Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin 1, dinophysistoxin 2

Để góp phầnđưa ra các giải pháp phân tích đặc hiệu hơn, cũng như đánh giá toàn diện hơn sự có mặt của độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại Việt Nam, luận án: “NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TỐNG THỊ THANH VƯỢNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC

TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC,

DIN OPHY SISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT

SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TỐNG THỊ THANH VƯỢNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC

TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC,

DIN OPHY SISTOXIN -1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT

SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 9720210

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Đình Chi

PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tống Thị T hanh V ượng

Để hoàn thành Luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và hiệu quả của nhiều cá nhân và tập thể, các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Lê Đình Chi, giảng viên bộ môn Hoá phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội và PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện trưởng Việm Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, là hai người thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, cho tôi những kiến thức quý báu và động viên tôi quyết tâm hoàn thành luận án

GS.TS T hái Nguyễn H ùng Thu, nguyên Hiệu phó, trưởng chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội là người thầy

đã động viên, chỉ dẫn và đóng góp ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành luận án Ban G iám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội và Ban L ãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án đúng thời gian quy định

Các thầy, cô Bộ môn Hoá phân tích - Độc chất và Phòng Sau đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Gia đình và những người thân

đã chia sẻ, động viên tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận án

Tác giả luận án Tống Thị T hanh V ượng

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN Đ Ề 1

CH Ư Ơ NG 1 TỔNG Q U A N 3

1.1 ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Tóm tắt quá trình nghiên cứu một số nhóm độc tố tảo đơn bào gây độc 4 cho con người

1.2 NGUỒN GỐC, CẤU TRÚC HOÁ HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ QUY ĐỊNH KIỂM SOÁT ĐỘC TỐ DSP 7

1.2.1 Nguồn gốc độc tố D SP 7

1.2.2 Cấu trúc hoá học độc tố D SP 8

1.2.3 Cơ ch ế tác dụng, độc tính độc tố D SP 10

1.2.4 Ngộ độc cho người do độc tố D SP 11

1.2.5 Quy định kiểm soát độc tố D SP 12

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ DSP 16

1.3.1 Các phương pháp xử lý m ẫu để chiết độc tố nhóm acid okadaic 16

1.3.1.1 Lựa chọn dung môi để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn th ể 17

1.3.1.2 Các phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu 18

1.3.1.3 Các phương pháp thuỷ phân mẫu và làm sạch sau thuỷ phân 20

1.3.2 Các phương pháp sinh học để phân tích độc tố nhóm acid okadaic 21

1.3.2.1 Các phương pháp định lượng sinh học in vivo 21

1.3.2.2 Các phương pháp định lượng qua gây độc tế b ào 22

1.3.2.3 Các phương pháp hoá s in h 23

1.3.3 Các phương pháp hoá lý để phân tích độc tố nhóm acid okadaic 24

1.3.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 24

1.3.3.2 Điện di mao quản 26

1.3.3 3 Sắc ký kh í 27

1.4 ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ TRONG PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NHÓM ACID OKADAIC 27

1.4.1 Các đặc trưng khối phổ của độc tố nhóm O A 27

1.4.1.1 Khối phổ của OA trong kỹ thuật EI và C I 27

1.4.1.2 Khối phổ của OA trong kỹ thuật FA B 28

1.4.1.3 Khối phổ của OA trong kỹ thuật E SI 29

1.4.1.4 Khối phổ dạng ester của O A 34

1.4.2 Phân tích định tính, định lượng độc tố nhóm OA bằng LC - M S/M S 36

1.4.2.1 Kỹ thuật ion hoá 36

1.4.2.2 Lựa chọn phân tích khối 37

1.4.2.3 Điều kiện sắc k ý 38

CH Ư Ơ NG 2 NGUYÊN LIỆU, TRANG T H IẾ T BỊ, N Ộ I DUNG VÀ PH Ư Ơ N G PH Á P N G H IÊN C Ứ U 43

2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ 43

2.1.1 Dung môi, hoá chất và chất chuẩn 43

2.1.1.1 Chất chuẩn 43

2.1.1.2 Dung môi, hoá chất 43

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 43

2.1.2.1 Thiết bị phân tích 43

2.1.2.2 Dụng cụ phân tích 44

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 45

2.2.1 Mẫu nhuyễn thể lấy tại các địa phương 45

2.2.2 Mẫu thêm chuẩn 45

2.2.3 Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố 45

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 trong nhuyễn th ể 46

2.3.1.1 Khảo sát xây dựng điều kiện khối phổ 46

2.3.1.2 Khảo sát xây dựng điều kiện sắc k ý 47

2.3.1.3 Khảo sát điều kiện chiết độc tố từ mẫu nhuyễn th ể 48

2.3.1.4 Khảo sát điều kiện thuỷ phân để phân tích độc tố toàn phần 48

2.3.1.5 Thẩm định phương pháp 49

2.3.2 Lấy mẫu nhuyễn thể và bảo quản m ẫu 51

2.3.2.1 Lựa chọn số lượng cá thể cho mỗi mẫu nhuyễn th ể 51

2.3.2.2 Khảo sát điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn th ể 51

2.3.3 Phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn thể và biện giải kết quả 51

2.3.3.1 Tiến hành phân tích trên mẫu thực 51

2.3.3.2 Các tiêu chí đánh giá kết quả phân tích độc tố trong nhuyễn th ể 52

2.3.3.3 Các hướng biện giải, bàn luận kết quả 52

CH Ư Ơ NG 3 K ẾT QUẢ N G H IÊN C Ứ U 53

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 53

3.1.1 Khảo sát thiết lập điều kiện phân tích OA, DTX1 và DTX2 bằng M S 53

3.1.1.1 Điều kiện của detector M S/M S 53

3.1.1.2 Điều kiện sắc k ý 59

3.1.2 Khảo sát thiết lập điều kiện xử lý mẫu để chiết OA, DTX1 và DTX2 từ nhuyễn th ể 65

3.1.2.1 Đồng nhất m ẫu 65

3.1.2.2 Lựa chọn dung môi chiết độc tố 65

3.1.2.3 Lựa chọn thể tích dung môi chiết 67

3.1.2.4 Khảo sát điều kiện làm sạch dịch chiết 68

3.1.2.5 Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố ở dạng tự d o 73

3.1.2.6 Khảo sát thiết lập điều kiện thuỷ phân để phân tích OA, DTX1 và DTX2 toàn phần trong nhuyễn th ể 74

3.1.3 Khảo sát thiết lập điều kiện bảo quản nhuyễn th ể 79

3.1.3.1 Đánh giá độ ổn định của độc tố trong nhuyễn thể ở một số điều kiện nhiệt đ ộ 79

3.1.3.2 Điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn th ể 82

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 82

3.2.1 Điều kiện của các phương pháp được thẩm định 82

3.2.1.1 Phương pháp phân tích độc tố tự do trên cột Cortecs 82

3.2.1.2 Phương pháp phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax 84

3.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích độc tố trên cột Cortecs 85

3.2.2.1 Độ đặc hiệu 85

3.2.2.2 Độ thích hợp hệ thống 87

3.2.2.3 Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc 88

3.2.2.4 Độ chính xác 88

3.2.2.5 Độ đúng 91

3.2.2.6 Độ nhậy 92

3.2.3 Thẩm định phân tích độc tố tự do và toàn phần trên cột Zorbax 94

3.2.3.1 Độ đặc hiệu 94

3.2.3.2 Độ thích hợp hệ thống 96

3.2.3.3 Độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc 97

3.2.3.4 Độ chính xác khi phân tích độc tố tự do 98

3.2.3.5 Độ chính xác khi xác định độc tố toàn phần 101

3.2.3.6 Độ đúng khi phân tích độc tố tự do 103

3.2.3.7 Độ đúng khi phân tích độc tố toàn phần 104

3.2.3.8 Độ nhậy 104

3.3 PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 TRONG MẪU NHUYỄN THỂ 107

3.3.1 Lấy mẫu nhuyễn thể và phân tích độc tố 107

3.3.2 Kết quả phân tích độc tố trong mẫu nhuyễn th ể 109

3.3.2.1 Kết quả phát hiện độc tố tự d o 109

3.3.2.2 Kết quả phát hiện độc tố sau khi thuỷ phân 111

3.3.3 Sự phân bố các mẫu phát hiện có độc tố 113

3.3.3.1 Phân bố các mẫu có độc tố theo loại nhuyễn th ể 113

3.3.3.2 Phân bố các mẫu có độc tố theo địa điểm lấy m ẫu 116

3.3.3.3 Phân bố các mẫu có độc tố theo thời điểm lấy m ẫu 119

CH Ư Ơ NG 4 BÀN LU Ậ N 122

4.1 BÀN LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐƯỢC XÂY DỰNG 122

4.1.1 Điều kiện phân tích độc tố bằng LC - M S/M S 122

4.1.2 Điều kiện xử lý mẫu nhuyễn th ể 126

4.1.2.1 Cỡ mẫu nhuyễn th ể 126

4.1.2.2 Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố tự do 126

4.1.2.3 Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố toàn phần 127

4.2 BÀN LUẬN KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ TRONG NHUYỄN THỂ 129

4.2.1 Loại độc tố phát hiện được, tỷ lệ xuất hiện và mức độ hàm lượng trong nhuyễn th ể 129

4.2.2 Dao động sự xuất hiện của độc tố trong nhuyễn thể cùng các yếu tố ảnh hưởng 131

4.3 NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG TỚI SỨC KHOẺ VÀ HƯỚNG KIỂM SOÁT ĐỘC TỐ NHÓM OA TRONG NHUYỄN THỂ TRONG TƯƠNG LAI 140

K ÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị 142 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌN H CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIÉT TẮT

Anh (Centre for Environtment, Fisheries and Aquaculture Science)

DP Thê tách chùm (Declustering Potential)

Poisoning)

ImmunoSorbent Assay)

Mass Spectrometry)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

Forestry-Fisheries Quality Assurance Department)

SPE Chiêt pha răn (Solid phase extraction)

Drug Administation)

nhóm D SP 59

Bảng 3.7 Khảo sát thể tích rửa giải 72

lạnh 73

Bảng 3.10 Đánh giá thay đổi hàm lượng độc tố tự do trong các điêu kiện

bảo quản khác nhau 79

Bảng 3.11 Đánh giá thay đổi hàm lượng OA tự do và toàn phần trên mẫu thực trong các điêu kiện bảo quản khác nhau 80

Bảng 3.12 Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Cortecs 87

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm v i ệ c 88

Bảng 3.14 Thâm định độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do trên cột Cortecs 89

Bảng 3.15 Thâm định ảnh hưởng của loại nên nhuyễn thể lên độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do 91

Bảng 3.16 Kết quả đánh giá LOD, LOQ trên cột Cortecs 92

Bảng 3.17 Đánh giá độ thích hợp hệ thống trên cột Zorbax Eclipse Plus 97

Bảng 3.18 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của khoảng nồng độ làm việc 97

Bảng 3.19 Thâm định độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do trên cột Zorbax 99

Bảng 3.20 Thâm định ảnh hưởng của loại nên nhuyễn thể lên độ đúng, độ chính xác với độc tố tự do khi phân tích trên cột Zorbax 100

Bảng 3.21 Đánh giá độ đúng, độ chính xác trên mẫu chuân 102

Bảng 3.22 Thâm định độ chính xác với độc tố toàn phần trên mẫu thực 103

Bảng 3.23 Kết quả đánh giá LOD, LOQ trên cột Zorbax Eclipse P lus 105

Bảng 3.24 Kết quả lấy mẫu nhuyễn thể theo thời gian, địa điểm lấy mẫu và loại m ẫu 108

Bảng 3.25 Tổng hợp kết quả các mẫu phát hiện có độc tố 110

T rang

36 43 46 54 54 54 55 55 55 56 56 56 57 58

60

61

Các ion thứ cấp đặc trưng của các 7-O acyl ester có nguồn gốc

từ ion [M-H]- (ion (i) và (ii), và ion [M+Na]+ (các ion I, II, III,

IV) [123]

Một số ester diol và ester hỗn hợp của độc tố nhóm OA, cơ chế phân mảnh ion [M+Na]+ của các ester này [122]

Chuẩn OA, DTX1, DTX2 của N R C C

Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố của N R C C

Phổ ESI - MS của O A

Phổ ESI - MS của D TX 1

Phổ ESI - MS của DTX2

Kết quả khảo sát DP của O A

Kết quả khảo sát DP của DTX1

Kết quả khảo sát DP của DTX2

Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ c ấp O A

Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ c ấp D TX1

Kết quả ion thứ cấp thu được khi bắn phá ion sơ c ấp D TX 2

Kết quả tối ưu hoá CE cho các ion thứ cấp

Kết quả tối ưu hoá CXP cho các ion thứ cấp

Sắc ký đồ chuẩn độc tố ở cùng tỷ lệ pha động sử dụng dung môi là ACN (A,B) và MeOH (C,D)

Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ acid formic trong pha động tới đáp ứng pic của các độc tố

62

66

77 86 93 94 95 106 107 112 113 114 115 116 116 118

Hình dạng pic khi phân tích trên cột Cortecs với pha động ACN

- H2O chứa 0,1% acid formic, rửa giải theo chương trình

gradient tại bảng 3.3

Ảnh hưởng của amoni format tới hình dạng pic khi phân tích trên cột Zorbax với pha động có tỷ lệ dung môi ACN - H2O (35:65, tt:tt)

Ảnh hưởng của loại dung môi (A) và thể tích dung môi (B) tới hiệu quả chiết các độc tố từ nhuyễn th ể

Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tới hiệu quả thuỷ phân dẫn xuất ester của độc tố

Đánh giá độ đặc hiệu trên cột Cortecs

Kết quả đáp ứng sắc ký c ủa các độc tố tại LOQ với cột Cortecs

Kết quả đáp ứng sắc ký c ủa các độc tố tại LOD với cột Cortecs

Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu trên cột Zorbax

Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOQ với cột Zorbax

Kết quả đáp ứng sắc ký của các độc tố tại LOD với cột Zorbax

Một số sắc ký đồ khi phân tích bằng M S/M S

Kết quả phát hiện độc tố trên vẹm xanh

Kết quả phát hiện độc tố trên hàu

Kết quả phát hiện độc tố trên sò lông

Kết quả phát hiện độc tố trên sò huyết

Tỷ lệ phát hiện độc tố theo loại nhuyễn th ể

Kết quả phát hiện độc tố theo địa phương lấy m ẫ u

Hình 3.31 Kết quả phát hiện độc tố trong nhuyễn thể theo thời gian lấy

m ẫ u 120

m ẫu 134

ĐẶT VẤN ĐỀ•

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề có tầm quan trọng thường trực cho việc đảm bảo chất lượng cuộc sống của cả cộng đồng và đang nhận được sự quan tâm sát sao của toàn xã hội tại Việt Nam hiện nay Trong lĩnh vực này, nổi cộm hơn cả là việc thực phẩm bị “nhiễm bẩn” bởi các tác nhân gây hại tới sức khỏe con người có nguồn gốc rất đa dạng, song tựu chung lại có thể phân loại thành 2 nhóm lớn: Thứ nhất, đó là những chất độc hại nhiễm vào thực phẩm do các hoạt động vô ý hay cố ý của con người, như lạm dụng thuốc bảo

vệ thực vật trong canh tác cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hay việc lạm dụng kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng trong nuôi trồng thủy sản, chăn nuôi gia súc, hoặc những chất thải độc hại ngấm vào thực phẩm qua các hoạt động khác của con người như sản xuất công nghiệp, xả thải công nghiệp, rác thải sinh hoạt bừa bãi ra khí quyển, nguồn nư ớc Thứ hai là những độc tố mang nguồn gốc tự nhiên xâm nhập, tích lũy trong thực phẩm, trong đó điển hình có thể kể đến các độc tố vi nấm trong các loại hạt ngũ cốc, các độc tố vi tảo [13], [88] và vi khuẩn trong các loại thủy hải sản, nhất là các loại nhuyễn thể Trong

số các độc tố tự nhiên có thể tích lũy trong thực phẩm, cho tới nay những nghiên cứu đã được công bố cho thấy các độc tố do các loài vi tảo hai roi sản xuất là nguyên nhân gây ra rất nhiều hội chứng ngộ độc cho người Khả năng gây độc rất đa dạng, trong đó hay gặp nhất là các triệu chứng trên hệ thần kinh (gây tê liệt, hôn mê, mất trí n h ớ , có thể tử vong trong các vụ ngộ độc nghiêm trọng)

và hệ tiêu hóa (đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa ), dẫn tới những vụ ngộ độc ở quy mô khác nhau tại nhiều nơi trên thế giới [33], [133] Trong các hội chứng ngộ độc đường tiêu hóa do độc tố của vi tảo hai roi gây ra có hội chứng tiêu chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Diarrhetic Shellfish Poisoning - DSP) với tác nhân là nhóm độc tố gồm acid okadaic (OA) và các dẫn xuất gọi chung

là dinophysistoxin (DTX) [11]

