Tổng quan về các chất có hoạt tính sinh học trong thực vật

Hiện nay, người ta đã tìm được khoảng gần 6000 ancaloid và chủ yếu là các chất ít tan trong nước nhưng dễ tan trong các dung môi hữu cơ, nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như: Ancaloi

2 Tổng quan về các chất có hoạt tính sinh học trong thực vật

2.1 Ancaloid

Ancaloid là một hợp chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp mà mỗi phân tử của nó đều chứa ít nhất một nguyên tử nitơ dưới dạng dị vòng Do đó, nó là nhóm các hợp chất không thuần khiết về mặt hoá học Hiện nay, người ta đã tìm được khoảng gần 6000 ancaloid

và chủ yếu là các chất ít tan trong nước nhưng dễ tan trong các dung môi hữu cơ, nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như:

Ancaloid có tác dụng sinh lý đối với cơ thể sống của con người và động vật theo chiều hướng tích cực lẫn tiêu cực Để nghiên cứu định tính ancaloid, người ta thường dùng các phương pháp sau: Phản ứng Wagner, phản ứng nhận biết với thuốc thử dragendooc, phản ứng với dung dịch acid pyric

Các phương pháp chiết suất ancaloid bằng dung môi thường dùng hiện nay: Chiết bằng dung môi hữu cơ, chiết bằng dung dịch nước acid, cồn

2.2 Flavonoid

Flavonoid là dẫn xuất của phenol có hầu hết ở người, động thực vật và vi sinhvật do đưa trực tiếp vào từ nguồn thức ăn Bản thân con người không có khả năng tự tổng hợp được phenol Flavonoid tham gia vào tất cả các quá trình trao đổi chất, sinh tổng hợp và quá trình enzym Về mặt cấu tạo, flavonoid là các polyphenol có tính acid, đính nhóm hydroxy tự do ở các vòng

Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với glucid (glycosid) Trong đó, dạng aglycol thưòng tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng glycosid thì tan

trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực

như aceton, benzen, cloroform

Hoạt tính sinh học của flavonoid: Có tác dụng với khối u và

một số dạng ung thư như enpatin (3,5,3'-trihydroxy-6,7,4'-trimetoxyflavon), enpatoretin (3,3'-dihydroxy -5,6,7,4'-tetrametoxyflavon); Nâng cao tính bền của thành mạch máu như rutin; Có tác dụng estrogen như glycosid quecxetin và kaempferol-3-3-ramnogalacto-7-ramnorid Ngoài các tác dụng trên, flavonoid còn có các tác dụng khác như: chống dị ứng, chống co giật, giãn phế quản, giãn mạch, lợi mật, giảm đau và có tác dụng diệt nấm Một số dẫn chất của flavonoid có tác dụng thông tiểu như quercetin (có trong lá diếp cá), kháng khuẩn như acvicularin Đặc biệt, flavonoid còn có hoạt tính vitamin P, làm bền những mao mạch và giảm tính giòn của thành mạch

Các kết quả nghiên cứu khoa học đã kết luận rằng: tác dụng sinh học của flavonoid là do khả năng chống oxy hoá của chúng quy định Do khả năng ức chế quá trình oxy hoá nênchúng có hiệu ứng chống u lành tính và u ác tính Các flavonoid còn được ứng dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng như chống viêm loét dạ dày, viêm mật cấp tính và mãn tính, viêm gan, thận, thương hàn, lị

2.3 Glycosid trợ tim

Glycosid trợ tim là một nhóm glycosid có cấu trúc steroid,

có tác dụng đặc hiệu đối với bệnh tim nhưng với liều cao chúng là các chất gây độc Trong cây, chúng tồn tại ở dạng glycosid hoà tan trong các dịch tế bào Dưới tác dụng của enzym hay acid loãng, các glycosid bị thuỷ phân tạo thành các genin và các ose Là glycosid nên chúng tan nhiều trong nước và cồn loãng, ít tan trong các dung môi không phân cực như ete, dầu, benzen

