra mối liên hệ di tryền giữa các chủng 51

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

4.1 Kết quả khảo sát hình thái các chủng vi khuẩn thí nghiệm 52

4.2 Kết quả định danh 52

4.2.1 Nhuộm gram 52

4.2.2 Thử nghiệm Catalase 53

4.2.3 Thử nghiệm Oxidase 54

4.2.4 Thử nghiệm phân giải các loại đường 54

4.3 Kết quả kiểm tra quy trình PFGE trên chủng 12 – 705 DK 56

4.4 Kết quả điện di của 17 chủng để xây dựng mối liên hệ di truyền 57

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

5.1 Kết luận 66

5.2 Kiến nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism

A baumannii : Acinetobacter baumannii

CSF : Kit for collection of cerebrospinal fluid

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

ESBL : Extended spectrum beta-lactamase

MLST : Multilocus Sequence Typing

MLEE : Multilocus enzyme electrophoresis

N meningitidis : Neisseria meningitidis

PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

S typhi : Salmonella typhi

S aureus : Staphylococcus aureus

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Phân bố của các phân nhóm N meningitidis gây dịch trên toàn thế giới 5

Hình 2.2 Vành đai viêm màng não ở châu Phi 6

Hình 2.3 Tiêu bản nhuộm dịch não tủy (A) và vi khuẩn N meningitidis sau khi nhuộm Gram (X100) từ khuẩn lạc (B) 10

Hình 2.4 Hình thái khuẩn lạc N meningitidis trên môi trường BA và CA 11

Hình 2.5 Các protein bề mặt và thành phần màng ngoài của N meningitides 14

Hình 2.6 Quá trình xâm nhiễm của N meningitidis 16

Hình 2.7 Một số phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 24

Hình 2.8 Các bước thực hiện quy trình PFGE 29

Hình 2.9 Khả năng di động của phân tử DNA trong trường xung điện 31

Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện quy trình PFGE xác định mối liên hệ di truyền 44

Hình 3.2 Các bước của quy trình PFGE chuẩn 45

Hình 4.1 Khuẩn lạc sau khi cấy qua đêm trên môi trường CA và BA từ chủng 12-705DK 52

Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram 53

Hình 4.3 Kết quả thử nghiệm Catalase 53

Hình 4.4 Kết quả thử nghiệm Oxidase 54

Hình 4.5 Kết quả thử nghiệm 4 loại đường sau 24 giờ 54

Hình 4.6 Kết quả chạy điện di PFGE trên chủng N meningitidis (12-705 DK) 57

Hình 4.7 Kết quả chạy điện di PFGE trên 17 chủng N meningitides 58

Hình 4.8 Kết quả phân tích mối liên hệ di truyền của 17 chủng vi khuẩn N meningitidis 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Liều lượng sử dụng kháng sinh dự phòng 22

Bảng 2.2 Một số enzym cắt hạn chế được dung cho kỹ thuật PFGE 30

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn tương đồng về kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE 33

Bảng 2.4 Minh hoạ các chủng vi sinh vật được phân tích dựa trên kết quả PFGE thu được từ các đoạn nhiễm sắc thể 38

Bảng 3.1 Danh sách 17 chủng vi khuẩn N meningitidis thực hiện trong đề tài 39

Bảng 3.2 So sánh các thông số thay đổi giữa PFGE theo WHO và cải tiến 45

Bảng 3.3 Mô tả các bước thực hiện quy trình PFGE cải tiến 46

Bảng 4.1 Kết quả test sinh hóa trên 17 chủng thí nghiệm 55

Bảng 4.2 Số băng của 17 chủng N meningitidis được cắt bởi NheI từ kết quả PFGE ở hình 4.7 59

Bảng 4.3 Số băng khảo sát được từ kết quả điện di PFGE 61

Bảng 4.4 Các chủng khảo sát theo serogroup 62

Bảng 4.5 Biến động di truyền trên 17 chủng N meningitidis 63

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Neisseria meningitidis (còn gọi là vi khuẩn não mô cầu) là một trong những

tác nhận hàng đầu gây ra hai thể bệnh viêm màng não mủ và nhiễm trùng huyết nghiêm trọng trên toàn thế giới [9] Bệnh có những triệu chứng, biểu hiện và lây lan rất phức tạp Ngay cả khi bệnh được chẩn đoán sớm và điều trị đầy đủ thì tỉ lệ tử vong vẫn chiếm 5 - 10% Bệnh phát triển mạnh mẽ nhất là vào mùa đông và trẻ em

dưới 5 tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất với tỷ lệ tử vong chiếm từ 20 – 50% N meningitidis ký sinh ở nhiều cơ quan trên cơ thể người như các niêm mạc mũi hầu,

họng, đường hô hấp, hệ thần kinh, máu, khớp, màng tim, đường niệu và sinh dục [1], [13], [14]

N meningitidis có thể truyền từ người sang người theo dịch tiết qua đường hô

hấp vì thế rất dễ lây lan và có khả năng phát triển thành dịch cao, đặc biệt là ở những nơi tập trung đông người Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, hàng năm có khoảng 300.000 – 500.000 trường hợp bệnh nhiễm não mô cầu [14] Tại Việt Nam, tính từ năm 2011 đến tháng 8 năm 2013, trung bình mỗi năm có 150 trường hợp mắc bệnh do não mô cầu với tỷ lệ tử vong khoảng 3,3% (theo số liệu của viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh) Trong năm 2014, theo Tổng cục thống

kê, cả nước có 24 trường hợp mắc bệnh viêm màng não do não mô cầu gây ra, trong

đó 3 trường hợp tử vong [18]

Mười ba nhóm huyết thanh của N meningitidis đã được ghi nhận, dựa trên cấu

trúc vỏ polysaccharide khác nhau, tuy nhiên chỉ có 6 nhóm huyết thanh có khả năng gây dịch: A, B, C, X, Y và W – 135 Hiện nay, cách điều trị hữu hiệu nhất đối với

N meningitidis là dùng kháng sinh, tuy nhiên N meningitidis được biết đến là rất

nhạy cảm với các loại thuốc kháng sinh được sử dụng để điều trị và dự phòng Chính vì thế, cần có những nghiên cứu dịch tễ nhằm đưa ra đánh giá, cảnh báo và kịp thời về diễn biến của bệnh

N meningitidis rất đa dạng và phức tạp về mặt di truyền nhưng các nghiên cứu

trong nước về dịch tễ học của vi khuẩn này còn khá ít Bên cạnh việc chẩn đoán và

giám sát thường niên thì việc quan tâm đến dịch tễ học phân tử của chủng trong vùng dịch có ý nghĩa hết sức quan trọng Nhằm phục vụ công tác phòng chống dịch, xác định nguồn gốc, thực hiện các thử nghiệm vắc-xin, nghiên cứu sự biến đổi di truyền và mối liên quan giữa các chủng trong vùng dịch, giữa các chủng của các vụ

dịch trước để có biện pháp ứng phó kịp thời, đề tài “So sánh mối liên hệ di truyền

giữa các chủng Neisessria meningitidis (Não mô cầu) ở khu vực phía Nam bằng

phương pháp điện di trong trường xung điện (PFGE)” được thực hiện

1.2 Mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu

- So sánh mối liên hệ di truyền giữa các chủng N meningitidis ở khu vực phía

Nam bằng phương pháp điện di trong trường xung điện

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thực hiện PFGE trên 17 chủng đã được phân lập và định danh N meningitidis theo quy trình cải tiến

- Phân tích kết quả điện di, so sánh và xây dựng mối liên hệ di truyền giữa các

chủng N meningitidis

1.3 Phương pháp nghiên cứu

Hiện nay, một trong những phương pháp được áp dụng rộng rãi để phân tích

mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn N meningitidis là điện di trong trường xung

