Luận án tiến sĩ nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất benzen, toluen, ethylbenzen và xylen lên biểu hiện của gen cyp2e1

Mối tương quan giữa nồng độ giới hạn tiếp xúc của BTEX với sản phẩm chuyển hóa của từng chất trong nhóm BTEX và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 .... Mối tương quan giữa nồng độ giới hạ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

1 PGS TS BÙI PHƯƠNG THUẬN

2 PGS TS NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các kết quả trình bày trong luận án này là trung thực, khách quan, một phần đã công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành khác Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Hà Nội, ngày 6 tháng 11 năm 2020

Tác giả

NCS Nguyễn Thị Hiền

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận án Tôi đã nhận được sự dạy dỗ tận tình của các thầy cô, sự giúp đỡ động viên của đồng nghiệp gia đình và bạn bè Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc Tôi xin chân thành cảm ơn:

PGS TS Bùi Phương Thuận và PGS TS Nguyễn Quang Huy là những

người Thầy hướng dẫn khoa học đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm để tôi có thể hoàn thành luận án

Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, nơi có những thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp đã tận tâm hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, Bộ môn Di truyền học, Trung tâm nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Lãnh đạo Công ty TNHH Sơn Công nghiệp Hòa Phát, Công ty TNHH Công nghệ cao Việt Tiệp, Công ty cổ phần Sơn Tổng hợp Hà Nội và các công nhân của công ty đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Khoa học an toàn và Vệ sinh lao động, Lãnh đạo Trung tâm Sức khỏe nghề nghiệp và các đồng nghiệp đã luôn giúp

đỡ, ủng hộ tôi trong quá trình học tập và công tác

Cuối cùng, con xin cảm ơn bố mẹ, cảm ơn các thành viên đại gia đình yêu quý, xin gửi lời cảm ơn đến các anh em, bạn bè đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ động viên tôi trong quá trình học tập vừa qua

Hà Nội, ngày 6 tháng 11 năm 2020

NCS Nguyễn Thị Hiền

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACGIH American conference of governmental industrial hygienists - Hội nghị

các nhà vệ sinh công nghiệp của Chính phủ Hoa Kỳ BEI Biological exposure index - Chỉ số tiếp xúc sinh học

BNN Bệnh nghề nghiệp

BTEX Benzen, Toluen, Ethylbenzen, Xylen

Cre Creatinin

CI Confidence interval - Khoảng tin cậy

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

DNA Deoxyribonucleic acid

ĐTNC Đối tượng nghiên cứu

dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

KTX Không tiếp xúc

HA Axit hippuric

HP Công ty TNHH Sơn công nghiệp Hòa phát

HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng hiệu năng cao GHCP Giới hạn cho phép

GC/FID Gas Chromatography - Flame Ionization Detector - Sắc ký ion hóa ngọn

lửa GC/MS Chromatography Mass Spectrometry - Sắc ký khí khối phổ

IARC International Agency for Research on Cancer - Cơ quan Nghiên cứu

Ung thư Quốc tế

LC/MS Liquid chromatography - Mass spectrometry - Sắc ký lỏng khối phổ

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

NIOSH National Institute for Occupational Safety and Health - Viện An toàn và

Sức khoẻ nghề nghiệp Quốc gia Mỹ NLĐ Người lao động

NAD(P)H Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

OSHA Occupational safety and health administration - Cục an toàn và Sức

khỏe nghề nghiệp Mỹ PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

TCCP Tiêu chuẩn cho phép

TTMA Axit t,t-muconic

RE Restriction enzym - Enzym cắt giới hạn

SNPs Đa hình đơn nucleotide

STH Công ty cổ phần Sơn Tổng hợp

SD Độ lệch chuẩn

VOCs Volatile organic compounds - Hợp chất hữu cơ dễ bay hơi

VT Công Ty TNHH Công nghệ cao Việt Tiệp

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC v

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH xii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của luận án 1

2 Mục tiêu 2

3 Nội dung nghiên cứu luận án 2

4 Những đóng góp mới của luận án 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3

6 Địa điểm thực hiện luận án 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 KHÁI NIỆM DUNG MÔI HỮU CƠ, TÍNH CHẤT CỦA BENZEN, TOLUEN, ETHYLBENZEN VÀ XYLEN 4

1.1.1 Dung môi hữu cơ 4

1.1.2 Tính chất lý – hóa của benzen, toluen, ethylbenzen, xylen 4

1.2 GIÁM SÁT SINH HỌC 7

1.3 ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI HỮU CƠ ĐẾN SỨC KHỎE CON NGƯỜI 8

1.3.1 Ảnh hưởng của benzen 9

1.3.2 Ảnh hưởng của toluen 9

1.3.3 Ảnh hưởng của ethylbenzen 10

1.3.4 Ảnh hưởng của xylen 10

1.3.5 Ảnh hưởng của nhóm BTEX 11

1.4 ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE, ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN CYP2E1 VÀ MỘT

SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 13

1.4.1 Đa hình đơn nucleotide (SNP) 13

1.4.2 Đặc điểm của gen CYP2E1 và một số nghiên cứu liên quan 14

1.5 Nghiên cứu liên quan đến mức độ biểu hiện mRNA và đa hình của CYP2E1 18

1.6 Một số nghiên cứu có liên quan tại Việt Nam 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24

2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 25

2.2.1 Hóa chất 25

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 26

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG 26

2.3.1 Cách chọn mẫu nghiên cứu và cỡ mẫu 26

2.3.2 Phương pháp phân tích nồng độ BTEX trong mẫu cá nhân 28

2.3.3 Lấy mẫu, bảo quản mẫu 30

2.3.4 Phương pháp phân tích nồng độ BTEX trong máu, nước tiểu của đối tượng nghiên cứu 31

2.3.5 Phương pháp phân tích sản phẩm chuyển hóa của BTEX trong nước tiểu 32

2.3.6 Phương pháp phân tích công thức máu 34

2.3.7 Tách chiết DNA tổng số 34

2.3.8 Phương pháp khuếch đại gen bằng phương pháp PCR 35

2.3.9 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự 36

2.3.10 Tách chiết RNA tổng số 36

2.3.11 Tổng hợp cDNA 37

2.3.12 Phương pháp xác định mức độ biểu hiện mRNA bằng kỹ thuật Realtime

PCR 37

2.3.13 Phân tích thống kê sinh học 39

2.4 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU 40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 41

3.2 NỒNG ĐỘ BTEX TRONG MẪU CÁ NHÂN 42

3.2.1 Nồng độ benzen tại cơ sở nghiên cứu 42

3.2.2 Nồng độ toluen tại cơ sở nghiên cứu 45

3.2.3 Nồng độ ethylbenzen tại cơ sở nghiên cứu 47

3.2.4 Nồng độ xylen tại cơ sở nghiên cứu 49

3.2.5 Giới hạn nồng độ tiếp xúc với BTEX của nhóm tiếp xúc 50

3.3 NỒNG ĐỘ BTEX TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU 53

3.3.1 Nồng độ BTEX trong máu của đối tượng nghiên cứu 53

3.3.2 Nồng độ BTEX niệu của đối tượng nghiên cứu 55

3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SẢN PHẨM CHUYỂN HÓA CỦA BTEX 56

3.4.1 Sản phẩm chuyển hóa của benzen niệu 56

3.4.2 Sản phẩm chuyển hóa của toluen niệu 57

3.4.3 Sản phẩm chuyển hóa của xylen niệu 59

3.4.4 Sản phẩm chuyển hóa của ethylbenzen niệu 60

3.5 ẢNH HƯỞNG CỦA BTEX ĐẾN BIỂU HIỆN mRNA CỦA CYP2E1 64

3.5.1 Ảnh hưởng của BTEX đến mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 65

3.5.2 Mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 chia theo tuổi đời 67

3.5.3 Mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 chia theo tuổi nghề 73

3.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện mRNA của CYP2E1 qua mô hình hồi quy logistic 79

3.6 MỐI TƯƠNG QUAN CỦA NỒNG ĐỘ BTEX TRONG MẪU CÁ NHÂN

VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC TRONG CƠ THỂ 83

3.6.1 Mối tương quan của nồng độ benzen trong mẫu cá nhân với nồng độ benzen trong máu, nước tiểu, TTMA và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 83

3.6.2 Mối tương quan của nồng độ toluen trong môi trường với nồng độ toluen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của toluen và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 85

3.6.3 Mối tương quan của nồng độ xylen trong môi trường với nồng độ xylen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của xylen và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 87

3.6.4 Mối tương quan của nồng độ ethylbenzen trong mẫu cá nhân với nồng độ ethylbenzen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của ethylbenzen và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 89

3.6.5 Mối tương quan giữa nồng độ giới hạn tiếp xúc của BTEX với sản phẩm chuyển hóa của từng chất trong nhóm BTEX và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 91

3.6.6 Mối tương quan giữa nồng độ giới hạn tiếp xúc của BTEX và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 chia theo vị trí làm việc 95