Tác dụng của glycosid tim làm tăng sức co bóp của cơ tim cả

ở người lành lẫn người bệnh; làm tăng trương lực cơ tim: làm ngắn chiều dài của các sợi cơ tim đã bị căng, giãn do vậy làm tăng trương lực cơ tim, giảm thể tích và kích thước tim; làm chậm nhịp tim: do vừa có tác dụng trên dây thần kinh phế vị, vừa làm giảm tính tự động của nút xoang; làm giảm dẫn truyền trong nhĩ, đặc biệt nút nhĩ thất; làm giảm tính kích thích của cơ tâm nhĩ, nhưng trái lại, làm tăng tính kích thích của cơ tâm thất; gây lợi tiểu nhẹ do giảm tái hấp thu natri ở ống lượn gần

2.4 Coumarin

Coumarin là nhóm hợp chất tự nhiên, được xem là dẫn xuất lacton củab axit octo-hydroxy xinamic Đến nay đã xác định được khoảng 600 chất và coumarin tồn tại trong cây chủ yếu dưới dạng

tự do Ví dụ như:

Coumarin được dùng để làm thuốc chống đông máu Ngoài ra một số coumarin có tác dụng làm giãn động mạch vành [1], [2] và mạch ngoại vi Đồng thời có tác dụng chống co thắt Một số chất

có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật, tác dụng kháng khuẩn, diệt nấm, chống viêm

2.5 Terpenoid

Terpenoid là nhóm chất hữu cơ thiên nhiên không no có công thức chung là (izo-C5H8)n (n>=2) Ngoài các hydrocacbon không no, các dẫn xuất của chúng như ancol, andehyd, ceton, cacboxylic acid cũng được gọi là tecpen Tuỳ theo số nguyên tử cacbon trong mạch hydrocacbon, người ta phân chúng thành các nhóm: monoterpen, secpuiterpen, diterpen, triterpen, tetraterpen, polyterpen Trong đó monoterpen là quan trọng nhất trong terpenoid Nó có cấu trúc mạch hở, mạch vòng

Các terpenoid có chứa nhiều trong thực vật như secpuiterpen, diterpen và triterpen có chứa trong tinh dầu, nhựa của thực vật bậc

cao, polyterpen là thành phần chính của các cao su tự nhiên.Chính

vì do dặc điểm cấu tạo của chúng nên các terpenoid có tác dụng làm thông mạch và làm tăng độ đàn hồi của cơ tim và thành mạch

2.6 Steroid

Là những hợp chất thiên nhiên có bộ khung cacbon stenan gồm bốn vòng ngưng tụ với nhau, chứa các mạch bên và các nhóm chức khác nhau như: CO, -CHO, -COOH, -OH Steroid tồn tại trong động , thực vật dưới dạng glycosid hoặc liên kết với các cacbon acid amin

Các steroid tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống Cho đến nay, người ta đã biết đến hàng chục nghìn sterod và trong số đó có hàng trăm chất được sử dụng trong y học Một số chất tiêu biểu:

2.7 Saponin

Saponin được dùng để chỉ nhóm glycosid có đặc tính chung là khi hoà tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt Dưới tác dụng của các enzym thực vật, vi khuẩn, hoặc acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần glucid

Phần glusid gồm các ose phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-mannose và L-arabinose Phần sapogenin gồm hai nhóm lớn là saponin triterpen và saponin steroid Trong đó, saponin steroid phânbố tập trung ở cây một lá mầm còn saponin triterpen phân bố rộng nhưng tập trung chủ yếu ở cây hai lá mầm Về mặt hoạt tính sinh học, saponin cung cấp nhiều loại thuốc quan trọng với một số tác dụng chính như sau: Tác dụng bổ, tăng cường sinh lực (saponin

có trong họ nhân sâm); Tác dụng long đờm, dịu ho (có trong cam thảo, viễn chí); Giảm đau nhức khớp xương (có trong ngưu tất, cỏ xước), hạ cholesterol trong máu

xem tiếp: phần 2

3 Vật liệu và thực nghiệm

3.1 Vật liệu, phương tiện sử dụng trong

nghiên cứu:

Máy cất quay chân không, cân điện tử có độ chính xác tới 10-3 , dụng cụ bằng thuỷ tinh: Bình cầu, cốc, ống sinh hàn,

Thuốc thử thích hợp như NH3, CHCl3, HCl,

Mayer, Dragendooc, Axit Pycric, H2SO4…

Các dung môi chiết xuất dùng trong nghiên cứu: Nước tinh khiết, cồn, Cloroform, Etyl Acetat

3.2 Thực nghiệm

3.2.1 Nguyên tắc chung.

Trong quá trình nghiên cứu hoá thực vật cần phải tôn trọng nguyên tắc chung là không được làm thay đổi cấu trúc hoá học có sẵn trong thực vật và không làm ảnh hưởng đến thành phần hoá học của chúng tại thời điểm lấy mẫu Như vậy, ngay sau khi thu hái mẫu xong, cần phải tiến hành diệt men để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo

Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ… Tuy nhiên có hai

phương pháp phổ biến hơn cả để tách các chất ra khoir thực vật

Cách 1: Trước tiên, chiết bằng dung môi rượu -nước để tách hầu hết các chất ra khỏi thực vật Sau

đó, chiết sang lọc bằng các dung môi từ không phân cực đến phân cực Các dung môi chiết chứa các hợp chất hữu cơ có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đưổi dung môi, bảo quản dung cho các quá trinh

tách tiếp theo

Cách 2: Chiết và phân lập các chất trong mẫu thực vật bằng các loại dung môi từ không phân cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-

hexan, clorofom, etylaxetat, n- butanol, methanol, etanol- nước

3.2.2 Định tính các nhóm hợp chất

a Định tính alcaloid

Định tính alcaloid trong cây, chúng tôi đã tiến hành như sau: lấy khoảng 10g nguyên liệu khô, sau

đó được tẩm bằng hơi NH3 trong bình hút ẩm cho vào bình tam giác và rót vào khoảng 60ml CHCl3 lắc đều rồi để yên Sau đó dịch chiết được lọc và chuyển vào phễu chiết Tiếp theo cho vào dung dịch này khoảng 10ml HCl 10%, hỗn hợp này được lắc cẩn thận trong vài phút rồi để yên, sau đó chiết lấy phân trên (phần tan trong dung dịch HCl) Lấy phần dung dịch này để thử định tính

- Để định tính có thể dùng các thuốc thử sau

+ Thuốc thử Dragendoff: cho vài giọt thuốc thử này vào dung dịch cần định tính nếu thấy kết tủa màu da cam thì chứng tỏ có alcaloid

+ Thuốc thử Wagner: cho vài giọt thuốc thử này vào dung dịch cần định tính nếu thấy có eets tủa màu nâu chứng tỏ có alcaloid

Kết quả: có alcaloid.

b Định tính flavonoid

Cho khoảng 5 gam nguyên liệu đã giã nhỏ vào bình cầu, sau đó thêm khoảng 50ml cồn 95% và đun trên bếp cách thuỷ cho đến sôi, lắc bình vài lần, đóng nút bình lại và để khoảng 3 – 4 h (có thể để qua đêm) dịch chiết còn lại được rót ra và cô đặc lại đến còn khoảng 15ml Được chia làm 3 phần và

chuyển vào trong 3 ống nghiệm

- Phản ứng xianidin: thêm vào ống nghiệm thứ nhất khoảng 3ml dung dịch HCl đặc và một mảnh kim loại

