Ứng dụng enzyme và siêu âm phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma lucidum

Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi Li JJ và cộng sự 2014 .... Theo các tài liệu nghiên cứu, nấm Linh chi có nhiều công dụng trong việc hỗ trợ điều hòa

ĐOÀN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH

BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH

-

CÔNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA

LẦN THỨ XX NĂM 2018

TÊN CÔNG TRÌNH: ỨNG DỤNG ENZYME VÀ SIÊU ÂM PHÁ VÁCH BÀO TỬ

NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM)

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

Mã số công trình: ………

(Phần này do BTC Giải thưởng ghi)

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

TÓM TẮT 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 2

1 Lí do chọn đề tài 2

2 Mục đích 3

3 Mục tiêu 3

4 Nội dung 3

5 Đối tượng nghiên cứu 3

6 Phạm vi nghiên cứu 3

7 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn, quy mô và phạm vi áp dụng 3

7.1 Ý nghĩa khoa học 3

7.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 5

1.1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi 5

1.1.1.1 Phân loại 6

1.1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi 9

1.1.2 Bào tử nấm Linh chi 11

1.2 Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 14

1.2.1 Các polysaccharide và peptidoglycan 17

1.2.2 Triterpenes 18

1.2.3 Saponin 24

1.2.4 Acid béo 25

1.2.5 Các thành phần khác 26

1.3 Công dụng của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 27

1.3.1 Phòng chống ung thư 28

1.3.2 Khả năng kháng oxi hóa 30

1.3.3 Điều trị bệnh đái tháo đường 30

1.3.4 Điều trị các bệnh về tim mạch 31

1.3.5 Tăng cường hệ miễn dịch 31

1.4 Phương pháp phá vỡ và trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi 32

1.4.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma 32

1.4.1.1 Phân loại 33

1.4.1.2 Đặcđiểm chung của Trichoderma 33

1.4.1.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma 36

1.4.1.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh enzyme tổng hợp 36

1.4.2 Giới thiệu về enzyme thương mại 41

1.4.3 Cơ chế phân hủy chitin trong vách bào tử nấm Linh chi 41

1.4.4 Giới thiệu về siêu âm phá tế bào 42

1.4.4.1 Khái niệm 42

1.4.4.2 Bản chất của sóng âm 43

1.4.4.3 Nguyên lý tác động của sóng siêu âm 44

1.4.4.4 Tác động của sóng siêu âm lên tế bào 45

1.4.4.5 Ứng dụng của sóng siêu âm 46

1.4.4.6 Thiết bị phát sóng siêu âm 46

1.4.5 Các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi 48

1.4.6 Phương pháp trích ly hoạt chất thu dầu bào tử 51

PHẦN II: MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56

2.1 Mục tiêu 56

2.2 Phương pháp nghiên cứu 56

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 56

2.2.2 Thiết bị - dụng cụ - hóa chất 56

2.2.2.1 Thiết bị 56

2.2.2.2 Dụng cụ 57

2.2.2.3 Hóa chất 57

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 59

2.2.4 Khảo sát enzyme của T harzianum T2 và chế phẩm thương mại C20032 62

2.2.5 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 62

2.2.5.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 trên môi trường thạch PDA 62

2.2.5.2 Thu enzyme dịch trích ly bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường lỏng 62

2.2.5.3 Phương pháp xác định hoạt lực enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy T.harzianum T2 và chế phẩm enzyme C20032 62

2.2.6 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và enzyme chế phẩm C20032 64

2.2.7 Phương pháp xác định tỷ lệ kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và chế phẩm thương mại cellulase C20032 66

2.2.8 Khảo sát nồng độ tối ưu của chế phẩm thương mại cellulase C20032 kết hợp với dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 68

2.2.9 Khảo sát thời gian xử lí enzyme và siêu âm thích hợp để phá vỡ bào tử 68

2.2.10 Khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử 70

2.2.11 Khảo sát thành phần hóa học bào tử phá vỡ 71

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 74

3.1 Khảo sát hiệu quả xử lí bào tử nấm Linh chi khi có sự kết hợp giữa chế phẩm thương mại cellulase C20032 và dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harziamum T2 74

3.1.1 Kết quả định tính và định lượng các enzyme có trong chế phẩm thương mại cellulase C20032 và dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harziamum T2 74

3.1.1.1 Kết quả định tính các enzyme trong chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% và Trichoderma harziamum T2 74

3.1.1.2 Kết quả định lượng các enzyme có trong dịch nuôi cấy T harziamum T2 và chế phẩm thương mại C20032 (10%) 75

3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt lực enzyme chitinase của dịch nuôi cấy

T.harzianum T2 76

3.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động của enzyme chitinase trong chế phẩm C20032 (10%) 77

3.1.4 Ảnh hưởng các tỉ lệ phối hợp giữa enzyme T harzianum T2 và enzyme thương mại lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi theo thời gian ủ enzyme 78

3.1.5 Kết quả tỉ lệ bào tử nấm Linh chi bị phá vỡ khi thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 80

3.2 Tăng tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi kết hợp xử lý enzyme và sóng siêu âm 82

3.3 Kết quả ảnh hưởng của phương pháp tiền xử lý bằng lạnh đông lên tỉ lệ phá vỡ bào tử 85

3.4 Kết quả định tính định lượng thành phần có trong bào tử nấm Linh chi 87

3.4.1 Định lượng các hoạt chất thu được từ dịch bào tử và bào tử bị phá vỡ 88

3.4.1.1 Định lượng polysaccharide trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu âm và mẫu kết hợp siêu âm bằng phương pháp Phenol – Sulfuric 88

3.4.1.2 Định lượng lipid trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu âm và mẫu siêu âm bằng phương pháp Adam – Rose – Gottlieb 91

3.5 Đề nghị quy trình phá vỡ bào tử nấm Linh chi thu hoạt chất 93

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 96

4.1 Kết luận 96

4.2 Kiến nghị 97

TÀI LIỆU THAM KHẢO 98

Tài liệu tiếng Việt 98

Tài liệu tiếng Anh 98

PHỤ LỤC A – VẬT LIỆU 1

PHỤ LỤC B – PHƯƠNG PHÁP 5

PHỤ LỤC C – MỘT SỐ HÌNH ẢNH KẾTQUẢ 11

PHỤ LỤC D – KẾT QUẢ XỬ LÍ ANOVA 15

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

PDA: Potato Dextro Agar

EC: Enzyme Cellulase C20032

DD: Dung dịch

DTL: Dịch trích ly

DNC: Dịch nuôi cấy

ĐC: Đối chứng

KSA: Không siêu âm

SA: Siêu âm

PHC: Pha hữu cơ

PN: Pha nước

DI: Diethyl ether

BT: Bào tử

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác nhau (Lê Xuân Thám, 1996) 11 Bảng 1.2 Thành phần dược tính của nấm Linh chi 14 Bảng 1.3 Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li

