Tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B

Tinh chế kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



TINH CHẾ KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT

VIRUS VIÊM GAN B

LUẬN VĂN KỸ SƯ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

PGS TS NGUYỄN LÊ TRANG NGUYỄN THỊ KIM HIỀN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006

Professor Student

HCMC, 09/2006

i

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường

Con xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Lê Trang - người thầy đã dạy dỗ, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tại Viện Pasteur

Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hướng dẫn dạy

dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Nguyệt Thu, KS Đỗ Thị Châm,

KS Võ Thị Mỹ Duyên, CN Lạc Ngọc Thêm, CN Lại Ngọc Diễm, chị Sim phòng Miễn Dịch, Viện Pasteur đã nhiệt tình giúp đỡ, dạy bảo em nhiều điều trong suốt thời gian thực hiện khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Viện Pasteur – TpHCM đã cho phép

và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại Viện

Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 28 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Kim Hiền

Sau khi tiến hành đề tài, chúng tôi đã đạt được những kết quả sau:

 HBsAg được tinh chế với hoạt tính kháng nguyên HBsAg so với hàm lượng

protein tổng số là 32,35.10 3

mUI/ OD

 Độ tinh khiết của sản phẩm là 44 lần

 HBsAg được tinh chế khá tốt, kết quả được thể hiện trên gel điện di: dung

dịch HBsAg thu được có chứa các băng có trọng lượng phân tử từ 25 – 28 kDa tương

ứng với các quyết định kháng nguyên của HBsAg

Đề tài này là một bước quan trọng để tiến hành tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán phát hiện virus viêm gan B trong máu

iii

MỤC LỤC

Trang tựa

Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách các chữ viết tắt iv

Danh sách các hình v

Danh sách các bảng vi

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích – Yêu cầu 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Lịch sử phát hiện của HBV 3

2.2 Phân loại HBV 3

2.3 Hình dạng - Cấu trúc HBV 3

2.3.1 Hình dạng HBV 3

2.3.2 Cấu trúc gen HBV 5

2.4 Quá trình sao chép và nhân lên của HBV 8

2.5 Phương pháp xét nghiệm để phát hiện HBV 10

2.5.1 Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học 10

2.5.2 Phương pháp chẩn đoán dựa trên chức năng gan 10

2.5.3 Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học và hoá miễn dịch 10 2.6 Các kiểu lây truyền HBV 12

2.7 Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) 12

2.7.1 Bản chất HBsAg 12

2.7.2 Tầm quan trọng HBsAg 12

2.7.3 Các phân typ HBsAg 13

2.7.4 Tinh khiết HBsAg 14

2.7.5 Định lượng HBsAg 14

iv

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu 15

3.2.1 Dụng cụ 15

3.2.2 Thiết bị 15

3.2.3 Hoá chất và cách chuẩn bị các dung dịch 15

3.2.3.1 Hoá chất 15

3.2.3.2 Cách chuẩn bị các dung dịch 16

3.3 Bố trí thí nghiệm 20

3.4 Phương pháp nghiên cứu 21

3.4.1 Phương pháp tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate 21

3.4.1.1 Nguyên tắc 21

3.4.1.2 Tiến hành 23

3.4.2 Phương pháp tinh chế protein bằng hệ thống gel lọc - cột Sephacryl 300 23

3.4.2.1 Nguyên tắc 23

3.4.2.2 Tiến hành 24

3.4.3 Phương pháp tinh chế protein bằng sắc ký ái lực - cột Sepharose CL – 4B Dextran sulfate 25

3.4.3.1 Nguyên tắc 25

3.4.3.2 Tiến hành 26

3.4.4 Phương pháp định lượng protein bằng đo mật độ quang – OD 280nm 26

3.4.4.1 Nguyên tắc 26

3.4.4.2 Tiến hành 26

3.4.5 Phương pháp điện di trên SDS - polyacrylamide gel kiểm tra mức độ tinh chế 26

3.4.5.1 Nguyên tắc 26

3.4.5.2 Tiến hành 28

v

3.4.6 Phương pháp định lượng HBsAg 28

3.4.6.1 Khái niệm 28

3.4.6.2 Nguyên tắc hoạt động 28

3.4.6.3 Mục đích 29

3.4.6.4 Xác định kết quả 29

3.4.6.5 Đánh giá kết quả thí nghiệm 29

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả định lượng kháng nguyên HBsAg trong huyết thanh 30