Hiện tại ở Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ban hành Thông tư số 33/2015/TT-BNNVPTNT quy định về giám sát vệ sinh, an toàn thực phẩm trong thu hoạch nhuyễn thể hai mảnh vỏ trong đó có quy định giới hạn tổng của OA, các DTX và pectenotoxin (PTX) là 160 ppb [1] Tuy nhiên,

việc đánh giá nguy cơ có mặt của các độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại Việt Nam vẫn chưa được thực hiện một cách có hệ thống, ngoại trừ một số nghiên cứu khoanh vùng ở các khu nuôi thủy sảnnhư nghiên cứu của Viện Nghiên cứu hải sản tiến hành ở 3 vùng nuôi ngao tập trung vào năm 2003 [5] Bên cạnh đó, phương pháp chính thức hiện tại của TCVN 8341: 2010 [2] chỉ cho phép xác định OA, không cho phép xác định các DTX, còn phương pháp bán định lượng trên chuột (MBA) có thể cho kết quả dương tính cả với các nhóm hợp chất thân dầu chưa ghi nhận có độc tính trên người như PTX, yessotoxin (YTX) Do vậy, cần có phương pháp đặc hiệu hơn để xác định chính xác OA và các DTX, thủ phạm chính gây hội chứng DSP Để góp phầnđưa ra các giải pháp phân tích đặc hiệu hơn, cũng như đánh giá toàn diện hơn sự có

mặt của độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại Việt Nam, luận án: “NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỒ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DINOPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG M Ộ T SỒ NHUYỄN THỂ H AI M ẢN H VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC K Ý LỎNG KHỒI PHỔ "

được thực hiện nghiên cứu với 2 mục tiêu sau:

M ục tiêu 1: Xây dựng phương pháp định lượng các độc tố gây tiêu chảy acid

okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

M ục tiêu 2: Xác định hàm lượng các độc tố kể trên trong một số nhóm nhuyễn

thể hai mảnh vỏ được lấy tại các vùng biển Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN

1.1.1 Nguồn gốc

Các loại hải sản đã từ lâu được con người coi là một nguồn thực phẩm lành mạnh

và được tiêu thụ ngày càng nhiều trên phạm vi toàn cầu Tuy nhiên, cũng từ rất sớm con người đã ghi nhận những trường hợp ngộ độc [64], thậm chí có thể dẫn tới tử vong sau khi ăn hải sản Cho tới nay, nguyên nhân gây ra ngộ độc cho người

đã được xác định là do các độc tố tồn tại trong hải sản mà con người tiêu thụ, còn gọi là các độc tố sinh vật biển Các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng bản thân các loại hải sản chứa độc tố gây ngộ độc cho người không sản xuất ra những độc tố này mà tích luỹ độc tố do ăn thực vật phù du biển, trong đó có tảo độc Một

số loài tảo có khả năng sinh độc tố, một số không sinh độc tố nhưng có khả năng phát triển mạnh gây ra hiện tượng “tảo nở hoa” - algal bloom, có thể làm thay đổi màu nước biển (hiện tượng “thuỷ triều đỏ”), làm chết hàng loạt sinh vật biển [56] Những loài tảo mang một hoặc cả hai đặc tính này được gọi chung là tảo độc Trong các loài tảo độc, tảo đơn bào hai roi và tảo silic là nhóm tác nhân sản xuất

ra nhiều loại độc tố có khả năng gây ngộ độc cho người nhất Tảo đơn bào hai roi chính là tác nhân sản xuất ra độc tố gây tiêu chảy (hay hội chứng DSP) [148], độc

tố gây liệt cơ (hay hội chứng PSP - paralytic shellfish poisoning) [72], độc tố gây độc thần kinh (hay hội chứng NSP - neurotoxic shellfish poisoning) [26], độc tố gây hội chứng AZP (azaspiracid shellfish poisoning) [120], độc tố gây ngộ độc khi ăn cá (hay hội chứng ciguatera) [146], và palytoxin analog [130] Tảo silic là tác nhân sản xuất ra độc tố gây mất trí nhớ (hay hội chứng ASP - amnestic shellfish poisoning) [16] Vi khuẩn lam là tác nhân gây ra các hội chứng PSP [15], hội chứng ngộ độc tảo biển (seaweed poisoning) [90] và hội chứng ngộ độc rùa biển (turtle poisoning) [99] Một số loài vi khuẩn cũng đã được chứng minh là tác nhân sản xuất ra tetrodotoxin (TTX) [143], một độc tố thần kinh có độc tính rất mạnh Độc tố do các tác nhân này sản xuất ra sẽ theo nhiều con đường khác nhau (chẳng hạn như qua chuỗi thức ăn, qua phơi nhiễm trong môi trường sống) xâm nhập và tích lũy vào trong cơ thể các loài hải sản mà con người tiêu thụ, qua đó gây ngộ độc cho người Tùy thuộc tính chất của từng nhóm độc tố, sự phân bố của các loại hải sản theo khu vực địa lý cũng như đặc điểm hoạt động nuôi trồng, đánh bắt,

mỗi nhóm độc tố có thể gây phơi nhiễm trên người thông qua những loài hải sản khác nhau Ngộ độc TTX đã được ghi nhận khi tiêu thụ cá nóc [143], con so biển [68] Các hội chứng DSP [148], PSP [72], ASP [16], NSP [26] và AZP [120] xảy

ra chủ yếu khi tiêu thụ các loài hải sản vỏ cứng không xương sống (NT2MV, giáp xác, v v ) Ngộ độc do hội chứng ciguatera xảy ra chủ yếu khi tiêu thụ một số loài cá biển vùng nhiệt đới [146] Hội chứng ngộ độc do tảo biển xuất hiện khi tiêu thụ rau câu [90], trong khi hội chứng ngộ độc rùa biển xuất hiện khi ăn một

số loài rùa biển [99] Trên đây mới chỉ là những hội chứng ngộ độc và độc tố gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người nên được nghiên cứu, tìm hiểu kỹ Ngoài

ra, còn nhiều trường hợp sinh vật biển bị ngộ độc ở quy mô khác nhau đã được ghi nhận, nhất là trong những đợt “tảo nở hoa” [56] Hiện tượng “tảo nở hoa” là hiện tượng tự nhiên đã có từ thời xa xưa, khi con người chưa tác động nhiều đến các hệ sinh thái ven biển Khi điều kiện môi trường thuận lợi như ánh sáng, nhiệt

độ, độ mặn của nước b i ể n , các quần thể tảo phát triển nhanh chóng, chứa hàng triệu tế bào tảo trong một lít nước biển và có thể đổi màu nước biển Tuy nhiên các khảo sát mới đây cho thấy tần suất các đợt nở hoa tảo độc xuất hiện ngày càng thường xuyên trên khắp thế giới, khả năng phơi nhiễm của con người với độc tố sinh vật biển qua tiêu thụ hải sản, nhất là độc tố của tảo đơn bào, sẽ ngày càng tăng lên Điều này cũng dẫn tới việc kiểm soát độc tố của tảo đơn bào trong hải sản được cơ quan quản lý các nước trên thế giới quy định ngày càng chặt chẽ Cũng vì lý do kể trên, luận án này lựa chọn các độc tố chính thuộc nhóm độc tố gây tiêu chảy (DSP), một nhóm độc tố của tảo đơn bào, làm đối tượng nghiên cứu.1.1.2 Tóm tắ t quá trìn h nghiên cứu m ột số nhóm độc tố tảo đơn bào gây độc cho con người

Tảo đơn bào (có kích thước 20 - 200 |um) là thức ăn chính của một số động vật nhuyễn thể như hàu, vẹm, trai, sò, ngao, ố c Cho tới nay đã xác định được nhiều loại tảo đơn bào là tác nhân sản sinh ra các hợp chất có thể tích lũy trong những loại hải sản ăn tảo đơn bào và gây độc cho con người theo chuỗi thức ăn Khi con người ăn hải sản nhiễm các độc tố này có thể gây nên tình trạng ngộ độc kèm thể hiện ra bằng các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, liệt cơ, suy hô hấp, nặng có thể mất trí nhớ, và có thể dẫn tới tử vong trong những trường hợp ngộ độc cấp nghiêm trọng

Được biết đến sớm hơn cả trong các chứng ngộ độc do độc tố sinh vật biển là những tình trạng bệnh lý liên quan tới hệ thần kinh, do mức độ nghiêm trọng và triệu chứng điển hình của chúng Nhiều tài liệu đã ghi nhận hội chứng “ciguatera”

- được nhà sinh vật học Antonio Parra đặt tên năm 1787 khi ông nghiên cứu tình

trạng ngộ độc do loài ốc biển Cittarium pica gây ra ở vùng biển Caribe [156] -

với đặc điểm đặc trưng là các rối loạn về tiêu hóa, thần kinh và tim mạch xảy ra

ở vùng Ân Độ Dương (1601), Nam Thái Bình Dương (1774), Tân Caledonia (1774) và vùng Polynesia thuộc Pháp (1792) Từ đầu thế kỷ 19, người ta bắt đầu

để ý ghi nhận hiện tượng thủy triều đỏ xuất hiện định kỳ ở vịnh Mexico và bờ biển phía đông Florida, được biết đến như hiện tượng “thủy triều đỏ Florida” Trong thời gian diễn ra hiện tượng này, ăn nhuyễn thể có thể dẫn tới tình trạng được gọi là chứng ngộ độc thần kinh do thuỷ sinh vật vỏ cứng (NSP) với các triệu chứng thể hiện trên hệ tiêu hóa, thần kinh, tim mạch, và thậm chí phơi nhiễm với hơi nước biển cũng có thể gây một hội chứng đường hô hấp Tại châu Âu, từ năm