JJ và cộng sự (2014)) 16 Bảng 1.4 So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2,5 mg/mL) 29 Bảng 1.5 Những nghiên cứu về phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi trên Thế giới 49 Bảng 1.6 Các phương pháp trích ly 51

Bảng 1.7 Các dung môi trong chiết xuất lipid của Ganoderma lucidum (CN1099455C)

54 Bảng 2.1 Bảng dựng đường chuẩn glucosamine 62 Bảng 2.2 Bảng bố trí thay đổi tỉ lệ enzyme dịch nuôi cấy và chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% 67 Bảng 2.3 Bảng bố trí thay đổi tỉ lệ nồng độ chế phẩm thương mại cellulase C20032 (xác định tỉ lệ E/S tối ưu) 68 Bảng 3.1 Vòng phân giải các enzyme có trong chế phẩm thương mại C20032 và dịch

nuôi cấy T harziamum T2 74 Bảng 3.2 Kết quả định lượng các enzyme có trong dịch nuôi cấy Trichoderma harziamum T2 và chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% 75

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hoạt lực enzyme chitinase ở điều kiện nhiệt độ và pH thay đổi 76 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hoạt lực enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% điều kiện pH 5 77

Bảng 3.5 So sánh tỉ lệ phá vỡ giữa các tỉ lệ enzyme trong một mốc thời gian 78

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm thương mại cellulase C20032 kết hợp

enzyme T.harzianum T2 lên hiệu quả phá vỡ bào tử nấm Linh chi theo thời gian 80

Bảng 3.7 Bảng tổng hợp tỉ lệ phá vỡ của bào tử nấm Linh chi theo ngày và thời gian siêu

âm 83 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của chế độ lạnh động tiền xử lý lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi 85 Bảng 3.9 Bảng tổng kết các thử nghiệm tất cả các pha khi trích ly dịch phá vỡ bào tử

và vỏ bào tử 87 Bảng 3.10 Bảng mật độ quang của dịch D-glucose chuẩn 89 Bảng 3.11 Hàm lượng polysaccharide có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm (Hiệu suất thu hồi polysaccharide) 89 Bảng 3.12 Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide trong hai pha khi trích ly lỏng lỏng dịch phá vỡ bào tử bằng diethyl ether từ 100 g bào tử không siêu âm và siêu

âm 91 Bảng 3.13 Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm (hiệu suất thu hồi lipid tổng) 91

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A), nấm mọc trong tự nhiên (B) và

nấm trồng (C) 6

Hình 1.2 Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum 11

Hình 1.3 Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần 13

Hình 1.4 Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh chi 13

Hình 1.5 Cấu trúc của Ganodermasides 16

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi 18

Hình 1.7 Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự, 1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48: 2905-7; Sato và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari và cộng sự, 1989) 20

Hình 1.8 Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự, 2011) 22

Hình 1.9 Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự, 2011) 23

Hình 1.10 Các dạng sản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 28

Hình 1.11 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường thạch dịch chiết khoai tây (PDA) 33

Hình 1.12 Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum 34

Hình 1.13 Cấu trúc chitin 38

Hình 1.14 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 34

Hình 1.15 Cấu tạo cellulose 40

Hình 1.16 Quá trình phân hủy chitin thành chitosan và cellulose 42

Hình 1.17 Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí 45

Hình 1.18 Thiết bị phát sóng siêu âm dạng thanh 47

Hình 1.19 Máy phá mẫu, tế bào bằng sóng siêu âm Qsonica Q500 48

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 61

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ và pH tối ưu 65

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy và chế

phẩm thương mại cellulase C20032 10% 67

Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát thời gian siêu âm 69

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử 70

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học 72

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt lực chitinase trong dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 77

Hình 3.2 Hoạt lực enzyme chitinase có trong chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% điều kiện pH 5 78

Hình 3.3 So sánh tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm Linh chi khi thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm thương mại cellulase C20032 10% theo thời gian 80

Hình 3.4 Tỷ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi khi thay đổi nồng độ chế phẩm thương mại 81

Hình 3.5 Vòng phân giải của hỗn hợp enzyme trên đĩa thạch chứa chitin theo thời gian ủ với bào tử: a)Ngày 0; b) Ngày 3; c) Ngày 7, d) Ngày 9; e) Ngày 10 82

Hình 3.6 So sánh tỉ lệ phá vỡ của bào tử nấm Linh chi sau khi xử lý bằng enzyme và siêu âm ở các mức thời gian khác nhau 84

Hình 3.7 a) Bào tử nấm Linh chi trước khi xử lý enzyme; b) Sau khi xử lý enzyme T.harzianum T2 + C20032 10% tỉ lệ 1:1 ở 500C sau 10 ngày; c) Sau xử lý enzyme kết hợp siêu âm 86

Hình 3.8 Biểu đồ polysaccharide tổng (%) có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm 90

Hình 3.9 Biểu đồ hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm 92

Hình 3.10 Biểu đồ hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm 94

TÓM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này là xác định phương pháp phá vách bào tử nấm Linh Chi

Ganoderma lucidum Enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 và

chế phẩm thương mại Cellulase C20032 hoạt động tối ưu ở 500C và pH 5 Tỉ lệ phá vỡ

vách bào tử bào tử nấm Linh Chi Ganoderma lucidum khi kết hợp enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và chế phẩm thương mại cellulase C20032 ở 500C, pH 5 trong 10 ngày là 53,5% Sau khi xử lý enzyme, áp dụng chế độ siêu âm công suất 500 W trong 5 phút ở độ khuếch đại 100% tăng tỉ lệ phá vỡ bào tử lên đến 71,7% Tiền xử lý bào

tử trước khi thực hiện phản ứng enzyme là bước không thể thiếu, tuy nhiên không có sự khác biệt về hiệu quả phá vỡ vách bào tử giữa 4 điều kiện nhiệt độ là -40C, -200C, -700C (