4.2 Kết quả ở giai đoạn tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate 30

4.3 Kết quả tinh chế HBsAg bằng phương pháp sắc ký lọc gel - cột Sephacryl S300 32

4.4 Kết quả tinh chế HBsAg bằng phương pháp sắc ký ái lực - cột Sepharose CL – 4B Dextran sulfate 34

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮC

HBsAg Hepatitis B surface Antigen

HBcAg Hepatitis B core Antigen

DNA Desoxyribose Nucleic Acid

ALT Alanine Aminotransfease, SGPT

SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Các dạng HBV 4

Hình 2.2 Tổ chức genome của HBV 5

Hình 2.3 Mô hình Virus toàn vẹn (virion) 6

Hình 2.4 Lƣợc đồ vòng đời HBV 8

Hình 2 5 Quá trình sao chép và nhân lên của HBV 9

Hinh 3.1 Quá trình thẩm tích 22

Hình 3.2 Sắc ký lọc gel 24

Hình 3.3 Sắc ký ái lực 25

Hình 3.4 Nguyên tắc hoạt động của kit Architect®HBsAg (Abbott) 28

Hình 4.1 Kết quả điện di SDS – PAGE 5 -15 % sau khi tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate bão hoà 30

Hình 4.2 Đồ thị sắc ký lọc gel thực hiện trên máy AKTA với cột Sepharyl S 300 32

Hinh 4.3 Kết quả điện di SDS – PAGE 5- 15 % sau khi qua cột Sepharyl S 300 33

Hình 4.4 Đồ thị sắc ký ái lực thực hiện trên máy AKTA với cột Sepharose CL – 4B dextran sulfate 35

Hình 4.5 Kết quả điện di 15% SDS - PAGE DTT sau khi qua cột S Sepharose CL – 4B Dextran sulfate 36

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG Bảng 2.1 Ý nghĩa các dấu ấn huyết thanh học của HBV ở bệnh nhân

viêm gan B 11

Bảng 2.2 Các dấu ấn HBV chính trong viêm gan B cấp và mạn 11

Bảng 2.3 Phân typ của HBsAg 13

Bảng 4.1 Kết quả sau quá trình tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate 31

Bảng 4.2 Kết quả sau quá trình thực hiện sắc ký lọc gel trên Sepharyl S 300 33

Bảng 4.3 Kết quả thu đƣợc sau toàn bộ quá trình tinh chế HBsAg 37

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Bệnh viêm gan virus B (HBV) là vấn đề mang tính toàn cầu, bởi đây là một trong

những bệnh truyền nhiễm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng

Virus viêm gan B cũng chính là tác nhân liên quan đến ung thư tế bào gan và một số

bệnh liên quan đến xơ gan, viêm gan mạn tính

Ngoài ra, HBV còn có thể lây truyền cho người khác qua đường máu (tiếp xúc

với máu hay các sản phẩm từ máu, dụng cụ dính máu) Theo ước tính, người mang

HBsAg sẽ có 40% có nguy cơ ung thư gan, tuy vậy có thể ngăn ngừa bệnh bằng

vaccine, đặc biệt là lúc mới sinh bệnh

Theo phân bố dịch tễ học HBV của Tổ chức y tế Thế giới thì Việt Nam là một

trong những nước có nguy cơ cao về nhiễm virus viêm gan B, với tỉ lệ người mang

HBsAg trong cộng đồng dân chúng từ 15 - 26% Do đó, nguồn kháng nguyên tự nhiên

ở những người lành mang HBsAg là rất nhiều

Đồng thời, HBsAg là kháng nguyên được sản xuất ra gấp bội so với các loại

kháng nguyên khác của HBV và có hoạt tính kháng nguyên cao có thể sản sinh được

kháng thể bảo vệ và chống lại HBV

Mặt khác, HBsAg lại rất đặc hiệu để chuẩn đoán bệnh HBV Vì vậy, y học đã sử

dụng HBsAg để làm vaccine, cũng như làm kháng nguyên để sản xuất kháng thể nhằm

tạo các bộ sinh phẩm chuẩn đoán HBV

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ”Tinh chế kháng

nguyên bề mặt của virus viêm gan B”