điện PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) Bằng phương pháp này, mối liên hệ

di truyền của các chủng vi khuẩn sẽ được xác định Tại Việt Nam, có rất ít nghiên

cứu đánh giá về mối liên hệ di truyền của các chủng vi khuẩn N meningitidis Vì

vậy, trong nghiên cứu này, ứng dụng phương pháp PFGE để đánh giá mối liên hệ di

truyền của các chủng vi khuẩn N meningitidis đã được thu nhận và phân lập

Mối liên hệ di truyền của một số chủng vi khuẩn N meningitidis được xác

định bằng phương pháp PFGE tại Phòng xét nghiệm Vi Khuẩn Hô Hấp, thuộc Khoa

Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur Tp.HCM Quy trình thực hiện dựa theo tiêu chuẩn của WHO và theo nghiên cứu của Nguyễn Thúy Nga, “Hoàn thiện quy trình điện di

trong trường xung điện (PFGE) trên các chủng N meningitidis”, năm 2014 Quy

trình được thực hiện như sau: Các chủng vi khuẩn được cấy lên môi trường BA/CA,

ủ ấm 37oC, 19 - 24 giờ, CO2 5% Sau 24 giờ, quan sát khuẩn lạc, tiến hành định danh sơ bộ bằng phương pháp truyền thống, chọn khuẩn lạc thuần, sau đó tiến hành tạo huyền phù tế bào bằng dung dịch Cell Suspension Buffer Tiếp tục hòa vi khuẩn vào thạch agarose 1% có bổ sung Proteinase K, rồi cho vào những plugs, kết quả tạo ra các plugs nhỏ có chứa toàn bộ tế bào vi khuẩn Vi khuẩn được cố định trong các plugs sẽ chịu tác dụng của Protein K và dung dịch Cell Lysis Buffer, ly giải tế bào qua đêm để giải phóng toàn bộ DNA, tiếp theo DNA này sẽ bị phân cắt tại

những vị trí đặc hiệu bởi enzyme giới hạn NheI Các plugs chứa DNA sau khi đã

được phân cắt được đặt vào những giếng tương ứng trong khuôn thạch agarose và tiến hành điện di Trong đó, bộ điện di được đặt với dòng điện có điện thế 160V, cường độ 140mA, chạy trong vòng 24 giờ với ba pha : 2,2 giây – 8 giờ, 10 giây – 8 giờ, 35 giây – 8 giờ Mẫu DNA sau điện di được nhuộm bằng Ethidiumbromide, chụp ảnh và phân tích kết quả dựa trên tiêu chuẩn của Tenover và cs (1995)

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nhiễm Neisseria meningitidis

2.1.1 Tình hình nhiễm N meningitidis trên thế giới

Bệnh viêm màng não do N meningitidis được mô tả lần đầu tiên bởi

Vieusseus vào năm 1804 trong một trận dịch xảy ra ở vùng lân cận Geneva (Thụy Sĩ) với 33 ca tử vong và ở New England vào năm 1806 [17] Năm 1884, nhà bệnh

lý học người Ý Marchiafava và Celli lần đầu tiên mô tả hình dạng của N meningitidis trong dịch não tủy Năm 1887, Anton Weichselbaum là người đầu tiên

phân lập vi khuẩn từ dịch não tủy của 6 trong 8 bệnh nhân viêm màng não và xác định đây là nguyên nhân gây ra bệnh [47]

Hàng năm, theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới có khoảng 300.000 đến 500.000 trường hợp viêm màng não do não mô cầu Tỷ suất bệnh mắc hàng năm là từ 1 - 2 trên 100.000 dân cho những trường hợp rải rác ,từ 5 - 10 trên 100.000 dân cho những vùng có dịch nhỏ và từ 10 cho đến trên 100.000 dân khi xảy ra những vụ dịch lớn hay đại dịch [53]

Sự phân bố của N meningitidis trên thế giới theo nhóm huyết thanh thay đổi

tùy theo khu vực địa lý (hình 2.1) Dịch não mô cầu xảy ra tại các khu vực trên thế giới gây ra do các nhóm huyết thanh khác nhau: nhóm A và C thường gây bệnh ở Châu Á và Châu Phi, với nhóm A gây bệnh chủ yếu ở Châu Á Nhóm B và C gây bệnh phần lớn tại Châu Âu, Châu Mỹ Nhóm C gây một số vụ dịch tại Canada, Mỹ (1992 - 1993) và Tây Ban Nha (1995 - 1997) Nhóm B gây dịch nhiều hơn tại Tân Tây Lan với 500 trường hợp hàng năm Nhóm W - 135 gây bệnh cho vài trăm người đi hành hương ở Á Rập Saudi vào năm 2000 - 2001, gây dịch ở Burkina Faso (Châu Phi) làm chết 1500 người trong số 3000 người mắc bệnh vào năm 2002 [46], [54], [55]

Hình 2.1 Phân bố của các phân nhóm N meningitidis gây dịch trên toàn thế giới

Nguồn: Tổ chức Y tế thế giới – WHO Châu Phi được biết đến với tên gọi “vành đai viêm màng não” (meningitis belt), chạy dài từ phía tây Senegal cho đến phía đông Ethiopia (Hình 2.2) với dân số khoảng 300 triệu người, là nơi có tần suất dịch N meningitidis cao Dịch dễ xảy ra

là do khu vực này có khí hậu đặc biệt: trong mùa khô, giữa tháng 6 và 12, gió bụi cùng với bệnh nhiễm trùng đường hô hấp do khí hậu lạnh ban đêm khiến miễn dịch tại chỗ ở họng giảm và làm tăng nguy cơ viêm màng não [22] Tập quán xã hội cũng góp phần làm cho bệnh lan truyền dễ dàng hơn: điều kiện nhà ở đông đúc, chật chội và sự di cư của phần lớn người dân trong các chuyến đi hành hương hoặc đi chợ truyền thống ở địa phương Nhóm hay gây bệnh viêm màng não ở Châu Phi là nhóm A, C và W - 135 Nhóm A được biết đến với tỷ lệ mắc cao nhất của bệnh viêm màng não, gây ra bệnh dịch rất lớn, đặc biệt là ở Châu Phi, cận Sahara [22], [30], [51] Trong phần lớn các vụ dịch ở Châu Phi, tỷ suất tấn công từ 100 - 800 trên 100.000 dân và những quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề nhất là Burkina Faso, Chad, Ethiopia và Niger Vào năm 1996 - 1997, dịch viêm màng não lớn nhất trong lịch sử Châu Phi xảy ra với hơn 250.000 trường hợp và 25.000 tử vong [54]

Hình 2.2 Vành đai viêm màng não ở châu Phi

Nguồn: Tổ chức Y tế thế giới - WHO Theo hệ thống tăng cường giám sát bệnh não mô cầu, từ 1/1/2013 – 12/5/2013 tại “vành đai viêm màng não” có 9.249 trường hợp nghi ngờ nhiễm và

857 trường hợp tử vong do viêm màng não, chiếm tỷ lệ 9,3% [52]

Dịch viêm màng não cũng được xác định xảy ra ở Guinea với 404 trường hợp nghi ngờ nhiễm trong đó có 38 trường hợp tử vong và ở phía Nam Sudan với 196

trường hợp nhiễm trong đó có 13 trường hợp tử vong Ngoài ra, dịch bệnh do N meningitidis còn được ghi nhận ở Benin, Burkina Fasco và Nigeria xảy ra trong thời

1995, Saudi Arabia năm 1987, Yemen 1988) [55] Các dịch lớn nhất có nguồn gốc

ở miền bắc Trung Quốc, lan rộng về phía nam và sau đó trên toàn cầu, được gây ra

bởi nhóm huyết thanh A [14], [41], [44] Một trong những dòng này lan rộng đến tiểu lục địa Ấn Độ vào năm 1983 đến năm 1987 Từ năm 1987 đến 1996, chúng đi qua khu vực Trung Đông gây ra đại dịch cho khách hành hương tại Mecca Năm

1985, Bhutan cũng đã xảy ra viêm màng não với 247 trường hợp, trong đó 41 trường hợp tử vong được báo cáo giữa tháng 9 năm 1985 và tháng 1986 Trong

1982 - 1984, 1475 trường hợp xảy ra ở thung lũng Kathmandu, Nepal với tỷ lệ tử vong cao nhất và tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ dưới một tuổi Nhiều dịch viêm màng não do

N meningitidis đã được ghi nhận trong năm 1966 và năm 1985 tại Delhi và Areas

[16], [47]