đá khô) và -1960C (nitơ lỏng).Sau khi phá vỡ bào tử bằng enzyme, dịch trong sau ly tâm chứa 12,03% polysaccharide và 50,5% lipid tổng, trong khi đó từ phần vỏ bào tử chỉ thu được 0,04% polysaccharide và 1,08% lipid tổng Sau khi phá vỡ bào tử bằng enzyme kết hợp siêu âm, dịch trong sau ly tâm chứa 16,80% polysaccharide và 86,17% lipid tổng, trong khi đó từ phần vỏ bào tử chỉ thu được 0,03% polysaccharide và 6,75% lipid tổng Quy trình phá vỡ bào tử nấm linh chi bằng enzyme kết hợp siêu âm và thu hồi hoạt chất từ bào tử phá

vỡ được đề nghị

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Lý do chọn đề tài

Từ xưa đến nay, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được cho là một loại dược liệu

và đã có không ít người sử dụng làm thuốc Theo các tài liệu nghiên cứu, nấm Linh chi có nhiều công dụng trong việc hỗ trợ điều hòa huyết áp, tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể,

hỗ trợ giải độc và cải thiện bệnh viêm gan mãn tính, xơ gan, thần kinh suy nhược.Có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt chất và xác định tác dụng dược lý của nấm Linh chi như: Germanium, acid ganoderic, acid ganodermic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans, adenosin, ß – D – glucan… (đặc biệt trong nấm Linh chi có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 - 8 lần) Các nhà khoa học Việt Nam tìm thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự vận hành và chuyển hóa của cơ thể như: đồng, sắt, kalium, magnesium, natrium, calcium Trong đó, triterpenoid

và polysaccharide được xem là thành phần chủ yếu có trong nấm được chú ý nhiều nhất Chính vì lí do đó mà hiện nay việc trồng và sử dụng nấm Linh chi đang trở nên rất phổ biến

và được nhiều người quan tâm

Bên cạnh đó, phần bào tử do nấm Linh chi phóng thích ra cũng có nhiều công dụng

bổ ích nhưng lại ít được quan tâm nghiên cứu trích ly hoạt chất Bào tử nấm Linh chi được cho là tinh chất của nấm Linh chi chứa nhiều chất dinh dưỡng và các đặc tính dược lý, là sản phẩm rất tốt cho sức khỏe Tuy nhiên, cấu tạo bào tử nấm Linh chi gồm 2 lớp vỏ cứng, việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi để thu triệt để hoạt chất bên trong bào tử là điều đáng được quan tâm

Ngày nay đã có các phương pháp nghiên cứu phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng cơ học kết hợp enzyme… Phương pháp phá vỡ sử dụng biện pháp cơ học vẫn chưa mang lại hiệu quả tối ưu Theo nghiên cứu của Ma Jingjing và cộng sự từ trường Đại học Vũ Hán, Trung Quốc (2007), vách bào tử nấm Linh chi chứa 57,64% là chitin, cellulose, canxi… Do đó việc sử dụng enzyme chitinase và cellulase trong việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi là bước không thể thiếu Để góp phần tăng hiệu suất phá vách bào tử nấm Linh chi đồng thời chiết

xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào tử, nhóm chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm

Trichoderma harzianum T2 kết hợp với enzyme thương mại Cellulase C20032 và sóng siêu

âm Đó là lí do chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng enzyme và siêu âm phá vách bào

tử nấm Linh chi (Ganoderma licidum)”

2 Mục đích: Thu hồi hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi

3 Mục tiêu: Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma licidum kết

hợp enzyme và siêu âm

4 Nội dung:

- Sử dụng enzyme phá vỡ bào tử nấm Linh chi (tìm nguồn enzyme, xác định nhiệt

độ tối ưu và pH tối ưu enzyme, tỉ lệ enzyme cơ chất thích hợp)

- Áp dụng siêu âm sau khi phá vỡ bằng enzyme (theo dõi tỉ lệ phá vỡ theo thời gian khi siêu âm)

- Xác định chế độ tiền xử lý lạnh đông mang lại hiệu quả cho việc xử lý phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi

- Phân tích định tính và định lượng các thành phần chính trong bào tử phá vỡ nhờ enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm

- Thiết lập được quy trình phá vỡ bào tử kết hợp enzyme và siêu âm thu hoạt chất

5 Đối tượng nghiên cứu: Bào tử nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

6 Phạm vi nghiên cứu: quy mô phòng thí nghiệm

7 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn, quy mô và phạm vi áp dụng

Cung cấp quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi, là tiền đề phát triển cho hướng chiết xuất thu dầu bào tử nấm Linh chi ứng dụng trong việc sản xuất thuốc chữa bệnh Cung cấp thông tin về thành phần polysaccharide tổng và lipid tổng của bào tử phá

vỡ bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

1.1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi

Nấm Linh chi (tiếng Anh: Lingzhi mushroom) có tên khoa học là Ganoderma lucidum,

thuộc họ Nấm Lim (Ganodermataceae) Nấm Linh chi còn có những tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung được phân bố rộng rãi ở các nước Á Đông và thường mọc trên các thân cây khô hoặc đã chết Ở một số nước Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan… nấm Linh chi được sử dụng như một loại dược thảo thiên nhiên giúp cải thiện sức khỏe, tăng cường khả năng kháng tế bào ung thư Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏ

ngoài nhẵn bóng và nhìn giống như một khúc gỗ Trong tiếng Latin thì lucidus có nghĩa là

“sáng bóng” hay “rực rỡ” và điều này cũng tương thích với hình dáng bên ngoài của nấm Linh chi Ở mỗi nơi nấm Linh chi được gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan) Ngoài ra còn một số tên gọi khác như nấm vạn niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc) Theo

2 cuốn sách rất nổi tiếng mô tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing – Thần Nông Bản Thảo Kinh” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán), tác phẩm chuyên tập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật từ đời Hán trở về trước và

“Ben Cao Gang Mil – Bản Thảo Cương Mục” của “Li Shi Zhen – Lí Thởi Trân” (1590 trước Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ Trong đó có hơn 250 loại nấm Linh chi được đề cập Tuy nhiên, trong các văn

bản cổ chỉ đề cập nhiều đến khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi đỏ

