Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước và bảo quản đậu hũ được sản xuất theo phương pháp kết tủa bằng nước chua

LỜI CÁM ƠN Qua hơn 3 tháng thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất theo phương pháp kết tủa bằng nước chua” đến nay đ

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan toàn bộ nội dung đồ án tốt nghiệp là của riêng em Các kết quả nghiên cứu đƣa ra trong đồ án này do em tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan, không sao chép của bất kỳ kết quả nghiên cứu nào của các tác giả khác Nội dung của đồ án có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu từ các nguồn sách, tạp chí đƣợc liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Linh Chi

LỜI CÁM ƠN

Qua hơn 3 tháng thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất theo phương pháp kết tủa bằng nước chua” đến nay đã được hoàn thành

Em xin cám ơn BGH trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cùng tất cả quý Thầy Cô, bạn bè trong phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt

đề tài

Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn đến TS Nguyễn Lệ Hà, Cô đã tận tình giúp

đỡ và hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Bên cạnh những nỗ lực của bản thân thì đây vẫn là một lĩnh vực khá mới, đòi hỏi chuyên môn sâu và kinh nghiệm thực tế Song, do bản thân còn nhiều hạn chế

về kiến thức, kinh nghiệm cũng như gặp phải một số khó khăn trong việc sưu tầm tài liệu và những thông tin cần thiết có liên quan đến đề tài nên những thiếu sót trong việc phân tích, trình bày đồ án là không thể tránh khỏi Em rất mong nhận được sự chỉ dẫn thêm từ quý Thầy Cô

Kính chúc mọi người luôn dồi dào sức khỏe, vui vẻ và luôn thành công trong công việc

Tp Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 07 năm 2014

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Linh Chi

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích và nội dung nghiên cứu 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đậu hũ 3

1.1.1 Giới thiệu về đậu nành 3

1.1.1.2.1 Tính tan 4

1.1.2 Quy trình sản xuất đậu hũ 6

1.1.3 Các chỉ tiêu chất lượng của đậu hũ 11

1.1.4 Những nguyên nhân và biến đổi gây hư hỏng đậu hũ 13

1.2 Tổng quan về chitin - chitosan 15

1.2.1 Giới thiệu về chitin – chitosan 15

1.2.2 Cấu trúc hóa học của chitin – chitosan 16

1.2.3 Tính chất của chitosan 18

1.2.4 Các phương pháp thu nhận chitosan 25

1.2.5 Chitosan tan trong nước (WSC) 28

1.2.6 Ứng dụng của chitosan trong thực phẩm 30

CHƯƠNG 2.NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Nguyên vật liệu 34

2.1.1 Nguyên liệu 34

2.1.2 Vật liệu 34

2.2 Bố trí thí nghiệm 34

2.2.1 Chuẩn bị cho nghiên cứu 34

2.2.3 Tiến hành thí nghiệm 37

2.2.4 Phương pháp sử dụng trong nghiên cứu 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Một số thông số cơ bản của đậu hũ dùng trong nghiên cứu 39

3.2 Nghiên cứu quá trình biến đổi của đậu hũ trong thời gian bảo quản 39

3.2.1 Khảo sát biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 39

3.2.2 Khảo sát độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 42

3.2.3 Khảo sát chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 44

3.2.4 Khảo sát chỉ tiêu nấm men – nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 46

3.2.5 Khảo sát chỉ tiêu E coli trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 48

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PCA: Plate Count Agar

PDA: Potato Dextrose Agar

SCA: Simmon Citrate Agar

TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam

TPC: tổng vi sinh vật hiếu khí

VP: Voges – Proskauer

WSC: chitosan hòa tan trong nước

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.3 Hàm lượng acid amin không thay thế trong protein đậu nành 4

Bảng 1.4 So sánh hai phương pháp đông tụ protein trong sữa đậu nành 10

Bảng 1.5 Chỉ tiêu cảm quan của đậu hũ (TCVN 4978 : 1997) 11

Bảng 1.6 Chỉ tiêu vi sinh của đậu hũ (Lê Văn Việt Mẫn, 2011) 12

Bảng 1.7 Chỉ tiêu hóa lý của đậu hũ (TCVN 49 : 78) 12

Bảng 1.8 Tính chất chitosan sản xuất từ chitin chiết rút bằng phương pháp hóa học và sinh học 27

Bảng 1.9 Bảng so sánh các tính chất của chitosan tan trong acid và chitosan tan trong nước 29

Bảng 2.1 Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của dung dịch ngâm đậu hũ 38

Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu được xác định của đậu hũ dùng trong nghiên cứu 39

Bảng 3.2 Giá trị pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 39

Bảng 3.3 Giá trị độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 42

Bảng 3.4 Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 44

Bảng 3.5 Mật độ nấm men nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 46

Bảng 3.6 Số lượng E coli giả định trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ quy trình sản xuất đậu hũ 7

Hình 1.2 Cấu tạo hóa học của chitin 16

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của chitosan 17

Hình 1.4 Sơ đồ sản xuất và thu nhận chitosan 27

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36

Hình 3.1 Biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 40

Hình 3.2 Biến đổi độ đục của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 43

Hình 3.3 Biến đổi về tổng vi sinh vật hiếu khí của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 45

Hình 3.4 Biến đổi về nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 47

Hình 3.5 Biến đổi về E coli giả định của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh 49

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu hũ là một sản phẩm được ưa chuộng của người châu Á, thích hợp cho nhiều đối tượng do dễ tiêu hóa, dễ sử dụng, ít cholesterol và chất béo bão hòa… rất tốt cho sức khỏe của con người

Tuy nhiên, đậu hũ khó bảo quản và dễ hư hỏng do thành phần giàu dinh dưỡng và chứa hàm lượng nước cao, thời hạn sử dụng cao nhất của đậu hũ là từ 1 đến 2 ngày trong điều kiện bình thường (Dotson và cộng sự, 1977; Kovats và cộng

sự, 1984) Vì vậy, nhiều người sản xuất đã bổ sung thạch cao, chất phụ gia hoặc chất bảo quản trong quá trình sản xuất để kéo dài thời gian bảo quản, điều này gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng

Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang cố gắng tìm ra các chất bảo quản có hoạt tính sinh học để thay thế cho chất bảo quản hóa học, và một trong những chất đó là chitosan Chitosan là polysaccharide nhiều thứ hai sau cellulose được tìm thấy trong

tự nhiên, đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng chitosan trong thực tế như nông nghiệp, công nghiệp, y dược, bảo vệ môi trường, chất bảo vệ hoa quả,…

Một số nước như Nhật Bản, Hàn Quốc đã có nghiên cứu khoa học về ứng dụng chitosan vào bảo quản đậu hũ Ở Việt Nam chưa có báo cáo khoa học nào về

đề tài này, vì vậy, chúng tôi muốn thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất bằng phương pháp kết tủa nước chua” trong điều kiện khí hậu cũng như nguồn nguyên liệu của Việt