Năm 2005, bệnh tăng đột ngột tại Delhi, Ấn Độ và các quốc gia láng giềng của bang Uttar Pradesh và Haryana Tính đến ngày 17 tháng 06 năm 2005, 429 trường hợp có nguy cơ bệnh viêm màng não đã được báo cáo tại Delhi trong đó 128 trường

hợp đã cho thấy nhiễm N meningitidis [47]

Ngày nay, mặc dù có kháng sinh điều trị hữu hiệu và vắc xin có thể giúp phòng ngừa được phần lớn các trường hợp bệnh, những vụ dịch (đặc biệt dịch xảy

ra tại Châu Phi, Tân Tây Lan, Singapore) và những thể bệnh nặng gây ra do loại vi trùng này vẫn còn là một trong những vấn đề quan trọng hàng đầu của y tế thế giới

2.1.2 Tình hình nhiễm N meningitidis tại Việt Nam

Ở Việt Nam, dịch bệnh viêm màng não gây ra phổ biến bởi vi khuẩn N meningitidis serogroup A, B và C Vào năm 1939 - 1940 tại miền Bắc, có một vụ dịch lớn gây nhiễm trùng huyết và viêm màng não do N meningitidis lan từ Trung

Quốc sang Sau năm 1941, miền Bắc vẫn còn thấy một số những vụ dịch nhỏ Ở miền Nam, dịch viêm màng não xảy ra vào năm 1973 trong một trại tân binh Năm

1977 - 1978, một trận dịch lớn đã xảy ra trên nhiều tỉnh thành phía Nam, gây do não

mô cầu nhóm C Ngoài các vụ dịch quan trọng nói trên, bệnh xảy ra lẻ tẻ, tuy có khuynh hướng gia tăng vào các thời điểm như các tháng lạnh ở miền Bắc và các tháng 6, 7, 8 tại các tỉnh phía Nam [54]

Theo số liệu của Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương, tỷ lệ mắc bệnh từ 1991 -

2000 ở Việt Nam là 2,3 trên 100.000 dân và là bệnh xếp thứ 6 trong 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ chết cao nhất (0,03 trên 100.000 dân) [55]

Theo Cục Y tế dự phòng, giai đoạn từ năm 2001 - 2011, trung bình ghi nhận

650 trường hợp mắc bệnh viêm màng não do N meningitidis gây ra, chủ yếu ở các

tỉnh khu vực miền Bắc Năm 2011 ghi nhận 305 trường hợp mắc và 4 trường hợp tử vong Bệnh xảy ra chủ yếu vào mùa xuân [63], [64]

Cuối tháng 12 năm 2011, bệnh nhiễm N meningitidis khởi phát tại công ty

Fukukawa (Khu chế xuất Tân Thuận, Quận 7, TP.HCM) Đến tháng 02 năm 2012, bệnh nhiễm não mô cầu đã xuất hiện ở 10 quận, huyện của TP.HCM, gồm các quận:

7, 8, 9, 10, Tân Bình, Tân Phú, Bình Tân, Gò Vấp và các huyện Bình Chánh, Củ Chi [54], [56], [57]

Trong năm 2014, theo Tổng cục thống kê, cả nước có 24 trường hợp mắc bệnh

viêm màng não do N meningitidis gây ra, trong đó 3 trường hợp tử vong [57] Số ca

mắc bệnh so với năm 2013 tăng lên 4 ca nhưng so với trung bình 3 năm (2011 - 2013) thì giảm 86,8%

Theo Bộ Y tế, từ đầu năm 2015 đến nay cả nước ghi nhận 24 ca bệnh viêm màng não do não mô cầu, 2 người tử vong, tăng 16 ca so với cùng kỳ năm ngoái Trong đó riêng tháng 4, cả nước ghi nhận 11 ca viêm màng não do não mô cầu, 2 ca

tử vong [61]

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Neisseria meningitidis

2.2.1 Phân loại N.meningitidis

Về phân loại khoa học, N.meningitidis được xếp loại vào:

Loài: Neisseria meningitidis

N meningitidis được xếp loại theo hệ thống phân týp huyết thanh, dựa trên sự

khác biệt cấu trúc của nang polysaccharide (nhóm huyết thanh), protein màng ngoài chủ yếu OMP (týp huyết thanh), protein màng ngoài khác (phụ týp huyết thanh) và lipo-oligosaccharide (týp miễn dịch) [12], [20]

N meningitidis được chia thành 13 nhóm huyết thanh là: A, B, C, H, I, K, L,

M, X, Y, Z, 29E và W135, 20 týp huyết thanh, 10 phụ týp huyết thanh và 13 týp miễn dịch [54]

2.2.2 Hình thái N meningitidis

N meningitidis là song cầu Gram âm, có vỏ polysaccharide, ái khí, không di

động, không tạo thành nha bào, đường kính 0,6 x 0,8µm, có thể thấy ở các dạng đơn độc hoặc song cầu hình hạt cà phê úp mặt khuyết vào nhau hoặc đứng riêng từng đôi cũng có thể tụ lại thành đám

Quan sát phết nhuộm bệnh phẩm cho thấy chúng nằm trong hoặc ngoài bạch

cầu đa nhân Các vi khuẩn N meningitidis hầu hết đều có vỏ nang [1],[54]

A B

Hình 2.3 Tiêu bản nhuộm dịch não tủy (A) và vi khuẩn N meningitidis sau

khi nhuộm Gram (X100) từ khuẩn lạc (B)

2.2.3 Tính chất nuôi cấy

N meningitidis là một loại vi khuẩn khó mọc, chúng chỉ có thể mọc trên môi

trường giàu chất dinh dưỡng như thạch 5% máu cừu (blood agar) hay thạch máu chín (chocolate agar) với nhiệt độ 35 - 37oC, CO2 5%, trong 18 - 24 giờ

N meningitidis có tính nhạy cảm với nhiệt độ lạnh và khô, do chúng tự ly giải rất nhanh Khi ở ngoài cơ thể, N meningitidis sống được 3 - 4 giờ và bị tiêu diệt

ngay dưới tia cực tím, dung dịch Cloramin 0.5 – 1 %, nhiệt độ 55 - 60oC hoặc cồn

70o Vì vậy bệnh phẩm não mô cầu cần được cấy ngay vào môi trường ấm và nhanh chóng ủ trong bình nến [48]

Đối với bệnh phẩm là dịch tỵ hầu cần thiết dùng môi trường thạch máu chín có

bổ sung kháng sinh: Vancomycin để ức chế các vi khuẩn Gram dương, Colistin để ức chế các vi khuẩn Gram âm và Nystatin để ức chế các loại vi nấm khác nhằm sàng lọc các dòng Neisseria

Trên môi trường thạch máu và thạch chocolate, khuẩn lạc N meningitidis tròn,

lồi, nhẵn, ẩm ướt, óng ánh và có màu hơi xám, không có mùi đặc trưng Sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính khoảng 0,8 – 1 mm, không gây tan máu, để lâu

khuẩn lạc có màu xám đục, nhầy hơn do tự ly giải và có thể làm màu môi trường ở dưới vùng vi khuẩn mọc đậm hơn

2.2.5 Đặc điểm dịch tễ

Bệnh não mô cầu phổ biến toàn thế giới, thành từng ca rải rác hay những vụ dịch nhỏ ở làng, xã, tập thể, cơ quan, nhưng cũng cũng có thể thành những vụ dịch lớn Mặc dù có kháng sinh và cả vaccine có hiệu quả, não mô cầu vẫn là một nguyên nhân gây viêm màng não và nhiễm trùng nặng hàng đầu trên thế giới, gây tử vong nhanh chóng cho một người trước đó còn khoẻ mạnh bình thường

Não mô cầu là tác nhân gây bệnh duy nhất trong số những vi khuẩn gây viêm

màng não có thể gây thành dịch bên cạnh những ca rải rác Dịch do N meningitidis

xảy ra tại các khu vực trên thế giới do 5 nhóm huyết thanh A, B, C, Y và W - 135 gây ra với 90% các trường hợp mắc Nhóm A, B và C chiếm phần lớn các trường

hợp bệnh do N meningitidis trên toàn thế giới Trong đó, nhóm A và C thường gây

bệnh ở Châu Á và Châu Phi, nhóm B và C gây bệnh phần lớn tại Châu Âu, Châu

do nhóm W - 135 gây ra Dịch bệnh viêm màng não do N meningitidis gia tăng từ 1

- 3 trên 100.000 trường hợp ở các nước phát triển đến 10 - 25 trên 100.000 trường hợp ở các nước đang phát triển Sự khác biệt về tỷ lệ tấn công phản ánh sự khác biệt

về tính chất gây bệnh của các chủng N meningitidis và cho thấy khả năng xuất hiện

bệnh tỷ lệ thuận với điều kiện kinh tế, xã hội và môi trường [47]