Hình 1.1 Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A),

nấm mọc trong tự nhiên (B) và nấm trồng (C)

1.1.1.1 Phân loại

Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010)

Giới: Nấm – Mycota hay Fungi Ngành: Nấm thật – Eumycota Ngành phụ: Basidiomycotina Lớp: Hymenomycetes

Lớp phụ: Hymenomycetidae Bộ: Ganodermatales

Họ: Ganodermataceae Chi: Ganoderma

Loài: Ganoderma lucidum

Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc và phương Tây) đã tìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra rất nhiều hệ thống để phân loại nấm Linh chi Những nhà nghiên cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm Linh chi thành rất nhiều loại khác nhau dựa vào thể quả cũng như hình dáng bên ngoài của nấm

Ở phương Tây, theo trình định danh có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này Kể từ lần đặt tên đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học Phần Lan

xác định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Kể từ đó nấm Linh chi đỏ đã

trở thành một đại diện tiêu biểu cho chủng loại nấm này Về sau, đặc điểm phân loại của nấm Linh chi đã được thay đổi bởi một số nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano

và Steyaert… Sau khi họ đã tìm ra những đặc tính khác của nấm Linh chi như các bào tử của nấm Linh chi có hình quả trứng, lớp ngoài của thành tế bào tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp trong của thành tế bào lại dày, màu vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ Cũng

từ đó, nấm Linh chi không còn được phân loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngoài nữa

Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu sắc và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi

- Xích Chi - Nấm Linh chi đỏ: còn được gọi là Đơn chi, Hồng chi có vị đắng, thường

được tìm thấy ở trên núi Huo Ganoderma lucidum là đại diện chính cho loài nấm này

Những đặc điểm của nấm Linh chi đỏ chính là nắp nấm có hình dạng giống như quả thận hoặc hình bán nguyệt, màu nâu đỏ Thân nấm có dạng giống như một thân cây, cùng màu hoặc đậm hơn so với nắp nấm Nấm Linh chi đỏ giúp ích tâm khí, chủ vị, tăng trí tuệ Sử dụng Linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh các bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực

- Tử chi - Nấm Linh chi tím: còn được biết đến với tên gọi là Linh chi gỗ, màu tím có

vị ngọt Đặc điểm của loại nấm này là nắp nấm có màu nâu hoặc nâu tím Thể quả có màu

nâu, bào tử của chúng lớn hơn nấm Linh chi đỏ Ganoderma sinense là đại diện của loài nấm này Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi đẹp

- Hoàng chi - Linh chi vàng: còn gọi là Kim chi, loại nấm này có màu vàng tím, có vị ngọt Một cây nấm lớn có thể nặng khoảng 5 kg hoặc hơn, còn cây nấm non thì nặng khoảng

1,5 đến 2 kg Laetiporus sulphureus là đại diện của loài nấm này Khi tươi thì nấm này sẽ

chứa rất nhiều nước, có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần

- Bạch chi - Linh chi trắng: còn gọi là nấm Linh chi ngọc bích, có màu trắng Theo như

Bao Puzi mô tả thì đây là loại nấm không có chất béo, Fomitopsis officinalis là đại diện cho

loài nấm này Loại nấm này có thể quả màu trắng, hình dáng giống như một cái móng ngựa Một cây nấm lớn có thể nặng đến nhiều kilogram Loại nấm này thường mọc trên cây thông

và một số loại cây lá kim khác Bạch chi có vị cay, tính bình, không độc, ích phế khí, chữa

ho nghịch hơi

- Hắc chi - Linh chi đen: còn gọi là nấm Linh chi xuân hay Huyền chi có màu đen và

vị mặn Loại nấm này thường mọc ở trong những thung lũng, nắp nấm bên ngoài có màu

đen bên trong có màu đỏ, thường mọc trên các thân cây, có vị mặn và đắng Amauroderma rugosum và Polyporus melanopus là 2 đại diện chính của loài nấm này Cả cuống và nắp của 2 loại nấm này đều có màu đen Hắc chi có tác dụng ích thận khí, khiến cho đầu óc sản

khoái và tinh tường

- Thanh chi – Linh chi xanh: còn gọi là nấm Linh chi rồng Theo Bao Puzi miêu tả thì

nấm Linh chi xanh có hình dáng giống như những sợi lông của chim bói cá Coriolus versicolar là đại diện tiêu biểu cho loài nấm này Đặc điểm của loài này là mũ nấm cứng

và bề mặt được bao phủ bởi những sợi lông ngắn Thanh chi giúp cho sáng mắt, giúp cho

an thần, bổ can khí, nhân thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái

Trong mỗi loài nấm Linh chi lại được chia ra rất nhiều loại khác nhau Ví dụ như nấm

Linh chi đỏ thì có Ganoderma lucidum và Ganoderma tsugae được biết đến nhiều nhất Đối

với Linh chi tím thì có Ganoderma neojaponicum và Ganoderma sinense Tuy nhiên, trong lĩnh vực trồng trọt, y dược và nha khoa, người ta chỉ tập trung nghiên cứu 2 loại đó là Linh

chi đỏ và Linh chi tím

Gần đây khi đã tìm ra được phương pháp gây giống, những nhà khoa học Nhật Bản chứng minh được rằng những cây nấm có màu sắc khác nhau không phải vì khác loại mà chỉ vì môi trường và điều kiện sống khác nhau Nếu thay đổi điều kiện người ta có thể có được sáu loại từ cùng một giống

Ngoài cách phân loại Linh chi theo màu sắc, người ta còn có thể phân loại Linh chi theo các đặc điểm như:

 Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 200C – 230C

 Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 240C – 260C

 Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 270C – 300C

Do đó, có thể thấy rằng Linh chi không những đa dạng về chủng loại mà còn đa dạng

về sinh thái, đây là loại nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N 189) Linh chi thuộc nhóm

nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại, từ khi xác lập một chi riêng là Ganoderma Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến nhất là Ganoderma lucidum có tới 45

loại

Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công trong

phòng thí nghiệm năm 1978 Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏ đặc sắc của các rừng cây Lim miền Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào nuôi trồng chủ động

1.1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi

Về hình thái ngoài, chúng cũng có ít nhiều sai khác:

- Cuống nấm: dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống nấm ít

phân nhánh, đôi khi uốn khúc Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen, bóng, không

có lông phủ trên mặt tán nấm

- Mũ nấm: khi non hình trứng, lớn dần hình quạt Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi khi

xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng

xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu đen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có đầu sợi dày thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 – 10 μm Chính những tế bào vỏ này tạo nên lớp vỏ bền vững

và bóng như vecni cho nấm Lớp vỏ láng phủ suốt theo cuống Kích thước tán biến động từ

2 – 30 cm, dày 0,8 – 2,5 cm, cuống dài từ 2,5 - 3,5 cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính

từ 0,5 – 2,2 cm) phần đính cuống hoặc gồ lên hoặc lõm như lõm rốn Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8 cm màu vàng kem – nâu nhạt – trắng Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh trong cồn Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm

chịu được mưa, nắng Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào

- Thụ tầng: Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 –

1,7 cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5 ống/mm Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, không màu, dài 16 - 22μm Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpore) phồng căng hay lõm thụt vào

mà thành

Hình 1.2 Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum

1.1.2 Bào tử nấm Linh chi

Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử, tức

là hạt giống hữu ích cho đời sau Bào tử thường được mô tả có dạng trứng cụt Đôi khi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn - nhọn Thực ra đó là do chụp phủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành Mỗi bào tử được bao phủ với hai lớp vách rất khó phá vỡ gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999), màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kích thước bào tử rất nhỏ dao động khoảng từ 6,5 x 8,0 µm đến 9,6 x 12,6 µm Vách đôi bào tử có độ dày 0,8 x 1,0 µm và 11 x

14 µm, có cấu trúc phức tạp Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vách rất cứng, khó nảy mầm (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016) Một số nghiên cứu về kích thước bào tử nấm Linh chi được trình bày trong bảng dưới đây (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác nhau (Lê Xuân Thám, 1996)

Nguồn Kích thước bào thử (μm) Vùng thu mẫu

1972, Steyaert 8,5 – 10,8 – 13 x 5,5 – 8,5 Indonesia, Úc châu

1976, Ryvarden 7 – 12 x 6 – 8 Bắc Âu, Phi châu

1980, Ryvarden và cộng

sự

7 – 12 x 6 – 8 Đông Phi châu

1994, Tham và cộng sự 8 – 10,5 x 5 x 7 Lạng Sơn, Việt Nam

Khi nấm Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào

tử bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất mịn Tuy vậy số lượng bào tử Linh chi rất ít Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ thu được 1

kg bào tử

Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu tạo tinh vi của bào tử thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt

a) b)

Hình 1.3 Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần

a) Bào tử nấm Linh chi chưa bị phá vỡ b) Bào tử nấm Linh chi bị phá vỡ vách

Hình 1.4 Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh chi 1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử)

2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻ múi

ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma)

Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường cản quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học Cấu trúc của lớp vỏ trong cho đến nay còn chưa được biết rõ Cần lưu ý rằng: khái niệm – “gai chống nhọn” từ màng trong đâm sát màng ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác Thực chất các gai hay chính các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thành các u lồi - và chính các u lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium, exosporium hay chính là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt - mụn cóc - u nhú trên bề mặt vỏ bào tử Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973), Mims và cộng sự (1989) đã từng phân tích và thảo luận nhiều

1.2 Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

Trong đề tài nghiên cứu năm 2005 của Nguyễn Minh Khang, thành phần dược tính của nấm Linh chi được phân như sau:

Bảng 1.2 Thành phần dược tính của nấm Linh chi

ma-giê, selen, sắt, kẽm, trong đó đồng chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Borchers và cộng sự, 1999) Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau và cộng sự (2001) đã xác định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm Linh chi gồm: tro (1,8%), carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 - 8%) Hàm lượng của protein trong nấm Linh chi khoảng 7 - 8%, thấp hơn so với nhiều loại nấm khác (Chang và cộng sự, 1996; Mau và cộng sự, 2001) Đặc biệt thành phần protein của nấm Linh chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là lysine và leucine Hàm lượng chất béo tổng thấp nhưng chứa nhiều acid béo không bão hòa nhiều nối đôi, đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người (Chang và cộng sự, 1996; Borchers và cộng sự, 1999; Sanodiya và cộng sự, 2009) Ngoài ra trong nấm còn chứa các glycoprotein và các polysaccharide

Bên cạnh đó, nấm Linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học như các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của chúng Hoạt tính sinh học của nấm Linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide, peptidoglycan và các triterpene mang lại (Boh và cộng sự, 2007; Zhou và cộng sự, 2007)

Địa điểm sinh trưởng của nấm Linh chi cũng được xem là yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi Trong một nghiên cứu về hoạt tính sinh học của 11 mẫu sản phẩm nấm Linh chi được trồng ở Nhật Bản, người ta nhận thấy sự chênh lệch về hàm lượng triterpenoid giữa các mẫu dao động trong khoảng từ 0 – 7,8% và hàm lượng các polysaccharide dao động trong khoảng từ 1,1 - 5,8% (Lu và cộng sự, 2012)

Sự khác nhau về hàm lượng của các hoạt tính sinh học trong các sản phẩm thương mại cũng chịu ảnh hưởng bởi quá trình chế biến hoặc chiết xuất, qua đó cho thấy chiết xuất bằng nước

sẽ cho hàm lượng triterpenoid ít hơn khi chiết xuất bằng ethanol (Lu và cộng sự, 2012) Bên cạnh đó, điều kiện sinh trưởng cũng ảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học

có trong nấm Linh chi (Lu và cộng sự, 2012)

Trước kia, việc thu thập bào tử Ganoderma lucidum rất khó nên điều này làm cho việc

nghiên cứu chức năng cũng như các hoạt chất sinh học có trong bào tử cũng trở nên khó khăn, do đó cũng chỉ tập trung nghiên cứu vào thể quả của nấm Linh chi Hiện nay, việc

trồng nấm Linh chi đã trở nên phổ biến hơn, việc thu thập dễ dàng cũng tạo nhiều điều kiện

để nghiên cứu về bào tử Ganoderma lucidum Ganodermasides A, B, C và D là dẫn xuất ergosterol phân lập từ chiết xuất methanol của bào tử Ganoderma lucidum (Jue Wang và cộng sự, 2017) Cấu trúc của Ganodermasides A, B, C và D được thể hiện trong hình 1.5

Hình 1.5 Cấu trúc của Ganodermasides

A, B, C và D 1 đại diện cho A, 2 đại diện cho B, 3 đại diện cho C, 4 đại diện cho D; 1:

R 1 = H, R 2 = OH, R 3= H; 2: R 1 = H, R 2 = H, R 3 = OH; 3: R 1 = OH, R 2 , R 3 = O; 4: R 1 = OH, R 2 = H, R 3 = H

Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi: Polysaccharide, triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng,… với hàm lượng đậm đặc hơn Linh chi từ 7 - 20 lần (Cheng CR và cộng sự, 2010) Bào tử nảy mầm có hoạt tính sinh học cao hơn bào tử không nảy mầm, có thể thấy việc thu các hợp chất sinh học phụ thuộc vào việc vách bào tử có bị vỡ hay không (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016) Bảng 1.3 Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li JJ

và cộng sự, 2014)

Hàm lượng Polysaccharides Triterpenoids Protein

tích, thành phần chủ yếu trong polysaccharide của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum -

polysaccharides: GL - PSs) là đường glucose (Bao và cộng sự, 2002; Wang và cộng sự, 2002) Ngoài ra, GL - PSs cũng có cấu trúc polymer mạch thẳng, bao gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị trí liên kết p hoặc a khác nhau như 1 - 3, 1 - 4 và 1 - 6 với các dạng đồng phân - D hay L (Lee và cộng sự, 1999; Bao và cộng sự, 2002) Khả năng chống lại sự hình thành khối u của GL - PSs phụ thuộc vào cấu hình mạch nhánh cũng như tính tan của polysaccharide này (Bao và cộng sự, 2002; Zhang và cộng sự, 2001) Ngoài ra,

nấm Linh chi cũng có chứa một mạng lưới chitin, đây là thành phần mà cơ thể người không tiêu hóa được và đóng vai trò tạo nên độ cứng cho nấm Linh chi (Upton và cộng sự, 2000)

Có rất nhiều peptidoglycan có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi đã được phân lập, bao gồm proteoglycan (GLPG) có tác dụng kháng virus (Li và cộng sự, 2005), tăng cường miễn dịch (Ji và cộng sự, 2007) và F3 là một glycoprotein trong cấu trúc có chứa fucose (Chien và cộng sự, 2004)

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi

1.2.2 Triterpenes

Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là một bội số của 5, ví dụ như menthol (monoterpene) và β - carotene (tetraterpene) Phần lớn các terpenoid thuộc nhóm alkene, một số có chứa những nhóm chức năng, đa phần các terpenoid có cấu trúc mạch vòng Những hợp chất này được tìm thấy trên rất nhiều loài thực vật Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lượng chất béo Terpenoid được tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch quả, ví dụ như hương thảo

(Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng) có tác dụng tăng cường sức khỏe

(Mahato và cộng sự, 1997; Mashour và cộng sự, 1998; Haralampidis và cộng sự, 2002) Triterpene là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon là 30 Khối lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp và có khả năng

bị oxy hóa cao (Mahato và cộng sự, 1997; Zhou và cộng sự, 2007) Nhiều loài cây có khả năng tổng hợp triterpene trong quá trình sinh trưởng và phát triển Một số có chứa nhiều triterpene trong nhựa, qua đó giúp các cây này chống lại các loại bệnh Mặc dù có hàng trăm loại triterpene đã được phân lập từ rất nhiều loại thực vật khác nhau và phân nhóm này cũng

đã cho thấy có rất nhiều tiềm năng nhưng hiện nay có rất ít những ứng dụng của triterpene được sử dụng trong thực tế

Trong nấm Linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là chất tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis và cộng sự, 2002) Trong quá trình chiết xuất triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng Dịch chiết sau đó sẽ được phân tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường hoặc HPLC pha nghịch đảo (Chen và cộng sự, 1999; Su và cộng sự, 2001) Những triterpene đầu tiên được Kubota phân tách từ nấm Linh chi là ganoderic acid A và B (Kubota và cộng sự, 1982) Kể từ khi đó, hơn

100 loại triterpene cùng với cấu hình của chúng đã được tìm ra Trong số đó, có hơn 50 loại

là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong nấm Linh chi Đa số các triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có một số loại khác như là ganoderal, ganoderiol và ganodermic

acid (Nishitoba và cộng sự, 1984; Sato và cộng sự 1986; Budavari và cộng sự, 1989; Gonzalez và cộng sự 1999; Ma và cộng sự 2002; Akihisa và cộng sự 2007; Zhou và cộng

sự 2007; Jiang và cộng sự 2008; Chen và cộng sự 2010)

Hình 1.7 Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự, 1982;

Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48: 2905-7; Sato

và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari và cộng sự, 1989) Nấm Linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần tạo nên vị đắng của nấm Linh chi Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể Tuy nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm Linh chi lại không ổn định Chúng phụ thuộc rất nhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế biến, điều này đã được thể hiện trong một nghiên cứu của Chen và Su được tiến hành vào năm 1999 và 2001 (Chen và cộng sự, 1999; Su và cộng sự, 2001)

Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được tìm thấy từ thể quả của nấm Linh chi đại diện cho năm lớp cấu trúc chính So với thể quả của nấm Linh chi, các nghiên cứu về bào tử của nấm Linh chi mới bắt đầu từ năm 1988 (Hou CY và cộng sự, 1988) và có 29 loại triterpenoids đã được tìm thấy trong bào tử này Với những tiến bộ gần đây trong quang phổ

và trắc phổ kỹ thuật hiện đại, một loạt các triterpenoids được phân lập từ các bào tử của nấm

Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược sĩ Tất cả các triterpenoids trong các bào tử của nấm Linh chi có quá trình tổng hợp tương tự nhau, cụ thể là con đường acid movalonic (MVA) (Bingji Ma và cộng sự, 2011) Các Triterpenoids này được bắt đầu

từ trans - squalene và sau đó đã được thay đổi bởi quá trình oxy hóa, giảm, khử acid, tạo vòng, sắp xếp lại, tạo ra nhiều loại cấu hình triterpenoids trong bào tử của nấm Linh chi Triterpenoids được cô lập từ bào tử Linh chi cho thấy khả năng kháng HIV-1 protease, chống khối u, và các hoạt động chống bổ sung Triterpenoids này là thành phần hoạt chất chính của bào tử Linh chi và biểu thị cho các hoạt tính sinh học khác nhau được sử dụng trong dược liệu