3.7 XÁC ĐỊNH SỰ BIẾN ĐỔI CỦA GEN CYP2E1 96

3.7.1 Khuếch đại và tinh sạch đoạn promoter của CYP2E1 96

3.7.2 Giải trình tự và phân tích đa hình đoạn promoter của gen CYP2E1 97

3.8 TÌNH TRẠNG THIẾU MÁU DO TIẾP XÚC VỚI BTEX 109

KẾT LUẬN 117

KIẾN NGHỊ 118

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ 119

ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 119

PHỤ LỤC 1

-DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu 24

Bảng 2.2 Các cặp mồi được dùng cho nghiên cứu 25

Bảng 3.1 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 41

Bảng 3.2 Nồng độ benzen trong môi trường theo vị trí làm việc 42

Bảng 3.3 Nồng độ toluen trong môi trường chia theo vị trí làm việc 46

Bảng 3.4 Nồng độ ethylbenzen ở nhóm tiếp xúc chia theo vị trí làm việc 48

Bảng 3.5 Nồng độ xylen trong môi trường chia theo vị trí làm việc 49

Bảng 3.6 Giới hạn nồng độ tiếp xúc với BTEX của nhóm tiếp xúc theo vị trí 51

Bảng 3.7 Tổng hợp kết quả phân tích nồng độ BTEX và giới hạn nồng độ BTEX cho phép tại cơ sở nghiên cứu 52

Bảng 3.8 Nồng độ BTEX trong máu 53

Bảng 3.9 Nồng độ benzen, toluen, ethylbenzen, xylen trong nước tiểu 55

Bảng 3.10 Kết quả phân tích nồng độ TTMA trong nước tiểu 56

Bảng 3.11 Kết quả phân tích nồng độ O-cresol trong nước tiểu 58

Bảng 3.12 Kết quả phân tích nồng độ mHA trong nước tiểu 59

Bảng 3.13 Kết quả phân tích nồng độ MA, PGA trong nước tiểu 61

Bảng 3.14 Kết quả phân tích sản phẩm chuyển hóa của BTEX trong nước tiểu 62 Bảng 3.15 Số đối tượng có chỉ số giám sát sinh học vượt tiêu chuẩn 63

Bảng 3.16 Kết quả phân tích biểu hiện mRNA của CYP2E1 65

Bảng 3.17 Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm tuổi đời 20 - 30 tuổi 68

Bảng 3.18 Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm tuổi đời 31 - 40 tuổi 69

Bảng 3.19 Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm tuổi đời từ 41 - 50 tuổi 70

Bảng 3.20 Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm tuổi đời trên 50 tuổi 71

Bảng 3.21 Mức biểu hiện mRNA của CYP2E1 theo tuổi đời ở nhóm tiếp xúc 72

Bảng 3.22 Mức biểu hiện mRNA của CYP2E1 theo tuổi đời nhóm không tiếp xúc 73

Bảng 3.23 Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề 3 - 10 năm 74 Bảng 3.24 Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề 11 - 20 năm 75 Bảng 3.25 Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề 21 - 30 năm 76 Bảng 3.26 Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề trên 30 năm 77 Bảng 3.27 Mức biểu hiện mRNA của CYP2E1 theo tuổi nghề nhóm tiếp xúc 78 Bảng 3.28 Mức biểu hiện mRNA của CYP2E1 theo tuổi nghề nhóm không tiếp

xúc 78

Bảng 3.29 Phân tích hồi quy logistic đơn biến mối liên quan giữa mức độ biểu

hiện mARN của gen CYP2E1 với một số yếu tố 81

Bảng 3.30 Mối tương quan của nồng độ benzen trong mẫu cá nhân với nồng độ

benzen trong máu, nước tiểu, TTMA 84

Bảng 3.31 Mối tương quan của nồng độ toluen trong môi trường với nồng độ

toluen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của toluen và mức độ

biểu hiện mRNA của CYP2E1 86

Bảng 3.32 Mối tương quan của nồng độ xylen trong môi trường với nồng độ xylen

trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của xylen và mức độ biểu

hiện mRNA của CYP2E1 88

Bảng 3.33 Mối tương quan của nồng độ ethylbenzen trong mẫu cá nhân với nồng

độ ethylbenzen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của

ethylbenzen và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 90

Bảng 3.34 Mối tương quan giữa nồng độ giới hạn tiếp xúc của BTEX với sản

phẩm chuyển hóa của từng chất trong nhóm BTEX và mức độ biểu hiện

mRNA của CYP2E1 92

Bảng 3.35 Mối tương quan giữa nồng độ giới hạn tiếp xúc của BTEX và mức độ

biểu hiện mRNA của CYP2E1 95

Bảng 3.36 Tần số các đa hình, tần số các alen trong quần thể nghiên cứu 99

Bảng 3.37 Kết quả phân tích biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở điểm đa hình

trạng thiếu máu do ảnh hưởng của dung môi hữu cơ 113

Bảng 3.43 Mối liên quan của tần số kiểu gen của các đa hình được phát hiện với

tình trạng thiếu máu do ảnh hưởng của dung môi hữu cơ 114

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ vị trí lấy mẫu 29

Hình 3.1 Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở các đối tượng nghiên cứu 66

Hình 3.2 Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi đời ≤ 30 tuổi 69

Hình 3.3 Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi đời từ 31 - 40 tuổi 70

Hình 3.4 Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi đời từ 41 - 50 tuổi 71

Hình 3.5 Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi đời trên 50 tuổi 72

Hình 3.6 Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề từ 3 đến 10 năm 74

Hình 3.7 Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề từ 11 - 20 năm 75

Hình 3.8 Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề từ 21 - 30 năm 76

Hình 3.9 Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề trên 30 năm 77

Hình 3.10 Sản phẩm PCR được tinh sạch 97

Hình 3.11 Alen G của chuỗi CYP2E1 ở mẫu được giải trình tự với mồi ngược, tương ứng với alen C của CYP2E1 3739 G> C 100

Hình 3.12 Các alen A của chuỗi CYP2E1 của mẫu được giải trình tự với mồi ngược, tương ứng với alen T của CYP2E1 3620 C> T 101

Hình 3.13 Alen C của chuỗi CYP2E1 của mẫu được giải trình tự với mồi ngược lại, tương ứng với alen G của CYP2E1 3519 T> G 102

Hình 3.14 Các alen T của chuỗi CYP2E1 của mẫu được giải trình tự với mồi ngược lại, tương ứng với alen A của CYP2E1 3468 T> A 103

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Dung môi hữu cơ là một nhóm các chất hữu cơ có khả năng hòa tan các chất khác nhau Dung môi này chứa nhiều loại hydrocarbon kích thước nhỏ, bay hơi vào môi trường không khí tạo thành các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (Volatile organic compounds VOCs) VOCs nói chung, một số chất như benzen, toluen, ethylbenzen, xylen (nhóm BTEX) nói riêng với đặc điểm về khả năng hòa tan và độ bay hơi cao, được sử dụng trong sản xuất nhựa tổng hợp, sản xuất sơn, keo dán Đặc biệt, đối với ngành sản xuất sơn việc sử dụng dung môi hữu cơ nhóm BTEX là rất phổ biến Nhóm chất này có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người lao động như giảm sức nghe, gây bệnh điếc nghề nghiệp, giảm chức năng hô hấp, một số bệnh về da,… Đặc biệt benzen, toluen là những chất có thể gây ung thư

Mặc dù, benzen đã được hạn chế sử dụng và thay thế bằng nhóm toluen, ethylbenzen, xylen (TEX) có độ độc thấp hơn, nhưng trong các ngành công nghiệp

có sử dụng dung môi hữu cơ nói chung, đặc biệt đối với ngành sản xuất sơn có nguồn nguyên liệu chính là nhóm TEX vẫn còn một lượng benzen nhất định Chính vì thế, người lao động trong ngành sơn vẫn thường xuyên phải tiếp xúc với nhóm BTEX, những chất này khi thấm nhiễm vào cơ thể gây ảnh hưởng đến biểu hiện của gen mã

hóa cho cytochrome P450 2E1 là gen CYP2E1 Gen CYP2E1 mã hoá cho enzym tham

gia vào quá trình chuyển hóa của VOCs [74], styren [44], vinyl chloride monomer [114] và nhiều chất độc khác bao gồm cả các tiền chất gây ung thư Mối liên quan giữa phơi nhiễm BTEX trong môi trường và mức độ biểu hiện mRNA của gen

CYP2E1 là hướng nghiên cứu đang được quan tâm Mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở người lao động làm việc trong môi trường có BTEX được coi là chỉ dấu

sinh học mới để giám sát người lao động có tiếp xúc với dung môi hữu cơ [74]

Nhiễm độc benzen và các đồng đẳng của benzen (nhóm BTEX) đã được Việt Nam công nhận là bệnh nghề nghiệp Giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với 1 trong 4 dung môi trên đã được xác định, nhưng mỗi chỉ số giám sát sinh học chỉ được sử dụng cho từng dung môi riêng rẽ; trong khi đó, người lao động khi

tiếp xúc với dung môi hữu cơ thường là một nhóm chất Ở Việt Nam, số lượng người lao động thường xuyên phải tiếp xúc với BTEX ở các ngành như da giày, điện tử, in