N meningitidis có khả năng gây dịch lớn hoặc các trường hợp bệnh lẻ tẻ

Nhóm A thường gây bệnh dịch lớn, xảy ra theo chu kỳ khoảng 20 - 30 năm hoặc dịch nhỏ có chu kỳ 8 - 12 năm Chẳng hạn như trong thế chiến thứ I và thứ II đều đã xảy ra dịch não mô cầu bên trong cũng như bên ngoài quân đội Nhóm B và C thường gây các trường hợp riêng lẻ, vẫn có khả năng gây nên các trận dịch Một nửa

số trường hợp nhiễm N meningitidis xảy ra ở trẻ em dưới 1 tuổi là do nhóm B gây

ra Nhóm C thường xảy ra ở vị thành niên Nhóm Y chỉ gây dịch riêng lẻ và chủ yếu

ở lứa tuổi thành niên [47], [53] Tuổi dễ mắc bệnh nhất là trẻ em từ 6 tháng đến 3 tuổi hoặc thanh thiếu niên từ 14 - 20 tuổi và tỷ lệ bệnh thấp ở người trên 20 tuổi Không có sự khác biệt rõ rệt về giới tính, tuy ở nam giới thường được ghi nhận mắc bệnh viêm màng não và nhiễm trùng huyết nhiều hơn ở nữ giới [54]

Những trường hợp đầu tiên của dịch viêm màng não do não mô cầu thường xẩy ra do những tiếp xúc trong gia đình hơn là từ cộng đồng Tỷ lệ lây nhiễm cho người thứ hai là 400 - 1000 trên 100.000 thành viên trong gia đình Lây lan ở trường học cũng được ghi nhận, nhưng tỷ lệ chỉ 2 - 4 trên 100.000 Trong các vụ dịch ở làng Đại học, tỷ lê lây lan cao nhất ở những sinh viên ở cư xá Những trường hợp

lây đa số xẩy ra trong vòng 2 tuần kể từ khi có trường hợp mắc bệnh đầu tiên, nhưng cũng có trường hợp kéo dài đến vài tháng sau [65]

Thời điểm bệnh xảy ra tại các nước khí hậu ôn đới thường vào mùa đông và đầu mùa xuân, thấp nhất là giữa mùa hè Tại các vùng nhiệt đới, bệnh gia tăng khi

có sự thay đổi thời tiết, khí hậu, thí dụ như vào lúc cuối mùa khô, đầu mùa mưa Dịch não mô cầu còn được nhận xét có nhiều nguy cơ bộc phát vào các thời gian con người tập trung đông đúc thí dụ như mùa khai trường, đợt tuyển quân Bệnh hay xảy ra và lan rộng tại các tập thể đông đúc ở thành thị hơn là nông thôn Thí dụ như nhà trẻ, trường học, ký túc xá, đặc biệt là trại lính, nhất là ở những tập thể mới được thành lập, cá nhân sống chật chội, thiếu vệ sinh [48], [53]

2.2.6 Cơ chế và khả năng gây bệnh

2.2.6.1 Vật chủ và con đường lây nhiễm

N meningitidis là vi khuẩn cư trú tại vùng họng mũi của người và lây truyền

theo các giọt nước nhỏ bài tiết qua đường hô hấp của bệnh nhân hay người lành

mang mầm bệnh Ngoài khả năng gây bệnh, N meningitidis cũng là một mối nguy

cơ tiềm ẩn, trong một nghiên cứu, N meningitidis phân lập được từ mũi họng của 8

- 20% cá thể lành mạnh [23] Người lành mang N meningitidis là yếu tố lây truyền

mạnh hơn đối với những người đang mắc bệnh Khi bệnh xảy ra lẻ tẻ, tỷ lệ mang vi khuẩn này ở những người tiếp xúc gần gũi tăng 40% và tại những nơi đông dân cư, đặc biệt trong các doanh trại quân đội hay các trận dịch lớn thì tỷ lệ này có thể lên đến 60 - 80%

Con người là ký chủ duy nhất của N.meningitidis và hiện nay chưa phát hiện

có ký chủ truyền bệnh nào khác Thời gian ủ bệnh chính xác thường không xác định

rõ và đã được ước tính trung bình từ 2 - 10 ngày, thông thường từ 3 - 4 ngày

2.2.6.2 Các yếu tố độc lực

N meningitidis là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên người, chứa các yếu tố

độc lực tạo nên các cơ chế gây bệnh của vi khuẩn trên vật chủ bao gồm: pili, vỏ polysaccharide, protein phân cắt kháng thể IgA và nội độc tố lipopolysaccharide [62]

Hình 2.5 Các protein bề mặt và thành phần màng ngoài của N meningitidis

[62]

 Vỏ polysaccharide: chia N meningitidis thành 13 nhóm huyết thanh Lớp vỏ

này bao bọc bên ngoài tế bào vi khuẩn, bảo vệ chúng khỏi hiện tượng thực bào của cơ thể vật chủ, tăng khả năng xâm nhập và tồn tại của vi khuẩn trong máu và hệ thần kinh trung ương

 Pili: có vai trò quan trọng, tạo khả năng bám của vi khuẩn lên các tế bào niêm mạc mũi họng, giúp vi khuẩn vượt qua hàng rào máu não đi vào hệ thần kinh trung ương và tồn tại gây bệnh

 Các lipooligosaccharide: chứa carbohydrate lacto - N - neotetrose, đây là một trong những yếu tố quyết định khả năng gây độc của vi khuẩn Đồng thời, lipooligosacchride cũng kích thích giải phóng TNF - alpha làm tổn thương tế bào chủ, cảm ứng cho sự hình thành của các cytokine khác nhau gây tổn thương nội

mô mạch máu, dẫn đến hoại tử và tổn thương nghiêm trọng ở nhiều cơ quan và hệ thống

 Protein porA và porB: đây là những protein màng ngoài lớn của N meningitidis đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra độc lực của vi khuẩn

Trong đó, porB có khả năng chèn vào bên trong màng tế bào chủ gây chết tế bào,

nhiễm trùng và giúp vi khuẩn xâm nhập vào bên trong cơ thể vật chủ

 Protein Opa và Opc: những protein này khác nhau giữa các chủng, chúng tạo

điều kiện cho vi khuẩn bám dính vào các tế bào biểu mô và bạch cầu trung tính

2.2.6.3 Cơ chế gây bệnh

Cơ chế gây bệnh của N meningitidis trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Vi khuẩn cố định lên và xuyên qua màng nhày hầu họng

Bệnh thường khởi phát do vật chủ (người) mang một loại vi khuẩn đường mũi họng và vi khuẩn này mang đặc điểm có khả năng xuyên qua màng nhầy Để có thể

cố định được lên màng nhầy, các vi khuẩn phải có cơ chế tiết ra những protease giúp chúng phân giải được các phân tử thuộc cơ chế bảo vệ bởi hệ miễn nhiễm vật chủ hoặc cắt đứt các liên kết phân tử của lớp tế bào biểu mô màng nhầy hầu họng Sau khi bám lên được, vi khuẩn phải xuyên niêm mạc để xâm nhập vào máu vật chủ Hai yếu tố giúp chúng thực hiện là nhung mao và protein vỏ Các nhung mao giúp chúng gắn kết với các thụ thể trên tế bào biểu mô màng nhầy tại những nơi sẽ hình thành túi thực bào để xuyên qua màng nhầy Các protein vỏ có khả năng kết

hợp với protein vận chuyển kháng thể IgA, tạo thành phức hợp protein vỏ - protein

vận chuyển, có thể đi xuyên qua hàng rào tế bào biểu mô [3], [4]