Nam

2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

Mục đích chung của đồ án là nghiên cứu khả năng sử dụng chitosan hòa tan trong nước để kéo dài thời gian bảo quản đậu hũ sản xuất theo phương pháp kết tủa bằng nước chua Để đạt được mục đích này, nghiên cứu tập trung vào một số nội dung sau:

- Phân tích một số chỉ tiêu cơ bản của đậu hũ dùng trong nghiên cứu

- Theo dõi biến đổi chất lượng của đậu hũ thông qua dung dịch ngâm đậu hũ trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về đậu hũ

1.1.1 Giới thiệu về đậu nành

1.1.1.1 Khái quát về đậu nành

Đậu nành là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại được trồng từ

hơn 5000 năm trước, có tên khoa học là Glycine Maxx Merril

Bảng 1.1 Thành phần của hạt đậu nành (Nguyễn Thị Hiền, 2006)

Thành

phần của

hạt

Tỷ lệ (%)

Protein (%)

Lipid (%)

Tro (%)

Chất bột đường (%)

Đậu nành cũng như tất cả các hạt khác đều chứa enzyme cần thiết cho quá trình nảy mầm Về mặt công nghệ thì enzyme quan trọng của đậu nành là lipoxygenase Enzyme này xúc tác cho phản ứng oxy hóa acid béo không bão hòa, gây mùi hôi cho đậu nành

Bảng 1.3 Hàm lượng acid amin không thay thế trong protein đậu nành

Các acid amin không thay thế

là đặc tính kết tủa của protein đậu nành Protein đậu kết tủa ở pI = 4,5

Tính tan của protein đậu nành còn bị ảnh hưởng bởi lực ion Ở pH=6,8 lực ion ít ảnh hưởng, ở pH = 2 lực ion làm giảm tính tan, ở pH = 4,7 lực ion làm tăng tính tan

Tính tan của protein đậu nành còn bị ảnh hưởng bởi chế độ xử lý nhiệt Nhiệt

xử lý làm biến tính và giảm tính tan của protein đậu nành, sau đó một số protein có thể phân cắt thành các thành phần nhỏ hơn và tan lại

1.1.1.2.2 Khả năng hấp thụ và giữ nước

Khả năng hấp thụ và giữ nước của protein dựa trên tương tác giữa protein – protein và protein – nước Khi nồng độ protein tăng, khả năng hấp thụ nước tăng

Khi pH thay đổi thì sự tích điện của protein cũng thay đổi Do đó, ở điểm đẳng điện, sự hút nước là thấp nhất vì tương tác giữa protein – protein rất chặt chẽ

Ở pH cao hơn và thấp hơn pI, sự hấp thụ và giữ nước của protein tăng

Khi nhiệt độ tăng, khả năng hấp thụ nước giảm vì giảm các liên kết hydro nhưng làm tăng các liên kết khác như liên kết disunfide…

1.1.1.2.3 Khả năng tạo gel

Protein đậu nành có khả năng tạo gel Khi đó protein tạo mạng lưới giữ các phân tử nước lại cho thực phẩm chứa nhiều nước và có sự liên kết chặt chẽ như cấu trúc của agar

Khi protein bị biến tính, các cấu trúc bậc cao bị phá hủy, các mạch polypeptide duỗi ra, tiến lại gần nhau, tiếp xúc và tạo nên mạng lưới không gian tương đối chặt chẽ

Các yếu tố gây tạo gel:

 Sử dụng nhiệt: khi dịch sữa protein đậu nành có nồng độ cao được đun nóng ở pH trung tính thì sẽ tạo gel

 Sử dụng pH đẳng điện: ở pH đẳng điện, protein có khả năng tạo gel

 Sử dụng các muối của ion kim loại hóa trị 2: nhờ liên kết giữa Ca2+,

Mg2+ và nhóm carboxyl

1.1.1.2.4 Khả năng tạo kết cấu

Protein đậu nành có khả năng tạo sợi tốt Khi protein bị phân ly, chuỗi polypeptide duỗi mạch và cho qua khuôn đúc sẽ định hướng được các phân tử protein và các sợi hình thành

1.1.1.2.5 Khả năng tạo nhũ

Trong phân tử protein đậu nành có đầu ưa nước và ưa béo nên có khả năng

làm bền hệ nhũ tương chất béo/nước

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo nhũ:

 pH: ở điểm đẳng điện, khả năng hòa tan là thấp nhất nên khả năng tạo nhũ giảm

 Nhiệt độ: gia nhiệt và cô đặc làm đông tụ protein nên làm giảm độ bền của nhũ tương, nhưng do khả năng tạo gel đã tạo nên lớp màng protein và chất béo (tàu hũ ki)

1.1.2 Quy trình sản xuất đậu hũ

1.1.2.1 Quy trình sản xuất đậu hũ

Hình 1.1 Sơ đồ quy trình sản xuất đậu hũ

Đậu hũ

1.1.2.2 Thuyết minh quy trình

Quá trình này xảy ra hai giai đoạn:

 Giai đoạn đầu xảy ra quá trình solvat hóa Ở giai đoạn này các liên kết trong hạt đậu chưa bị phá vỡ

 Giai đoạn hai xảy ra khi các phân tử nước tiếp tục tác động và làm phá vỡ liên kết các phân tử trong hạt đậu, chuyển chúng sang trạng thái dịch thể keo linh động nằm trong các tế bào hạt đậu

Thời gian ngâm:

 Nhiệt độ ngoài trời từ 15oC – 25oC, ta ngâm 5 – 6 giờ

 Nhiệt độ ngoài trời từ 25oC – 30oC, ta ngâm 3 – 4 giờ

 Kết thúc giai đoạn ngâm là thời điểm độ ẩm hạt đậu đạt 55% - 65% là tốt nhất

1.1.2.2.3 Đãi vỏ

Mục đích: Sau khi ngâm, vỏ tách khỏi hạt đậu nành, tránh một số thành phần không mong muốn có trong vỏ hạt như sắc tố, chất chát,… đi vào sữa đậu khi xay, làm giảm chất lượng của đậu hũ

1.1.2.2.4 Xay

Mục đích: Dùng lực cơ học để phá vỡ tế bào, nhằm giải phóng protein, lipid, glucid, Nhờ có nước hòa tan các chất này và sẽ chuyển chúng sang dạng huyền phù

Các biến đổi:

 Kích thước hạt đậu nành giảm đáng kể thành các hạt mịn

 Nhiệt độ tăng do ma sát giữa các hạt rắn trong quá trình xay

 Hóa lý: đây là biến đổi quan trọng vì các chất dinh dưỡng trong đậu nành được trích ly vào nước, đậu nành chuyển từ trạng thái hạt rời thành hỗn hợp huyền phù gọi là sữa đậu nành thô