ấn là khá cao, đặc biệt cao trong ngành sản xuất sơn Tuy nhiên việc nghiên cứu chỉ

số giám sát sinh học cho người lao động tiếp xúc với nhóm chất như BTEX chưa được quan tâm Nghiên cứu về ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến người lao động

có tiếp xúc nghề nghiệp đã có nhưng chưa nhiều, chưa sâu, đa phần các nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc khảo sát: nồng độ ô nhiễm, hiện trạng sức khỏe của công nhân

Để nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của dung môi hữu cơ nói chung và ảnh hưởng của BTEX nói riêng đến người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp, đặc biệt mong muốn tìm ra chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với BTEX, chúng tôi

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất benzen, toluen,

ethylbenzen và xylen lên biểu hiện của gen CYP2E1 ở người lao động có tiếp xúc

nghề nghiệp”

2 Mục tiêu

- Xác định được mức độ thấm nhiễm của benzen, toluen, ethylbenzen và xylen ở người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp tại cơ sở nghiên cứu

- Xác định được ảnh hưởng của benzen, toluen, ethylbenzen và xylen lên biểu hiện

gen CYP2E1 ở đối tượng nghiên cứu

3 Nội dung nghiên cứu luận án

- Xác định được mức độ thấm nhiễm của BTEX ở người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp

+ Xác định nồng độ BTEX trong môi trường lao động của đối tượng nghiên cứu + Xác định nồng độ axit t,t muconic (TTMA), O-cresol, methylhippuric (mHA), axit mandelic (MA) và axit phenylglyoxylic (PGA) trong nước tiểu TTMA, O-cresol, MA + PGA và mHA lần lượt là sản phẩm chuyển hóa của benzen, toluen, ethylbenzen và xylen

+ Xác định nồng độ của BTEX trong máu, nước tiểu của đối tượng nghiên cứu

- Xác định biểu hiện của gen CYP2E1 của người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp qua mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1

- Đánh giá ảnh hưởng của BTEX đến mức độ biểu hiện của gen CYP2E1

4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình nghiên cứu đánh giá đồng thời mức độ tiếp xúc, thấm nhiễm của một nhóm chất BTEX ở công nhân có tiếp xúc nghề nghiệp tại Việt Nam,

có 82,19% đối tượng nghiên cứu có giới hạn nồng độ tiếp xúc với nhóm BTEX vượt tiêu chuẩn cho phép

Luận án là công trình nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của nhóm BTEX đến

biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp tại Việt Nam Nhóm tiếp xúc có mức độ biểu hiện mARN của gen CYP2E1 cao hơn nhóm

không tiếp xúc 10,47 lần, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Luận án đã đánh giá thực trạng tiếp xúc, thấm nhiễm của người lao động trong một số cơ sở sản xuất sơn với nhóm chất BTEX Kết quả nghiên cứu của luận án làm

cơ sở dữ liệu cho Bộ Y tế đưa ra quy định đầy đủ về các chỉ số giám sát môi trường, giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với nhóm chất này

Luận án đã phát hiện ảnh hưởng của nhóm BTEX làm tăng biểu hiện mRNA

của gen CYP2E1, mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 có tương quan tuyến

tính với tổng giá trị tiếp xúc của nhóm BTEX Kết quả nghiên cứu của luận án làm

cơ sở khoa học cho việc đề xuất sử dụng chỉ số mRNA của gen CYP2E1 làm chỉ số

giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc đồng thời với nhóm chất BTEX

6 Địa điểm thực hiện luận án

Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; Trung tâm Sức khỏe Nghề nghiệp, Trạm quan trắc môi trường Lao động Viện khoa học An toàn và Vệ sinh lao động

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 KHÁI NIỆM DUNG MÔI HỮU CƠ, TÍNH CHẤT CỦA BENZEN, TOLUEN,

ETHYLBENZEN VÀ XYLEN

1.1.1 Dung môi hữu cơ

Dung môi hữu cơ là một nhóm các chất hóa học, khác nhau về cấu trúc nhưng

có chung các đặc tính quan trọng như tồn tại ở dạng lỏng và dễ bay hơi ở nhiệt độ thường, có thể gây độc đối với hệ thần kinh trung ương nếu tiếp xúc thời gian dài, trong môi trường công nghiệp với nồng độ cao [18]

Hiện nay, dung môi hữu cơ được sử dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sơn, da giày một số dung môi như toluen (T), ethylbenzen (E), xylen (X) là những chất phổ biến Bên cạnh đó, benzen (B) là dung môi đã bị cấm sử dụng trong công nghiệp, tuy nhiên rất khó để có thể loại trừ hoàn toàn benzen vì trong thành phần của toluen, ethylbenzen hoặc xylen thường chứa một lượng benzen nhất định Người lao động làm việc trong các ngành công nghiệp có sử dụng VOCs thường chịu ảnh hưởng đồng thời của nhiều chất, đặc biệt là nhóm benzen, toluen, ethylbenzen và xylen (BTEX) [64, 69, 78, 111]

1.1.2 Tính chất lý – hóa của benzen, toluen, ethylbenzen, xylen

Benzen là chất lỏng không màu, khối lượng riêng 0,8786 g/cm³, điểm nóng chảy 5,5 °C, nhiệt độ sôi 80,1 °C, độ hòa tan trong nước 1,79 g/L ở 25 °C, dễ bay hơi, tan ít trong nước nhưng dễ hòa tan trong dầu khoáng cũng như trong dầu, mỡ động vật, dầu thực vật Trong công nghiệp, benzen được dùng để tổng hợp các chất hữu cơ như nitrobenzen, anilin, phenol và được sử dụng để hòa tan các nguyên liệu cao su, sơn, hóa chất trừ sâu hay dùng để tẩy mỡ ở xương, da, sợi vải, len, dạ và các dụng cụ

có chất mỡ bám bẩn [17, 20] Tuy nhiên, việc sử dụng benzen hiện nay đã được hạn chế và benzen đã được thay bằng toluen – chất ít độc hơn Mặc dù vậy, trong toluen vẫn chứa một phần benzen thường là 5% [19] Công thức hóa học của benzen là C6H6

còn công thức cấu tạo là:

Toluen là chất lỏng không màu, nhẹ, dễ bay hơi, khối lượng riêng 0,8669 g/cm³, điểm nóng chảy -93 °C, nhiệt độ sôi 110,6 °C, độ hòa tan trong nước 0,053 g/100 mL (20-25 °C) Toluen được tách từ dầu mỏ, nhựa, than hoặc sản phẩm tổng hợp Toluen được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp để tổng hợp các chất hữu cơ như clorua benzyl, benzyliden, cloramin và trinitrotoluen Toluen hòa tan được nhiều chất nên được sử dụng trong công nghệ sơn, sản xuất dược phẩm, vecni, mực, keo,

da giày [21, 24] Công thức hóa học của toluen là C7H8, còn công thức cấu tạo có

01 vòng benzen và 01 nhóm - CH3

Ethylbenzen là chất lỏng không màu, dễ cháy, có mùi tương tự xăng, khối lượng riêng 0,867 g/cm3, điểm nóng chảy -95 oC, nhiệt độ sôi 136 oC, độ hòa tan trong nước 0,015 g/100 mL (20 oC) Ethylbenzen là một hợp chất hữu cơ có công thức C6H5CH2CH3 Ethylbenzen có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp hóa dầu, như một chất trung gian trong sản xuất styren, tiền thân của polystyren, một chất dẻo được sử dụng phổ biến Ethylbenzen được tiêu thụ trong sản xuất styren, sử dụng

để tạo ra các hóa chất khác trong nhiên liệu ví dụ như dung môi trong mực, chất kết dính cao su, sơn dầu và sơn Loại xylen công nghiệp có chứa khoảng 20% [23], thậm chí có thể đạt đến 40,4% ethylbenzen [22] Ethylbenzen xuất hiện lẫn trong các dung môi hữu cơ khác, phổ biến trong môi trường của ngành sản xuất sơn [22] Công thức hóa học của ethylbenzen là C8H10 còn công thức cấu tạo là:

Xylen là chất lỏng không màu, khối lượng riêng 0,864 g/mL, điểm nóng chảy -47,4 °C, nhiệt độ sôi 138,5 °C, không tan trong nước Xylen trong công nghiệp được dùng trong công nghệ sơn, vecni, da giày, matit, điều chế dược phẩm, làm tăng chỉ

số octan của xăng máy bay Xylen là loại dung môi tốt đối với parafin, là nguyên liệu chính trong ngành sản xuất sơn [23] Công thức hóa học là C8H10, công thức cấu tạo của xylen là:

Đường xâm nhập của BTEX vào cơ thể

Dung môi hữu cơ là chất lỏng dễ bay hơi nên chủ yếu xâm nhập vào cơ thể con người theo đường hô hấp Đây là con đường gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất đến sức khỏe con người, đặc biệt đối với NLĐ có tiếp xúc nghề nghiệp [21, 28, 29,

36, 38, 69, 79, 101, 102]

Ngoài ra, BTEX còn có thể xâm nhập qua đường da, qua đường tiêu hóa (nhưng rất hiếm gặp với trường hợp qua đường tiêu hóa)