Hình 2.6 Quá trình xâm nhiễm của N meningitidis

Nguồn: David Stephens et al, 2007,J The Lancet, 369: 2196-2210

Trong đó, A: N meningitidis xâm nhập vào bề mặt niêm mạc hầu họng

B: Giai đoạn đính màng

C: Hình thành tập đoàn

D: Xâm chiếm và định cư ở vùng hầu họng

Giai đoạn 2: Vi khuẩn tăng sinh trong máu

Vi khuẩn tiếp tục du nhập vào máu, để sống sót và nhân lên về số lượng, chúng tiếp tục chống đỡ với một cơ chế bảo vệ nữa của vật chủ là khả năng thực bào của bạch cầu trung tính và hoạt động diệt khuẩn của hệ bổ thể Chính vỏ capsule và protein trên bề mặt capsule của vi khuẩn giúp chúng vượt qua hàng rào miễn nhiễm của vật chủ Vì thế, hầu hết các vi khuẩn có độc lực cao và có thể sống sót trong cơ thể vật chủ đều có capsule

Giai đoạn 3: Vi khuẩn xâm nhập màng não

Vi khuẩn sống sót trong máu và không ngừng nhân lên về số lượng, nhưng để vượt qua hàng rào máu não và xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương thì điều kiện cần thiết là nồng độ của chúng phải đạt trên 103 CFU/ml [3], [4] Đến giai đoạn này những vi khuẩn có nhung mao sẽ chuyển sang pha biến đổi với hình thái không nhung mao hay vi khuẩn liên kết với bạch cầu đơn nhân để bước qua hàng rào máu

não, xâm nhập hệ thần kinh trung ương Khi vi khuẩn vào được dịch não tủy, cơ chế bảo vệ của vật chủ không đủ để khống chế chúng Tại đây chúng kích thích miễn dịch, tạo đáp ứng viêm trong khoang dưới nhện (dịch não tủy) và màng não Những phân tử chính gây nên hiện tượng trên là lipopolysaccharide (thành phần cấu tạo chủ yếu của vi khuẩn Gram âm), peptidoglycan (thành phần cấu tạo chủ yếu của vi khuẩn Gram dương), DNA của vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn…Sau khi khơi mào của các thành phần vi khuẩn, các chất trung gian gây viêm được tiết vào hệ thần kinh trung ương sẽ làm thay đổi tính thấm của hàng rào máu não

2.2.7 Biểu hiện lâm sàng

Thông thường, bệnh nhân có triệu chứng hô hấp trước khi có bệnh cảnh nhiễm trùng huyết hay viêm màng não, 99% biểu hiện của nhiễm não mô cầu là nhiễm trùng huyết, viêm màng não mủ hay phối hợp cả hai

2.2.7.1 Viêm họng

Viêm họng do N meningitidis khó chẩn đoán vì phân lập được vi trùng từ cổ

họng cũng không xác định được đó chính là nguyên nhân gây bệnh Thật vậy, phần

lớn người mang N meningitidis ở họng mũi là người lành mang trùng Nhiều tác giả

đã ghi nhận thực sự có bệnh viêm họng mũi do não mô cầu Bệnh xảy ra hàng loạt khi đang thời gian có dịch, đa số không có triệu chứng lâm sàng rõ hoặc có thể sổ mũi, viêm họng đỏ tuy hạch amiđan không to và không có hạch cổ

2.2.7.2 Nhiễm trùng huyết

Nhiễm trùng huyết do N meningitidis có nhiều hình thức thay đổi, từ thể tối

cấp diễn tiến trong vòng vài giờ đến những bệnh âm ỉ kéo dài nhiều ngày hoặc đôi khi nhiều tháng [52]

 Nhiễm trùng huyết thế cấp

N meningitidis có thể gây nhiễm trùng huyết kèm theo viêm màng não mủ

hoặc không; do đó, cần khảo sát dịch não tủy các bệnh nhân nhiễm trùng huyết do

N meningitidis để chẩn đoán kịp thời thể bệnh có phối hợp này Tỷ lệ bệnh nhân

nhiễm trùng huyết cấp nhưng không kèm viêm màng não mủ chiếm khoảng 30 - 35%

Khởi bệnh thường đột ngột, tuy trong nhiều trường hợp bệnh nhân có tình trạng tương tự như bị cảm cúm trước đó: mệt nhọc, đau họng, ho, nhức đầu… Tiếp theo, bệnh nhân sốt cao 39 - 40oC, ớn lạnh, rét run nhiều lần, nhức đầu, nôn ói, đau khớp, đau cơ đặc biệt đau nhiều ở sống lưng và hai chân Bệnh nhân có mạch nhanh, thở nhanh và có thể có huyết áp thấp tuy sốc thực sự hiếm xảy ra trừ khi rơi vào thể tối cấp

Biểu hiện rõ ràng nhất là tử ban, xuất hiện trong khoảng 75% các trường hợp, trong vòng một hai ngày sau sốt Tử ban cần được quan sát dưới nguồn ánh sáng tốt

và có đặc điểm: màu đỏ hoặc tím thẫm, bờ không tròn đều, kích thước thay đổi từ 1 – 2 mm đến vài cm, bề mặt bằng phẳng không gồ lên mặt da, có khi có hoại tử vùng trung tâm Vị trí tử ban phân bổ khắp người, song thấy nhiều nhất ở vùng nách hông, quanh khớp (khuỷu, gối, cổ chân) Đôi khi tử ban có dạng bóng nước (nốt phỏng) hoặc tràn rộng lớn như hình bản đồ

Khi tử ban lan tràn nhanh chóng về số lượng hoặc phát triển kích thước cần lưu ý bệnh đang diễn tiến đến thể tối cấp Tuy nhiên không có tử ban không có nghĩa là bệnh diễn tiến nhẹ Ngoài ra, hầu hết trường hợp có xuất huyết niêm mạc mắt, tuy xuất huyết các nơi khác (như xuất huyết tiêu hoá) hiếm xảy ra Dấu hiệu khác: lách to, nốt herpes ở khoé miệng

 Nhiễm trùng huyết tối cấp

Còn được gọi là hội chứng Waterhouse - Friderichsen, xảy ra với tỉ lệ khoảng

10 - 20% các trường hợp nhiễm trùng huyết do N meningitidis Đây là bệnh nhiễm

trùng huyết não mô cầu rất cấp tính, diễn tiến nhanh chóng đến tình trạng suy tuần hoàn, sốc phổi và gây tử vong, có thể chỉ trong vòng vài giờ

Bệnh nhân khởi đầu có các triệu chứng tương tự như nhiễm trùng huyết cấp nhưng các dấu hiệu tiên lượng nặng xuất hiện rầm rộ và đầy đủ trong vòng 12 giờ đầu tiên của bệnh:

 Sốt cao đột ngột 39– 40oC, trên cơ địa trước đó khỏe mạnh

 Kích động hoặc hôn mê sớm

 Sốc xảy ra sớm và tái đi tái lại nhiều lần

 Tử ban xuất hiện sớm và lan ra nhanh chóng

 Một số dấu hiệu “âm tính”: không có dấu màng não (bạch cầu dịch não tủy dưới 20/mm3), bạch cầu máu không tăng (dưới 10.000/mm3), tốc độ lắng máu không tăng (dưới 10 mm giờ đầu)

Bệnh nhân thường có biểu hiện co mạch toàn thân ngay trong giai đoạn tiền sốc nên tím tái rất nặng và giá lạnh tứ chi Những trường hợp bệnh nhân hồi phục

có thể bị bội nhiễm hoặc bị mất ngón tay, ngón chân do hoại tử Thời gian lành lặn cho các sang thương này chậm và có thể cần phải ghép da

 Nhiễm trùng huyết mạn tính

Đây là hình thức hiếm thấy của nhiễm trùng huyết do não mô cầu với diễn tiến kéo dài nhiều tuần, hoặc nhiều tháng và có đặc điểm là sốt, rét run, nổi đỏ da nhiều hình thức, viêm khớp hay đau các khớp

Trường hợp điển hình các triệu chứng của bệnh thường tái đi tái lại cách khoảng vài ngày, giữa thời gian nói trên tổng trạng bệnh nhân vẫn bảo tồn Vi trùng cũng hiện diện trong máu từng lúc, do đó cần phải cấy máu rất nhiều lần mới có thể chẩn đoán xác định được bệnh

