Phát hiện vius bệnh dịch tả heo dựa trên đoạn gen NS5B

Phát hiện vius bệnh dịch tả heo dựa trên đoạn gen NS5B

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO

DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khoá: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ THU NGÂN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO

DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B

Giáo viên hướng dẫn:

PGS.TS TRẦN THỊ DÂN

KS VƯƠNG HỒ VŨ

KS LƯƠNG QUÝ PHƯƠNG

Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ THU NGÂN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

iii

LỜI CẢM TẠ

Trước tiên con xin gởi ngàn lời cảm ơn đến ba mẹ kính yêu, ba mẹ đã luôn hy

sinh để dành những gì tốt đẹp nhất cho con Con xin cảm ơn tất cả người thân đã

luôn yêu thương, quan tâm và luôn cổ vũ cho con học tập

Em xin chân thành cảm ơn:

 Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ

nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt

những kiến thức quý báu cho em trong suốt 4 năm học

 Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường

Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi và tận

tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập

Em xin trân trọng biết ơn cô Trần Thị Dân và thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã hết

lòng hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực

hiện đề tài tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn anh Vương Hồ Vũ, anh Lương Quý Phương đã

luôn chỉ dẫn tận tình cho em trong suốt quá trình thực tập

Em xin gởi lời cảm ơn đến:

 Thầy Phát, anh Út, chị Hưng, chị Trang, cùng với các anh chị ở Trung tâm

đã luôn giúp đỡ, động viên em trong những lúc khó khăn

 Các bạn lớp CNSH K29 thân yêu đã luôn cùng tôi chia xẻ, cổ vũ và giúp đỡ

nhau trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

iv

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Ngô Thị Thu Ngân, Đại học Nông Lâm TP Hồ chí Minh, tháng 9/2007,

“PHÁT HIỆN VIRUS DTH DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B”

Hướng dẫn khoa học:

PGS TS Trần Thị Dân

KS Vương Hồ Vũ

KS Lương Quý Phương

Đề tài được tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2007 đến ngày 01 tháng 08

năm 2007 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá sinh trường Đại học Nông Lâm

thành phố Hồ Chí Minh

Gen NS5B là một trong những gen của bộ gen virus DTH ngày càng được

sử dụng nhiều trong những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus

DTH Do đó, việc phát hiện virus DTH bằng phương pháp RT-PCR khuếch đại

đoạn gen NS5B nhằm ứng dụng vào công tác chuẩn đoán bệnh và có thể được sử

dụng để hình thành dữ liệu di truyền đánh dấu dịch tễ virus

Kết quả đạt được như sau:

1 Xác định được quy trình tách chiết RNA thích hợp từ mẫu lách Nồng độ

LiCl 2,5 M cho tủa RNA với độ tinh sạch và chất lượng sản phẩm khuếch

đại cao

2 Đưa ra được quy trình RT-PCR một bước phát hiện gen NS5B của virus

DTH với nồng độ Taq giảm từ 2,5 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản

phẩm khuếch đại không thay đổi

3 Mức tỉ số OD của ELISA lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR dương tính cao

4 Kết hợp được những đặc điểm bệnh tích thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH

với nhau thông qua kết quả chẩn đoán RT-PCR dương tính

v

SUMMARY

Ngô Thị Thu Ngân, Department of Biotechnology, Nong Lam University,

HCMC September, 2007 The title of thesis: “DETECTION OF CLASSICAL

SWINE FEVER VIRUS BASED ON NS5B GENE”

Thesis were carried out from 01/03/07 to 01/08/07 at Biochemical Analysis

and Experimental Center, Nong Lam University

One of the genes of CSFV genome is NS5B gene, which is widely used for

research on CSFV isolation and genetic typing Therefore, CSFV detecting based

on amplification of the NS5B gene by RT-PCR method for the purpose of disease

diagnostic application and this process may be used for the generation of genetic

sequence data to be used for epidemiological tracing of virus

Results obtained from the study:

(1) Determined RNA extracted protocol suitable for spleen sample At

LiCl 2,5 M concentration, we collected higher pure RNA precipitate

which was used in RT-PCR resulted in highly qualitative product

(2) Advanced single RT-PCR protocol to detect CSFV NS5B gene with

Taq concentration decreased from 2,5 UI down 2 UI, but RT-PCR

product quality was not different

(3) OD ratio of ELISA was more than 2 value resulted in high positive

RT-PCR diagnostic

(4) Combined symptoms of CSFV infected pigs together through positive

RT-PCR diagnostic result

vi

MỤC LỤC

Bìa i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt khóa luận iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình và biểu đồ x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2

1.2.1.Mục tiêu 2

1.2.2.Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Bệnh DTH 3

2.2 Một số bệnh tích đặc trưng của bệnh DTH 5

2.2.1 DTH điển hình 5

2.2.2 DTH không điển hình 6

2.3 Cấu trúc bộ gen virus DTH 6

2.4 Một số phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 9

2.5 Sơ lược các nghiên cứu liên quan 15

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 17

3.1 Thời gian và địa điểm 17

3.1.1 Thời gian 17

vii

3.1.2 Địa điểm 17

3.2 Nội dung nghiên cứu 17

3.3 Vật liệu và hóa chất 17

3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 17

3.3.2 Hóa chất 17

3.4 Bố trí thí nghiệm 19

3.5 Phương pháp tiến hành 21

3.5.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm 21

3.5.2 Ly trích RNA tổng số 21

3.5.3.Phản ứng RT-PCR 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Kết tủa RNA ở các nồng độ LiCl khác nhau 27

4.2 Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng 28

4.3 So sánh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR 30

4.4 Mối liên hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tích 32

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

5.1 Kết luận 34

5.2 Đề nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

Tài liệu tiếng Việt 35

Tài liệu tiếng Anh 36

PHỤ LỤC 38

viii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

BVDV : Bovine viral diarrhoea virus

cDNA : Complementary deoxyribonucleotide acid

DEPC : Diethyl pyrocarbonate

EDTA : Ethylendiaminetetraacid acetic

ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay

dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate

IRF-3 : IFN regulatory factor 3

M-MLV : Moloney murine leukemia virus

MOPS : [N-morpholino] propanesulfonic acid

PBS : Phosphate buffered saline

OIE : Office International des Epizooties

RT-PCR : Reverse transcriptase – polymerase chain reaction

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3 1: Thành phần phản ứng RT-PCR 25

Bảng 4 1: Tỉ số OD và hàm lượng RNA ở các nồng độ LiCl 27

Bảng 4 2: Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Bảng 4 3: Tỉ số OD của ELISA và kết quả RT-PCR 30

Bảng 4 4: So sánh các mức OD của ELISA và RT-PCR 31

Bảng 4 5: Đặc điểm bệnh tích các mẫu RT-PCR dương tính và âm tính 32

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2 1: Cấu trúc bộ gen Pestivirus 7

Hình 2 2: Phản ứng RT-PCR 12

Hình 4 1: Sản phẩm RT-PCR của mẫu kết tủa ở các nồng độ LiCl 28

Hình 4 2: Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq 29

Hình 4 3: Kết quả sản phẩm RT-PCR các mẫu bệnh phẩm 33

Biểu đồ 4 1: Tỉ số OD và hàm lượng RNA ở các nồng độ LiCl 27

Âu mà họ nghĩ bệnh đã được thanh toán triệt để trước đó (Nguyễn Tiến Dũng, 1999)

DTH là bệnh rất dễ lây, sự lây lan chủ yếu là do sự tiếp xúc giữa những heo sống với nhau hoặc với những sản phẩm của heo bệnh, hoặc những nguyên nhân

khác…Tác nhân gây bệnh là một virus thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae Virus

này có tính kháng nguyên chung với virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV- Bovine viral diarrhoea virus) và virus bệnh biên giới ở cừu (BDV- border disease virus)