Chuyển hóa và đào thải BTEX trong cơ thể

Khi dung môi hữu cơ xâm nhập vào cơ thể, chúng sẽ được đào thải nhanh chóng Nếu như ion kim loại xâm nhập vào cơ thể có thể tồn tại vài tháng, thậm chí vài năm thì dung môi hữu cơ có thể đào thải gần hết trong vài giờ Khi xâm nhập vào

cơ thể, tùy chất cụ thể sẽ được chuyển hóa thành sản phẩm khác nhau rồi đào thải ra ngoài qua đường tiết niệu Một phần sẽ được đào thải ngay ra ngoài môi trường thông qua con đường hô hấp [20 - 23, 38]

Đối với BTEX, một phần thải ra ngoài qua đường hô hấp Phần còn lại được chuyển hóa và thải ra ngoài qua đường nước tiểu Trong quá trình chuyển hóa dung

môi hữu cơ đặc biệt là nhóm BTEX thì cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) có vai trò

đặc biệt quan trọng, mặt khác thì dung môi hữu cơ này có thể gây ảnh hưởng đến cấu

trúc DNA của gen CYP2E1 [15, 74, 92]

BTEX được đào thải theo 2 cách chính:

- Đào thải qua đường hô hấp

- Đào thải qua đường tiết niệu Cách đào thải này bao gồm cả dung môi hữu cơ dạng mà nó được hấp thụ vào và dạng chuyển hóa [20 - 23, 38]

1.2 GIÁM SÁT SINH HỌC

Bệnh nghề nghiệp là bệnh phát sinh do điều kiện lao động có hại của nghề nghiệp tác động đối với người lao động Người lao động bị bệnh nghề nghiệp thuộc Danh mục bệnh nghề nghiệp do Bộ Y tế ban hành được hưởng chế độ bảo hiểm theo quy định [5] Giám sát sinh học của các phơi nhiễm nghề nghiệp đối với các hóa chất có nghĩa là đánh giá “liều lượng bên trong” của người lao động bằng cách xác định nồng độ của hóa chất hay chất được tạo thành trong quá trình chuyển hóa ở trong các dịch sinh học hoặc tóc, móng [5] Thông thường trong giám sát sinh học,

sử dụng phương pháp định lượng sản phẩm chuyển hóa trong dịch sinh học Tuy nhiên, có thể xác định trực tiếp hàm lượng các chất được hấp thụ trong dịch sinh học hay có thể sử dụng chỉ tiêu đặc trưng khác Chỉ tiêu này có thể thay đổi tùy từng

tổ chức, quốc gia

Một số khái niệm liên quan:

- Phơi nhiễm được xác định là sự tiếp xúc với yếu tố gây bệnh dẫn đến nguy

cơ mắc bệnh (nghề nghiệp)

- Thấm nhiễm là hiện tượng các yếu tố độc hại xâm nhập vào trong cơ thể gây

ra một số ảnh hưởng nhưng chưa đến mức độ gây ra các tổn hại bệnh lý

- Nhiễm độc là một tình trạng hay một quá trình trong đó con người bị tổn hại nghiêm trọng bởi một chất hóa học nào đó [5]

Đối với benzen

Hiện nay, một số nước như Anh, Pháp, Thụy Sỹ, Hàn Quốc đã sử dụng chỉ

số TTMA (≥ 0,5 mg/g creatinin) làm chỉ tiêu giám sát sinh học cho người lao động

có tiếp xúc với benzen, ngoài ra có thể sử dụng chỉ số S-phenylmecapturic (≥ 25 µg/g creatinin - ở người bình thường) trong nước tiểu làm chỉ tiêu giám sát sinh học [18]

Đối với toluen

Khoảng 80% lượng toluen được hấp thụ sẽ bài tiết qua nước tiểu dưới dạng

HA Một phần nhỏ dưới dạng O-cresol, do vậy định lượng HA hoặc O-cresol trong nước tiểu là phương pháp để giám sát sinh học đối với người lao dộng có tiếp xúc với toluen hiệu quả Hiện nay, giới hạn cho giám sát sinh học của toluen là 0,3 mg/g creatinin đối với O-cresol [18, 21]

Đối với ethylbenzen

MA và PGA là sản phẩm chuyển hóa của ethylbenzen trong nước tiểu của người lao động sau khi bị thấm nhiễm ethylbenzen Tổng nồng độ MA và PGA có mối quan hệ tuyến tính cao với nồng độ ethylbenzen trong môi trường, nên tổng MA

và PGA được coi là chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với ethylbenzen, với giá trị cho phép của tổng MA và PGA niệu là ≤ 0,15 g/g creatinin [18, 55]

Đối với xylen

Chất chuyển hóa chính của xylen là mHA đã được đề xuất như một phương tiện để giám sát sinh học tại nơi làm việc Hội nghị các nhà Vệ sinh công nghiệp chính phủ Mỹ (ACGIH, 2018) đã đề nghị sử dụng chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với xylen là mHA với giới hạn cho phép là ≤ 1,5 g/g creatinin [18, 23]

1.3 ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI HỮU CƠ ĐẾN SỨC KHỎE CON NGƯỜI

Dung môi hữu cơ nói chung và nhóm (BTEX) nói riêng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người, khi tiếp xúc với môi trường có nồng độ vượt ngưỡng cho phép Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nhóm BTEX, có thể gây ảnh hưởng đến DNA ngay cả khi tiếp xúc ở nồng độ thấp Do vậy, cần nghiên cứu để

thiết lập tiêu chuẩn cho phép đảm bảo an toàn cho con người nói chung và người lao động nói riêng

1.3.1 Ảnh hưởng của benzen

đẻ non hoặc sẩy thai Đây là bệnh nguy hiểm vì benzen có thể tích luỹ lâu dài trong tuỷ xương, có thể sau hai năm mới phát bệnh kể từ khi nhiễm benzen [20] Benzen là một trong những chất gây ung thư ở người với tỉ lệ rất cao và được xếp vào nhóm 1, nhóm chất gây ung thư theo Cơ quan Nghiên cứu ung thư Quốc tế [20, 36, 99]

1.3.2 Ảnh hưởng của toluen

Nhiễm độc cấp tính

Theo báo cáo của cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ năm 1980 toluen gây các triệu chứng bao gồm: đau đầu, chóng mặt, mệt mỏi, yếu cơ thể, buồn ngủ, mất thăng bằng cơ thể, dị cảm da, đột quỵ và hôn mê [21, 36, 99]

Nhiễm độc mạn tính

Toluen có thể gây các tổn thương khu trú hoặc gây tác hại đến toàn thân Nó

có thể gây kích ứng mắt, đường hô hấp và da Lặp đi lặp lại hoặc tiếp xúc kéo dài với toluen dạng lỏng có thể gây ra việc loại bỏ các chất béo tự nhiên của da, dẫn đến khô,

viêm nứt da Tiếp xúc mạn tính cũng như phơi nhiễm cấp tính với toluen có thể dẫn

đến suy yếu hệ thần kinh trung ương và giảm trí nhớ [21, 36, 99]

1.3.3 Ảnh hưởng của ethylbenzen

Nhiễm độc cấp tính

Ethylbenzen gây ra nhức đầu, buồn nôn, chóng mặt, mất phương hướng và bất tỉnh Phơi nhiễm cấp tính với nồng độ cao có thể gây ra các dấu hiệu kích ứng hô hấp trên, tiếp theo là ngạt, yếu cơ, hôn mê và tử vong do suy hô hấp [21]

Nhiễm độc mạn tính

Ethylbenzen được phân loại là một chất có thể gây ung thư theo Cơ quan Nghiên cứu ung thư Quốc tế và được xếp vào nhóm 2B Nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc tiếp xúc lâu dài với ethylbenzen gây ảnh hưởng xấu đến chức năng gan, thận, sinh sản, khả năng nghe, làm gia tăng u thận, u phổi, u gan [20 - 23, 36, 99]

1.3.4 Ảnh hưởng của xylen

1.3.5 Ảnh hưởng của nhóm BTEX

Nhiễm độc mạn tính hay còn gọi là ngộ độc trường diễn (ngộ độc tích lũy) là trạng thái nhiễm độc với liều lượng thấp, chưa ảnh hưởng ngay mà phải trải qua một thời gian dài tích lũy chất độc trong cơ thể đến một mức độ nào đó làm biến đổi quá trình sinh lý, sinh hóa mới phát sinh ra triệu chứng ngộ độc [16, 17, 21] Tùy từng chất độc mà thời gian tiếp xúc tối thiểu là khác nhau, nhưng đối với nhóm BTEX trong hướng dẫn chẩn đoán, giám định suy giảm khả năng lao động do bệnh nhiễm độc benzen và đồng đẳng không có quy định về thời gian tiếp xúc tối thiểu [1]

Một đặc điểm nổi bật của nhiễm độc mạn tính do BTEX là gây thiếu máu, thiếu máu nhẹ ngay ở giai đoạn khởi phát và rất nghiêm trọng ở giai đoạn toàn phát Cục An toàn vệ sinh lao động Hoa Kỳ (OSHA) và tổ chức Y tế thế giới (WHO) đưa

ra [59, 109] tiêu chuẩn đánh giá thiếu máu do nhiễm độc benzen và đồng đẳng của benzen dựa trên số lượng tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu Sự tăng hay giảm của các chỉ số này là dấu hiệu của độc tính tiềm tàng, đặc biệt là nếu tất cả các chỉ số trong máu giảm Một số bất thường được tìm thấy thông qua sàng lọc thường có ý nghĩa rất lớn ở công nhân tiếp xúc với benzen và đồng đẳng của benzen cụ thể là:

- Giảm số lượng tế bào tiểu cầu

- Xu hướng giảm số lượng tế bào bạch cầu, hồng cầu và tiểu cầu

Sự bất thường trong các chỉ số huyết học khác nhau có ý nghĩa nhiều hơn là một

sự bất thường duy nhất của một chỉ số Trường hợp số lượng bạch cầu thấp không liên quan với bất kỳ bất thường trong các chỉ số tế bào khác có thể là một kết quả thống kê bình thường, trong khi đó nếu số lượng bạch cầu thấp được đi kèm với sự giảm số lượng tế bào tiểu cầu hoặc các chỉ số tế bào hồng cầu thì nhiễm độc benzen phải xem xét đến

Thiếu máu có nhiều cấp độ khác nhau Tình trạng thiếu máu được phân loại theo

tổ chức Y tế thế giới [109] gồm: Chỉ số bình thường khi Hb ≥ 12 g/dL Thiếu máu chỉ số Hb < 12 g/dL, thiếu máu nhẹ chỉ số Hb từ 10 - 11,9 g/dL, thiếu máu vừa chỉ số

Hb 7 - 9,9 g/dL và thiếu máu nặng chỉ số Hb < 7 g/dL

Đặc điểm môi trường một số ngành sản xuất có sử dụng BTEX

Dung môi hữu cơ được sử dụng rất phổ biến trong nhiều ngành công nghiệp như ngành da giày, điện tử, sản xuất keo gián, các ngành sản xuất sơn Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, môi trường lao động tại một số ngành sản xuất có sử dụng dung môi hữu cơ nói chung, đặc biệt là nhóm BTEX có nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe của người lao động Do người lao động tiếp xúc với dung môi liên tục trong thời gian dài hoặc tiếp xúc ở nồng độ cao hơn tiêu chuẩn cho phép

Trong nghiên cứu phối hợp giữa Viện Nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Bảo hộ Lao động, Viện Y học lao động và Trường Đại học Y Hà Nội về “Thực trạng sức nghe của công nhân khi tiếp xúc với dung môi hữu cơ (DMHC) và đề xuất các biện pháp nâng cao sức khỏe cho người lao động tại hai công ty sản xuất giày, một công

ty sản xuất nhựa và một công ty sản xuất sơn” Kết quả cho thấy nồng độ dung môi hữu cơ trong đó có toluen, xylen là cao nhất trong số các cơ sở nghiên cứu và có những vị trí mà nồng độ DMHC vượt quá tiêu chuẩn cho phép từ 1,7 - 2,3 lần [10] Ngành công nghiệp sơn Việt Nam đã ra đời và phát triển từ năm 1914 - 1920 với

sự xuất hiện của một số xưởng sơn tại Việt Nam Giai đoạn 1976 - 1990 toàn quốc

có 12 công ty - xí nghiệp sản xuất sơn lớn nhỏ thuộc sở hữu nhà nước Đến năm 2007, hầu hết các hãng sơn lớn của thế giới đều đã có mặt tại Việt Nam, dưới hình thức đầu

tư 100% vốn nước ngoài hoặc gia công hợp tác sản xuất với các công ty sơn trong nước Sơn sử dụng trong trang trí chiếm tỉ trọng lớn về thể tích (64 - 66%) tổng sản lượng nhưng lại có giá trị thấp, ứng với (41 - 45%) về trị giá Mức tăng trưởng trung bình của ngành 15 - 20%, số doanh nghiệp ngày càng gia tăng (VPIA) Hiện số doanh nghiệp sản xuất sơn tại Việt Nam đã tăng lên gần 600 doanh nghiệp [12] Hiện chưa

có con số thống kê cụ thể nhưng số lượng lao động làm việc tại các cơ sở sản xuất sơn từ vài chục đến vài nghìn người tùy thuộc vào quy mô sản xuất của cơ sở Tuy nhiên, trong tổng số lao động thì thực tế có hơn 50% số lao động của cơ sở có tiếp xúc với DMHC

Moon và cộng sự nghiên cứu trên 862 xưởng sản xuất dung môi hữu cơ ở khu công nghiệp Jangrim tại Hàn Quốc trong vòng 2 năm 1995 - 1997 với phương pháp thu thập số liệu bằng lấy mẫu cá nhân Kết quả cho thấy dung môi được sử dụng nhiều trong sơn, keo ứng dụng, dung môi làm sạch, in ấn và dung môi dùng

để pha loãng theo thứ tự giảm dần Toluen là dung môi được sử dụng nhiều nhất Trong năm công việc có sử dụng dung môi thì axeton, hexan, xylen cũng được sử dụng thường xuyên [80]

Môi trường lao động có ảnh hưởng trực tiếp tới tình trạng sức khỏe của người lao động Khi môi trường lao động đạt tiêu chuẩn thì sức khỏe của người lao động được đảm bảo năng suất lao động sẽ cao và ngược lại Mặc dù, môi trường lao động được xác định là có nồng độ nhóm BTEX nằm trong giới hạn cho phép nhưng tiếp xúc trong thời gian dài vẫn có thể gây những ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người lao động [20 - 23]

1.4 ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE, ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN CYP2E1 VÀ MỘT SỐ

NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

1.4.1 Đa hình đơn nucleotide (SNP)

Đa hình đơn nucleotide (SNP) là một biến thể trong một nucleotide đơn (A, T,

C, hoặc G) xảy ra ở một vị trí cụ thể trong bộ gen, mà sự thay đổi có tần số xuất hiện đáng kể trong quần thể (> 1%) [90] Trong thực tế, thay đổi một nucleotide trong vùng mã hóa sẽ không nhất thiết phải thay đổi trình tự axit amin của protein được tạo

ra, do sự thoái hóa của mã di truyền Một SNP xuất hiện không làm thay đổi trình tự chuỗi polypeptide mới được gọi là đồng nghĩa (đôi khi được gọi là đột biến thầm lặng) Nếu một chuỗi polypeptide khác được tạo ra thì bộ ba chứa SNP không đồng nghĩa với bộ ba mã hóa ban đầu [95]

Hầu hết các SNP xảy ra trong vùng không mã hóa, do đó SNP thường không làm ảnh hưởng đến gen Tuy nhiên vẫn có một số SNP không nằm trong vùng mã hóa vẫn có thể ảnh hưởng tới việc nối gen, liên kết với các nhân tố phiên mã hoặc chuỗi RNA không mã hóa Những SNP này đã được chứng minh là quan trọng trong

nghiên cứu về sức khỏe con người Các nghiên cứu đã tìm thấy các SNP có thể giúp

dự đoán đáp ứng của cơ thể đối với một số loại thuốc nhất định, nhạy cảm với các yếu tố môi trường như độc tố và tăng nguy cơ phát triển của một số bệnh SNP cũng

có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền của các gen bệnh trong gia đình Các hướng nghiên cứu trong tương lai nhằm hướng tới việc xác định các SNP liên quan

đến các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư [87]

1.4.2 Đặc điểm của gen CYP2E1 và một số nghiên cứu liên quan

Nhóm BTEX khi xâm nhập vào cơ thể sẽ được chuyển hóa để tạo thành nhiều sản phẩm khác nhau và đào thải ra ngoài thông qua con đường tiết niệu Tham gia vào quá trình chuyển hóa BTEX có vai trò quan trọng của nhóm enzym CYPP450, trong nhóm này có một số enzym như CYP1A1, CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2E1 cùng tham gia trong các giai đoạn chuyển hóa khác nhau Trong 5 enzym này, có enzym CYP2E1 có vai trò quan trọng nhất, quyết định trong việc xúc tác ở phản ứng phân giải BTEX đầu tiên [20 - 23] Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu đã cho

thấy khi tiếp xúc với BTEX ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện mARN của gen CYP2E1

[71], đồng thời nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra với một số cơ thể mang những điểm đa hình nhất định có nguy cơ nhiễm độc BTEX cao hơn những cơ thể mang đa hình, đặc biệt là những đa hình trên đoạn promoter [46, 74, 92, 95, 107]

Gen CYP2E1 (Cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1) nằm trên

nhiễm sắc thể số 10, tại vị trí 10q/26.3, dài 14.776 bp, bao gồm 9 exon, 8 intron và

một hộp TATA điển hình Gen CYP2E1 mã hóa một enzym tham gia vào quá trình

chuyển hóa của thuốc, hoóc môn và một số chất sinh học lạ trong cơ thể [106, 115]

Gen CYP2E1 tham gia vào quá trình chuyển hóa hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân

tử thấp như benzen, ethanol, dung môi halogen hóa thơm, ankan, alken, nitrosamine và các dung môi hữu cơ khác [26, 63] Enzym CYP2E1 được biết là tác nhân hình thành các gốc tự do, tham gia vào quá trình tiền oxy hóa lipit và mất cânbằng oxy hóa [63, 108]