Mg, quan sát trong 10 phút, nếu có màu từ vàng, đỏ, xanh thì chứng tỏ có flavonoid Thêm vào ống

nghiệm thứ 2 khoảng 2ml dung dịch HCl, đun cách thuỷ 5 phút nếu có màu đỏ

Ống thứ 3 làm đối chứng

- Phản ứng với thuốc thử : FeCl31%+K3[Fe(CN)6] dung dịch cho màu xanh thẫm

- Phản ứng với H2SO4 cho màu hồng nhạt

Kết quả: có flavonoid.

c Định tính Coumarin

Trong bình cầu trộn khoảng 10 gam nguyên liệu khô đã giã nhỏ, thêm khoảng 80ml cồn 95%, đun sôi trên bếp cách thuỷ và để lại 3 – 4h, luôn lắc trộn Dịch chiết được gạn lọc và làm bay hơi còn

khoảng 5ml Tiến hành phản ứng sau:

Trong 2 ống nghiệm, rót 2ml dịch chiết cồn, mỗi ống nghiệm thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% Sau đó đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thuỷ và làm lạnh Trong mỗi ống rót vào khoảng 4ml nước cất Nếu như trong ống đã được thêm kiềm và nước trong suốt hơn so với ống nghiệm không có kiềm, có thể khẳng định có phản ứng lacton Khi axit hoá

bằng vài giọt HCl đặc thì thấy xuất hiện màu vàng đục hoặc kết tủa bông thì kết luận có cumarin

Kết quả: có coumarin.

d Định tính saponin

Để xác định saponin trong mẫu chúng tôi làm như sau: lấy vài gam nguyên liệu đã nghiền nhỏ, lắc mạnh với 5 – 10ml nước, dấu hiệu đầu tiên có

saponin là xuất hiện bọt bền vững

+ Bọt bảo toàn 15 phút

++ Bọt bảo toàn 30 phút

+++ Bọt bảo toàn trên 60 phút

Có thể xác định sơ bộ saponin steroid và

saponin triterpen như sau: lấy khoảng 0,5 gam

nguyên liệu khô và nghiền nhỏ, thêm vào 5ml nước cất Hỗn hợp được đun nóng trong ống nghiện đến sôi trên bếp cách thuỷ, làm lạnh và lọc lấy nước Để xác định sự có mặt của saponin ta lấy 2 ống nghiệm Trong ống 1, thêm 5ml dung dịch HCl 0,1N (pH = 1), ống nghiệm 2 thêm vào 5ml dung dịch NaOH 0,1N (pH = 13).Trong cả 2 ống nghiệm thêm vào 2 – 3 giọt nước sắc và lắc thật mạnh trong khoảng 1 phút

Nếu như trong cả 2 ống nghiệm bọt được tạo thành bằng nhau cả về kích thước, số lượng và sự bền vững của cột bọt thì nguyên liệu chứa saponin triterpen Nếu như ở pH = 13 bọt lớn hơn một vài lần

về số lượng và sự bền vững thì nguyên liệu chứa saponin steroit

Kết quả: có saponin steroid.

e Định tính glycosid tim

Lấy 10 gam nguyên liệu khô đã giã nhỏ vào bình tam giác thêm vào 100ml cồn 20 – 30% và để lại sau 1 ngày, thỉnh thoảng khuấy trộn,l sau đó lọc thu được dịch chiết Để tủa chất bẩn trong dịch chiết

ta tiến hành tuả lần lượt bằng chì axetat và dung dịch natrisunfat bão hoà Từ dung dịch đã lọc bỏ chất bẩn lấy các glycozet ra bằng hỗn hợp CHCl3 và cồn (3:1), phân đoạn khoảng 20ml dịch chiết CHCl3 - cồn của các glycosid được làm khô bằng natrisunfat khan và lọc vào bình cầu Chưng cất thu hồi dung môi đến khô trên bếp cách thuỷ

Hỗn hợp các glycosid thu được từ cách điều chế trên được xác định bằng phản ứng định tính