 Loại bỏ lần lượt các thành phần protein huyết thanh qua các quá trình tủa

phân đoạn bằng ammonium sulfate, sắc ký lọc trên gel Saphacryl S300, sắc ký ái lực trên Sepharose CL - 4B - dextran sulfate

 Xác định tổng lượng protein bằng phương pháp đo mật độ quang học ở bước

sóng 280 nm (OD 280nm)

 Xác định hàm lượng kháng nguyên HBsAg bằng phương pháp định lượng miễn dịch

 Kiểm tra độ tinh sạch của kháng nguyên HBsAg đã tách chiết bằng phương

pháp điện di trên SDS - PAGE

PHẦN 2 TỔNG QUAN

2.1 Lịch sử phát hiện HBV

 1963: Blumberg phát hiện một loại kháng thể có thể phản ứng với một loại kháng nguyên trong mẫu huyết thanh của một thổ dân Úc bị viêm gan Và được gọi là kháng nguyên Úc Châu (Au)

 1967: phát hiện Au, là kháng nguyên bề mặt của virus gây viêm gan siêu vi loại B (HBsAg)

 1970: Dane phát hiện kháng nguyên lõi (HBcAg), có đường kính 42 nm trong máu của bệnh nhân bị viêm gan siêu vi B - gọi là hạt tử Dane

 1973: phát hiện HBeAg (kháng nguyên nội sinh)

 1979: nhân dòng HBV DNA và xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần

 1983: khuếch đại DNA virus bằng phương pháp PCR do Mullis phát hiện

2.2 Phân loại HBV

Hepatitis B virus (HBV) thuộc họ Hepadnaviridae do tính hướng gan và bộ gen

DNA kép của chúng

Họ Hepadnaviridae có 2 nhóm phụ:

 Orthohepadnavirus: gây viêm gan B ở loài có vú

 Avihepadnavirus: gây viêm gan B ở loài chim

2.3 Hình dạng - Cấu trúc HBV [ 2 ] [ 3 ] [ 18 ]

2.3.1 Hình dạng

Khi quan sát huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn hoạt động nhân lên của siêu

vi bằng kính hiển vi điện tử, người ta thấy có 3 dạng khác nhau

 Hạt tử Dane hoặc virion hoàn chỉnh

 Có dạng hình cầu, đường kính 42 nm

 Khi nhuộm âm bản, virion hiện rõ cấu trúc 2 vỏ

 Vỏ bọc bên ngoài được tạo bởi các protein bề mặt (HBsAg)

 Vỏ bên trong được cấu tạo từ các protein lõi (HBcAg), tạo thành hình cầu

có đường kính 28 - 34 nm; gồm khoảng 240 bản sao của protein lõi Bên trong chứa

cấu trúc DNA chuỗi đôi và các enzyme như enzyme DNA polymerase và protein kinase

 Cấu trúc hình cầu

 Có đường kính 15 - 25 nm, thường có nồng độ 1013 /ml

 Được cấu tạo từ các protein bề mặt

 Các cấu trúc hình ống

 Có đường kính 20 - 22 nm, có chiều dài thay đổi, có nồng độ 1011/ml

 Các cấu trúc này có thể do cấu trúc hình cầu chồng chất lên nhau tạo ra

Hai cấu trúc hình cầu và hình ống là phần kháng nguyên bề mặt của siêu vi được sản xuất dư thường từ tế bào gan và chúng biểu hiện những đặc tính kháng nguyên HBsAg Nồng độ HBsAg trong huyết thanh 10 - 1000 µg/ml