Trong công tác chẩn đoán hay phòng và trị bệnh, các phương pháp truyền thống dựa trên dịch tễ lâm sàng hiện ngày càng bộc lộ nhiều khiếm khuyết không thể khắc phục và không thể theo kịp tình hình hiện nay nhất là mầm bệnh càng ngày càng khó kiểm soát Mặt khác, sinh học phân tử tuy mới đặt nền móng khoảng vài thập kỷ nhưng đã có những bước phát triển vượt bậc với nhiều thành tựu to lớn, đã, đang và sẽ đóng góp vào mọi mặt của đời sống Trong thú y, sinh học phân tử với trọng tâm là công nghệ di truyền đã được ứng dụng khá sớm trong chẩn đoán, phòng và trị bệnh trên nhiều đối tượng gây bệnh, trong đó có dịch tả - một trong 4 bệnh “đỏ” của ngành chăn nuôi Việt Nam

Để phân biệt chính xác virus gây bệnh DTH với những virus cùng chi

Pestivirus như BVDV, BDV…, kĩ thuật RT-PCR trở nên hữu ích dựa trên các đoạn

gen như E2 (Wirz, 1993; Harding, 1994; Rugg Li, 1996; Knepp, 2003; Risatt, 2002, 2004; Pereda, 2005) Paton và cộng sự (2000) phân tích ba đoạn gen (E2, 5’NTR,

NS5B) trong việc phân biệt chủng virus DTH và tổng kết sự phân biệt chủng virus DTH ở nhiều nơi trên thế giới kể cả châu Á; kết quả cho thấy mối quan hệ giữa các chủng ở một số nước

Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu về virus DTH của các tác giả như Bùi Nghĩa Vượng và ctv (2003), Nguyễn Thị Phương Duyên và ctv (2001), Kim Văn Phúc và ctv (2004), Nguyễn Thế Vinh và ctv (2004), Hồ Thu Hương và ctv (2004)… tuy nhiên chưa có nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của nhiều đoạn gen khác như NS5B, 5’NTR của những virus phân lập được từ các ổ dịch Gen NS5B là một trong những gen của bộ gen virus DTH được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus Vì vậy việc thực hiện đề tài “Phát hiện virus DTH dựa trên đoạn gen NS5B” nhằm ứng dụng vào công tác chẩn đoán bệnh và tạo tiền đề cho những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus DTH sau này

1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU

Chạy RT-PCR theo dẫn liệu của Paton và cộng sự (2000) để nhân vùng gen NS5B

So sánh kết quả RT-PCR với kết quả ELISA của mẫu bệnh phẩm

 Tình hình nhiễm bệnh DTH trên thế giới

DTH được mô tả đầu tiên vào năm 1833 ở Ohio – Hoa Kỳ Những năm sau

đó, một bệnh trên heo ở Châu Âu biết như là chứng sốt trên heo giống y hệt như bệnh mô tả ở Hoa Kỳ Cuối thế kỷ 19, DTH phân tán khắp nơi trên thế giới

Với sự gia tăng hiểu biết về nguyên nhân và dịch tễ học bệnh DTH, nhiều quốc gia thành công trong việc tiệt trừ virus bằng cách đưa ra những biện pháp tương đối đơn giản như luật vận chuyển thú và sự ngăn cấm cho thú ăn thức ăn chưa xử lý như Đan Mạch (1933), Phần Lan (1956), Úc (1963), Canada (1964), Thụy Sỹ (1974) và Mỹ (1977)

Năm 1997 đã in dấu đậm nét trong tâm trí các nhà dịch tễ học, virus học, những cán bộ thú y và những người hoạt động trong ngành chăn nuôi heo: bệnh DTH, một bệnh mà Liên hiệp châu Âu từng nghĩ là đã được thanh toán đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp (tính đến ngày 31/12/1997 có 424 ổ dịch tại Hà Lan) Năm nước khối EU (Đức, Hà Lan, Italia, Tây Ban Nha và Bỉ) trở thành nạn nhân của bệnh DTH với hơn 10 triệu heo phải giết bỏ

Năm 2000, dịch bệnh xảy ra ở Anh Năm 2001, dịch bệnh nổ ra ở Đức, Slovakia Vào cuối năm 2003, dịch xuất hiện tại Nhật, Albania và Slovakia Hiện nay, bệnh đã được ghi nhận khắp thế giới: Châu Âu, Trung Phi, Mexico, các nuớc Trung mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc, Đông Á và Đông Nam Á: Hàn quốc, Indonesia, Philippine, Thái Lan, Việt Nam