 Hóa sinh: có thể xảy ra phản ứng oxy hóa do enzyme lipoxygenase xúc tác Enzyme này được giải phóng ra khi tế bào hạt đậu bị phá vỡ Tuy nhiên, phản ứng xảy ra không đáng kể vì quá trình xay được thực hiện trong nước

1.1.2.2.5 Lọc

Sau khi xay ta có một dung dịch huyền phù, gồm có dung dịch keo và những chất rắn không tan trong nước Trong quá trình tách dung dịch keo khỏi các chất rắn sẽ xảy ra hiện tượng các chất rắn sẽ giữ trên mặt nó những tiểu phần keo, vì vậy phải dùng nước rửa lại phần bã Lượng nước dùng để rửa không nên quá nhiều

1.1.2.2.6 Gia nhiệt

Mục đích gia nhiệt:

 Ức chế enzyme và tiêu diệt toàn bộ các hệ vi sinh vật có mặt trong sữa

 Loại bỏ những hợp chất gây mùi khó chịu trong dịch sữa

 Phá vỡ lớp solvat (lớp nước bao quanh) tạo điều kiện cho các phần tử sữa gần lại nhau hơn và dễ keo tụ hơn

Các biến đổi:

 Độ nhớt của dịch sữa giảm khi nhiệt độ tăng

 Một số phản ứng phân hủy xảy ra làm tổn thất các thành phần dinh dưỡng trong dịch sữa

 Các thành phần đường khử và acid amin tham gia phản ứng Maillard làm cho dịch sữa bị sậm màu

1.1.2.2.7 Kết tủa

Một số phương pháp kết tủa protein đậu nành:

- Kết tủa bằng ion kim loại kiềm thổ kết hợp với nhiệt độ

 Các muối đông tụ protein đậu nành: CaSO4, MgSO4, CaCl2, MgCl2…

 Quá trình cho chất đông tụ vào đơn giản, dễ kiểm soát, có thể chỉ cho một lần vào dung dịch

 Cơ chế đông tụ: đông tụ bằng muối của ion kim loại kiềm thổ xảy ra theo hai bước:

+ Bước 1: protein bị biến tính bởi nhiệt, các mạch polypeptide duỗi ra làm lộ các gốc –COO-

+ Bước 2: cation hóa trị 2 (kim loại kiềm thổ) cho vào sẽ liên kết các mạch protein lại với nhau nhờ các gốc –COO-, làm cho khối protein bị đông tụ

- Kết tủa bằng acid thực phẩm kết hợp với nhiệt độ

 Các acid thực phẩm được dùng làm tác nhân gây đông tụ protein như: acid acetic, acid lactic, acid citric, glucono – delta – lactone (GDL)… Trong các acid nói trên, acid lactic được sử dụng nhiều nhất

 Acid lactic: có dạng lỏng, không thuận lợi cho việc vận chuyển, sử dụng Ở các cơ sở sản xuất đậu hũ quy mô gia đình, người ta dùng nước chua – là acid lactic được tạo ra bằng cách lên men phần nước trong của sữa đậu nành sau khi tách protein

Bảng 1.4 So sánh hai phương pháp đông tụ protein trong sữa đậu nành

Các yếu tố Đông tụ bằng CaSO4 Đông tụ bằng acid thực phẩm Thời gian bảo quản Sản phẩm có pH = 6 – 6,8

nên thời gian bảo quản ngắn

Sản phẩm có pH = 5 – 5,5, khả năng ức chế vi sinh vật cao nên bảo quản lâu hơn

Mùi vị Không có mùi thơm đặc

1.1.3 Các chỉ tiêu chất lượng của đậu hũ

Bảng 1.5 Chỉ tiêu cảm quan của đậu hũ (TCVN 4978 : 1997)

Hình dạng Sản phẩm có dạng hình hộp đáy chữ nhật, không bị vỡ nát

Cho phép không quá 20% sản phẩm bị mất góc và sứt mẻ Khối lƣợng sản phẩm bị mất góc và sứt mẻ không quá 5%

Màu sắc Bề mặt màu trắng ngà, mặt cắt màu trắng

Mùi vị Mùi thơm, vị ngon của đậu hũ không có mùi ôi, chua, khê và

các mùi vị lạ khác

Tạp chất Không có cát sạn, mảnh vụn của cháy đậu và các loại tạp chất

khác

Trạng thái Bề mặt đậu hũ mịn, sờ vào hơi ráp tay, không mủn bột Khi

sản xuất xong, để nguội ở nhiệt độ phòng, đậu hũ phải dẻo, khi cầm ở giữa miếng đậu không bị nứt Mặt cắt của đậu hũ

mịn, nhẵn trên mặt cắt ngang của đậu hũ có lỗ hổng không quá 3 Ăn sống có cảm giác béo ngậy, dai Miếng đậu khi ráng phải nở đều

Bảng 1.6 Chỉ tiêu vi sinh của đậu hũ (Lê Văn Việt Mẫn, 2011)

Bảng 1.7 Chỉ tiêu hóa lý của đậu hũ (TCVN 49 : 78)

1.1.4 Những nguyên nhân và biến đổi gây hư hỏng đậu hũ

1.1.4.1 Những nguyên nhân gây hư hỏng đậu hũ

Có 2 nguyên nhân cơ bản dẫn đến giảm chất lượng và hư hỏng thực phẩm:

do hoạt động của vi sinh vật và do hoạt động sinh lý, sinh hóa của nguyên liệu Ngoài ra, các yếu tố khác như độ ẩm môi trường, ánh sáng, không khí cũng ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng của thực phẩm

Các vi sinh vật gây hư hỏng bao gồm vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và một

số loại tảo, kí sinh trùng, virus Khi xâm nhập vào thực phẩm, đầu tiên vi sinh vật

sẽ phát triển về mặt số lượng, trong quá trình đó chúng tiết ra các sản phẩm thải, làm biến đổi màu sắc, trạng thái, mùi vị của thực phẩm dẫn đến hư hỏng hoặc giảm chất lượng thực phẩm

Vi khuẩn có khả năng tiết ra nhiều enzyme hỗn hợp có thể phân hủy được tất

cả các thành phần protein, glucid, lipid có trong thực phẩm Sự lên men glucid hình thành các acid hữu cơ làm cho môi trường trở nên acid Trong quá trình này, các acid được tạo thành như acid acetic, acid lactic, … ức chế vi sinh vật gây thối Nấm men, nấm mốc tiêu thụ các acid làm cho môi trường trở nên trung tính Vi sinh vật gây thối bắt đầu phát triển chuyển hóa protid thành peptid, acid amin,… và cuối cùng là các chất đơn giản bay hơi có mùi khó chịu như NH3, H2S, indol, phenol,…