Hình 2.1 Các dạng HBV

2.3.2 Cấu trúc gen

Bộ gen HBV toàn vẹn có chiều dài từ 3.182 - 3.221 base

Bộ gen ở dạng vòng, gồm 2 sợi DNA có chiều dài không bằng nhau

 DNA chuỗi âm: nằm bên ngoài, 3 - 3,3 kb (thay đổi tuỳ loài

Hepadnavirus), mã hoá cho các thông tin di truyền, chứa nhiều gen chồng lấp lên

nhau, tạo thành vòng tròn liên tục và dư ra một đoạn 8 - 9 nucleotide Đầu 5’ của mạch DNA âm mang vị trí gắn kết DNA polymerase của virus

 DNA chuỗi dương: nằm bên trong, 1,7 - 2,8 kb, có đầu tận cùng 5’ cố

định nhưng đầu 3’ thay đổi Đa số các bộ gen HBV có một đoạn hổng mạch đơn có chiều dài 300 - 2000 base Đầu 5’ của mạch DNA dương được tạo bởi một oligoribonucleotide dài 18 base, được gắn chóp giống mRNA

Cấu trúc vòng của DNA được đảm bảo nhờ sự ghép nối hai đầu 5’ của hai sợi DNA trên một đoạn có chiều dài 200 nucleotide gọi là vùng liên kết.Vùng này nằm giữa hai trình tự DR1 và DR2 có 10 - 11 nucleotide DR1 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA

âm và cũng hiện diện ở đoạn dư của đầu 3’ DR 2 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA dương Hai trình tự này đóng vai trò khởi sự quá trình sao chép các chuỗi DNA tương ứng

Hình 2.2 Tổ chức genome của HBV (http://www.socgenmicrobiol.org.uk/JGVDirect/18197/18197ft.htm)

Trên mạch DNA âm của HBV của loài có vú có 4 khung đọc mở mã hoá cho 4 loại protein tương ứng Các đoạn đọc mở này nằm chồng lên nhau Quá trình đọc mã bắt đầu bằng codon mở đầu (AUG) và kết thúc bằng codon kết thúc (TAG)

 Gen S

Bao gồm vùng S, pre –S1, pre-S2, mã hoá để tổng hợp các protein bề mặt

 Đoạn gen S: mã hoá cho protein bề mặt nhỏ (Small Hepatitis B surface) gồm

226 acid amine, có trọng lượng phân tử 24 kD Protein này rất kỵ nước, có thể glycosyl hoá ở asp 146 Là protein chủ yếu chiếm đa số Người ta phát hiện ở vùng S

Quyết định kháng nguyên w lại gồm những biến thể w1, w2, w3, w4

Hình 2.3 Mô hình virus toàn vẹn (virion) (http://www.dgk.de/web/dgk_content/de/bildarchiv_erreger.htm)

 Gen S, pre-S1, pre S2: mã hoá tổng hợp nên protein bề mặt lớn (Large Hepatitis B surface ) có trọng lượng phân tử 39 kD mã hoá 389 acid amine gồm 2

dạng protein p 39 và gp 42 Chuỗi protein pre - S1 có chiều dài thay đổi tuỳ theo từng

chủng loại khác nhau.Đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt tế bào gan sẽ liên kết với siêu vi, giúp siêu vi xâm nhập vào trong tế bào Kháng thể anti - pre - S1

có thể trung hoà và ức chế siêu vi kết dính vào tế bào gan

 Gen C

Gồm 2 vùng pre-C và C Nếu quá trình đọc mã được bắt đầu từ codon AUG thứ

nhất ở vị trí 1814 và đọc suốt chiều dài của đoạn gen pre-C và C sẽ tổng hợp nên HBeAg

Các nucleotide đầu tiên của vùng pre-C và C sẽ mã hoá cho việc tạo nên một đoạn peptide gồm 19 acid amine gọi là peptide tín hiệu Peptide này giúp cho HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội chất của tế bào gan dưới dạng hoà tan trong huyết thanh HBeAg là một protein không tham dự vào cấu trúc của virion và chức năng chưa biết rõ Tuy nhiên sự hiện diện của nó liên quan đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạng đang nhân đôi của siêu vi