N-Vai trò quan trọng của enzym CYP2E1 là chất xúc tác, tăng tốc độ phản ứng trong phản ứng độc tính với gan do ethanol gây ra Sau đó, CYP2E1 được quan tâm

vì khả năng chuyển hóa và kích hoạt nhiều chất độc phân tử nhỏ để tổng hợp nhiều hợp chất và thuốc kỵ nước hơn, bao gồm cả tiền chất gây ung thư [65, 68,

96] CYP2E1 được biểu hiện ở mức độ cao trong gan, là nơi có nhiệm vụ loại bỏ độc tố khỏi cơ thể, tuy nhiên một số bằng chứng cho thấy CYP2E1 cũng được biểu

hiện trong các bộ phận khác của cơ thể như phổi, não [52] Enzym CYP2E1 chuyển hóa các chất gây ung thư và một số dung môi hữu cơ như BTEX,

sự chuyển hóa của nhóm BTEX được bắt đầu với quá trình oxy hóa bởi enzym

CYP2E1 thành các oxide khác nhau [62] Một số sản phẩm phụ như quinones được tạo ra thông qua quá trình oxy hóa, các chất chuyển hóa này được cho là gây ra tổn thương DNA

Một số nghiên cứu đã cho thấy người lao động tiếp xúc với dung môi hữu cơ

có liên quan đến mức độ biểu hiện của gen CYP2E1 Biểu hiện của gen được điều

hòa bởi nhiều yếu tố và nó liên quan mật thiết đến vùng promoter, ví dụ đa hình tại

điểm -1293G->C (mã công bố rs3813867) và -1053C->T (mã công bố rs2031920)

có liên quan đến sự phiên mã của CYP2E1 [65, 68], biểu hiện của CYP2E1 còn có sự

khác biệt ở những bệnh nhân ung thư phổi, thực quản, Một số nghiên cứu đã chỉ ra

đa hình tại một số điểm trên vùng promoter có liên quan đến khả năng chuyển hóa dung môi hữu cơ trong cơ thể [45, 62, 74, 75]

Một số đa hình trên gen CYP2E1 - Sự biến đổi của gen

Thông thường, để phát hiện sự biến đổi của gen, có thể sử dụng phương pháp khuếch đại gen nghiên cứu sau đó ủ với enzym cắt đặc hiệu Sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel polyacrylamide 10% Căn cứ vào các băng trên gel xác định được tính đa hình của gen Enzym cắt sẽ nhận ra những vị trí đặc hiệu và cắt tạo các đoạn gen khác nhau Nhưng nhiều trường hợp vị trí đặc hiệu trên gen bị thay đổi, enzym không nhận

ra để cắt – sự thay đổi này đối với CYP2E1 có thể do sự biến đổi nucleotide trên DNA

hoặc sự methyl hóa Để phát hiện sự biến đổi gen thì việc xác định đa hình sử dụng giải trình tự gen là biện pháp hiệu quả nhất

Đa hình CYP2E1 được Stephens E.A và cộng sự thực hiện bằng phân tích

RFLP, đa hình gen xảy ra với các tần số alen khác nhau xuất hiện trong các quần thể

trên khắp các châu lục Có nhiều đa hình khác nhau của gen CYP2E1 đã được xác định [95] Vai trò của các đa hình gen CYP2E1 trong rối loạn chức năng gan liên quan đến rượu đã được nghiên cứu rộng rãi vì rượu là một chất cảm ứng mạnh với CYP2E1 [74, 107] Các đa hình trong vùng mã hóa của CYP2E1 có thể gây ra sự thay thế axit

amin và do đó ảnh hưởng đến độ đặc hiệu của chất nền Bên cạnh đó, khi vị trí đa

hình tồn tại trong vùng promoter của gen CYP2E1, các đa hình này ảnh hưởng đến

sự liên kết của nhân tố phiên mã và thay đổi điều hòa phiên mã của gen, sự khác biệt

có thể được giải thích bằng sự thay đổi mức biểu hiện mRNA gen CYP2E1 [46, 92]

Cho đến nay hơn 100 SNPs đã được tìm thấy trong CYP2E1 nhưng chỉ một số

SNP có thể làm thay đổi hoạt động của enzym [71] Ở các chủng tộc khác nhau cho

thấy đa hình di truyền gen CYP2E1 khác nhau rõ rệt về tần số của các alen [115] Gần

đây, một nghiên cứu đã được tiến hành trên thế giới là phương pháp ước lượng phơi

nhiễm nhóm BTEX thông qua đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 trong

các tế bào máu, ở những người bị phơi nhiễm nghề nghiệp Do đó, việc đánh giá các

đa hình di truyền trong vùng promoter của gen CYP2E1 từ những người lao động tiếp

xúc với VOCs là một bước không thể thiếu Nghiên cứu của Hayashi và cộng sự cho

thấy, các đa hình di truyền trong vùng mã hóa của gen CYP2E1 ở người gây ra sự

khác biệt đáng chú ý trong hoạt động phiên mã của gen Khi các đoạn DNA (-1372 đến -960) khuếch đại bằng PCR alen đồng hợp tử trội chiếm ưu thế (A) hơn alen đồng hợp tử lặn (C) của điểm đa hình, sau đó được gắn vào gen thông báo với promoter SV40, kết quả cho thấy hoạt động tăng cường đối với DNA loại C gấp khoảng 10 lần

so với loại A Trong khu vực này, đã tìm thấy 5 sự khác biệt của nucleotide trong hai

kiểu gen đã quan sát ở 1259 (đa hình PstI), 1165, 1019 (đa hình RsaI), 991 và

-771 và kết luận rằng vị trí đa hình RsaI là cần thiết cho các hoạt động phiên mã [46]

Munaka và cộng sự cũng đã chỉ ra hai SNPs rs3813867 và rs2031920 có liên

quan với mức độ phiên mã cao hơn của CYP2E1 và tăng nguy cơ gây ung thư gan

với kiểu gen C/C hoặc G/C có xu hướng nhạy cảm hơn với độc tính benzen [103]

Bên cạnh đó, ảnh hưởng của các đa hình kiểu gen CYP2E1 đã được nghiên cứu bởi Hanioka và các cộng sự đối với các biến thể như CYP2E1*2, CYP2E1*3 và CYP2E1*4, các biến thể này ảnh hưởng đến quá trình thủy phân benzen và toluen bằng cách sử dụng các tế bào nấm men biểu hiện CYP2E1 tái tổ hợp [42] Kết quả

là tất cả các biến thể CYP2E1 có thay thế vị trí axit amin, có thể xúc tác quá trình oxy hóa benzen và toluen Hơn nữa, một số đa hình trong CYP2E1 đã được báo cáo

là có liên quan đến nguy cơ ung thư và các bệnh khác như phát ban đỏ, bệnh bạch cầu [63, 67]

Công bố gần đây đã cho thấy, vai trò của CYP2E1 có ảnh hưởng đến mối quan

hệ giữa sự phơi nhiễm dung môi và ung thư hạch trong một số lượng mẫu lớn chủ yếu là ở phụ nữ da trắng Các tác giả đã tìm thấy sự tương tác đáng kể giữa đa hình

CYP2E1 rs2070673 và phơi nhiễm nghề nghiệp với dicloromethan, cacbon

tetraclorua và methyl clorua Các cá nhân có biến thể đồng hợp tử bị tăng nguy cơ nhiễm bệnh hơn so với cá thể có kiểu gen hoang dại [45] Các ảnh hưởng đã được tìm

thấy tương tự ở các cá thể mang alen biến thể dị hợp tử (CYP2E1*5B), kiểu gen này

có liên quan tới quá trình chuyển hóa các dung môi của gen CYP2E1 và liên quan đến

bệnh thần kinh gây ra bởi dung môi [60]

Kim và cộng sự đã nghiên cứu gen CYP2E1 trên đối tượng tiếp xúc nghề

nghiệp với dung môi hữu cơ đặc biệt là nhóm BTEX tại vị trí -1054 C được thay thế

bằng T kết quả làm thay đổi tần số alen, ảnh hưởng đến tính đa hình của CYP2E1

Kiểu gen cụ thể của đối tượng nghiên cứu là C/C: 239 đối tượng (kiểu dại), C/T: 127 (biến thể dị hợp), T/T 19 (biến thể đồng hợp) [62]

Nghiên cứu của Helmig và cộng sự ngoài phát hiện sự thay đổi mức độ biểu

hiện mRNA CYP2E1 thì kết quả còn cho thấy trên gen CYP2E1 tại vị trí 1053 C được

thay thế bằng T Sự thay đổi này, làm thay đổi tần số alen và thành phần kiểu gen [48]

Gần đây, ảnh hưởng của BTEX đối với người lao động ngày càng được mô tả rõ ràng hơn, tính chất và cơ chế tác động của BTEX lên các cơ quan đích cũng được phát hiện chính xác hơn