 Tình hình bệnh DTH tại Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh DTH được Houdemer phát hiện đầu tiên vào năm

1923-1924 Từ đó, bệnh trở thành mối đe doạ nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi heo nước ta

Năm 1949-1950, dịch bệnh lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang các tỉnh Phú Yên, Yên Bái, Thái Nguyên, Hà Nội và Hải Phòng Năm 1968-1969, dịch phát ra hơn 20 tỉnh miền Bắc, theo thống kê có 481 ổ dịch nổ ra

Theo báo cáo của Cục thú y (1986), tại các tỉnh Nam Bộ bệnh DTH thường

bị bội nhiễm với bệnh phó thuơng hàn: An Giang, Long An (1984), Tiền Giang và Hậu Giang (1985) Năm 1985, tại Đồng Nai và TP Hồ Chí Minh xuất hiện DTH bội nhiễm với bệnh tụ huyết trùng

Năm 2000, có 18106 trường hợp bệnh DTH được báo cáo tại Việt Nam

Hiện nay, bệnh DTH vẫn còn tồn tại ở các dạng bệnh không điển hình gây trở ngại cho việc chuẩn đoán

2.1.2 Dạng bệnh

DTH là một bệnh truyền nhiễm riêng của heo Nguyên nhân gây ra bởi virus

thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae Virus này có quan hệ mật thiết với virus gây

bệnh tiêu chảy ở bò (bovine viral diarrhoea-BVD) và virus gây bệnh biên giới ở cừu (Boder disease-BD)

Bệnh DTH có thể xuất hiện ở nhiều dạng khác nhau Tuy nhiên, người ta chia bệnh DTH ra làm 4 dạng (Nguyễn Tiến Dũng, 1999):

 Dạng siêu cấp tính: xuất hiện đột ngột không có triệu chứng ban đầu, sốt cao kết hợp với trạng thái thương hàn Heo bệnh tử vong trong vòng 24 đến 48 giờ, chưa kịp xuất hiện triệu chứng trên da nên gọi là DTH trắng

 Dạng cấp tính: gây sốt cao từ 41 - 420

C, heo bệnh biểu hiện mệt điển hình như heo con nằm chất đống Sau 24 - 48 giờ mắt sưng húp và viêm kết mạc với các triệu chứng ngoài da (như vết chàm tím, xuất huyết, tụ huyết màu đỏ tại các vùng da mỏng, tai, chân, bụng, bao dương vật…), viêm dạ dày ruột (tiêu chảy, nôn mửa…), triệu chứng hô hấp (ho, tụ huyết phổi) và có thể xuất hiện triệu chứng thần kinh (loạng choạng, liệt, liệt nhẹ các chi sau…), tử vong trong thời gian 6 đến 20 ngày sau khi phát bệnh

 Dạng á cấp tính hoặc mãn tính diễn ra trong 3 giai đoạn:

Giai đoạn đầu: kéo dài 10 - 15 ngày, toàn bộ đàn heo phát bệnh, các triệu chứng cục bộ giống như dạng cấp tính nhưng ở mức độ nhẹ

Giai đoạn hai là giai đoạn thuyên giảm

Giai đoạn ba: xuất hiện mầm bệnh bội nhiễm phát bệnh toàn thân với các triệu chứng cục bộ về hô hấp hoặc tiêu hoá hoặc cả hai (viêm phổi và ruột thông thường do Salmonella) Heo bệnh gầy mòn và tử vong trong vòng 1 đến 3 tháng

 Dạng không điển hình: biểu hiện dưới các dạng rất khác nhau như rối loạn sinh sản hoặc bệnh lý sinh sản (sảy thai, thai chết, thai gỗ, dị dạng gây run rẩy bẩm sinh, rối loạn vận động, chết yểu…), chậm lớn, chết rải rác Dưới dạng này, virus DTH có thể lưu hành một cách không rõ ràng, nhất là heo sinh sản với các trường hợp lâm sàng lẻ tẻ nổ ra khi có các điều kiện thuận lợi (như stress, chuyên chở…)