Hình 1.8 Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji

Ma và cộng sự, 2011)

Hình 1.9 Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng

sự, 2011)

Triterpenoids được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi: năm triterpenoids thu được từ

phần tan trong ether của bào tử của nấm Linh chi và trên cơ sở tính chất hóa học và dữ liệu

quang phổ, acid ganopsoreric A (1), acid ganoderic B (2), acid ganoderic C1 (3), acid ganoderic E (4) và ganodermanontriol (5) được xác định tương ứng (Bingji Ma và cộng sự, 2011) Thí nghiệm dược lý cho thấy acid ganopsoreric A có có hoạt tính GTP thấp đối với gan chuột bị tổn thương bởi CC14 và GaNI (Chen RY và cộng sự, 1993) Hai triterpenoids pentacyclic mới, có tên ganosporelactone A (6) và B (7) được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi, có thể được bắt nguồn từ khung lanostane thông qua việc hình thành liên kết C18 và C23

(Chen RY và cộng sự, 1991) Hai triterpenes lanostane kiểu mới, lucidumol A (8) và p - acid ganoderic (9), cùng với một lucidumol B (10) và bảy triterpenoids đã biết, ganodermanondiol (11), ganoderiol F (12), acid ganoderic A (13), acid ganolucidic A (14),

và 2, 3, 5 Trong số các hợp chất cô lập, các hợp chất 5, 10, 11 và 14 cho thấy khả năng kháng virus gây suy giảm miễn dịch (kháng HIV) - 1 protease hoạt động đáng kể với giá trị

IC50 với giá trị 20 - 90 μM (Min BS và cộng sự, 1998)

6 loại lanostane - triterpenes mới có tính oxy hoá cao, được gọi là ganoderic acid γ

(15), acid ganoderic δ (16), acid ganoderic ε (17), acid ganoderic ξ (18), acid ganoderic η (19), acid ganoderic θ (20), cùng với ganolucidic acid D (21) và acid ganoderic C2 (22) thu được từ các bào tử nấm Các khả năng gây độc của các hợp chất 15 - 21 đã được thực hiện

in vitro chống dòng tế bào ung thư Meth - A và LLC (Min BS và cộng sự, 1998) Một terpenoid C27 có hoạt tính oxy hóa cao mới, lucidenic axit SP1 (23), thu được từ một phần CHCl3 - tan của bào tử nấm Linh chi cùng với 11 triterpenoids, acid ganoderic C6 (24), acid ganoderic G (25), và 2, 3, 5, 8, 9, 11, 12, 13, 14 (Bingji Ma và cộng sự, 2011)

1.2.3 Saponin

Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo - xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng),

là một nhóm glycosid lớn, được tìm thấy rộng rãi trong thực vật Người ta cũng phân lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao

Saponin có một số tính chất đặc biệt:

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch

- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng

- Độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa, đi lỏng

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b -hydroxysteroid khác

Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid trong cam thảo dây, oslandin

trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt

Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta dùng

3 dung môi này để tủa saponin Saponin có thể bị tủa bởi chì acetate, bari hydroxyde, ammoni sulfat

Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm

Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin steroid

1.2.4 Acid béo

Người ta thu được lipid của bào tử bị phá vỡ bằng sắc kí lỏng CO2 siêu tới hạn tìm thấy có 15 loại acid béo, các hợp chất chính là acid palmitic (6,12%), acid stearic (4,97%), acid oleic (67,11%) và acid linoleic (9,63%) (Gao P và cộng sự, 2012) Chen và cộng sự (2013) đã xác định và định lượng 9 acid béo, phần lớn trong số đó là acid oleic (C18:1; 57,5%), acid linoleic (C18:2; 13,4%), acid palmitic (C16:0; 19,6% ), acid hexadecenoic (C16:1; 2,2%),

và acid linolenic (C18:3; 0,5%) và Liu và cộng sự (2007) xác định được 18 acid béo Hoạt tính của acid béo thu được từ bào tử gồm acid nonadecanoic và acid cis-9-nonadecenoic có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào khối u và gây độc cho tế bào hồng cầu (HL-60) (Gao P

thuộc loài Ganoderma spp, ông đã xác định được trong hàm lượng chất khoáng của loại nấm

này có chứa 10,2% là kali, calcium và magnesium Cũng trong một nghiên cứu khác thì Falandysz đã không tìm thấy cadmium và thủy ngân trong những mẫu nấm Linh chi, nhưng hàm lượng selenium được xác định là 72 pg/g

Trong thành phần của nấm Linh chi (Ganoderma spp) có một chất cũng nhận được rất

nhiều sự quan tâm, đó là germanium Đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5 trong các chất khoáng (489 pg/g) có trong nấm Linh chi Chất này tồn tại rất ít ở các loại thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm, lô hội và tỏi (Mino và cộng sự, 1980) Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu, nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch, kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến (Kolesnikova và cộng sự, 1997)

Những hợp chất khác cũng được tìm thấy trong nấm Linh chi đó là các loại enzyme như metalloprotease (đây là loại enzyme có tác dụng trì hoãn quá trình đông máu) Ngoài

ra, ergosterol (provitamin D2), các nucleoside và các nucleotide (như adenosine và guanosine) (Wasser và cộng sự, 2005; Paterson và cộng sự, 2006; Kim và cộng sự, 2004) cũng đã được tìm thấy trong nấm Linh chi, đây là những hợp chất có tác dụng ức chế thuận nghịch a-glucosidase và SKG-3

Trong lớp vách sporoderm còn phát hiện được các chất vô cơ như magie, nhôm, silicon, phosphate, lưu huỳnh, clo, kali, canxi, sắt và niken, một số chất có hàm lượng cao như

silicon (19,01%) và canxi (24,31%) (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016)

1.3 Công dụng của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

Một số dạng sản phẩm từ nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi đang có hiện nay:

- Trà túi lọc nấm Linh chi: bồi bổ sức khỏe, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, điều hòa tim mạch, hạ cholesterol, phòng và chống viêm gan, an thần, tăng trí nhớ, tăng tuổi thọ

- Bột Nấm Linh chi: bồi bổ sức khỏe và hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh ung thư, xơ gan, điều hòa huyết áp, tiểu đường, tăng cường hệ miễn dịch, chống lão hóa…