Quá trình hư hỏng đậu hũ luôn bắt đầu từ bề mặt sau đó mới đi dần vào bên trong Thường trong giai đoạn đầu các vi khuẩn chứa enzyme hỗn hợp sẽ nhân lên trước và hoạt động mạnh mẽ để khai phá nguyên liệu, sau đó đến lượt các vi khuẩn chứa enzyme đơn tiến hành phân hủy thực phẩm một cách mạnh mẽ và triệt để Cùng với các enzyme do vi sinh vật tiết ra thì đồng thời những enzyme có sẵn trong bản thân khối thực phẩm cũng bị kích hoạt và tham gia vào các phản ứng phân hủy làm tăng tốc độ hư hỏng của thực phẩm

Đậu hũ là loại thực phẩm chứa nhiều protein, glucid và lipid Mặt khác, hàm lượng nước trong đậu hũ rất cao, đây là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật gây hư hỏng phát triển

1.1.4.2 Những biến đổi của đậu hũ trong quá trình hư hỏng

- Biến đổi protein:

Từ các chất đạm tạo ra các chất như: amoniac, phenol, indol…và các amin như: putresin, tyramin, histamin,…

Yếu tố quyết định tốc độ quá trình hư hỏng là nhiệt độ, độ ẩm tương đối của không khí và mức độ nhiễm vi sinh vật ban đầu Quá trình biến đổi protein thể hiện qua các dạng thối rữa, lên mốc, đổi màu, hóa nhầy…

- Sự lên men thối: quá trình lên men thối được chia làm 3 giai đoạn:

 Quá trình thủy phân protein dưới tác dụng của enzyme protease do vi sinh vật tiết ra tạo thành nhiều sản phẩm trung gian và cuối cùng là acid amin

 Quá trình khử acid amin thành amoniac, acid (acetic, propyonic, butyric), rượu (propyolic, butylic, amylic), H2S, indol, skatol

 Các chất hữu cơ được tạo thành do sự phân hủy sơ bộ acid amin lại tiếp tục chuyển hóa Tùy theo loại vi sinh vật và điều kiện môi trường mà các hợp chất

đó bị oxy hóa hoàn toàn cho ra các hợp chất vô cơ như CO2, H2O, NH3, H2S Trong điều kiện kỵ khí sẽ cho ra các acid hữu cơ, rượu, amin, trong đó có nhiều chất độc

và mùi hôi thối

Các vi khuẩn hiếu khí hoạt động mạnh như Bacterium Vulgaris, Bacterium Paecalis, Pseudomonas Fiuoresen,… vi khuẩn yếm khí như Bacillus Spectogennes, Bacillus Putripicus, Bacillus Putripiciens, Bacillus Postamus, Clostridium Butulinum, Clostridium Sporogenes…

- Sự lên men chua:

Trong quá trình lên men chua xảy ra hàng loạt các quá trình: quá trình tăng sinh khối của vi sinh vật tạo ra acid lactic, quá trình ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối bởi acid lactic và muối Quá trình này xảy ra 3 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: đường và các chất hòa tan có trong dịch bào của mô thực vật được thẩm thấu ra ngoài tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic và một số vi sinh vật khác phát triển

 Giai đoạn 2: Trong giai đoạn này, sinh khối của vi khuẩn lactic đạt cao nhất Đồng thời acid lactic tích tụ nhiều, pH của dịch giảm Do tác dụng của vi khuẩn lactic mà các vi khuẩn gây thối phát triển rất nhanh Cuối giai đoạn này lượng acid lactic tích tụ cực đại nên quá trình chyển sang giai đoạn 3

 Giai đoạn 3: Vi khuẩn lactic chết dần trong khi nấm mốc và nấm men lại tăng dần số lượng Acid lactic bắt đầu giảm nên sản phẩm hư hỏng nhanh

- Biến đổi lipid:

 Sự hóa chua lipid (sự thủy phân): sự tạo thành gốc tự do do hoạt động của enzyme Dạng phân giải lipid này liên quan đến cả hai quá trình thủy phân lipid và

sự oxy hóa acid béo do hoạt động của enzyme lipoxydase Quá trình thủy phân lipid gây ra do vi sinh vật hoặc enzyme lipase nội tại Bước đầu tiên của phản ứng này là

sự thủy phân triglyceride tạo thành glycerol và các acid béo tự do Glycerol làm tăng độ nhớt, nhầy của chất béo Các acid béo tạo ra càng nhiều càng làm cho thực phẩm bị chua (chỉ số acid tăng cao, chất lượng chất béo giảm)

 Oxy hóa: dưới tác động của enzyme lipoxydase và oxy không khí Sau khi thủy phân các sản phẩm glycerin và các chất béo tiếp tục bị oxy hóa tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau, trong đó nhiều sản phẩm độc hại như: peroxyde, hydroperoxyde, ceton,… Các sản phẩm này làm cho thực phẩm có mùi khó chịu

1.2 Tổng quan về chitin - chitosan

1.2.1 Giới thiệu về chitin – chitosan

Chitin, chitosan là những polysaccharide tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ 2 sau cellulose)

Chitin lần đầu tiên được tìm thấy trong nấm bởi nhà khoa học người Pháp Braconnot vào năm 1811, nó cũng được tách ra từ biểu bì của sâu bọ và được đặt tên là chitin, có nghĩa là bao bọc, tức là vỏ bọc của cuộc sống trong tiếng Hy Lạp, bởi nhà khoa học người Pháp Odier vào năm 1823

Và chất được khử acetyl từ chitin đã được khám phá bởi Roughet vào năm

1859, nó được đặt tên là chitosan bởi nhà khoa học người Ðức Hoppe Seyler vào năm 1894 Chitosan (được chuyển hoá từ chitin) rất độc đáo, là polymer hữu cơ tự

nhiên duy nhất mang điện tích dương do có những nhóm amino tự do tích điện dương, điều này khiến cho chitosan có những thuộc tính đặc biệt hơn nhóm amide của chitin

Cho đến hôm nay, việc sử dụng hợp chất thiên nhiên này vẫn còn rất ít, vì chitin/chitosan dù dồi dào nhưng lại ở các nguồn phân tán quá rộng, đặc biệt hàm lượng chứa trong các nguồn ấy thường nhỏ, không đạt hiệu quả kinh tế (giá thành điều chế chitosan còn rất đắt) Hơn nữa, cả chitin và chitosan đều rất khó tan trong các dung môi thông thường và các phản ứng hoá học nhằm biến tính chúng đều tốn kém và có hiệu suất thấp

1.2.2 Cấu trúc hóa học của chitin – chitosan

1.2.2.1 Cấu trúc hóa học của chitin

Chitin là polysaccharide mạch thẳng, có thể xem như là dẫn xuất của cellulose, trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm acetyl amino (-NHCOCH3) (cấu trúc I) Như vậy chitin là poly-(N-acety-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β-(C-1-4) glycoside Trong đó các mắt xích của chitin cũng được đánh số như của glucose

Hình 1.2 Cấu tạo hóa học của chitin Tên gọi: poly(1 – 4) – 2- acetamido – 2 – deoxy – β- D- Glucose