Thời gian bệnh kéo dài từ bốn đến tám tuần, tuy có thể kéo dài đến hơn 10 tuần nếu có biến chứng Trường hợp không phát hiện được bệnh sớm để điều trị sẽ diễn tiến đến các tổn thương khu trú như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm thận, viêm tinh hoàn, viêm kết mạc mắt Cơ chế bệnh sinh của thể bệnh này không

rõ Có giả thuyết cho là do phản ứng siêu nhạy cảm

2.2.7.3 Viêm màng não

Viêm màng não do N meningitidis hay gặp xảy ra tiên phát ở trẻ từ 6 tháng

đến 10 tuổi Triệu chứng lúc khởi bệnh khó phân biệt với những trường hợp nhiễm trùng toàn thân, tuy nhiên trên một số bệnh nhân, bên cạnh biểu hiện nhiễm trùng huyết và tử ban, dấu hiệu viêm màng não nổi bật với độ nặng gia tăng dần như sốt,

ói, nhức đầu, mê sảng

So sánh với các loại viêm màng não mủ gây do những vi trùng khác như phế

cầu, Haemophilus influenzae, biểu hiện thần kinh khu trú và co giật rất hiếm thấy

trên viêm màng não do N meningitidis Dấu hiệu mê sảng nếu xảy ra sớm trên bệnh

nhân, có thể báo hiệu đã có áp-xe não ở thùy thái dương hoặc viêm não

Khoảng 20 - 40% số trường hợp, viêm màng não do N meningitidis không có

triệu chứng lâm sàng của nhiễm trùng huyết rõ rệt, chẩn đoán cần dựa vào xét

nghiệm phân lập N meningitidis trong dịch não tủy

Trên thực tế lâm sàng, những yếu tố sau đây gợi ý tác nhân gây bệnh là N meningitidis trên một bệnh nhân có biểu hiện viêm màng não:

 Khởi phát đột ngột trên cơ địa là trẻ em trên 6 tháng tuổi hoặc thanh thiếu niên trước đó khỏe mạnh

 Đang thời gian có nhiều bệnh nhiễm N meningitidis xảy ra hoặc có tiếp xúc với

người bệnh đã xác định

 Tiền căn viêm họng mũi, tắm hồ bơi công cộng Không có tiền căn viêm tai, viêm xoang

 Có tử ban đặc sắc thấy trên bệnh do N meningitidis

 Có thể kèm viêm khớp, herpes ở quanh miệng

 Dịch não tủy màu trắng đục như nước vo gạo (khác với dịch não tủy do phế cầu thường có màu mủ vàng)

đã được chứng minh là có hiệu quả trên bệnh viêm màng não não mô cầu [59]

2.2.9 Phòng ngừa

Các nguyên tắc phòng bệnh chung đối với não mô cầu thường là:

 Thực hiện tốt vệ sinh cá nhân: rửa tay thường xuyên bằng xà phòng, súc miệng họng bằng các dung dịch sát khuẩn mũi họng thông thường

 Thực hiện tốt vệ sinh nơi ở, thông thoáng nơi ở, nơi làm việc

 Có thể tiêm vắc xin phòng bệnh

 Khi phát hiện có dấu hiệu nghi ngờ mắc bệnh cần đi khám tại các cơ sở khám chữa bệnh càng sớm càng tốt

Đối với môi trường bệnh viện, cần tuân thủ các nguyên tắc để phòng ngừa lây lan và phát tán bệnh như việc cách ly bệnh nhân, đeo khẩu trang khi tiếp xúc hoặc chăm sóc người bệnh; quản lý và khử khuẩn đồ dùng và chất thải của bệnh nhân, dịch tiết mũi họng của bệnh nhân; có thể sử dụng thuốc dự phòng cho nhân viên y tế

và người tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân [2]

Có thể tiến hành dự phòng bằng thuốc đối với những người tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân đã được chẩn đoán chắc chắn nhiễm não mô cầu, bao gồm các trường hợp như:

 Những người sống cùng nhà và sinh hoạt cùng với bệnh nhân (sống trong cùng một nhà, cùng khu nhà trọ, cùng phòng làm việc…) trong vòng 7 ngày trước khi bệnh nhân có biểu hiện triệu chứng

 Những người tiếp xúc với bệnh nhân trong thời gian ngắn (có nguy cơ bị nhiễm bệnh qua đường hô hấp như: nói chuyện với bệnh nhân, tiếp xúc với dịch tiết đường hô hấp của bệnh nhân…)

 Việc dự phòng có thể sử dụng các kháng sinh như rifampicin, ciprofloxacin hay azithromycin với liều lượng khác nhau

Bảng 2.1 Liều lượng sử dụng kháng sinh dự phòng

Nguồn: Bộ Y Tế

Rifampicin Dùng liều đơn duy nhất 500 mg cho người lớn và

trẻ em trên 12 tuổi

Ciprofloxacin Chống chỉ định trong các trường hợp sau: đang có

biểu hiện vàng da, có tiền sử tăng nhạy cảm với

2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử phân loại N meningitidis

Các kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu N meningitidis ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam Mỗi một kỹ thuật đều

có những ưu điểm và hạn chế riêng do vậy cần lựa chọn những phương pháp phân loại phụ thuộc vào các câu hỏi về dịch tễ học và về di truyền quần thể sinh vật đang được điều tra, đồng thời phù hợp với điều kiện trang thiết bị thực tiễn và đáp ứng nhu cầu của nghiên cứu

 Ribotyping

Là phương pháp định loại phổ biến sử dụng DNA nhiễm sắc thể và một đoạn

dò của ARN Do tất cả các chủng vi khuẩn có một hay nhiều RNA thông tin phân

bố quanh nhiễm sắc thể, trình tự các operon này có tính bảo tồn cao Do vậy vi khuẩn sẽ được định loại bằng việc sử dụng các đoạn dò hướng trực tiếp tới trình tự DNA mã hóa các RNA thông tin này [11], [35] Trong nghiên cứu dịch tễ học,

ribotyping là kỹ thuật rất hữu ích trong việc xác định các chủng vi khuẩn gram âm sinh ESBL là căn nguyên gây ra các vụ dịch trên toàn thế giới [11], [27], [34]

 Kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP)

Nguyên lý: DNA nhiễm sắc thể hay các plasmid của vi khuẩn sẽ được cắt bằng các enzym giới hạn thành những đoạn DNA Các đoạn DNA sẽ được phân tách bằng điện di trên thạch, chuyển lên màng nitrocellulose, sau đó các đoạn cắt này sẽ được lai ghép với một đoạn DNA dò đặc hiệu đã được đánh dấu phóng xạ Những đoạn DNA có trình tự axit nucleic bổ xung phù hợp sẽ gắn với đoạn dò và được phân biệt dựa vào sự khác nhau về số lượng và kích thước của các phân đoạn DNA [8], [41]

 Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE)

Kỹ thuật được sử dụng để phân loại và xác định nguồn gốc của các loại vi khuẩn Kỹ thuật này sử dụng những enzym giới hạn phù hợp để cắt DNA nhiễm sắc thể thành những phân đoạn không đều (10 đến 30 vạch DNA), các phân đoạn DNA này sẽ được điện di để phân tách các phân đoạn từ 1kb đến 1000kb Quá trình phân tích dựa trên sự so sánh các đoạn DNA của các chủng vi khuẩn để xác định mối liên quan và nguồn gốc của các chủng vi khuẩn ở các vùng và thời gian khác nhau [42] Hiện nay PFGE được coi là một trong các tiêu chuẩn vàng trong phân loại cũng như xác định nguồn gốc vi khuẩn [25], [27], [35]

Hình 2.7 Một số phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử

Nguồn: Daniel J,Methods for analysis of the Intestinal Microflora [69]

 Multilocus enzyme electrophoresis – MLEE

MLEE là một phương pháp phân loại xác định độ linh động của các enzym chuyển hóa trong gel agarose hoặc gel polyacrylamide Những biến đổi trong tính di động của một enzyme cho các chủng khác nhau của cùng một loài trong điều kiện này có thể được quy cho isozyme hoặc allozymes Những thay đổi trong tính di động của các enzym được gây ra bởi sự khác biệt do amin thay thế acid trong chuỗi polypeptide