2.2 MỘT SỐ BỆNH TÍCH ĐẶC TRƢNG CỦA BỆNH DTH

2.2.1 DTH điển hình (cấp tính, á cấp tính hoặc mãn tính)

Biểu hiện bệnh tích sung huyết hay xuất huyết của một hay nhiều bệnh đỏ, biến đổi huyết học

Trên da: xuất huyết lấm chấm hoặc từng đám, chàm xanh nhất là da tứ chi (tai, chân), xuất huyết vùng bụng và bao quy đầu ở heo đực

Hạch bạch huyết: dải hạch vùng xương chậu và hạch ruột sưng to, màu đá hoa văn, tụ huyết hoặc xuất huyết vùng vỏ hoặc toàn bộ

Thận: không sưng nhưng xuất huyết lấm chấm sau khi lột màng bao thận (thận trứng gà tây)

Lách: không sưng, nhồi huyết bên rìa lách

Bàng quang: niêm mạc xuất huyết lấm chấm

Amiđan: sưng to và xuất huyết

Tim: xuất huyết cơ tim và trên vành tim

Hệ hô hấp: tụ huyết, xuất huyết phổi, tiểu thiệt xuất huyết lấm chấm

Hệ tiêu hoá: tụ huyết và xuất huyết

Giảm bạch cầu

2.2.2 DTH không điển hình

Bệnh tích thay đổi không đặc hiệu: xuất huyết, viêm, dị dạng

Da: xuất huyết

Các hạch lâm ba: viêm hạch lâm ba có thể có xuất huyết lấm chấm

Trên não: xuất huyết

2.3 CẤU TRÖC BỘ GEN VIRUS DTH

Virus DTH thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae Virus này có chung tính

kháng nguyên với virus bệnh tiêu chảy ở bò và bệnh biên giới ở cừu Virus DTH là một loại virus RNA chuỗi đơn dương có vỏ bọc đường kính 40 - 50 nm RNA virus

mã hoá 4 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc Chỉ có một týp huyết thanh xác định So với virus gây bệnh biên giới, những dòng virus DTH hình thành một nhóm kháng nguyên đồng dạng có quan hệ với nhau nhưng có một vài thay đổi tồn tại giữa những dòng phân lập Những phản ứng chéo huyết thanh với virus BVD và

BD có thể xảy ra và gây trở ngại trong chẩn đoán huyết thanh

Bộ gen virus có chuỗi đơn RNA dài 12,3 kb Bộ gen đã được biết trình tự gen hoàn toàn, chứa một khung đọc mở nằm ở bên sườn của 5’-UTR và 3’-UTR mã hoá một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid Polyprotein này được cắt bởi protease được mã hoá bởi virus và tế bào vật chủ để tạo nên protein trưởng thành của virus gồm 4 protein cấu trúc (C, Erns, E1 và E2), p7 và 7 protein không cấu trúc (Npro, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B) Trình tự của sản phẩm gen dọc theo khung đọc mở là:

Hình 2 1: Cấu trúc bộ gen Pestivirus (Brett D L., 2007)

Một polyprotein lớn được dịch mã từ RNA của virus sẽ được xử lý thành những protein virus riêng biệt Protein đầu tiên mã hoá là Npro một protein không cấu trúc có nhiệm vụ phân cắt vị trí Npro/C Peptidase ký chủ phân cắt những vị trí C/Erns, E1/E2, E2/p7 và p7/NS2 với sự phân cắt không hoàn toàn ở vị trí E2/p7 NS2-3 được phân cắt bởi autoprotease NS2 Sự phân cắt của polyprotein hình thành NS4A, NS4B, NS5A và NS5B được thuỷ phân bởi enzyme protease serine NS3-4A

 N pro là autoprotease không cấu trúc có hoạt tính thuỷ phân protein Nprokhông cần thiết đối với sự sao chép virus Npro cũng hoạt động như một chất đối