Công thức phân tử : [ C8H13O5N ]n

Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n

1.2.2.2 Cấu trúc hóa học của chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2)

Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycozide, do vậy chitosan có thể gọi là poly β-(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose hoặc là poly β-(1,4)-D-glucosamine (cấu trúc III)

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của chitosan Tên gọi: Poly(1,4) – 2- amino- 2- deoxy- β- D- glucose

Công thức phân tử: [ C6H11O4N ]n

Phân tử lượng: Mchitosan= (161,07)n

Qua cấu trúc hóa học của chitin và chitosan, ta thấy chitin chỉ có 1 nhóm chức hoạt động là –OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hidoxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh), còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là –OH và –NH2,

do đó dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin

Chitin có cấu trúc thuộc họ polysaccharide, hình thái tự nhiên ở dạng rắn Do

đó, các phương pháp nhận dạng chitin, xác định tính chất, phương pháp hoá học để

biến tính chitin cũng như việc sử dụng và lựa chọn các ứng dụng của chitin gặp nhiều khó khăn

Mặt khác, khả năng ứng dụng của chitin thường thấp hơn so với các dẫn xuất của nó như chitosan, glucosamine, vì vậy chitin thường được sử dụng để điều chế các dẫn xuất của nó Chitosan là một chất có nhiều đặc tính hóa học thích hợp nên được nghiên cứu sử dụng trong nhiều ngành lĩnh vực

1.2.3 Tính chất của chitosan

1.2.3.1 Mức độ deacetyl hóa

Quá trình deacetyl hóa bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân

tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao Mức độ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi

vì nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của chitosan sau này Mức độ deacetyl hóa của chitosan vào khoảng 56% - 99% (nhìn chung là 80%) phụ thuộc vào loài giáp xác và phương pháp sử dụng Chitin có mức độ deacetyl hóa khoảng 75% trở lên thường được gọi là chitosan

Phương pháp để xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan bao gồm thử ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ bằng HI…

1.2.3.2 Trọng lượng phân tử

Chitosan là polymer sinh học có khối lượng phân tử cao Giống như cấu tạo, khối lượng nguồn nguyên liệu và phương pháp chế biến Khối lượng chitin thường lớn hơn 1 triệu Da trong khi các sản phẩm chitosan thương phẩm có khối lượng khoảng 100,000 – 1,200,000 Da, phụ thuộc quá trình chế biến và loại sản phẩm Thông thường, ở nhiệt độ cao, sự có mặt của oxy và sức kéo có thể dẫn đến phân hủy chitosan Giới hạn nhiệt độ là 280°C, sự phân hủy do nhiệt xảy ra và mạch

polymer nhanh chóng bị phá vỡ, do đó khối lượng phân tử giảm

1.2.3.3 Độ nhớt

Độ nhớt là một nhân tố quan trọng để xác định khối lượng phân tử của chitosan Chitosan phân tử lượng cao thường làm cho dung dịch có độ nhớt cao, điều này có thể không mong muốn trong đóng gói công nghiệp

Một số nhân tố trong quá trình sản xuất như mức độ deacetyl hóa, khối lượng nguyên tử, nồng độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sản xuất chitosan và tính chất của nó Quá trình loại protein trong dung dịch NaOH 3% và sự khử trong quá trình khử khoáng làm giảm độ nhớt của dung dịch chitosan thành phẩm Tương tự như vậy, độ nhớt của chitosan bị ảnh hưởng đáng kể bởi các biện pháp xử lý vật lý (nghiền, gia nhiệt, hấp khử trùng, siêu âm)

và hóa học (xử lý bằng ozone), trừ quá trình làm lạnh thì độ nhớt sẽ giảm khi thời gian và nhiệt độ xử lý tăng Dung dịch chitosan bảo quản ở 4°C được cho là ổn định nhất

Tỉ lệ nồng độ giữa chitosan và acid rất quan trọng Ở nồng độ dung môi hữu cơ cao hơn 50%, chitosan vẫn hoạt động như là một chất gây nhớt giúp cho dung dịch mịn Một số nhân tố ảnh hưởng đến dung dịch chitosan bao gồm nhiệt

độ và thời gian quá trình deacetyl hóa, nồng độ các chất kiềm, việc xử lý sơ bộ, kích thước của các phần tử

1.2.3.5 Khả năng kết hợp với nước (WBC) và khả năng kết hợp với chất béo (FBC)

Sự hấp thụ nước của chitosan lớn hơn rất nhiều so với cellulose hay chitin Thông thường, khả năng hấp thụ của chitosan khoảng 581 - 1150% (trung bình là 702%), và sự thay đổi trong thứ tự sản xuất như quá trình khử khoáng và khử protein cũng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng giữ nước và giữ chất béo Sự khử

protein sau quá trình khử khoáng sẽ làm khả năng giữ nước tăng Bên cạnh đó quá trình khử màu cũng là nguyên nhân làm giảm khả năng này của chitosan

Khả năng hấp thụ chất béo của chitin và chitosan trong khoảng 315 - 170%, chitosan có khả năng thấp hơn rất nhiều chitin Bước tẩy trắng trong quá trình sản xuất làm giảm khả năng này cũng như ảng hưởng đến độ nhớt của chitosan Các bước tiến hành theo thứ tự: khử khoáng, khử protein, deacetyl hóa sẽ làm tăng khả năng này hơn là theo thứ tự khử protein, khử khoáng, deacetyl hóa

1.2.3.6 Khả năng tạo màng

Chitosan có khả năng tạo màng sử dụng trong bảo quản thực phẩm nhằm hạn chế các tác nhân gây bệnh trong các sản phẩm đóng gói thịt, cá tươi hay đã qua chế biến

 Khi dùng màng chitosan, dễ dàng điều chỉnh độ ẩm, độ thoáng không khí cho thực phẩm Nếu dùng bao gói bằng PE thì mức cung cấp oxy bị hạn chế, nước sẽ bị ngưng đọng tạo môi trường cho nấm mốc phát triển

 Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương với một số chất dẻo vẫn được dùng làm bao gói

 Màng chitosan làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả Rau quả sau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị Rau quả

bị thâm là do quá trình lên men tạo ra các sản phẩm polymer hóa của oquinon Nhờ bao gói bằng màng chitosan mà ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, làm thành phần của anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho rau quả tươi lâu hơn

Cách tạo màng chitosan:

 Chitosan được nghiền nhỏ bằng máy để gia tăng bề mặt tiếp xúc

 Pha dung dịch chitosan 3% trong dung dịch acid acetic 1,5%

 Sau đó bổ sung chất phụ gia PEG - EG 10% (tỷ lệ 1:1) vào và trộn đều, để yên một lúc để loại bọt khí

 Sau đó đem hỗn hợp thu được quét đều lên một ống inox đã được nung nóng ở nhiệt độ 64 - 65°C (ống inox được nâng nhiệt bằng hơi nước)