1689 đã có những mô tả khoa học về sự xuất hiện của chứng ngộ độc tê liệt do thuỷ sinh vật vỏ cứng (PSP) [54]

Tuy nhiên, tác nhân thực sự gây ra những hiện tượng ngộ độc đó mới chỉ bắt đầu được tìm ra và nghiên cứu một cách có hệ thống từ cuối thế kỷ 19, khi Taharain phát hiện ra TTX, một loại độc tố có quan hệ chặt chẽ với hiện tượng ngộ độc khi

ăn một số loài cá nóc vào năm 1880 [64] Sau đó, TTX cũng đã lần lượt được phân lập từ nhiều loài sinh vật biển khác [95] Hiểu biết của con người về “hội chứng ciguatera” bắt đầu có những bước tiến đáng kể từ năm 1959, khi Randall đưa ra giả thiết tác nhân gây ngộ độc được đưa vào chuỗi thức ăn do các loài cá

ăn thực vật đã tiêu thụ các loài vi tảo độc, rồi sau đó lại bị các loài cá ăn thịt lớn hơn ăn [103] Những tiến bộ mang tính đột phá đạt được bao gồm việc phát hiện

và phân lập được “ciguatoxin” (CTX) vào năm 1967 từ một loài tảo đơn bào hai

roi Gambierdiscus toxicus [88] tiết ra độc tố, xác định cấu trúc hóa học và các dẫn

xuất của CTX

Nhóm độc tố là nguyên nhân gây ra bệnh NSP được phân lập vào thập niên 1970, cấu trúc hóa học của chúng được xác định trong thập niên 1980 Nhóm độc tố này

do các loài tảo Karenia brevis tiết ra và được đặt tên là các “brevetoxin” [13]

Trong trường hợp của bệnh PSP, mối liên hệ chính xác giữa tình trạng ngộ độc

với các loài trai chỉ được thiết lập năm 1927, sau khi một đợt bệnh bùng phát ở

bờ biển miền trung California (Mỹ), làm 102 người mắc bệnh và 6 người tử vong Những nghiên cứu tiếp theo đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh là loài tảo đơn

bào hai roi Alexandrium catenella và các độc tố chúng tiết ra Những độc tố này

sau đó cũng lần lượt được phân lập, xác định cấu trúc, trong đó chất đầu tiên được xác định là “saxitoxin”

Gần đây nhất, vào năm 1987, một chứng ngộ độc thần kinh mới được ghi nhận trên người sau khi ăn trai bị nhiễm acid domoic khai thác từ một khu nuôi ở bờ biển phía đông đảo Hoàng tử Edward, Canada, làm 150 người ngộ độc, trong đó

có 4 trường hợp tử vong [144] Căn bệnh này được gọi là mất trí nhớ do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (ASP) Acid domoic ban đầu được phân lập từ loài tảo đỏ

Chondria armata ở miền nam Nhật Bản Sau đợt bùng phát ASP năm 1987, nghiên cứu cho thấy cả các loài tảo silic thuộc chi Pseudo-nitzschia cũng tiết ra

acid domoic [101]

So với hiểu biết về các độc tố tác động lên hệ thần kinh, việc khám phá ra các độc

tố gây nên triệu chứng tiêu chảy diễn ra gần đây hơn Trường hợp tiêu chảy do ngộ độc đầu tiên được ghi nhận liên quan tới tiêu thụ trai có độc xảy ra ở vùng Easterscheldt tại Hà Lan năm 1961 [70] Đợt bệnh tiếp theo bùng phát ở Easterscheldt xảy ra năm 1971 với 100 người mắc bệnh Ngoài ra, cũng có những trường hợp tiêu chảy do ăn vẹm xanh lơ xảy ra ở Na Uy năm 1968 Đến năm 1976, Yasumoto và cộng sự [151] lần đầu tiên mô tả chứng tiêu chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (DSP) trong một đợt dịch ngộ độc thức ăn bùng phát do ăn trai

và sò điệp ở vùng đông bắc Nhật Bản Đồng thời, nhóm nghiên cứu của Yasumoto cũng thiết lập mối liên hệ giữa căn bệnh DSP với một nhóm độc tố thân lipid, sau này được gọi chung làđộc tố DSP, bao gồm OA và các dẫn xuất

Năm 1995, trong một đợt bùng phát bệnh tiêu chảy do ngộ độc tại Hà Lan sau khi

ăn trai Ireland (Mytilus edulis), một nhóm độc tố mới được phát hiện và đặt tên là

azaspriracid (AZA) xuất phát từ cấu trúc hóa học của nhóm hợp chất này có một

dị vòng chứa nitơ và nhóm chức acid [110] Các AZA gây nên ở người những triệu chứng ngộ độc đường tiêu hoá rất giống với DSP và được gọi tên là hội chứng AZP

Trong những thập niên gần đây, sự bùng nổ của hoạt động nuôi trồng khai thác hải sản, giao thông hàng hải và du lịch đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc lan tỏa

ra toàn cầu các tác nhân sản sinh ra độc tố như các loại tảo hai roi độc Hiện tượng sinh trưởng quá mức của các loài tảo (tảo nở hoa) diễn ra thường xuyên hơn, làm tăng nguy cơ phơi nhiễm của con người với các loại hải sản (cá, nhuyễn th ể ) bị nhiễm độc Để có cái nhìn cụ thể hơn về ảnh hưởng của các độc tố sinh vật biển, luận án sẽ đi sâu vào độc tố nhóm DSP là nhóm chưa được nghiên cứu nhiều tại Việt Nam

1.2 NGUỒN GỐC, CẤU TRÚC HOÁ HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ QUY ĐỊNH KIỂMSOÁT ĐỘC TỐ DSP

1.2.1 Nguồn gốc độc tố DSP

Độc tố DSP do các loài tảo hai roi thuộc các chi Dinophysis spp và Prorocentrum spp sản xuất ra Trong các điều kiện môi trường thuận lợi, những loài tảo này có

thể phát triển mạnh về số lượng gây ra các đợt tảo nở hoa Cho tới nay đã có

khoảng 10 loài tảo thuộc chi Dinophysis được xác nhận là có tạo ra các độc tố DSP, gồm D.fortii [148], D.acuminata, D.acuta, D.mitra, D.norvegica (ở vùng Scandinavia), D.rotundata [76], D.tripos [138], D.caudata [60], D.hastata [53]

và D.sacculus [48] Ngoài ra các loài thuộc chi Prorocentrum gồm P.lima, P.concavum và P.redfieldi cũng tạo ra độc tố DSP [138] Việc tạo ra độc tố thay

đổi đáng kể giữa các loài tảo, cũng như giữa các kiểu hình tùy theo vùng và mùa

của cùng một loài Chẳng hạn, D.fortii ở miền bắc Nhật Bản chứa hàm lượng độc

tố cao vào tháng 3 và tháng 6, nhưng cũng loài tảo này vào tháng 5 và tháng 7 lại

có độc tính rất nhẹ [53] Một nghiên cứu đã công bố cho thấy mật độ tảo

Dinophysis ở mức 200 tế bào/lít nước biển đã có thể gây nhiễm độc tố trong

nhuyễn thể tới mức ảnh hưởng đến con người [22] Nhóm độc tố này gây ra hội chứng tiêu chảy - DSP, một bệnh đường tiêu hóa cấp tính lần đầu tiên được ghi nhận tại Nhật Bản năm 1978 [147], gồm OA và các chất dẫn xuất được gọi chung

là DTX OA được phân lập đầu tiên từ loài bọt biển Halichondria okadai vào năm

1981 [118] và được đặt tên theo tên của loài bọt biển này Các DTX được đặt tên

theo chi Dinophysis gồm dinophysistoxin-1 (DTX1) và dinophysistoxin-2

(DTX2) DTX1 được phân lập năm 1982 [89] và là dẫn xuất của OA (acid 35(R)- methyl okadaic), còn DTX2 được phân lập năm 1992 [62] và là đồng phân cấu

tạo của OA Trong luận án sẽ gọi chung 3 độc tố OA, DTX1, DTX2 thành 1 nhóm độc tố và nhóm có tên theo tên độc tố được phân lập đầu tiên là OA, “nhóm độc

tố OA”

1.2.2 C ấu trú c hóa học độc tố DSP

Về bản chất, độc tố DSP đều là các polyether bền nhiệt và thân dầu, với 3 độc tố chính là OA, DTX1 và DTX2 OA và các DTX có chung bộ khung cơ bản là một polyether của một acid béo 38 carbon OA được phân lập đầu tiên từ hai loài bọt

biển Halichondria okadai và H.melanodocia, có cấu trúc phân tử chứa 17 tâm

hoạt quang và cấu hình tuyệt đối đã được xác định năm 1981 (hình 1.1)