1.5 Nghiên cứu liên quan đến mức độ biểu hiện mRNA và đa hình của CYP2E1

Khi tiếp xúc với nhóm BTEX, nhóm BTEX sẽ xâm nhập vào cơ thể, một phần được đào thải trực tiếp qua đường hô hấp còn phần lớn được chuyển hóa và bài tiết qua các con đường khác Các quá trình chính của sự trao đổi chất benzen, toluen, ethylbenzen, xylen là do hydroxyl hóa để tạo ra rượu benzyl bởi các thành viên của cytochrome P450 (CYP) Có 5 CYP quan trọng trong việc chuyển hóa các dung môi

hữu cơ này là CYP1A2, CYP2B6, CYP2E1, CYP2C8 và CYP1A1 Tuy nhiên, enzym

CYP2E1 được nhiều nghiên cứu xác nhận là enzym chính trong việc thủy phân nhóm

BTEX Mức độ biểu hiện mRNA CYP2E1 còn được dùng để giám sát tiếp xúc với nhóm BTEX Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy sự biểu hiện của CYP2E1 có rất nhiều

thay đổi, có thể khác nhau ở các nước khác nhau, các chủng tộc khác nhau [57] Nhóm BTEX là độc tố có ảnh hưởng đến hệ thống gan, thận và hệ thần kinh trung ương, các cơ quan đích chính Quá trình chuyển hóa của chúng diễn ra trong gan bởi cytochrome P450 2E1 (CYP2E1), sản xuất axit hippuric đối với toluen, sản xuất phenol đối với benzen được bài tiết trong nước tiểu CYP2E1 là một enzym có trong các mô của con người, nó chuyển hóa một số chất độc hại như hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOCs) [68, 71]

Hiện nay, hướng nghiên cứu đánh giá mức tiếp xúc với benzen, toluen, ethylbenzen và xylen qua mức biểu hiện mRNA trong tế bào lympho ngoại vi ở những người có tiếp xúc nghề nghiệp đang được thế giới quan tâm Một số nghiên cứu về

tác động của benzen, toluen, ethylbenzen và xylen đến CYP2E1 thông qua tỷ lệ trao đổi chất chlorzoxazone (CHZ) cũng như mức độ biểu hiện mRNA CYP2E1 đã được

thực hiện Kết quả cho thấy béo phì, tuổi tác và hút thuốc cũng như uống rượu và việc

dùng một số loại thuốc nhất định có ảnh hưởng đến CYP2E1 [74, 105]

Jiménez-Garza và cộng sự [58] xác định CYP2E1 một enzym cảm ứng có trong các mô, chuyển hóa một số chất độc hại bao gồm nhiều hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOCs) Một cách gián tiếp theo dõi việc tiếp xúc với VOCs có thể là đánh giá hoạt tính CYP2E1 trong cơ thể bằng cách sử dụng thử nghiệm (CHZ) – người lao động được cho sử dụng CHZ sau đó đánh giá tỷ lệ chuyển hóa của CHZ thành 6-hidroxylation chlorzoxazone Người có tiếp xúc với dung môi hữu cơ thì lượng CHZ được chuyển hóa ít hơn, do hiện tượng cạnh tranh cơ chất của enzym CYP2E1 Tác giả so sánh hoạt động của CYP2E1 trong hai nhóm: một nhóm có mức độ tiếp xúc nghề nghiệp với VOCs (nhóm phơi nhiễm) và nhóm còn lại làm nhiệm vụ hành chính (nhóm đối chứng) ở Guanajuato, México Kết quả cho thấy mức phơi nhiễm trung bình toluen cao hơn ở nhóm tiếp xúc (2,86 so với 0,05 ppm, P < 0,001) Ngoài ra, trong nhóm tiếp xúc hoạt tính CYP2E1 thấp hơn nhóm không tiếp xúc (P < 0,05) và hoạt tính CYP2E1 tiếp tục giảm ở tháng tiếp theo, trong khi tiếp xúc của người lao động tăng lên (tương quan âm, P < 0,05) Kết quả này phù hợp với những phát hiện trước đây thu được từ các công ty sản xuất giày dép - người lao động có tiếp xúc với các dung môi hữu cơ, nhưng lại cho kết quả đó lại trái ngược so với các nghiên cứu

ở đối tượng công nhân của nhà máy in [58] Nghiên cứu cho thấy mặc dù mức độ phơi nhiễm toluen tương đối thấp đối với các công nhân ngành thuộc da, nhưng ảnh hưởng lên hoạt động của CYP2E1 là rõ rệt Cơ chế tương tác này vẫn chưa được làm

rõ, nhưng sự suy giảm hoạt động CYP2E1 có thể ảnh hưởng đến sức khoẻ, vì những người này có thể ít được bảo vệ chống lại các chất nền của CYP2E1 khác có trong môi trường lao động [32, 58, 72, 94]

Mendoza-Cantú và cộng sự cho thấy có mối liên quan giữa mức độ biểu hiện

mRNA CYP2E1 với mức tiếp xúc toluen nghề nghiệp Tác giả cho rằng dựa vào mức

độ biểu hiện mRNA CYP2E1 là một cách đánh giá mức độ tiếp xúc nghề nghiệp với

benzen, toluen, ethylbenzen và xylen hơn cả việc sử dụng tỷ lệ trao đổi chất (trao đổi

chất Chlorzoxazone - CHZ) Hơn nữa, mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 là xét

nghiệm không xâm lấn, an toàn, không chịu ảnh hưởng của các yếu tố khác như tỷ lệ trao đổi chất hay sản phẩm chuyển hóa [57, 74]

Wang và cộng sự cho biết mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở công

nhân tiếp xúc với VOC là (0,89 ± 0,46) cao hơn đáng kể ở công nhân không tiếp xúc (0,61 ± 0,35) (P <0,01) Đặc biệt, những đối tượng bất thường về gan biểu hiện của

mRNA của CYP2E1 ở tế bào máu được tăng lên đáng kể trong công nhân tiếp xúc so với nhóm không tiếp xúc [105] Do đó, mức độ biểu hiện của mRNA của gen CYP2E1

có thể hữu ích cho việc giám sát sức khỏe và bảo vệ công nhân có tiếp xúc với một

số dung môi hữu cơ [74]

Kế thừa kết quả của một số nghiên cứu trước [45, 49, 62, 71, 74, 75, 95,

107, 114], trong khuôn khổ nghiên cứu này chúng tôi xác định tính đa hình của

gen CYP2E1 trong phạm vi một đoạn của promoter có kích thước 563 bp Tính từ

nucleotide đầu tiên của gen vị trí chúng tôi phân tích đa hình từ nucleotide thứ 3370 đến nucleotide số 3933 Đánh giá ảnh hưởng của BTEX lên mức độ biểu hiện gen

CYP2E1 thông qua biểu hiện của một đoạn gen trong vùng mã hóa tại exon số 7

từ nucleotide số 12151 đến nucleotide số 12338 trên gen CYP2E1

1.6 Một số nghiên cứu có liên quan tại Việt Nam

Cho đến nay, điều kiện lao động của người lao động trong các ngành có sử dụng dung môi hữu cơ nói chung và ngành sản xuất sơn nói riêng đã được cải thiện tốt hơn như hệ thống thông gió, nguyên liệu sử dụng… Tuy nhiên, môi trường làm việc tại các cơ sở sản xuất có sử dụng dung môi hữu cơ tại Việt Nam vẫn luôn tiềm ẩn nhiều tác nhân gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người lao động

Các nghiên cứu trong nước khi đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến sức khỏe người lao động đã phát hiện được nồng độ dung môi hữu cơ trong không khí vùng làm việc vượt quá tiêu chuẩn cho phép Các tác giả Hoàng Thị Minh Hiền [6], Nguyễn Thế Công [4], Hà Lan Phương [9] đã sử dụng nồng độ axit hippuric trong nước tiểu như một chỉ số đánh giá sự hiện diện và mức độ phơi nhiễm dung môi hữu cơ theo thường quy kỹ thuật Y học lao động [14]

Nghiên cứu của Hoàng Thị Minh Hiền về thực trạng sức nghe của công nhân khi tiếp xúc với DMHC và đề xuất các biện pháp nâng cao sức khỏe cho người lao

Công ty Da giày Phúc Yên, Công ty Da giày Yên Viên, Công ty Nhựa Hưng Yên và một cơ sở sản xuất sơn ở Hà Nội Kết quả cho thấy về mức độ ô nhiễm DMHC: tại 2 công ty da giày, trong các phân xưởng sản xuất giày, nồng độ DMHC vượt quá tiêu chuẩn cho phép (TCCP) từ 1,3 - 1,5 lần, có điểm đo vượt 2,3 lần (ô nhiễm ở mức nhẹ

và vừa) ở hai công ty này toluen là chất gây ô nhiễm chính Tại một cơ sở sản xuất sơn ở Hà Nội: trong phân xưởng sản xuất sơn tường và sơn cao cấp: 2 điểm đo có nồng độ DMHC vượt quá tiêu chuẩn cho phép từ 1,7 - 2,3 lần (ô nhiễm ở mức vừa) Tại đây, xylen là chất gây ô nhiễm chính Tại Công ty Nhựa Hưng Yên nồng độ DMHC tại các điểm đo ở mức cho phép [6] Nghiên cứu của Hà Lan Phương [9], về ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến thính lực công nhân tiếp xúc và đề xuất biện pháp dự phòng chỉ ra rằng mặc dù tiếng ồn tại các cơ sở nghiên cứu không vượt quá tiêu chuẩn cho phép nhưng tỷ lệ công nhân giảm sức nghe khá rõ