 Kỹ thuật Multilocus Sequence Typing - MLST

Kỹ thuật Multilocus sequence typing (MLST) được đánh giá kỹ thuật tốt nhất

để phân loại kiểu gen của nhiều loại vi khuẩn như: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae và S aureus [17], [18], [27] Ví dụ: Bartual và cộng sự

đã sử dụng kỹ thuật này để phân loại các chủng A baumannii dựa vào các trình tự

gen có độ dài từ 305 đến 513bp tại các vùng bảo tồn (conserved regions) của 7 loại

gen: gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi, và rpoD [9]

 Kỹ thuật giải trình tự gen

Đây là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để giải trình tự các gen kháng kháng sinh, đặc biệt là phân tích các plasmid mang gen kháng kháng sinh 33 của vi khuẩn Đây là phương pháp chính xác nhất để xác định các đặc tính kháng kháng sinh của

vi khuẩn Tính đến nay đã có hơn 800 plasmid của vi khuẩn đã được giải trình tự gen [66] Các nhà khoa học đã chứng minh tính kháng quinolone có liên quan đến

các điểm đột biến trên gen GyrA, GyrB, ParC trên DNA của vi khuẩn S.typhi [12],

[38] Hiện nay, đã có nhiều bước đột phá trong kỹ thuật giải trình tự gen như kỹ thuật “next-generation sequencing” cho phép giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn một cách nhanh chóng trong một lần giải mã so với hệ thống giải mã trình tự

cũ (chỉ giải mã được 35-700bp)

Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng cho mục đích dịch tễ học để điều tra dịch bùng phát, lây lan sinh vật và để kiểm tra cấu trúc di truyền quần thể của sinh vật nhằm hiểu rõ hơn về sự thay đổi và tiến hóa của các chủng vi khuẩn

Trong một so sánh của năm phương pháp phân loại phân tử cho các chủng N meningitidis nhóm B, PFGE, MLEE và ribotyping cho 100% tỷ lệ của tất cả các chủng hiện tại có thể được phân loại nhưng các chỉ số phân biệt về tính đa dạng di truyền của các chủng ở mỗi kỹ thuật là khác nhau, ribotyping 98,8%, với 99,4% MLEE và PFGE 99,7% [42] Mặc dù, ribotyping là phương pháp phân loại tốt, rất hữu ích cho các nghiên cứu dịch tễ dài hạn, nhưng lại là phương pháp ít hiệu quả hơn khi so sánh với PFGE [39]

MLEE được sử dụng để nghiên cứu quần thể di truyền học và dịch tễ học của

nhiều loài vi khuẩn trong đó, 107 chủng N meningitidis được phân lập ở Anh từ các

trường hợp lâm sàng Sự đa dạng di truyền của quần thể trên được ước tính là 0,7; với nhóm B (0,707) cho mức độ đa dạng di truyền cao hơn nhóm C (0,605) [6] Hạn chế của kỹ thuật này phản ánh những biến đổi di truyền rất chậm nên MLEE phù hợp cho dài hạn và dịch tễ toàn cầu MLEE là một kỹ thuật phân biệt chỉ số kiểu

gen gián tiếp và đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa

N meningitidis [6], [13], [15], [32]

MLEE chỉ phát hiện ra những alen với sự khác biệt trong mã hóa chuỗi gen dẫn đến thay đổi tính di dộng điện di, trong khi với MLST phát hiện trực tiếp các alen dựa trên sự khác biệt trình tự nucleotide MLST cho phép so sánh các kết quả từ các phòng thí nghiệm khác nhau mà không cần phải trao đổi chủng hoặc tham biến trong kỹ thuật điện di Vì vậy, nó phù hợp với việc xây dựng dữ liệu toàn cầu

mà có thể truy cập bởi các phòng thí nghiệm khác nhau để so sánh kết quả Mặc dù MLST cũng có thể trở thành “tiêu chuẩn vàng” để nghiên cứu về sự tiến hóa lâu dài

và dịch tễ học toàn cầu của N meningitidis, nhưng nó không nhạy cảm với vi tiến

hóa Vì vậy, phương pháp phân loại như PFGE nhạy cảm với vi tiến hóa được sử dụng để phát hiện những khác biệt nhỏ giữa các chủng liên quan [30], [45]

Trình tự DNA vẫn là phương pháp nhạy nhất của phát hiện tính đa hình trong một gen Trình tự bộ gen đầy đủ có thể được sử dụng để xác định các yếu tố chưa được ghi nhận như là mục tiêu có thể cho các nghiên cứu dịch tễ học So sánh trình

tự gen như một cách phân loại là không khả thi hiện nay ở hầu hết các phòng thí nghiệm Phương pháp giải trình tự cần phải được đơn giản hóa và tự động Điều này tạo thành một nhiệm vụ to lớn mà đòi hỏi sự hợp tác quốc gia và quốc tế

Cơ cấu di truyền của N meningitides rất phức tạp Có mười ba nhóm huyết

thanh được ghi nhận nhưng sáu nhóm A, B, C, X, Y và W - 135 rất quan trọng về mặt lâm sàng [37] Trong đó tỉ lệ biến thể di truyền của nhóm A thấp hơn so với nhóm B và C, cấu trúc về mặt di truyền của nhóm A tương đối đồng nhất và các bản sao tồn tạị trong một thời gian dài Đáng chú ý là với hai nhóm B, C thì các bản sao phát triển mạnh, nhưng theo thời gian thì các chủng này bị phá vỡ bởi sự tái tổ hợp [30]

Đối với các chủng nhóm huyết thanh A, các kỹ thuật như Ribotyping, RFLP, PFGE phù hợp cho việc xác định các vi biến đổi để phân biệt và tìm ra mối quan hệ giữa các chủng lưu hành trọng một vị trí địa lý Tuy nhiên, đối với các chủng thuộc nhóm huyết thanh B và C, cấu trúc di truyền đa dạng hóa tương đối nhanh chóng

nên các kỹ thuật trên trên cũng được áp dụng trong tình hình dịch bộc phát Phương pháp định lượng như MLEE và MLST thích hợp cho việc đánh giá dài hạn và dịch

tễ học toàn cầu

Việc định danh và mô tả yếu tố dịch tễ bằng phương pháp sinh học phân tử

những chủng N meningitidis phân lập xảy ra theo thời gian, không gian là hết sức

quan trọng, giúp xác định nguồn gốc và cách lây truyền Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng, từ kỹ thuật đơn giản như định phage, định danh dựa trên huyết thanh, cho tới kỹ thuật sinh học phân tử phức tạp, đòi hỏi trình độ, phương tiện máy móc hiện đại được nêu trên và một số kỹ thuật khác như phân tích plasmid, ribosom, kỹ thuật phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ plymerase), kỹ thuật phân tích đa hình các đoạn enzyme khuyếch đại RAPD, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism PCR) Song, kỹ thuật sinh học phân tử được chọn lựa nhiều nhất hiện nay để so sánh mối di truyền giữa các chủng trong cùng một loài về sinh học phân tử là kỹ thuật PFGE

2.4 Kỹ thuật PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): kỹ thuật điện di trong trường xung điện hay điện di trong trường điện thay đổi

2.4.1 Nguyên tắc chung của PFGE

Nguyên lý của kỹ thuật này là phân tách DNA trên nhiễm sắc thể bằng các enzym giới hạn để tạo ra các đoạn DNA với các kích cỡ khác nhau làm cơ sở tạo nên các kiểu hình DNA khác nhau bằng điện di gel agarose Kỹ thuật PFGE có khả năng tách những đoạn DNA có kích thước rất lớn (50 kb – 12 Mb) thành những đoạn có kích thước nhỏ dựa trên nguyên tắc đổi hướng định kỳ điện trường xung trong quá trình điện di PFGE là kỹ thuật có hiệu lực phân biệt, khả năng lặp lại cao

và thường được chọn lựa cho nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử, các vụ dịch do các tác nhân gây bệnh gây ra Kỹ thuật này lần đầu tiên được Schwartz và Cantor (1984) giới thiệu Tuy nhiên sau đó đã có nhiều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, tuy

có sai khác ít nhiều nhưng cơ sở lý thuyết của các phương pháp này là như nhau: mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh DNA có kích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như không thay