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của OA và các D TX

Tại vị trí C19, OA có một epimer là 19-epi-OA phân cực hơn OA và có những đặc tính sinh học khác biệt so với OA [30] DTX1 được phân lập đầu tiên từ loài

M.edulis năm 1982 [89] và được xác định cấu trúc là dẫn xuất của OA có tên

(35(R)-methyl-OA) [150] Đến năm 1992, DTX2 được phân lập từ trai Ireland và được xác định cấu trúc là đồng phân cấu tạo của OA [62] Cả OA, DTX1, DTX2 đều tồn tại ở cả dạng tự do lẫn dạng các dẫn xuất ester hóa, thường gặp nhất là ở nhóm carboxyl ở đầu tận C1 và nhóm hydroxyl ở vị trí C7 Một nhóm dẫn xuất ester được gọi là các diol ester của OA do nhóm carboxyl ở đầu tận C1 của OA được ester hóa với một số diol không bão hòa để tạo các allylic diol ester

Nhóm dẫn xuất ester thứ hai là hỗn hợp phức tạp của các dẫn xuất 7-O-acyl ester của OA, DTX1 và DTX2 (các ester này còn được gọi là hỗn hợp “DTX3”) Các DTX3 có thể là sản phẩm chuyển hóa của OA, DTX1, DTX2 tự do trong cơ

thể nhuyễn thể sau khi tiêu hóa tảo độc Nhìn chung, việc acyl hóa nhóm hydroxyl

ở C7 làm giảm tác dụng sinh học của OA [145] Trong các ester thuộc nhóm DTX3, độc tính nhìn chung tăng lên theo mức độ không bão hòa của các gốc acyl [145] Các ester của OA, DTX1 và DTX2 có thể chuyển hóa thành độc tố tự do tương ứng trong điều kiện kiềm mạnh [149] Năm 2008, hai dạng ester diol phức

hợp được phát hiện trong loài M edulis, một dạng có acid béo gắn vào nhóm OH

ở C7 trên khung cấu trúc của OA và một dạng khác có acid béo gắn vào nhóm

OH của phần diol [122]

# Quá trình tích lũy, thải trừ, biến đổi độc tố DSP trong nhuyễn thể

Cho tới nay, độc tố DSP đã được tìm thấy trong nhiều loài nhuyễn thể khác nhau, tùy thuộc vào các vùng biển Tại Nhật Bản, các độc tố DSP đã được tìm thấy trong

các loài vẹm xanh lơ Mytilus edulis và M.coruscum, các loài sò điệp Patinopecten yessoensis, Chlamys nipponesis akazara, các loài trai Tapes japonica và Gomphina melaegis Trong khi đó tại bờ biển Đại Tây Dương thuộc châu Âu, loài M.edulis đặc biệt hay gặp chứa các độc tố DSP cũng như một số loài hàu thuộc chi Ostreasp [138] Ở vùng biển Adriatic, độc tố DSP được tìm thấy trong loài vẹm M.galloprovincialis [27] Một nghiên cứu đã phát hiện thấy độc tố DSP ở nồng độ th ấp trong loài vẹm xanh lục Perna viridis tại vùng biển Johor, Singapore,

tuy nhiên luôn ở mức thấp hơn giới hạn cho phép [60] Độc tố DSP cũng được phát hiện ở dọc theo bờ biển Trung Quốc trong nhiều loại nhuyễn thể như

M.galloprovincialis [78], P.viridis [155] ở nồng độ cao hơn mức cho phép theo

quy định quản lý

Các độc tố DSP được tạo ra từ các loài tảo Dinophysis spp và Prorocentrum spp

dễ dàng tích lũy trong nhuyễn thể, chẳng hạn theo một nghiên cứu về sò điệp, lượng độc tố DSP tích lũy trong nhuyễn thể vượt mức 0,2 ^g/g chỉ sau chưa tới

một giờ phơi nhiễm với mật độ P.lima cao, với mức độ bão hòa độc tố (2 ^g/g

thịt nhuyễn thể) đạt được sau 2 ngày phơi nhiễm, phần lớn lượng độc tố tích lũy trong các nội tạng [17] Quá trình thải trừ độc tố từ nội tạng qua các nghiên cứu

về sò điệp, vẹm gồm có 2 giai đoạn, trong giai đoạn đầu lượng độc tố trong nhuyễn thể giảm nhanh trong 2 ngày đầu tiên sau khi ngừng phơi nhiễm với tảo độc, sau

đó là một giai đoạn đào thải chậm hơn, các đặc tính của quá trình nhiễm độc tố và thải trừ độc tố tùy thuộc vào loại nhuyễn thể và không phụ thuộc vào loại độc tố

của tảo hai roi [17], [111] Một nghiên cứu cho thấy các loài vẹm có xuhướng ăn

chọn lọc các loài tảo thuộc chi Dinophysis hơn các loài tảo hai roi khác [112]

Độc tố nhóm OA ở dạng tự do (OA, DTX1, DTX2) và ở dạng ester đều được

nhuyễn thể hấp thu từ các loài tảo độc và chuyển hóa Trên sò điệp P.yessoensis

một nghiên cứu đã phát hiện thấy DTX1 được chuyển hóa nhanh thành 7-O-acyl- DTX1 [116], trong khi quá trình này lại chậm hơn nhiều trên các loài vẹm

M.galloprovincialis và M.coruscus [117] Dẫn xuất 7-O-acyl của các độc tố DSP

có độc tính giảm đi đáng kể so với độc tố tự do, vì thế có thể đây là một cơ chế phòng vệ của các nhuyễn thể [145] Các gốc acid béo phổ biến nhất được ester hóa ở vị trí C-7 của OA, DTX1, DTX2 lần lượt là 16:0, 14:0 và 16:1 theo một số nghiên cứu đã được công bố [123], [125], [148] Ngược lại, một số nghiên cứu cho thấy các ester diol của OA có thể bị thủy phân với mức độ nhanh chậm khác nhau ở một số loài nhuyễn thể để giải phóng OA tự do [86], [122] Các nghiên cứu đã công bố cũng cho thấy tỷ lệ hấp thu DTX1 ở cả dạng tự do và ester hóa là

dưới 3 % ở P.yessoensis [116], trong khi tỷ lệ hấp thu các dạng OA ở loài sò điệp Argopecten irradians là dưới 5 % [18], và ở loài vẹm M.galloprovicialis là 9 %

[18]

1.2.3 C ơ chế tác dụng, độc tính độc tố DSP

Không giống PSP, hội chứng DSP hiếm khi đe dọa tính mạng, triệu chứng đường tiêu hoá do nhóm độc tố này gây ra có thể kéo dài tới 3 ngày Trong nhóm độc tố DSP, OA, DTX1 và DTX2 là 3 độc tố ở dạng tự do có độc tính cao nhất OA là một chất ức chế mạnh các enzym serin/threonin phosphatase PP1 và PP2A, trong

đó PP2A bị ức chế mạnh hơn PP1 khoảng 200 lần [41] Tương tự như vậy, DTX1

và DTX2 cũng ức chế các phosphatase (PP), trong khi DTX3 không có hoạt tính với các enzym này nếu không được thủy phân Hoạt tính của OA cao hơn DTX1 trên PP1 [59], trong khi một số nghiên cứu so sánh hoạt tính của OA và DTX1 lên PP2A cho kết quả trái ngược nhau [59], [106] Một nghiên cứu đã công bố cho thấy DTX2 có hoạt tính thấp hơn OA trên PP2A [12] Các PP nhạy cảm với

OA như PP1 và PP2A thu ộc về nhóm các protein PP, m ột nhóm enzym quan trọng điều hòa mức độ liên quan m ật thiết tới nhiều quá trình chuyển hóa sống còn trong

tế bào nhân thực Việc ức chế các protein PP của các độc tố nhóm OA dẫn tới việc tăng nhanh chóng protein phosphoryl hóa trong các tế bào Việc tăng mức

phosphoryl hóa của protein khung tế bào làm thay đổi các yếu tố liên kết giữa các

tế bào biểu mô ruột kiểm soát khả năng thấm các chất tan, dẫn tới sự mất chất lỏng thụ động và gây ra tiêu chảy [44], [126]