Nếu quá trình dịch mã bắt đầu từ codon AUG thứ 2 ở vị trí 1901 đi suốt đoạn gen

C sẽ tổng hợp nên HBcAg có trọng lượng phân tử 21 kDa, gồm 183 - 185 acid amine

Đây là kháng nguyên cấu trúc của phần nucleocapside Protein này không được bài tiết

ra khỏi tế bào gan vì không có đoạn peptide tín hiệu

Vùng đầu tận cùng N: mã hoá cho primase là đoạn mồi cần thiết cho sự tổng hợp mạch DNA âm

Vùng kế tiếp: là vùng đệm nằm gối lên các vùng pre - S1 và pre - S2 vai trò chưa hiểu rõ, có lẽ giúp biểu hiện các protein bề mặt trung bình và lớn

Vùng kế tiếp: mã hoá DNA polymerase phụ thuộc RNA hoặc DNA có vai trò

là men phiên mã ngược Vùng này có một trình tự mã hoá các acid amine tương đối ổn

định YMDD (tyrosine – methyonine – apartate - aspartate) có lẽ đây là vị trí xúc tác của men phiên mã ngược

Vùng đầu C: là Rnase H có vai trò phân cắt RNA trong các thể lai RNA-DNA làm thoái biến khuôn trong lúc tổng hợp mạch DNA âm

Gần đây, HBx được chứng minh góp phần làm ung thư di căn

2.4 Quá trình sao chép và nhân lên của HBV [ 18 ]

Chu kỳ sống của HBV được chia thành nhiều bước

1 Gắn virus vào màng tế bào ký chủ

2 Sự xâm nhập của virus vào tế bào

3 Sự phóng thích bộ gen của virus

4 Sự biểu hiện các sản phẩm gen virus

5 Sự sao chép bộ gen virus

6 Lắp ráp các hạt virion

7 Phóng thích virus

Hình 2.4 Lược đồ vòng đời HBV

(www.infekt.ch)

Virion vào cơ thể, xâm nhập vào tế bào, gắn lên thụ thể trên bề mặt tế bào, có sự dung hợp giữa màng tế bào và vỏ virus Sau đó, virus sẽ phóng thích bộ gen vào trong nhân

Trong nhân, bộ gen sợi đôi không khép kín của HBV biến đổi thành DNA sợi đôi vòng khép kín đồng hoá trị (cccDNA.) cccDNA của virus sẽ liên kết với histone nhân của tế bào chủ hình thành nhiễm sắc thể nhỏ ngoại thể và đƣợc sử dụng làm khuôn để phiên mã tổng hợp các RNA

Các RNA dịch mã cho ra protein polymerase và protein lõi HBcAg Hai protein này lắp ráp chung với mRNA hình thành phức hợp sao chép Vùng primase của polymerase đƣợc dùng nhƣ những đoạn mồi đối với enzyme transcriptase sẽ phiên mã tiền genome RNA hình thành DNA sợi âm

Hình 2 5 Quá trình sao chép và nhân lên của HBV

Khi DNA âm được tổng hợp, tiền genome mRNA sẽ bị giáng hoá dưới tác dụng của Rnase H, trừ một đoạn nhỏ khoảng 20 cặp base ở đầu 5’ Đoạn RNA này sẽ hoạt động như một primer để tổng hợp DNA sợi dương từ DNA sợi âm mới được tổng hợp, hình thành DNA sợi kép hoàn chỉnh

DNA sợi kép sẽ nhận vỏ bọc chứa HBsAg bằng cách đâm chồi từ màng bào tương và sẽ trở thành những hạt virus gây nhiễm Các hạt virion hoàn chỉnh này được

giải phóng vào máu tuần hoàn và tiếp tục gây nhiễm các tế bào chủ tiếp theo

2.5 Các phương pháp xét nghiệm để phát hiện HBV [ 1 ]

Hiện nay, việc chẩn đoán HBV thường dựa vào các dấu ấn miễn dịch (finger -print) như tìm kháng nguyên HBs, HBe và kháng thể anti - HBs, anti - HBe, anti - HBc, tìm DNA hoặc hạt tử Dane trong huyết thanh hoặc trong tế bào gan bị nhiễm, xác định và định lượng kháng nguyên của HBV đặc biệt là HBsAg