 Để khô màng trong vòng 35 phút rồi tách màng

 Lúc này người ta thu được một vỏ bóng có màu vàng ngà, không mùi vị, đó là lớp màng chitosan có những tính năng mới ưu việt

1.2.3.7 Tính kháng khuẩn của chitosan

Cơ chế chính xác về hoạt động kháng khuẩn của chitosan, chitin và các dẫn xuất của chúng vẫn chưa được biết đến đầy đủ Tuy nhiên hiện nay có 2 cơ chế được quan tâm:

- Cơ chế thứ nhất:

Chitosan là đại phân tử tích điện dương, trong khi màng tế bào vi sinh vật đa

số tích điện âm, do đó xảy ra tương tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật bị

hư hỏng, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng tế bào, đồng thời làm xuất hiện những lỗ hổng trên thành tế bào, tạo điều kiện để protein và các thành phần cấu tạo của tế bào bị thoát ra ngoài dẫn đến tiêu diệt vi sinh vật (Shahidi, Arachchi, và Jeon,

1999)

Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tôm

kháng lại E.coli, người ta đã tìm ra rằng nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm

tăng ảnh hưởng của chitosan đến vi khuẩn Nghiên cứu cũng chỉ ra cơ chế ức chế vi khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ion kim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào Khi bổ sung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy chitosan không trực tiếp

hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli mà là do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện

dương ở màng của vi khuẩn Chitosan N – carboxybutyl – một polycation tự nhiên,

có thể tương tác và hình thành polyelectrolyte với polymer acid có trên bề mặt vi khuẩn, do đó làm dính kết một lượng vi khuẩn với nhau

Cũng từ thí nghiệm này người ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+

, Na+, Mg2+ và Ca2+ Nồng

độ lớn các ion kim loại có thể khiến mất tính chất này, ngoại trừ ảnh hưởng của Na+

đối với hoạt động kháng Staphylococcus aureus Người ta cũng thấy rằng chitosan

có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn Khi sử dụng chitosan thì một lượng lớn các ion K+ và ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm Candida albicans Cả chitosan phân tử lượng 50 kDa và 5 kDa đều

kháng tốt hai loại trên nhưng chitosan phân tử lượng 50 kDa làm mất nhiều gấp 2 -

4 lần ion K+ và ATP so với chitosan 5 kDa Điều này thể hiện cơ chế kháng khuẩn khác nhau ở chitosan khối lượng phân tử thấp và cao Hoạt động kháng khuẩn của chitosan phân tử lượng khác nhau đã được nghiên cứu trên 6 loài vi khuẩn Cơ chế kháng khuẩn này đã được chứng minh dựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào

vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào Kết quả chỉ ra rằng khả năng này giảm khi khối lượng nguyên tử tăng và tăng cao ở nồng độ pH thấp, giảm rõ rệt khi

có mặt ion Ca2+, Mg2+ Nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0,03 – 0,25%, thay đổi tùy từng loài vi khuẩn và khối lượng phân tử của chitosan Đối với vi khuẩn gram

dương, chitosan 470 kDa có ảnh hưởng đến hầu hết các loài trừ lactobacillus spp.,

trong khi với vi khuẩn gram âm, chitosan có khối lượng 1106 kDa mới có ảnh hưởng Điều này là do vi khuẩn gram dương nhạy cảm hơn, vi khuẩn gram âm có lớp màng chắn bên ngoài (Zhong và cộng sự, 2008)

Theo Ming Kong và cộng sự (2008), tất cả các vi khuẩn gram âm có một màng ngoài do sự biểu hiện của lớp lipopolysaccharide (LPS) Sự ổn định của lớp LPS thông qua tương tác tĩnh điện với các cation hóa trị 2 Giống như EDTA, chitosan loại bỏ các cation, việc giải phóng LPS làm mất sự ổn định của màng ngoài

Cơ chế hoạt động kháng khuẩn của chitosan khác nhau ở vi khuẩn gram dương và gram âm (Zheng & Zhu, 2003) Trong nghiên cứu này, họ phân biệt tác

động của chitosan trên Staphylococcus aureus (gram dương) và Escherichia coli (gram âm) Đối với Staphylococcus aureus, hoạt động kháng khuẩn tăng khi tăng trọng lượng phân tử của chitosan Trong khi đó, với E.coli, hoạt động kháng khuẩn

tăng lên khi giảm trọng lượng phân tử Các tác giả gợi ý hai cơ chế khác nhau cho

hoạt động kháng khuẩn: (1) Trong trường hợp của Staphylococcus aureus, các

chitosan trên bề mặt của tế bào có thể hình thành một màng polymer, ức chế các

chất dinh dưỡng đi vào tế bào (2) Đối với E.coli, chitosan trọng lượng phân tử thấp

sẽ đi vào các tế bào thông qua sự lan tỏa

- Cơ chế thứ hai:

Các phân tử chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các tương tác làm biến đổi ADN, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp ARN thông tin và tổng hợp protein, ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản trao đổi chất, hấp thu các thành phần dinh dưỡng của vi sinh vật…(Sudarshan và cộng sự, 1992)

Chitosan hoạt động như một tác nhân kìm hãm, liên kết có chọn lọc với kim loại dạng vết do đó ức chế sự sản xuất chất độc và tăng trưởng vi sinh vật (Cuero, Osuji, Washington, 1991)

Các nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan:

- Nghiên cứu trên vật thí nghiệm cho thấy chitin và chitosan có hoạt động

ức chế vi khuẩn và nấm Một trong các đồng phân của chitosan là N - carboxybutyl chitosan có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt 298 loài vi sinh vật gây bệnh Khi có chitosan và chitin trên bề mặt các tác nhân gây bệnh ở thực vật, chúng ức chế sự phát triển của những loài này Ở nồng độ 0,1% và pH 5,6, chitosan kháng các loại

nấm: Fusarium, Alternaria, Rhizopus… Và hoạt động kháng này sẽ giảm ở những

vi sinh vật mà trên thành tế bào có chứa chitin, chitosan hoặc chitin – ß – glucan

- Chitosan đã được cho phép làm chất phụ gia thực phẩm ở Nhật và Hàn Quốc lần lượt từ năm 1983 và 1995 Chính hoạt động ức chế vi khuẩn của chitosan ở pH thấp nên khi thêm chitosan vào những thực phẩm có tính acid thì nó

có chức năng tăng cường hoạt động kháng khuẩn như là một chất bảo quản tự

nhiên Ở pH 5,5, với nồng độ 0,5 - 1% chitosan có tác dụng ức chế đến các loài

Staphylococcus aureus, E.coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes Ở

pH 6,5 chỉ có Staphylococcus aureus bị ức chế ở nồng độ 0,5% trong khi các loài

khác vẫn phát triển ở nồng độ 2,5% (nồng độ cao nhất đã được nghiên cứu) Chitosan phân tử nhỏ có tính kháng các tác nhân gây bệnh trên thực vật mạnh hơn rất nhiều các chất phân tử lớn