Bên cạnh độc tính gây tiêu chảy, OA [118] cũng như DTX1 [97] và DTX2 [100] đều có khả năng gây độc tế bào OA và các độc tố cùng nhóm có thể ảnh hưởng tới chu kỳ tế bào, tác động tới mức độ phosphoryl hóa các protein liên quan tới việc kiểm soát sự nhân lên của tế bào Các nghiên cứu đã được công bố cho thấy với các loại tế bào khác nhau và trong điều kiện thí nghiệm khác nhau, đáp ứng với tác động của OA dao động rất nhiều, có những lúc đối lập nhau Một mặt, OA được chứng tỏ là kích thích tổng hợp ADN, kích thích phân bào và ngăn cản quá trình chết tế bào Mặt khác, độc tố này cũng được phát hiện làm ngừng quá trình phân bào và gây chết tế bào [20] Một số nghiên cứu đã được công bố cũng cho

thấy OA có khả năng gây đột biến gen mạnh in vitro với tế bào động vật [43] và

gây bất thường nhiễm sắc thể trên tế bào lympho người [58] Khả năng kích thích

phát triển khối u của OA và DTX1 cũng đã được phát hiện in vivo [45] cũng như

in vitro [57] Hoạt tính làm phát triển khối u của OA có thể liên quan tới các hoạt

động khác ở mức độ tế bào như quá trình oxy hóa các cơ chất khác nhau, quá trình methyl hóa các base của ADN và các cơ chế ức chế quá trình liên hệ qua khoảng gian bào [29]

Cho tới nay đã biết được trên 20 dẫn chất của OA, phần lớn là các tác nhân ức chế các protein PP yếu hơn so với OA Tác dụng sinh học của các dẫn xuất này chịu ảnh hưởng lớn bởi những thay đổi trên nhóm carboxyl hoặc trên hydroxyl ở C7 Một nghiên cứu về độc tính cấp cho thấy OA có LD50 = 204 Mg/kg, trong khi DTX2 có LD50 = 352 ^g/kg khi tiêm màng bụng, như vậy LD50 của DTX2 cao hơn OA tới 1,7 lần [12] Một nghiên cứu khác cho biết liều gây chết tối thiểu trên chuột với OA, DTX1 và DTX3 lần lượt là 200, 160 và 500 ^g/kg [11] Kết quả này cho thấy OA, DTX1 có độc tính cấp không chênh lệch nhiều, trong khi DTX3

có độc tính thấp hơn đáng kể so với OA và DTX1

1.2.4 Ngộ độc cho người do độc tố DSP

Hội chứng DSP hiếm khi gây đe dọa tính mạng, đồng thời triệu chứng tiêu chảy

có thể do nhiều nguyên nhân khác gây ra khi tiêu thụ hải sản, nên việc ghi nhận các trường hợp ngộ độc cho người do độc tố DSP gây ra là khó và không đầy đủ

Khi có những nghiên cứu sâu hơn vê khả năng kích thích phát triển khối u của

OA và DTX [45], [57] thì các nước mới quan tâm và chú ý nhiêu hơn tới hội chứng DSP Tại Pháp, những trường hợp mắc phải DSP đã được ghi nhận từ năm

1978 trở đi, trong đó có 10.000 ca hội chứng DSP đã được ghi nhận tại Pháp đến năm 1984 [33] Tại Bỉ, vào tháng 2/2002 đã có 403 ca DSP được ghi nhận sau khi tiêu thụ vẹm xanh lơ nhập từ Đan Mạch Kết quả phân tích trên mẫu vẹm đã phát hiện thấy OA vượt quá mức quy định [31] Tại Tây Ban Nha sự xuất hiện của

D.acuminata và D.acuta đã dẫn tới 5.000 trường hợp ghi nhận viêm đường tiêu

hóa với các triệu chứng DSP vào năm 1981 [133] Tại Anh, DSP xuất hiện lần đầu tiên năm 1997 khi 49 bệnh nhân xuất hiện triệu chứng sau khi ăn vẹm tại 2 nhà hàng ở London [33] Những trường hợp ngộ độc liên quan tới độc tố DSP cũng đã được ghi nhận tại Canada [83] và tại Mỹ, khi số trường hợp DSP được ghi nhận lên tới gần 2.000 ca vào năm 1983 [115] Năm 1999, tại Argentina lần đầu tiên ghi nhận xuất hiện DSP do ăn vẹm [42], trong khi một vụ ngộ độc gây rối loạn tiêu hóa cho 120 người sau khi ăn vẹm tươi xảy ra tại Chile năm 1991,

trong mẫu vẹm phát hiện có D.acuminata và các độc tố OA, DTX1 [11] Ở Việt

Nam chưa chính thức ghi nhận lần xuất hiện nào của DSP, tuy nhiên các loài tảo

hai roi có thể sinh ra những độc tố DSP như D.caudata, D.miles, D.rotundata đã

được xác định có mặt tại vùng biển Việt Nam [73]

l.2.5 Quy định kiểm soát độc tố DSP

1.2.51 Quy định kiểm soát độc tố DSP trên thế giới

Trên thế giới, đã có một số quốc gia đưa ra quy định quản lý nhóm độc tố DSP Nhật Bản là quốc gia đầu tiên thiết lập giới hạn cho phép của độc tố DSP ở mức

5 MU/100g thịt nhuyễn thể dựa trên các số liệu dịch tễ học khi DSP bùng phát tại Nhật năm 1978, tương đương với 0,16 mg OA/kg thịt nhuyễn thể [102] Dựa trên các nghiên cứu vê độc tính của độc tố DSP, Hội đồng châu Âu quy định mức tối

đa các độc tố gây ra DSP trong phần thịt ăn được của nhuyễn thể là 160 |ug OA [35] hoặc tương đương trong một kg, tuy nhiên riêng với nhóm OA giới hạn tối

đa khuyến cáo là 45 Mg/kg tính theo tương đương với OA [36] Tại Mỹ, USFDA cũng sử dụng giới hạn này [131], trong khi New Zealand đưa ra giới hạn 20 |ug

OA hoặc tương đương trong 100g thịt nhuyễn thể [113] Cho tới nay, quy định chính thức của đa số các quốc gia cho giới hạn độc tố DSP đêu ở mức không quá

tương đương 0,16 mg OA/kg thịt nhuyễn thể [35], [131], trong khi đó Australia đưa ra giới hạn cho phép của độc tố DSP cao hơn, tương đương 0,2 mg OA/kg thịt nhuyễn thể.

Về phương pháp phân tích, việc kiểm soát độc tố DSP trước đây được quy định thực hiện bằng phương pháp định lượng sinh học trên chuột (MBA) Phương pháp này có lợi thế đánh giá được tổng độc tính do tất cả các độc tố DSP có trong mẫu nhuyễn thể gây ra và không cần chất chuẩn độc tố tinh khiết khi phân tích thường quy Tuy nhiên, phương pháp MBA lại thiếu đặc hiệu, và để nâng cao độ đặc hiệu cho việc xác định cụ thể hàm lượng từng nhóm độc tố DSP, đặc biệt là hàm lượng nhóm OA trong nhuyễn thể, các phương pháp phân tích hóa lý đã được thiết lập ngay khi có các chất chuẩn độc tố tinh khiết Những phương pháp phân tích hóa

lý này chủ yếu dựa trên kỹ thuật sắc ký, trong đó LC - MS/MS là lựa chọn thích hợp nhất do độ nhạy, độ đặc hiệu cao Từ tháng 7/2011, EU đã quy định chuyển

từ phương pháp MBA sang phương pháp LC - MS/MS làm phương pháp chính thức để phân tích các độc tố DSP trong nhuyễn thể và là phương pháp hòa hợp chung [39]

1.25.2 Quy định kiểm soát độc tố DSP tại Việt Nam

Tại Việt Nam, việc quản lý chất lượng thủy hải sản thuộc thẩm quyền của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Năm 2015, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành thông tư số 33/2015/TT-BNNVPTNT [1] “Quy định về giám sát vệ sinh, an toàn thực phẩm trong thu hoạch nhuyễn thể hai mảnh vỏ” Thông tư này quy định nội dung, trình tự, thủ tục triển khai: “Chương trình giám sát vệ sinh, an toàn thực phẩm trong thu hoạch nhuyễn thể hai mảnh vỏ” trên cơ

sở đề nghị của địa phương (Chương trình giám sát); trách nhiệm, quyền hạn của các cơ quan và tổ chức, cá nhân có liên quan trong Chương trình giám sát Quá trình giám sát được quy định theo tinh thần của Thông tư 33/2015 bao gồm các nội dung:

1/ Khảo sát đưa vùng thu hoạch vào “Chương trình giám sát”

2/ Khảo sát lại định kỳ các vùng thu hoạch đã được phân loại

3/ Xây dựng kế hoạch lấy mẫu giám sát hàng năm

4/ Tổ chức thực hiện chương trình giám sát với các công việc:

♦ Lấy mẫu, kiểm nghiệm mẫu và kiểm soát thu hoạch, bao gồm:

+ Lấy mẫu và kiểm nghiệm mẫu.