2.5.1 Phương pháp chẩn đoán huyết học

Phương pháp này dựa vào sự biến động các thành phần của máu Khi bị nhiễm virus, bạch cầu đa nhân giảm, lympho bào tăng ở thời kỳ trước vàng da và bình thường khi vàng da

2.5.2 Phương pháp chẩn đoán dựa trên chức năng gan

Khi tế bào gan bị tổn thương sẽ xuất hiện các hội chứng ứ mật làm tăng bilirubin máu, hội chứng viêm mô làm mất sự thăng bằng protein huyết tương hoặc sự thay đổi thuộc tính của transaminase ở hội chứng huỷ hoại tế bào gan

2.5.3 Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học và hoá miễn dịch

Phương pháp trực tiếp phát hiện các hạt Dane hoặc kháng nguyên của HBV trong huyết thanh hoặc tế bào gan bằng kính hiển vi điện tử

Phương pháp gián tiếp phát hiện HBV thông qua các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan có trong huyết thanh bằng cách cho chúng tạo phức với kháng nguyên hoặc kháng thể tương ứng, việc đánh giá có thể thực hiện bằng mắt thường hoặc bằng máy

Bảng 2.1 Các dấu ấn HBV chính trong viêm gan B cấp và mạn [ 1 ]

Dương tính, rồi biến mất Xuất hiện khi hồi phục

Dương tính, tồn tại Thấp hoặc âm tính HBeAg hoặc anti – HBe

Cao hoặc thấp, tồn tại

Âm Bảng 2.2 Ý nghĩa các dấu ấn huyết thanh học của HBV ở bệnh nhân viêm gan [ 3 ]

HBsAg HBeAg Anti-HBe Anti-HBc Anti-HBs Nhận định

đầu giai đoạn cấp tính

2.6 Các kiểu lây truyền HBV [ 1 ]

Có 4 kiểu lây truyền HBV chủ yếu sau

 Lây nhiễm qua đường máu và các dịch sinh lý cơ thể

 Lây nhiễm HBV qua tiếp xúc tình dục

 Lây nhiễm giữa các trẻ nhỏ qua tiếp xúc

 Lây nhiễm qua chu sinh

2.7 Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) [ 3 ]

2.7.1 Bản chất của HBsAg

 HBsAg là phần gắn liền với HBV

 Phần lớn là những hạt hình cầu đường kính 22 nm hoặc những hạt hình ống chiều dài thay đổi, đường kính 22 nm hoặc một số hạt đường kính 42 nm Tất cả các hạt này đều là HBsAg

 Phần lớn HBsAg có tỷ trọng 1,2 g/ cm3

trong chlorua cesium

 HBsAg được cấu tạo bởi protein và lipid

 HBsAg tinh khiết có trọng lượng phân tử cao 3.10 6

Da, song các quyết định

kháng nguyên của HBsAg được biểu thị bằng các chuỗi polypeptid có kích thước nhỏ hơn nhiều, ví dụ như 22.000, 27.000 và 49.000 Da, nồng độ từ 10 – 1.000 µg/ml

2.7.2 Tầm quan trọng của HBsAg

Việc phát hiện HBsAg trong huyết thanh của một người, chứng tỏ người đó có HBV và có khả năng truyền bệnh cho người khác

Việc xét nghiệm HBsAg cho những người cho máu để đề phòng truyền máu hoặc các sản phẩm của máu HBsAg (+) đã làm giảm được sự truyền máu có liên quan đến viêm gan B

HBsAg là chỉ điểm của một nhiễm trùng HBV ngay cả khi trạng thái của bệnh không rõ ràng HBsAg có thể là một dấu hiệu duy nhất của một nhiễm trùng viêm gan

B cấp tính trong một vài ngày đến vài tuần, trước khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng hoặc các chỉ điểm khác của sự nhiễm trùng (kháng thể kháng kháng nguyên lõi của viêm gan B (anti-HBc) xuất hiện)

HBsAg được tìm thấy trong tất cả các thành phần của máu và các sản phẩm điều chế từ huyết thanh có HBsAg (+) Ngoài ra, HBsAg còn có trong các dịch tiết khác nhau của cơ thể: nước tiểu, nước mắt, sữa, nước bọt…