NH2-(Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH

kháng của sự hoạt hoá IRF-3 và sự sản xuất ra IFN, ức chế sự phiên mã IRF-3 ở những tế bào nhiễm virus DTH Những đột biến bỏ đi Npro của virus DTH đã được

đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống

 Protein cấu trúc

C (mã hoá protein p14): là protein của nucleocapsid Đầu cuối C terminus) của protein C ở virus DTH đã được xác định và được định vị ở phần kỵ nước của chuỗi peptide tín hiệu bên trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di chuyển của Erns vào trong khoang mạng lưới nội chất

(C-Erns (mã hoá protein gp44/48), E1(gp33), E2(gp55): là các protein vỏ E2 và

Erns có tính kháng nguyên mạnh nhất Erns có tác dụng hỗ trợ thải virus qua một màng đặc biệt, được tiết ra từ tế bào nhiễm, đặc điểm nổi bật của Erns là hoạt tính ribonuclease với tính chuyên biệt đối với gốc uridine Những kháng thể ức chế hoạt tính ribonuclease có khuynh hướng trung hoà tính nhiễm virus, sự đột biến ở Erns phá huỷ hoạt tính ribonuclease gây nên gia tăng số lượng virus Erns tái tổ hợp là một độc chất đối với tế bào bạch huyết trong ống nghiệm, có thể kết hợp với sự giảm bạch cầu ở nhiễm tự nhiên Mặc dù độc tính tế bào là một đặc điểm nổi bật của những enzyme ribonuclease hoà tan khác nhưng người ta chưa rõ là hoạt tính ribonuclease của Erns

có liên quan đến độc tính của nó hay không Vùng đầu cuối C (C-terminal) của Erns có thể khởi động sự di chuyển của nó qua màng tế bào, có thể coi như là mục tiêu hoặc chức năng trong tế bào Tuy nhiên, Erns

tái tổ hợp cũng có thể nối một cách vững chắc với bề mặt tế bào qua sự tương tác với glycosaminoglycan và ức chế sự lây nhiễm

E1 và E2 là những protein màng không thể thiếu E2 của virus DTH tái tổ hợp có thể kết hợp với các tế bào và ngăn chặn sự lây nhiễm của virus DTH và BVD Mặc dù vai trò quan trọng của những glycoprotein ở virus là lắp rắp và tiếp nhận nhưng những kháng thể đối với Erns

hoặc E2 có thể trung hoà tính lây nhiễm của virus và cả hai kháng nguyên này có thể tạo ra tính sinh miễn dịch bảo vệ

 Protein p7 theo sau những protein cấu trúc, gồm một vùng đảm đương

nhiệm vụ trung tâm đối với việc tách đầu cuối kỵ nước và cần cho sự sản sinh của virus lây nhiễm nhưng không đòi hỏi trong quá trình sao chép RNA P7 của pestivirus được phân cắt một cách không hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt E2-p7 không phân cắt không cần thiết đối với sự sao chép trong nuôi cấy tế bào và cả hai E2-p7 và p7 giúp tế bào kết hợp với nhau Tuy nhiên, chưa biết rõ p7 là một protein cấu trúc hay không cấu trúc mặc dù nó không được phát hiện trong virus tinh sạch Pestivirus có p7 thì có thể hình thành những kênh ion tham gia trong sự lắp ráp và tiếp nhận của virus

 Protein không cấu trúc

Protein NS2 là một enzyme thuỷ phân protein chứa cysteine đã được nhận diện Sự phân cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao chép RNA của pestivirus và hiệu quả phân cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bào và có thể xác định tính gây bệnh tế bào Vùng NS2-3 tham gia lắp ráp virus

NS3 chứa một vùng protease serine ở đầu cuối N và một helicase RNA ở đầu cuối C Protease serine NS3 đòi hỏi NS4A như là một yếu tố hỗ trợ Protease serine NS3-4A phân cắt giữa leucine và những amino acid không phân cực nhỏ Hoạt tính protease serine ảnh hưởng đến sự sao chép RNA virus,đóng vai trò thiết yếu trong khả năng tồn tại của virus

NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tính protease serine NS3 NS4A và NS4B không đóng vai trò thiết yếu trong sự sao chép RNA của virus

NS5A và NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phân cắt hoàn toàn cũng không khác gì NS5A-5B không phân cắt Chức năng của NS5A chưa được biết rõ NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA dependent RNA polymerase)

2.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH DTH TRONG PHÕNG THÍ NGHIỆM

(1) Phân lập virus

(2) Đánh dấu miễn dịch phát hiện virus trong nuôi cấy tế bào

(3) Phương pháp hoá mô

(4) ELISA phát hiện kháng nguyên hoặc ELISA phát hiện kháng thể

(5) Phản ứng trung hoà

(6) Phương pháp reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) RT-PCR là một phương pháp chẩn đoán nhanh và nhạy hơn so với phương pháp ELISA và phân lập virus, thích hợp trong chuẩn đoán bệnh sớm, tránh được sự nhiễm khuẩn từ môi trường bên ngoài

2.4.1 PCR (Polymerase chain reaction)

Khái niệm: PCR là một tiến trình lặp đi lặp lại bao gồm 3 công đoạn: biến

tính mẫu bởi nhiệt, bắt cặp những mồi nucleotide với trình tự đích mạch đơn, kéo dài mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Biến tính: mẫu DNA mạch đôi biến tính ở nhiệt độ được xác định bởi thành phần G+C Thành phần G+C càng cao thì nhiệt độ đòi hỏi tách mạch càng cao Những phân tử DNA càng dài thì thời gian cần ở nhiệt biến tính để tách hai mạch một cách hoàn toàn càng lớn Nếu nhiệt độ biến tính quá thấp hoặc nếu thời gian quá ngắn thì chỉ có những vùng giàu AT sẽ bị biến tính Khi nhiệt độ bị giảm trễ hơn trong chu trình PCR, DNA mẫu sẽ tái bắt cặp thành một tình trạng nguyên gốc

Trong những phản ứng PCR xúc tác bởi Taq DNA polymerase, sự biến tính

được tiến hành ở 94 - 950C, là nhiệt độ cao nhất mà enzyme có thể chịu được khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn mà không chịu được tác hại quá mức Trong chu kỳ đầu của PCR, sự biến tính thỉnh thoảng được tiến hành khoảng 5 phút để gia tăng khả năng những phân tử DNA mẫu được biến tính đầy đủ Tuy nhiên, thời gian biến tính khoảng 45 giây ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thông thường có thành phần G+C là 55% hoặc thấp hơn

Mẫu DNA giàu G+C (> 55%) thì nhiệt độ biến tính càng cao DNA

polymerase phân lập từ Archaea thì chịu nhiệt hơn Taq do đó nó thích hợp khuếch

đại DNA giàu G+C

Bắt cặp mồi với DNA mẫu: nếu nhiệt độ bắt cặp quá cao, mồi oligonucleotide bắt cặp ít với mẫu, như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp việc bắt cặp của mồi không đặc hiệu có thể xảy ra, kết quả là tạo ra những đoạn DNA không mong muốn Sự bắt cặp được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy 3 - 50C Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp, nên tiến hành một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide

Kéo dài mồi: việc kéo dài mồi được tiến hành ở hoặc gần nhiệt độ thích hợp

đối với sự tổng hợp DNA xúc tác bởi polymerase chịu nhiệt, trong trường hợp Taq

Khái niệm: là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại RNA thành

cDNA Nhạy và đa năng, RT-PCR được sử dụng để hồi phục và nhân đầu cuối 5’và 3’ của mRNA và hình thành thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thêm vào

đó, RT-PCR dễ dàng xác định đột biến và những đa hình trong những trình tự được sao lại và đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế

Bước đầu tiên là chuyển RNA thành cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide được lai với RNA và sau đó kéo dài bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA-dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thúc tiến trình tạo cDNA

là chuyển qua tiến trình PCR để nhân lên một lượng lớn cDNA

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị trí của primer nhờ enzyme reverse trascriptase

Sợi cDNA được tạo thành

Khuôn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H cDNA được sử dụng để thực hiện PCR