- Viên nang dầu bào tử: Chống oxy hóa, trung hòa các gốc tự do, giảm Cholesterol trong máu, chống xơ vữa động mạch, ổn định huyết áp, giải độc gan Chữa mất ngủ, giúp

da dẻ mịn màng, giảm sạm nám tàn nhang Hỗ trợ tăng hồng cầu cho bệnh nhân ung thư Giúp đào thải độc tố trong gan cho bệnh nhân ung thư, bệnh mãn tính, người hay tiếp xúc rượu bia, stress

- Bột bào tử nấm Linh chi: Tăng cường hệ thống miễn dịch, cô lập và diệt các tế bào ung thư, chống viêm nhiễm, bảo vệ gan, tăng cường chức năng chức năng gan, thải độc chống dị ứng, điều hoà huyết áp, nhịp tim, tăng lượng oxy trong máu, giảm cholesterol, dùng tốt cho bệnh nhân tiểu đường

Hình 1.10 Các dạng sản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

Riêng đối với bào tử nấm Linh chi có thể được sử dụng dưới dạng còn nguyên hoặc bị phá vỡ, nhưng có nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng bào tử bị phá vỡ có hoạt tính sinh học cao hơn so với bào tử còn nguyên Bào tử còn nguyên đã được tìm thấy trong phân người và

động vật, như vậy bào tử Ganoderma lucidum không thể được tiêu hóa trong cơ thể, nhưng

cũng có báo cáo cho rằng bào tử với lớp vách còn nguyên vẹn có thể hoạt động khi uống vào trong cơ thể (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016)

1.3.1 Phòng chống ung thư

Nấm Linh chi được sử dụng phổ biến trong quá trình hỗ trợ điều trị ung thư nhằm giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho các bệnh nhân bên cạnh áp dụng những liệu pháp chữa trị thông thường Mặc dù hiện nay quá trình điều trị bệnh ung thư đã có những tiến bộ nhất định thông qua việc chẩn đoán bệnh sớm cũng như những phương pháp hoá trị hiện đại, tuy nhiên việc chữa dứt điểm các căn bệnh này vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn thử thách (theo WHO 2008) Trong quá trình tìm kiếm những phương pháp điều trị và những tác nhân hoá trị mới, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loài thực vật, trong đó có cả nấm Linh chi,

những hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặn quá trình hình thành khối u (Wasser và cộng sự, 1999; Borchers và cộng sự, 2008) Trong nấm Linh chi có một lượng lớn những hợp chất hoá học có thể được chiết xuất từ thân nấm, sợi nấm và bào tử Trong đó, các polysaccharide và triterpene là 2 nhóm hợp chất chính trong nấm Linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư và ngăn chặn quá trình hình thành khối u, điều này đã được chứng minh trong những nghiên cứu của Yuen và cộng sự (2005) cũng như của Zaidman và cộng sự (2005) Một trong những tác dụng mới được tìm thấy của dịch chiết nấm Linh chi là có khả năng hỗ trợ điều trị cho các căn bệnh mãn tính, ví dụ như bệnh ung thư và bệnh liên quan đến gan (Bao và cộng sự, 2005) Những thí nghiệm trên động vật đã cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc ức chế sự hình thành và di căn của các tế bào ung thư Tuy nhiên, việc tiến hành những thí nghiệm này trên cơ thể người vẫn còn hạn chế

Daniel Sliva và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư vú trên chuột với các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi như: bào tử còn nguyên, bào tử bị phá vỡ, bột thể quả, dịch chiết của thể quả và bào tử với các nguồn cung cấp khác nhau và đã thu được kết quả như bảng 1.4

Bảng 1.4 So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2,5 mg/mL)

Tên Nguồn gốc Thành phần Khả năng ức chế tế

bào ung thư Zihang a Trung Quốc Bào tử còn nguyên 89,3%

Zhongke b Trung Quốc Bào tử phá vỡ 71,9%

Jilin c Trung Quốc Bào tử còn nguyên 9,5%

ReishiMax f Mỹ Dịch chiết thể quả

và bào tử

99%

Gần đây có nghiên cứu cho thấy rằng các acid béo C-19 là nonadecanoic acid và

cis-9-nonadecenoic acid thu được từ bào tử Ganoderma lucidum bị phá vỡ có tác dụng chống

tế bào ung thư (Gao P và cộng sự, 2012)

Từ những nhận định và kết quả thí nghiệm nêu trên cho ta thấy việc tìm ra một quy trình phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi hiệu quả để trích xuất các thành phần hoạt tính sinh học từ bào tử Ganoderma là việc rất quan trọng Đã có rất nhiều báo cáo khoa học về các

phương pháp phá vỡ bào tử Ganoderma lucidum

1.3.2 Khả năng kháng oxi hóa

Những hợp chất chống oxi hoá trong thực vật có tác dụng ngăn ngừa ung thư cũng như những căn bệnh nan y khác (Collins và cộng sự, 2005; Benzie và cộng sự, 2009) Những hợp chất này có tác dụng bảo vệ các thành phần có trong màng tế bào chống lại những tổn thương do quá trình oxy hoá gây nên, qua đó giúp làm giảm những nguy cơ gây ra đột biến

và ung thư cũng như góp phần bảo vệ các tế bào miễn dịch Những hợp chất có trong nấm Linh chi chủ yếu là các polysaccharide và các triterpene cũng có tác dụng chống lại quá trình oxy hoá tế bào (Lee và cộng sự, 2001; Lin và cộng sự, 2002; Shi và cộng sự, 2002; Wachtel Galor và cộng sự, 2005; Yuen và cộng sự, 2008; Saharelli và cộng sự, 2009; Wu

và cộng sự, 2009)

Các thành phần hoạt tính sinh học trong Ganoderma lucidum bao gồm

polysaccharides, triterpenes, peptide và polysaccharide peptide có tác dụng gián tiếp hoặc trực tiếp trong việc chống lão hóa (Jue W và cộng sự, 2017)

1.3.3 Điều trị bệnh đái tháo đường

Những thành phần của nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường huyết đối với động vật Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách từ thân nấm Linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100 mg/kg, cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm và tác dụng hạ đường huyết vẫn tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ (Hikiko và cộng sự, 1985) Cũng trong một thí nghiệm trên chuột, ganoderan B có tác dụng làm tăng lượng insulin, qua đó làm giảm hàm lượng glucose trong máu và điều chỉnh