HBsAg là kháng nguyên rất bền vững

2.7.3 Các phân typ của HBsAg

Kháng nguyên HBsAg có một quyết định kháng nguyên đặc hiệu nhóm a và hai cặp quyết định kháng nguyên: d và y; w và r Cả ba quyết định kháng nguyên trên đều

có mặt trong ba dạng thể virus Với ba quyết định kháng nguyên trên sinh ra bốn dòng

di truyền thứ là: adw, ayw, adr và ayr Phân biệt bốn dòng trên có ích trong giám sát dịch tể học nhưng bốn dòng đều gây bệnh lý như nhau

Bảng 2.3 Phân typ của HBsAg

Quyết định kháng nguyên nhóm Alen quyết định kháng nguyên

a

Phân typ chính của HBsAg:adw, ayw, adr, ayr

Quyết định kháng nguyên phân typ phụ:x, n, t, g,

Re, j, k và tên gọi a1(w1), a21(w2),a3(w4)

d-y w-r

2.7.4 Tinh khiết HBsAg [ 3 ] [ 11 ]

Có thể tách chiết và tinh khiết HBsAg bằng nhiều kỹ thuật khác nhau gồm

 Siêu ly tâm

 Sắc ký cột

 Tập trung đẳng điện

 Kết tủa bằng ammonium sulfate hoặc polyethylen glycol

 Và các phương pháp phối hợp các quá trình trên

Các thành phần hay liên kết với HBsAg là albumin, lipoprotein, 2-macroglobulin Việc tinh khiết HBsAg từ bất kỳ nguồn nào cũng là một quá trình thử thách hoàn toàn khác với quá trình tinh khiết các protein khác, bởi vì sản phẩm mong muốn không

chỉ là một polypeptide 24 kD đơn thuần mà là một phức hợp của polypeptide lắp ráp với lipide của tế bào chủ vào hạt hình cầu 22 nm, mỗi hạt chứa khoảng 100 polypeptide

Vì lượng kháng nguyên có trong nguyên liệu ban đầu (huyết thanh, dung dịch ly giải nấm men…) chỉ khoảng 1% lượng protein toàn phần Vì vậy việc phân tích trực tiếp có thể được tiến hành với các thử nghiệm dựa vào kỹ thuật hoặc miễn dịch men (ELISA) hoặc là miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA) Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và điện di trên SDS - PAGE được dùng để kiểm soát quá trình tinh khiết ở các giai đoạn sau khi kháng nguyên đã là thành phần cơ bản

Những kết quả làm biến tính và chạy điện di trên gel polyacrylamid của phòng thí nghiệm, một số tác giả mô tả có tới 11 băng trên HBs hình cầu đã được tinh chế Một

số khác cho rằng có 2 băng

Tóm lại, có 2 băng protein chủ yếu với MW = 22 - 26 (kD) và MW = 25 - 30 (kD) Theo Peterson (1977), protein lớn là dạng N - glycosyl hoá của protein loại nhỏ chưa được glycosyl hoá Những protein này là P24, PG 27

Rất nhiều tác giả cho rằng P24 và sản phẩm GP27 của nó là HBsAg hoặc protein HBs Tuy nhiên, quan điểm này không thống nhất với định nghĩa gốc về HBsAg như

là một thực thể của tất cả các thành phần KN có trên bề mặt của virus

Nghiên cứu một cách kỹ lưỡng hơn tất cả các protein của virion viêm gan B cho thấy ngoài P24 và GP27 còn có ít nhất 4 băng nữa cũng có trên bề mặt của virion: GP33, GP36, P39, GP42

2.7.5 Định lượng HBsAg [ 3 ]

Kỹ thuật miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA) đã được sử dụng trước đây để định lượng HBsAg trong huyết thanh Bộ thuốc thử RIA bán trên thị trường có thể xác định được 2 ng/ml HBsAg thuộc phân typ ad và 6 ng/ml HBsAg thuộc phân typ ay

Phần lớn các bộ thuốc thử HBsAg do Mỹ điều chế có thể xác định được hàm lượng HBsAg thuộc phân týp ad thấp hơn so với phân typ ay