- Các hợp chất chitosan lactate và chitosan hydroglutamate cũng được sử

dụng như là tác nhân ức chế E.coli, Staphylococcus aureus và Saccharomyces cerevisiae Nồng độ chitosan lactate trong nước cất có ảnh hưởng mạnh nhất đến E.coli Chưa đến 1h, số lượng vi khuẩn này giảm khoảng 104, còn Staphylococcus aureus giảm đến 106 Đối với nấm men, chúng hoàn toàn ngừng hoạt động ở

nồng độ 1 mg/ml chitosan lactate sau 17 phút

Độc tính của chitosan:

- Nghiên cứu về độ an toàn, độ độc tích lũy:

Chitosan được thử độ an toàn (LD50) trên 123 chuột trắng (18 – 21 g) chia 5 đợt, với liều lượng tăng dần 0,0025 - 0,020 g/ngày cho mỗi chuột Theo dõi liên tục trong 72 giờ Kết quả chuột vẫn khỏe mạnh, không chuột nào chết

Theo dõi độc tính tích lũy trên chuột nhắt, liều uống 0,02 g một ngày cho một chuột, cho uống liên tục 14 ngày, chuột vẫn sống khỏe mạnh bình thường

- Độc tính cấp:

Trên 5 lô chuột nhắt trắng (50 con) cho uống chitosan với liều lượng 9 g/kg cân nặng, theo dõi liên tục 72 giờ: không có chuột nào chết, suy ra chỉ số điều trị là 250g theo đường uống, chứng tỏ chitosan dùng an toàn

- Độc tính tại chỗ

Kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy chitosan không gây tổn thương các cơ quan, không gây phù nề tại chỗ, không gây phản ứng giãn mạch tại chỗ trên thỏ và chuột cống thực nghiệm

- Kết quả

Chitosan được thử trên động vật thực nghiệm(chuột nhắc, chuột cống, thỏ), kết quả cho thấy: chitosan không gây độc tính tại chỗ, không ảnh hưởng đối với trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, cơ quan tạo máu, các chỉ tiêu hóa sinh trong nước tiểu của động vật thực nghiệm

1.2.4 Các phương pháp thu nhận chitosan

Chitosan được sản xuất theo quy trình như sau:

Làm khô

Xử lý NaOH 5%, tỷ lệ 1:5 (w/v), nhiệt độ phòng, 24h

Chuyển chitin thành chitosan:

Ngâm trong NaOH 60%, tỷ lệ 1:5 (w/v), nhiệt độ 65oC, thời gian 20h

Hình 1.4 Sơ đồ sản xuất và thu nhận chitosan Theo Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007), hiện nay có hai nhóm phương pháp sản xuất chitin từ vỏ giáp xác là phương pháp hóa học và sinh học, trong đó phương pháp hóa học tách chiết chitin là phương pháp đã có từ rất lâu và ngày nay vẫn là phương pháp chính được áp dụng trong sản xuất polymer sinh học này, còn phương pháp sinh học mới được nghiên cứu áp dụng trong thời gian gần đây với mục đích thay thế phương pháp hóa học truyền thống tiêu hao nhiều hóa chất và gây ô nhiễm môi trường Hai nhóm phương pháp này giống nhau ở điểm là chúng đều được thực hiện theo 3 công đoạn chính đó là: loại khoáng, loại protein, loại các chất màu, tuy trình tự các công đoạn có thể phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể Điểm khác nhau căn bản của hai nhóm phương pháp này là ở cách loại protein Trong các phương pháp sinh học, protein bị loại trong những điều kiện rất

“mềm” nhờ sử dụng hoạt tính proteolytic (phân hủy protein) của các enzyme thuộc nhóm proteinase, còn trong các phương pháp hóa học protein bị loại bằng acid và kiềm

Bảng 1.8 Tính chất chitosan sản xuất từ chitin chiết rút bằng phương pháp hóa học

và sinh học (Phạm Thị Đan Phượng và Trang Sĩ Trung, 2012)

Tính chất Chitosan từ chitin

chiết rút bằng phương pháp hóa học

Chitosan từ chitin chiết rút bằng phương pháp sinh học

Độ đục (NTU) 26,3 2,8 42,2 6,4

Kết quả cho thấy chitosan sản xuất từ hai loại chitin với quá trình khử protein khác nhau thì tính chất khác nhau Sử dụng quy trình khử protein bằng phương pháp sinh học có hàm lượng protein và khoáng còn lại cao hơn so với phương pháp hóa học nên ảnh hưởng đến chất lượng chitosan thu được Bên cạnh đó, độ nhớt và độ deacetyl của chitosan cũng bị ảnh hưởng rõ rệt bởi chất lượng chitin ban đầu Độ nhớt của chitosan từ chitin khử protein bằng phương pháp sinh học thì cao hơn nhưng độ deacetyl thì thấp hơn so với mẫu chitosan từ chitin khử protein bằng phương pháp hóa học Độ nhớt cao của phương pháp xử lý sinh học có thể do khi

xử lý bằng Flavourzyme thì chitin ít bị cắt mạch so với phương pháp hóa học Nhưng hàm lượng protein và khoáng còn lại trong chitin đã làm giảm hiệu quả của quá trình deacetyl, dẫn đến chitosan từ chitin xử lý sinh học có độ deacetyl thấp hơn

Chitosan từ chitin khử protein bằng phương pháp sinh học có thể ứng dụng vào các lĩnh vực như nông nghiệp và xử lý môi trường (chất kích thích sinh học, keo tụ trong xử lý môi trường…) với yêu cầu về độ tinh sạch không cao thì phương pháp xử lý sinh học là một sự lựa chọn hợp lý vì đây là phương pháp sản xuất thân thiện với môi trường

1.2.5 Chitosan tan trong nước (WSC)

1.2.5.1 Điều chế chitosan tan trong nước

Chitosan tan trong nước (WSC) được điều chế theo phương pháp acetyl hóa Hòa tan 25 g chitosan trong 500 ml dung dịch acid lactic 3% thu được dung dịch A Sau đó cho 150 ml cồn 96o vào dung dịch A, khuấy đều được dung dịch B Cho 15

ml anhydride acetic vào 150 ml cồn 96o, khuấy đều ta được dung dịch C Cho từ từ

C vào B, khuấy đều để thực hiện phản ứng acetyl hóa trong 2 giờ Dung dịch chitosan đã acetyl hóa được điều chỉnh pH về 7 – 7,5 bằng NH4OH 5% và được kết tủa bằng cồn 96o Lọc kết tủa qua vải, rửa kết tủa bằng cồn 96o vài lần, sau đó sấy quạt cho bay hết dung môi cồn 96o, thu được chitosan tan trong nước

Chitosan tan trong nước được điều chế theo phương pháp trên có độ deacetyl hóa DDA = 60,1% và có khối lượng phân tử trung bình là 249790 Da (Nguyễn Thị Thanh Hải, 2012)