đổi theo các phương pháp điện di thông thường Tuy nhiên theo phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động của các mảnh DNA có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một trường điện không đổi Kết quả ở đây là phân

tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏ qua mắt xích agarose, tạo ra sự tách biệt trong trường điện di Trong trường hợp PFGE lực làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh DNA có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động Như vậy kết quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ

có khả năng di động khác nhau Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm [59]

Tiếp theo các mô tả của Schwartz và Cantor, Smith và Codemine (1990) đã đề cập đến sự di chuyển của các mảnh DNA khác nhau là hàm số tuyến tính với kích thước của chúng trên cơ sở đó có thể điều chỉnh các xung điện và điện trường Tuy nhiên các nhân tố khác cũng có mối tương tác lẫn nhau và ảnh hưởng đến khả năng di động của DNA như: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose cũng như nồng độ ion trong đệm [60]

2.4.2 Quy trình PFGE

Hình 2.8 Các bước thực hiện quy trình PFGE

PFGE được xem là "tiêu chuẩn vàng - gold standard" trong lựa chọn các phương pháp sinh học phân tử dùng để nghiên cứu dịch tễ học Trong kỹ thuật này, các chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường lỏng hoặc môi trường thạch, sau đó sẽ hòa vi khuẩn vào thạch agarose lỏng rồi đổ vào những khuôn nhỏ, kết quả miếng thạch sau khi đổ được cắt tạo ra các plugs nhỏ có chứa toàn bộ tế bào vi khuẩn Vi khuẩn được cố định trong thạch sẽ chịu tác dụng của enzyme ly giải tế bào để giải phóng toàn bộ DNA, tiếp theo DNA này sẽ bị phân cắt tại những vị trí đặc hiệu bởi enzyme giới hạn Các plugs chứa DNA sau khi đã được phân cắt được đặt vào những giếng tương ứng trong khuôn thạch agarose và tiến hành điện di Trong đó, bộ điện di được đặt với dòng điện thay đổi ở các khoảng được xác định trước sao cho điện trường phải cho phép các đoạn DNA có kích thước lớn khoảng 10 - 500 kb phân tách rời được với nhau Mẫu DNA sau điện di

sẽ được nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang như ethidium bromide và quan sát dưới đèn cực tím (UV light) Kết quả DNA trên thạch được chụp ảnh và phân tích theo tiêu chuẩn của Tenover và cs, 1995

Các băng được tạo ra từ các chủng N meningitidis bởi các enzyme cắt giới

hạn và độ phân giải của các băng còn lại bằng xung điện di gel trường (PFGE) Các dải băng của kỹ thuật này nhanh chóng tạo ra các mối quan hệ vô tính giữa các chủng khác nhau của viêm màng não được điều tra [23]

Bảng 2.2 Một số enzym cắt hạn chế được dùng cho kỹ thuật PFGE

Những enzyme cắt khác nhau cho các mô hình băng khác nhau Enzyne cắt

Not1 cho 34 băng khác nhau giữa 4 và 130 kbp, NheI cho16 băng từ 5 đến 400 kbp, Paci cho 14 băng từ 4 đến 400 kbp và SpeI cho 19 băng từ 6 - 300 kbp

Tính toán dựa trên các dữ liệu khác cho rằng kích thước nhiễm sắc thể N meningitidis là 1.8 – 2 Mbp Nghiên cứu cho thấy các băng PFGE có thể được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa phân lập lâm sàng với hai enzyme cắt (SfiI và

NheI) Các băng do NheI đã có khả năng phân biệt lớn hơn, phân biệt 'chủng dịch

cũ' và 'chủng dịch mới' cùng một phân nhóm Các băng của mỗi chủng cho phép

phân tích toàn bộ nhiễm sắc thể của sinh vật NheI là enzyme cắt đặc hiệu cho N meningitidis có khả năng phân cắt tạo ra những khác biệt nhỏ nhất giữa các chủng

phân nhóm khác nhau được phân lập tại thời điểm khác nhau và vị trí địa lý [24] Theo phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động của các mảnh ADN có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một trường điện không đổi Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau PFGE làm thay đổi khả năng di động nhờ trường điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh DNA có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động Sự di động khác nhau của DNA chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ không phải do gel agarose như ở phương pháp điện di thông thường

Hình 2.9 Khả năng di động của phân tử DNA trong trường xung điện [71]

Tenover và cộng sự đã đưa ra một hệ thống tiêu chuẩn để giải thích những mẫu PFGE trong mối tương quan để xác định sự liên quan giữa các chủng vi khuẩn phân lập được Trong đó, những chủng vi khuẩn tạo ra các mẫu PFGE tương ứng giống nhau được xem là có nguồn gốc từ một chủng

Mức độ tương đồng genome của các chủng vi khuẩn được chia thành các cấp độ khi phân tích bằng PFGE:

- Không thể phân biệt được (không có sự khác biệt, Indistinguishable): thể hiện số băng trên gel như nhau và kích thướt các băng tương tự nhau Đây có thể là cùng 1 chủng gây bệnh và là chủng đại điện cho ổ dịch Những chủng này cũng có thể không phân biệt được bằng các phương pháp khác

- Liên hệ rất gần (closely related): những chủng có sự khác biệt rất nhỏ chỉ với 1 yếu tố di truyền phân tử như 1 điểm đột biến, mất đi hoặc chèn thêm vào 1 đoạn DNA Khi phân tích PFGE, các chủng này thể hiện sự sai khác ở 2 - 3 băng Những chủng này có thể là những chủng tham gia gây nên ổ dịch và có đặc điểm dịch tễ của bệnh tương đối giống nhau

- Có thể có liên hệ (possibly related): gồm những chủng có 2 điểm khác biệt về di truyền phân tử độc lập, thể hiện có trên gel là có 4 - 6 băng khác nhau Những chủng này có rất ít đặc điểm về dịch tễ với nhau như xa về vùng địa lý, đặc điểm khí hậu,

- Không có liên hệ: có ít nhất 3 yếu tố di truyền phân tử độc lập khác nhau, thể hiện có ít nhất 7 băng khác nhau Các chủng này không có liên hệ với nhau về đặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như khả năng gây bệnh

Các chủng vi khuẩn được xếp vào các nhóm không thể phân biệt, liên hệ rất gần và có thể có liên hệ thường có mức độ tương đồng trên 85% Vì vậy, tiêu chuẩn này có thể áp dụng được đối các nghiên cứu ở địa phương nhỏ, trong đó sự khác biệt về gen được xem là có giới hạn

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn tương đồng về kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE [21]

(Indistinguishabble)

2 – 3 Có mối liên hệ gần (Closely related)

4 – 6 Có thể có liên hệ (Possibly related)

2.4.3 So sánh kỹ thuật PFGE với các phương pháp phân loại sinh học phân tử khác thường được sử dụng trong nghiên cứu

• PFGE phân nhóm đã được áp dụng thành công để phân nhóm của nhiều loại

vi khuẩn gây bệnh và có phù hợp cao với độ liên quan dịch tễ học

• PFGE phân biệt rõ ràng hơn so với các phương pháp phân loại khác như ribotyping hoặc multilocus sequence typing cho nhiều loại vi khuẩn

• PFGE trong các định dạng cơ bản tương tự có thể được áp dụng như một phương pháp chung cho phân nhóm của vi khuẩn Chỉ có những sự lựa chọn của các enzyme và các điều kiện cho điện hạn chế cần phải được tối ưu hóa cho từng loài

• Không phân biệt được giữa các bands không liên quan

• Kết quả mẫu khác nhau chút ít giữa các kỹ thuật viên

• Mối quan hệ nên được sử dụng như một hướng dẫn, không phải biện pháp phát sinh loài thực

• Một số chủng không thể được phát hiện bằng PFGE

Để nghiên cứu dịch tễ học phân tử hay xác định nguồn gốc của vi khuẩn, kỹ thuật PFGE luôn được lựa chọn dựa trên nhiều ưu điểm, đồng thời cũng phụ thuộc vào thực tiễn và nghiên cứu phù hợp với dịch tễ học

Hiện nay, với sự giúp đỡ của máy tính và phần mềm phân tích kết quả điện di trên thạch, PFGE có thể tạo ra ngân hàng số liệu về những mẫu phân tách ADN với