Nguyễn Thế Công và cộng sự khi đánh giá điều kiện làm việc và sức khỏe nghề nghiệp lao động nữ ngành da giày cho thấy nhiệt độ và độ ẩm không khí trong các dây chuyền may đa số đều vượt tiêu chuẩn cho phép, thông khí kém nên hạn chế khả năng pha loãng hơi khí độc trong phân xưởng, nồng độ toluen vượt 1,2 - 1,8 lần tiêu chuẩn cho phép Thời gian phản xạ đơn giản gia tăng - trí nhớ suy giảm khi so sánh các kết quả đo giữa đầu và cuối ca làm việc [4]

Tại Việt Nam, hiện nay đã có một số nghiên cứu về tác hại của các dung môi hữu cơ đến sức khoẻ người lao động một số ngành nghề như ngành sản xuất sơn, da giày Ngành sản xuất sử dụng các DMHC như nhóm BTEX đặc biệt là sản xuất sơn hiện đang phát triển với quy mô ngày càng rộng lớn, thu hút một lực lượng lao động trẻ đông đảo Tuy nhiên, môi trường lao động cũng như sức khỏe người lao động chưa được quan tâm đúng mức Vì vậy, cần thiết phải tiến hành nghiên cứu để tìm ra các giải pháp kịp thời nhằm cải thiện môi trường làm việc và bảo vệ sức khỏe cho người lao động

Ở nước ta đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của DMHC đến sức khỏe, tình trạng thiếu máu của người lao động Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào công bố

về ảnh hưởng của DMHC đến người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp đến mức độ

biểu hiện mRNA hoặc mối liên quan đến đa hình của gen CYP2E1

Các nghiên cứu đều cho thấy việc đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ nói chung và nhóm BTEX nói riêng đến sức khỏe con người đã được quan tâm Nếu ban đầu chỉ đánh giá dừng lại ở việc giám sát sản phẩm chuyển hóa thì về sau đã có những giám sát sinh học mới như đo trực tiếp nồng độ của toluen trong dịch sinh học

và xem xét ảnh hưởng của chúng đến mRNA hoặc DNA Trên cơ sở những nghiên cứu này mà ngưỡng tiếp xúc với VOCs trong môi trường cũng được điều chỉnh Kết hợp giám sát môi trường và giám sát sinh học người lao động làm việc trong môi trường có dung môi hữu cơ nói chung và benzen, toluen, ethylbenzen và xylen nói riêng sẽ được bảo vệ tốt hơn

Xác định mức thấm nhiễm của BTEX vào ĐTNC

Mẫu nước tiểu

Tách chiết DNA

tổng số

Khảo sát tại cơ sở

Đo mẫu cá nhân (BTEX) của

lượng tế bào máu (Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu)

Phân tích nồng độ BTEX trong máu

Phân tích sản phẩm chuyển hóa của BTEX (TTMA, O- cresol, mHA, MA, PGA)

Phân tích nồng độ BTEX trong mẫu

cá nhân

Phân tích nồng độ BTEX trong nước tiểu

Sử dụng Realtime PCR đánh giá biểu hiện mRNA gen

CYP2E1

Xác định ảnh hưởng của BTEX đến 3 dòng tế bào

tiếp xúc của ĐTNC với BTEX

Đánh giá ảnh hưởng của BTEX đến:

- Mức thấm nhiễm BTEX trong máu, trong nước tiểu Phân tích dữ liệu

tìm điểm đa hình

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Người lao động: Gồm nhóm tiếp xúc và nhóm không tiếp xúc (đối chứng) làm việc

tại cơ sở sản xuất của 4 công ty, 3 công ty sản xuất sơn trên địa bàn Hà Nội và 1 công

ty may trên địa bàn tỉnh Hải Dương

+ Công ty TNHH Sơn công nghiệp Hòa Phát - Chi nhánh tại Thanh Oai, Hà Nội + Công ty TNHH Công nghệ cao Việt Tiệp - Chi nhánh tại Thường Tín, Hà Nội (tại phân xưởng sản xuất sơn)

+ Công ty cổ phần Sơn tổng hợp - Chi nhánh Huyện Thanh Trì, Hà Nội

+ Công ty May Tứ Kỳ - Hải Dương

+ Thời gian thu mẫu: 2016-2018

Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu

+ Công nhân trực tiếp tham

gia sản xuất có tiếp xúc với

dung môi hữu cơ (BTEX)

Tiêu chuẩn lựa chọn

Đối tượng nghiên cứu phải có được các tiêu chuẩn:

+ Khỏe mạnh, không mắc bệnh gì trước khi vào làm việc tại cơ sở

+ Không dùng thuốc làm thay đổi hoạt độ của enzym CYP2E1 như: acetaminophen, isoniazid, disulfiram, chlormethiazole, chloroquine

+ Đồng ý tham gia nghiên cứu

+ Không sử dụng rượu, bia trong vòng 48 tiếng

+ Nam và nữ công nhân

- Thời gian nghiên cứu: từ 1/2016 đến 3/2020

- Hóa chất được sử dụng cho phân tích mRNA, DNA:

Kit tách chiết DNA: GeneJET whole blood genomic DNA purification mini kit, dNTP mix, Dream Taq DNA polymerase, Dream Taq DNA buffer của Thermo Fisher Scientific - Mỹ

Bộ kit Total RNA purification Kit của hãng Norgen – Canada

Bộ kit GeneJET PCR Purification

Bộ kit First Strand cDNA Synthesis Kit

Các dung dịch đệm TAE 1X, agarose, DNA loading Dye (6x), thang DNA chuẩn

1 kb của hãng Thermo Fisher Scientific - Mỹ Hóa chất được sử dụng cho phản ứng Reatime - PCR: vTOPreal qPCR 2X PreMix SYBR của hãng Enzynomics - Hàn Quốc

Bảng 2.2 Các cặp mồi được dùng cho nghiên cứu

Mồi Trình tự mồi (5’-3’) [104] Tm

(oC)

Mục đích sử dụng

Promoter 1F AAGCCAAGGCTTCAATTTCA 56,1 Khuếch đại đoạn

gen trên Promoter

của gen CYP2E1

trong phản ứng PCR

Promoter 1R GATGAGAAATGAAGAAAATAAAAGT

CYP2E1 F1 ACCTGCCCCATGAAGCAACC 62,5 Khuếch đại đoạn

gen trên exon 7 của gen CYP2E1 bằng

RT - PCR CYP2E1 R1 GAAACAACTCCATGCGAGCC 60,5

β - actin F CAACTCCATCATGAAGTGTGAC 60,3 Khuếch đại gen nội

chuẩn β-actin bằng

RT-PCR

β - actin R

CCACACGGAGTACTTGCGCTC 65,2

Kích thước sản phẩm PCR được khuếch đại sử dụng cặp mồi Promoter 1, CYP2E1 và β – actin lần lượt là 563 base pair (bp) và 187 bp và 184 pb

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

Dụng cụ nghiên cứu chính

Các loại bình định mức thể tích 5 – 100 mL; ống đựng mẫu 2 và 20 mL; Cân phân tích (chính xác 0,0001 mg); Máy ly tâm; Cột sắc ký khí DB 624 (60m  0,53mm

 3,0µm); Bể điều nhiệt; Cột C18 dài 100 mm, kích thước hạt 1,8 µm; Màng lọc dung

môi, đầu lọc mẫu chất liệu nilon kích thước 0,2 µm

Thiết bị nghiên cứu chính

Hệ thống máy sắc ký khí GC/FID; GC/MS kết nối bộ phận hóa hơi mẫu; máy sắc

ký lỏng hiệu năng cao - HPLC, đầu dò DAD; máy sắc ký lỏng khối phổ - LC/MS, các máy này của hãng Agilent – Mỹ Máy phân tích công thức máu Sysmex 1000i của hãng Sysmex - Nhật Bản Máy PCR (GeneAmp® PCR System 9700; Máy Realtime PCR (StepOne™ Real-Time PCR của hãng Applied Biosystems - Mỹ); Một số thiết

bị hỗ trợ khác: Máy vortex, tủ lạnh sâu -80 °C và -20 °C, máy điện di, máy soi gel và chụp ảnh gel tự động, máy ly tâm lạnh, lò vi sóng,…

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG

Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp mô tả cắt ngang có nhóm so sánh

2.3.1 Cách chọn mẫu nghiên cứu và cỡ mẫu

* Cỡ mẫu: Lấy toàn bộ đối tượng đủ tiêu chuẩn nghiên cứu tại 3 cơ sở đã lựa chọn

* Cách chọn mẫu nghiên cứu

+ Nhóm tiếp xúc: Sử dụng cách chọn mẫu chủ đích, toàn bộ người lao động trực tiếp tham gia sản xuất có tiếp xúc với nhóm BTEX được chọn từ 3 cơ sở sản xuất sơn với 140 công nhân, sau đó căn cứ vào tiêu chí chọn mẫu (bảng 2.1), chọn được