1.2.5.2 Tính chất của WSC

Theo Ying Chien Chung (2011), hoạt động kháng khuẩn của chitosan hòa tan

trong nước được đánh giá trên 6 loại vi sinh vật: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, B cereus, E.coli, Shigella dysenteriae và Salmonella typhimurium

ở các pH khác nhau của chitosan hòa tan trong nước và chitosan hòa tan trong acid Kết quả của bài báo cáo này kết luận rằng, khả năng kháng khuẩn của chitosan tan trong nước cao hơn chitosan tan trong acid

Bảng 1.9 Bảng so sánh các tính chất của chitosan tan trong acid và chitosan tan trong nước

Tính chất

Chitosan từ chitin sản xuất bằng phương pháp hóa học

Chitosan từ chitin sản xuất bằng phương pháp sinh học

Chitosan tan trong nước

Hàm lượng tro (%) 0,98 ± 0,6 1,89 ± 0,03 0,05 ± 0,003 Hàm lượng protein (%) 0,93 ± 0,1 1,95 ± 0,05 0,2 ± 0,01

Độ deacetyl (%) 84,2 ± 0,9 80,1 ± 1,3 87 ± 2

Ngoài khả năng kháng khuẩn cao của chitosan tan trong nước thì theo bảng 1.9 cho thấy hàm lượng protein và hàm lượng khoáng của chitosan tan trong nước thấp hơn so với chitosan tan trong acid nên có độ tan tương đối cao (> 99%) Do hàm lượng protein và hàm lượng khoáng của chitosan tan trong acid cao hơn chitosan tan trong nước nên độ deacetyl hóa của chitosan tan trong acid thấp hơn so với chitosan tan trong nước

Tóm lại, chitosan tan trong nước có độ tan tương đối cao, độ deacetyl cao hơn và khả năng kháng khuẩn của chitosan tan trong nước tốt hơn chitosan tan trong acid

1.2.6 Ứng dụng của chitosan trong thực phẩm

1.2.6.1 Chất làm trong - Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả

Trong sản xuất nước quả, việc làm trong là yêu cầu bắt buộc Thực tế hiện nay đang sử dụng các chất làm trong như: genatin, bentonite, kali caseinate, tannin, polyvinyl pirovinyl Chitosan là tác nhân tốt loại bỏ đi đục, giúp điều chỉnh acid trong nước quả

Chitosan được sử dụng như tác nhân lọc các chất lơ lửng trong nước quả Sử dụng dung dịch chitosan 2% trong acid acetic 7% giúp làm giảm độ đục hiệu quả hơn so với sử dụng bentonite và gelatin Đối với nước táo, khi sử dụng dung dịch chitosan hòa tan trong acid malic 2%, người ta nhận thấy rằng độ đục giảm đáng kể khi tăng lượng chitosan sử dụng từ 0,1 – 0,7 g/l nước quả Tuy nhiên, khi tăng lên đến 1 g/l thì độ đục tăng lên, điều đó được giải thích là do sự bão hòa về tính chất hấp phụ của chitosan

Chitosan còn được dùng để điều chỉnh độ chua của nước quả Imeri và Knorr (1998) đã nghiên cứu chitosan nồng độ 1,2% trong 2% acid ascorbic đối với nước ép cà rốt và táo, kết quả cho thấy chitosan làm giảm đáng kể lượng acid của dịch ép

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan có ái lực lớn đối với hợp chất pholyphenol chẳng hạn: catechin, proanthocianydin, acid cinamic, những chất mà

có thể biến màu nước quả bằng phản ứng oxy hóa

1.2.6.2 Bảo quản trứng gà tươi

Ở nhiệt độ thường, trứng gà tươi bọc màng chitosan nồng độ 1,5% có bổ sung 0,05% Sodium Benzoate hoặc 1% Sorbitol có khả năng duy trì hạng chất

lượng ở mức A đến 15 - 20 ngày sau khi đẻ

Trong khi đó, trứng gà tươi không qua bọc màng chỉ duy trì hạng chất lượng

ở mức A không quá 5 ngày sau khi đẻ Đồng thời các chỉ tiêu chất lượng khác (hao

hụt khối lượng, chỉ số màu lòng đỏ trứng) đều có biến đổi lớn hơn so với trứng có

xử lý màng bọc chitosan Kết quả nghiên cứu của PGS.TS Trần Thị Luyến (Trường

ĐH Nha Trang) và Th.S Lê Thanh Long (Trường ĐH Nông Lâm Huế) đã cho thấy màng bọc không tạo cảm giác khác lạ cho người sử dụng so với trứng gà tươi

thương phẩm cùng loại về chất lượng cảm quan bề mặt

Phương pháp tạo màng trên vỏ được các nhà khoa học thực hiện như sau: trứng gà tươi sau khi gà đẻ không quá 24 giờ, không rạn nứt, không có khuyết tật và đạt tiêu chuẩn TCVN 1858 : 1986 Sau đó tiến hành lau sạch và nhúng trong dung dịch bao màng chitosan được chuẩn bị gồm hỗn hợp dung dịch lọc bao gồm chitosan 1,5% pha trong dung dịch acetic acid 1% bổ sung thêm SB 0,05%, hoặc SOR 1% Tiếp theo để khô tự nhiên và bảo quản ở nhiệt độ thường nơi khô ráo

thoáng mát

1.2.6.3 Sử dụng trong thực phẩm chức năng

Chitosan có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu Nếu

sử dụng thực phẩm chức năng có bổ sung 4% chitosan thì lượng cholesterol trong máu giảm đi đáng kể chỉ sau 2 tuần Ngoài ra chitosan còn được xem là chất chống đông tụ máu Nguyên nhân việc giảm cholesterol trong máu và chống đông

tụ máu được biết là do không cho tạo các mixen Điều chú ý là ở pH = 6 – 6,5 chitosan bắt đầu bị kết tủa, toàn bộ chuỗi polysaccharide bị kết lắng và giữ lại toàn bộ lượng mixen trong đó Chính nhờ đặc điểm quan trọng này chitosan được

ứng dụng trong sản phẩm thực phẩm chức năng

1.2.6.4 Thu hồi protein

Whey được coi là chất thải trong công nghiệp sản xuất phomat, nó có chứa một lượng lớn lactose và protein ở dạng hòa tan Nếu thải trực tiếp ra ngoài sẽ gây ô nhiễm môi trường, còn nếu xử lý nước thải thì tốn kém do vận hành hệ thống dẫn đến hiệu quả kinh tế không cao Việc thu hồi protein trong whey được xem là biện pháp làm tăng hiệu quả kinh tế của sản xuất phomat Whey protein khi thu hồi được bổ sung vào đồ uống, thịt băm và các loại thực phẩm khác Nhiều phương pháp khác nhau đã được đưa ra nhằm thu hồi protein và chitosan được coi là