+ Cập nhật thông tin về vùng thu hoạch

+ Kiểm soát và cấp Giấy chứng nhận xuất xứ, phiếu kiểm soát thu hoạch

♦ Xử lý các cảnh báo trong “Chương trình giám sát”, gồm các trường hợp:

+ Mật độ tảo độc trong nước biển vượt quá giới hạn cảnh báo nhưng hàm lượng độc tố sinh học trong NT2MV chưa vượt quá mức giới hạn cho phép

+ Kết quả kiểm nghiệm độc tố sinh học trong NT2MV vượt quá mức giới hạn cho phép

+ Các chất ô nhiễm trong NT2MV vượt quá mức giới hạn cho phép

+ Ngừng thu hoạch để bảo vệ nguồn lợi thủy sản hoặc do thời tiết hoặc không có nguồn lợi NT2MV thương phẩm nên Cơ quan kiểm soát không lấy được mẫugiám sát

+ Kiểm tra vi sinh vật vượt giới hạn hoặc tăng cao đột biến

a / Quy định về giới hạn độc tố sinh học trong nhuyễn thể

Theo phụ lục I của Thông tư 33/2015/TT-BNNVPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 3 nhóm độc tố gồm các độc tố thân dầu (nhóm OA, PTX, YTX, AZA), độc tố gây liệt cơ (độc tố PSP) và độc tố gây mất trí nhớ (ASP) được kiểm soát với mức giới hạn cho phép và quy định về phương pháp kiểm nghiệm tham chiếu như bảng 1.1 Tần suất lấy mẫu để phân tích các nhóm độc tố này được quy định là 2 lần/tháng tại các vùng bị ảnh hưởng bởi thủy triều (có bãi triều)

và 1 lần/tuần tại các vùng không bị ảnh hưởng bởi thủy triều (không có bãi triều) [1]

Bảng 1.1 Quy định kiểm soát độc tố sinh học trong nhuyễn thể theo

Thông tư 33/2015/TT-BNNVPTNT [1 ]

nghiệm tham chiếu

b/ Các tiêu chuẩn Việt Nam về kiểm soát độc tố sinh học trong nhuyễn thể

Việc kiểm soát độc tố sinh học trong nhuyễn thể đã được quy định tại mục 7.2.2.4 của Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7265:2015 “Quy phạm thực hành đối với thủy sản và sản phẩm thủy sản”, trong đó nói rõ việc kiểm soát phân tích độc tố sinh học trong NT2MV phải thực hiện theo Codex Stan 292-2008, về mặt phương pháp phân tích có thể lựa chọn sử dụng bất cứ phương pháp phù hợp nào được cơ quan quản lý chấp nhận [4]

Về quản lý chất lượng NT2MV đông lạnh sau khi thu hoạch, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8681:2011 [3] quy định kiểm soát độc tố DSP như sau: không phát hiện thấy độc tố gây tiêu chảy - DSP, phương pháp phân tích theo TCVN 8341:

2010 [2] (Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao)

♦ TCVN 8341:2010 - Nhuyễn thể hai mảnh vỏ (xác định hàm lượng độc tố gây tiêu chảy - DSP) - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng độc tố DSP gồm OA, DTX1 và DTX2 trong NT2MV Các độc tố được chiết bằng hỗn hợp MeOH - H2O (3:1), dịch chiết được làm sạch bằng n-hexan, độc tố được chiết sangcloroform, cô cạn, tạo dẫn xuất huỳnh quang với ADAM Dẫn xuất huỳnh quang của độc tố được thu hồi bằng cách dùng cột SPE, rửa giải ra khỏi cột bằng hỗn

hợp methanol - cloroform (1:9), cô cạn, hòa vào MeOH và đưa vào hệ thống HPLC Dẫn xuất với ADAM của các độc tố được phân tích trên cột C18 (250 X 4,6mm, 5^m) sử dụng pha động là hỗn hợp ACN - H20 (8:2), phát hiện bằng detector huỳnh quang với bước sóng kích thích 254 nm và bước sóng phát xạ 410

nm [2]

Ở đây có thể thấy TCVN 8681:2011 đã có những điểm trở nên không còn đồng nhất với Thông tư 33/2015 ra đời sau, chẳng hạn như về quy định phương pháp phân tích tham chiếu và giới hạn cho phép, thành phần độc tố kiểm soát với nhóm độc tố gây tiêu chảy (bảng 1.1) Trong khi đó, TCVN 7265:2015 ra đời sau đã thể hiện tinh thần hòa hợp quốc tế trong kiểm soát độc tố sinh học trong nhuyễn thể khi áp dụng các quy định của Codex Stan 292-2008 Điều này cho thấy xu thế này càng hoàn thiện, hòa hợp quốc tế của các quy định kiểm soát độc tố sinh học trong nhuyễn thể tại Việt Nam

Hiện nay, Việt Nam đã ban hành tiêu chuẩn quy định phương pháp, quy trình phân tích độc tố DSP Một số cơ quan đã cung cấp dịch vụ kiểm tra độc tố DSP như: Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, trung tâm chất lượng nông lâm thuỷ sản vùng 4, trung tâm chất lượng nông lâm thuỷ sản vùng 6 và trung tâm phân tích dịch vụ thí nghiệm Hồ Chí Minh, tuy nhiên mới chỉ có phương pháp phân tích độc tố ở dạng tự do, chưa có phương pháp phân tích độc tố ở dạng ester.1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ DSP

Trong phần này, các phương pháp xử lý mẫu và phân tích độc tố DSP (trong luận

án gọi là độc tố nhóm OA) đã được công bố sẽ được tổng quan lại, riêng các phương pháp sử dụng sắc ký khối phổ sẽ được tách riêng để tổng quan trong phần1.4

1.3.1 Các phương pháp xử lý m ẫu để chiết độc tố nhóm acid okadaic

Để xác định độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể, độc tố cả dạng tự do và dạng ester hóa được chiết khỏi mẫu bằng một quy trình gồm 2 giai đoạn:

♦ Giai đoạn 1: chiết độc tố từ nhuyễn thể bằng một dung môi hay hỗn hợp dung môi phù hợp

♦ Giai đoạn 2: làm sạch dịch chiết để loại bớt tối đa các tác nhân có thể ảnh hưởng tới quá trình phân tích các độc tố trước khi đưa vào hệ thống phân tích

Hiện tại, do mới chỉ sẵn có các chất chuẩn của OA, DTX1, DTX2 ở dạng tự do, trong khi thành phần, tỷ lệ các dạng ester hóa của 3 độc tố trên (gọi chung là các DTX3) thay đổi rất đa dạng không theo quy luật và còn chưa được biết đầy đủ, nên việc phân tích các độc tố nhóm OA cho tới nay vẫn chỉ thực hiện được chủ yếu ở dưới dạng OA, DTX1, DTX2 tự do, còn để phân tích các dạng ester hóa cần thủy phân để giải phóng thành 3 độc tố tự do kể trên sau đó tiến hành xác định tổng lượng của mỗi độc tố rồi trừ đi lượng độc tố tự do Vì vậy, khi xác định tổng lượng độc tố nhóm OA cần thêm một giai đoạn 3 là thủy phân mẫu, sau đó dịch thủy phân có thể được phân tích trực tiếp hoặc trải qua một giai đoạn làm sạch sau thủy phân (giai đoạn 4) trước khi đưa vào hệ thống phân tích Trong phần1.3.1, ba yếu tố quan trọng sau đây sẽ được tổng quan lại:

Lựa chọn dung môi để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn thể

Các phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu

Các phương pháp thủy phân dẫn xuất ester hóa của độc tố nhóm OA và làm sạch mẫu sau thủy phân

Lựa chọn dung môi để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn thể

Do bản chất thân dầu của các độc tố nhóm OA cả ở dạng tự do lẫn dạng ester hóa, dung môi sử dụng để chiết các độc tố này ra khỏi nhuyễn thể cần có độ phân cực phù hợp để đảm bảo hiệu suất chiết, đồng thời cũng phải hạn chế được việc chiết theo cùng các thành phần khác trong nhuyễn thể để đơn giản hóa giai đoạn làm sạch mẫu cũng như hạn chế sai số, nhất là dương tính giả và âm tính giả trong giai đoạn phân tích Trong giai đoạn đầu sau khi OA được phát hiện và định danh, aceton được dùng để chiết các độc tố này từ nhuyễn thể để định lượng bằng phương pháp sinh học trên chuột [65], [37]

Cho tới nay, MeOH và các hỗn hợp MeOH - H2O với tỷ lệ khác nhau vẫn là lựa chọn phổ biến nhất để chiết các độc tố nhóm OA từ nhuyễn thể SOP hòa hợp chính thức của EU năm 2015 sử dụng MeOH để chiết độc tố nhóm OA trước khi phân tích bằng LC - MS/MS [39] MeOH cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn thể trước khi phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng với các detector khác nhau, chủ yếu là MS và MS/MS [48], [137], [105], [66], [32], [78], [141], [21] Bên cạnh methanol, hỗn hợp MeOH - H2O cũng được sử dụng để chiết độc tố nhóm OA ở tỷ lệ 90-10 (tt/tt) [74], [85],