Keller – Kiliani: trong 2ml axit acetic băng chứa oxit sắt ( trộn 99ml axit axetic băng với 1ml dung dịch FeCl3 5%) được hoà tan 1 -2 mg glycosid, dung dịch được chuyển sang theo thành ống nghiệm của một ông nghiệm khác chứa sẵn 2ml H2SO4 đặc sao cho phân làm hai lớp, ở giới hạn hai lớp xuất hiện màu nâu hoặc nâu đen, ở trên mặt vành màu nâu từ từ xuất hiện lớp màu xanh lục hoặc xanh trong vòng 1 – 2 phút thì kết luận có glycosid tim

Kết quả: có glycosid tim

f Định tính đường

Nguyên liệu được nghiền nhỏ, ngâm trong cồn 90%, chiết lấy dung dịch, thêm 50ml dung dịch vào ống nghiệm sau đó thêm 3ml dung dịch thuốc thử Fellinh, đun sôi 3 phút, nếu có kết tủa đỏ gạch thì chứng tỏ có đường khử

Kết quả: có đường khử.

g Định tính cyanua

Dùng giấy lọc tẩm dung dịch axit picric 1% để

1-2 phút, sau đó nhúng giấy vào dung dịch Na1-2CO3 rồi

để cho giấy khô Bình cầu đụng nguyên liệu tươi đã được nghiền nhỏ trộn với axit lactric, đậy bình cầu bằng nút cao su có cắm sinh hàn khí Treo giấy picrat vào trongn bình đó, đun bình trên bếp cách thuỷ sau một thời gian nếu thấy giấy picrat chuyển

sang màu vàng nâu chứng tỏ nguyên liệu có chứa cyanua

Kết quả: có cyanua.

3.2.3 Định lượng các nhóm hợp chất bằng phương pháp trọng lượng

a Phương pháp xác định hàm lượng chất hoà tan

Nguyên liệu được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, sau đó giã nhỏ cân chính xác khối lượng gói vào giấy lọc, cho vào cốc, cho thêm nước cất với thể tích nước mỗi lần như nhau, rồi đun trên bếp cách thuỷ ở 100oC Chiết gạn nhiều lần đến khi cân phần bã đã sấy khô thấy khối lượng không đổi là được Hàm lượng chất hoà tan theo công thức sau:

Y (%) = [(m-n)/m] * 100

Y: Phần trăm hàm lượng chất hoà tan (%) m: Khối lượng mẫu khô ban đầu (g)

n: Khối lượng mẫu sau khi hoà tan và sấy khô (g)

b Phương pháp định lượng các chất tan tan trong dung môi etylacetat

Nguyên liệu khô được chiết trong thiết bị soxhlet với dung môi là C2H5OH 70%, kết thúc chiết khi dịch được chiết trở thành không màu Dịch chiết cồn bằng

thiết bị soxhlet được lọc qua giấy lọc để loại bỏ vụn dược liệu, sau đó cô đặc bằng cách thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Dịch chiết đặc này được chiết lại bằng nước nóng và clorofom (CHCl3) nhiều lần để loại tạp chất màu và chất béo Phần tan trong nước được chiết tiếp với etylacetat nhiều lần Thu được dịch chiết etylacetat màu vàng (sau khi loại dịch nước) Dịch chiết này được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ta sẽ thu được cặn , sấy cặn ở 500C, ta thu được cao toàn phần

Hàm lượng được xác định theo công thức sau:

Trong đó: X(%)=(b/a)*100 (1)

a: Trọng lượng nguyên liệu khô (g).

b: Trọng lượng cao sấy khô (g).

X: Hàm lượng cao etylacetat trong dược

liệu khô (%)

c Phương pháp định lượng các chất tan tan trong dung môi clorofom.

Lấy dịch chiết cồn 70% thu được ở trên, ngâm với HCl 6N ,sau 12 giờ, ta cho NH3 vào đến khi pH của dung dịch khoảng 10-13, sau đó chiết với CHCl3 cho đến khi dịch chiết không màu, thu hồi CHCl3 dưới áp suất giảm, ta thu được cao, đem sấy cao ở 500C và xác định khối lượng theo (1)