Sự gắn của primer với cDNA

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase

cDNA sợi đôi được hình thành

Ba bước biến tính, bắt cặp, kéo dài được lặp lại nhiều lần

Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 0,5 – 5 mM với mức tối ưu là 1 – 2 mM, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998)

 Mồi (primer)

Mồi là một trong những thành phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng

Trình tự mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi

và đặc trưng cho trình tự đoạn gen được khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên đoạn gen Chiều dài mồi không được quá lớn thường trong khoảng 17-

25 nu, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự Nhân, 2001) Chiều dài mồi càng lớn sự tách các DNA mẫu để bắt cặp với mồi càng nhỏ Chiều dài và thành phần G-C của mồi đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ Tm của mồi

enzyme polymerase vì vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả các dNTP đều bằng nhau Nồng độ dNTPs thường dùng trong khoảng 20 – 200 µM, dung dịch dNTPs gốc phải giữ trung tính pH7,0

 Taq polymerase

Là một enzyme polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ vi khuẩn suối

nước nóng có tên là Thermus aquaticus Taq polymerase không bị phá huỷ ở nhiệt

độ biến tính trong phản ứng, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780

C

Nồng độ Taq sử dụng được khuyến cáo trong khoảng 1 - 2,5 đơn vị trên 100µl dung dịch phản ứng Nồng độ Taq quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt, nồng độ Taq quá thấp không đủ lượng enzyme xúc tác để tạo ra sản

phẩm theo mong muốn (Bùi Chí Bửu, 1999)

 Số chu kỳ trong phản ứng

Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vào lượng bản sao mẫu ban đầu DNA mẫu là 105 tương ứng với 25 - 30 chu kỳ, 102 - 103 tương ứng với 35 - 40 chu

kỳ

Không nên vượt quá 40 chu kỳ vì hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do:

Sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng

 RNAsin

Được dùng để ức chế enzyme phân huỷ RNA, giữ cho mẫu không bị mất trong quá trình thực hiện phản ứng

 Enzyme reverse transcriptase

Trong phản ứng RT-PCR thành phần không thể thiếu là enzyme phiên mã ngược, MMLV hoạt động như là một enzyme polymerase giúp tổng hợp sợi cDNA

từ RNA và với hoạt tính của enzyme RNAse H có độ nhạy cao giúp phân cắt sợi RNA trong mạch đôi RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng PCR

2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

2.5.1 Trong nước

Từ năm 1996-1998, Nguyễn Thị Phương Duyên và ctv khảo sát hội chứng sốt, táo bón, bỏ ăn đến chết và kháng nguyên virus DTH bằng miễn dịch huỳnh quang và ELISA ở đàn heo sinh sản và heo con tỉnh Khánh Hoà và Quảng Ngãi cho thấy virus DTH chiếm tỷ lệ không nhỏ trong các tác nhân gây hội chứng này

Từ năm 2002-2003, Akemi Kamakawa và ctv tiến hành khảo sát bệnh DTH giữa các đàn heo và các trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại đoạn gen 5’NTR

Nguyễn Thế Vinh và ctv, năm 2004 nghiên cứu phân tích di truyền virus DTH phân lập ở Việt Nam bằng cách phân tích đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH

và so sánh chúng với một số chủng đã được giới thiệu trên thế giới Kết quả đưa ra

là các chủng virus DTH thuộc nhóm 2 đang là tác nhân chính gây bệnh DTH ở Việt Nam

Hồ Thu Hương và ctv, năm 2004 so sánh 4 phương pháp chẩn đoán virus DTH (phân lập virus, phản ứng huỳnh quang kháng thể, phản ứng ELISA và RT-PCR) từ mẫu được bảo quản ở các điều kiện khác nhau Theo các tác giả, việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán phải dựa vào chất lượng mẫu

Bùi Nghĩa Vượng và ctv, năm 2004 chẩn đoán bệnh DTH bằng phương pháp RT-PCR với mẫu máu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng có thể phát hiện được virus DTH từ các mẫu giấy thấm máu khô giữ ở 370C trong 10 tháng