80-20 (tt/tt) [154], [75] trước khi phân tích bằng sắc ký l ỏng Tại Việt Nam, TCVN 8341:2010 cũng sử dụng hỗn hợp MeOH - H2O (80:20, tt/tt) để chiết độc tố nhóm

OA khỏi nhuyễn thể [2] Ngoài ra, MeOH - H2O (80:20, tt/tt) [127] và MeOH [152] cũng được dùng để chiết độc tố nhóm OA trước khi định lượng bằng phương pháp miễn dịch qua khả năng ức chế enzym protein PP2A MeOH - H2O (80:20, tt/tt) còn được dùng chiết độc tố nhóm OA trước khi định lượng bằng phương

pháp sinh học với Daphnia magna [135] Khi MeOH được dùng làm dung môi

chiết, dịch chiết MeOH có thể được dùng để đưa thẳng vào hệ thống phân tích sau khi ly tâm, lọc mà không qua các giai đoạn làm sạch tiếp theo [48], [137], [105],

[66]

Như vậy, MeOH hoặc hỗn hợp MeOH - H2O là lựa chọn phổ biến và thích hợp nhất để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn thể để phân tích

1.3.1.2 Các phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu

Tùy thuộc vào dung môi chiết sử dụng trong giai đoạn đầu và loại kỹ thuật phân tích sẽ sử dụng, dịch chiết ban đầu thu được từ mẫu nhuyễn thể có thể được xử lý làm sạch theo nhiều quy trình khác nhau, nhưng về cơ bản sử dụng 2 kỹ thuật: chiết lỏng - lỏng hoặc SPE

Chiết lỏng - lỏng

Khi aceton được sử dụng làm dung môi chiết ban đầu để lấy độc tố nhóm OA ra khỏi nhuyễn thể, dung môi này được bay hơi, cắn hòa tan trở lại vào nước, chiết bằng diethyl ether Dịch chiết diethyl ether được rửa lại bằng nước, bốc hơi dung môi trước khi hòa tan vào dung dịch Tween60 1% [37]

Khi MeOH được dùng làm dung môi chiết ban đầu, ngoài một số nghiên cứu đưa thẳng dịch chiết này vào hệ thống phân tích sau khi ly tâm, lọc, một số nghiên cứu khác sử dụng các quy trình xử lý dịch chiết ban đầu bằng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng:

♦ TCVN 8341:2010: dịch chiết ban đầu trong hỗn hợp MeOH - H2O (80:20, tt/tt) được làm sạch bằng cách chiết với n-hexan, sau đó lớp dịch chiết MeOH - H2O được pha loãng với nước để tỷ lệ MeOH - H2O giảm xuống còn (2:1, tt/tt) rồi chiết bằng cloroform Lớp cloroform được đem cô lấy cắn, hòa tan vào hỗn hợp MeOH - dung dịch acid deoxycholic 35 ppm trong MeOH (80:20, tt/tt) để mang tạo dẫn xuất với ADAM [2]

♦ Dịch chiết MeOH được pha loãng với nước để tỷ lệ MeOH giảm xuống 60 % rồi chiết bằng cloroform, sau đó lớp cloroform được lấy cô cạn, hòa tan cắn trong MeOH rồi đưa vào hệ thống phân tích [32].

♦ Dịch chiết MeOH được pha loãng với nước để giảm tỷ lệ MeOH xuống khoảng

50 %, chiết bằng isopropyl acetat, lấy lớp isopropyl acetat cô cạn, hòa tan cắn trong MeOH đưa vào hệ thống phân tích [66]

♦ Dịch chiết trong MeOH (80:20, tt/tt) được rửa với n-hexan, sau đó pha loãng với nước để giảm tỷ lệ MeOH xuống 50 %, rồi chiết với ethyl acetat, lấy lớp ethyl acetat cô chân không lấy cắn hòa tan lại vào ethanol để phân tích [127]

b Chiết pha rắn - SPE

Bên cạnh chiết lỏng - lỏng, dịch chiết sơ bộ ban đầu từ nhuyễn thể còn được xử

lý bằng SPE Một số quy trình chiết pha rắn để xử lý mẫu trước khi phân tích độc

tố nhóm OA đã được công bố như sau:

♦ Dịch chiết MeOH được cô bớt dung môi xuống còn khoảng 1ml, pha loãng 3 lần bằng H2O và đưa qua cột chiết pha rắn Strata-X (Phenomenex, Mỹ), rửa bằng MeOH - H2O (20:80, tt/tt) rồi rửa giải bằng MeOH chứa 0,3 % amoni hydroxyd [141]

♦ TCVN 8341:2010 sử dụng cột SPE nhồi silica gel để tinh chế dẫn xuất của các độc tố với ADAM sau giai đoạn tạo dẫn xuất, rửa bằng hỗn hợp cloroform - n- hexan (1:1, tt/tt) và cloroform chứa 1,15 % ethanol, dẫn xuất của độc tố và ADAM được rửa giải thu hồi bằng hỗn hợp methanol -cloroform (1:9, tt/tt), cô cạn rồi hòa tan cắn vào MeOH để tiêm sắc ký [2] Cột SPE silicagel cũng được sử dụng để làm sạch dẫn xuất của độc tố nhóm OA với thuốc thử BAP [51], BrDMEQ [96],

CA [96] trước khi phân tích bằng HPLC với detector huỳnh quang

♦ Có trường hợp, chiết lỏng-lỏng và SPE được kết hợp để làm sạch mẫu và tách riêng độc tố sau khi chiết từ nhuyễn thể bằng hỗn hợp MeOH - H2O (80:20, tt/tt), dịch chiết MeOH - H2O được rửa với n-hexan, rồi được pha loãng bằng nước tới

tỷ lệ MeOH - H2O (2:1) rồi chiết bằng cloroform Dịch chiết cloroform được cô cạn, cắn được hòa tan trong hỗn hợp aceton- n-hexan (80:20, tt/tt) nạp lên cột chiết pha rắn Sep-Pak silica, rửa bằng hỗn hợp aceton-n-hexan (80:20, tt/tt) và

MeOH 3 % trong aceton Độc tố được rửa giải bằng MeOH - H2O (40:60, tt/tt),

cô cạn, hòa cắn trong MeOH - H2O (80:20, tt/tt) để phân tích [154]

♦ Bên cạnh mẫu nhuyễn thể, cột Oasis HLB còn được dùng để chiết trực tiếp độc

tố nhóm OA từ tế bào tảo Dinophysis, sau đó độc tố lưu giữ trên cột được rửa giải

bằng MeOH [47]

1.3.1.3 Các phương pháp thủy phân mẫu và làm sạch mẫu sau thủy phân

Để thủy phân các dạng ester hóa của độc tố nhóm OA, cho tới nay có 2 lựa chọn

đã được thực hiện và công bố: thủy phân trong môi trường kiềm bằng NaOH và thủy phân bằng enzym

Thủy phân bằng NaOH là lựa chọn phổ biến hơn cả, trong đó các độc tố ở dạng ester hóa được thủy phân bằng dung dịch NaOH 2,5N ở 76 oC trong 40 phút [39], [21], [78], [152] hoặc ở 50 oC trong 1 giờ [108], hoặc bằng dung dịch NaOH 1M

ở 40 oC trong 45 phút [107] Sau khi thủy phân, dịch thủy phân được trung hòa bằng HCl và có thể được đưa thẳng vào hệ thống phân tích [21], [48], [78] hoặc trải qua một giai đoạn xử lý sau thủy phân Phương pháp chính thức của EU [39] hiện để mở không quy định bắt buộc việc xử lý mẫu sau giai đoạn thủy phân mà chỉ quy định cần đánh giá độ thu hồi của các giai đoạn xử lý mẫu sau thủy phân nếu có

Giai đoạn xử lý sau thủy phân thường là chiết lỏng - lỏng với một dung môi ít phân cực để chiết các độc tố tự do có chọn lọc sang pha dung môi hoặc làm sạch dịch thủy phân theo các cách sau:

♦ Dịch thủy phân được pha loãng với H2O để hạ tỷ lệ MeOH xuống khoảng 50

% rồi chiết bằng isopropyl acetat, lấy lớp isopropyl acetat cô cạn, hòa tan cắn trong MeOH đưa vào hệ thống phân tích [66]

♦ Dịch thủy phân được rửa bằng n-hexan, pha loãng với nước để tỷ lệ MeOH xuống khoảng 50 % rồi chiết bằng dicloromethan, dịch chiết dicloromethan được

cô lấy cắn hòa tan vào MeOH - H2O (80:20, tt/tt) để tiêm vào hệ thống phân tích [107]

♦ Dịch thủy phân được chiết bằng cloroform, sau đó lớp cloroform được lấy cô cạn, hòa tan cắn trong MeOH rồi đưa vào hệ thống phân tích [32]

Bên cạnh thủy phân bằng NaOH, các ester của độc tố nhóm OA còn được thủy phân bằng enzyme lipase và esterase [32]