Nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố và thiết kế hệ thống led để khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng của cây lan kim tuyến anoectochilus setaceus blume in vitro

Ảnh hưởng c a kết hợp c a LED đỏ với LED xanh dương lên quá trình tăng trưởng ở cây lan kim Tuyến Anoectochilus setaceus Blume.. Ảnh hưởng c a LED đỏ và LED xanh dương lên quá trình tăng

ĐOÀN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH

TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS

SETACEUS BLUME.) IN VITRO

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: NÔNG – LÂM – NGƯ NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP

Mã số công trình: ………

1

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH MỤC BẢNG 5

DANH MỤC BIỂU ĐỒ 7

DANH MỤC HÌNH ẢNH 8

DANH MỤC CH VIẾT TẮT 8

MỞ ĐẦU 11

1 Đặt vấn đề 11

2 Tình hình nghiên cứu 14

3 Mục đích nghiên cứu 16

4 Nội dung nghiên cứu 16

5 Các kết quả đạt được 16

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 18

1.1 Sơ lược về đề tài 18

1.2 Các công trình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Địa điểm thực hiện đề tài 23

2.2 Vật liệu 23

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2.2 Hóa chất và môi trường 23

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 23

2.2.4 Điều kiện trong phòng thí nghiệm 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Chuẩn bị môi trường 24

2.3.2 Thiết kế thí nghiệm chiếu sáng 26

a Thiết kế hệ thống chiếu sáng LED đơn sắc 26

b Thiết kế hệ thống chiếu sáng LED đỏ kết hợp LED xanh dương 27

2.3.3 Bố trí thí nghiệm 29

2.3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ N cố định ết hợp với đến sự tạo chồi c a lan im Tuyến Anoectochilus setaceus Blume.) 29

2.3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng c a bạc nitrate (AgNO3) đến khả năng tăng trưởng chồi ở c y lan im Tuyến 30

2.3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng c a giberelin (GA3) đến quá trình kéo dài thân ở cây lan kim Tuyến (A setaceus Blume.) 31

2.3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng c a ánh sáng LED đến quá trình tạo chồi c a cây Lan Kim Tuyến (A setaceus Blume.) nuôi cấy in vitro 33

2.3.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát tỷ lệ kết hợp c a LED đỏ và LED xanh dương lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 34

2.3.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng c a tốc độ lắc giai đoạn cảm ứng) và giá thể lên hả năng tăng trưởng c a c y lan im Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 35

a Thí nghiệm 6.1: Khảo sát ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên hả năng tăng trưởng c a c y lan im Tuyến (Anoectochilus setaceus lume.) cấy trên giá thế ông g n 35

b Thí nghiệm 6.2: Khảo sát ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên hả năng tăng trưởng c a c y lan im Tuyến (Anoectochilus setaceus lume.) cấy trên giá thế agar 36

c Thí nghiệm 6.3: Khảo sát ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm

ứng) lên hả năng tăng trưởng c a c y lan im Tuyến

(Anoectochilus setaceus Blume.) 37

2.3.4 h tiêu theo d i 39

2.3.5 Thống kê và xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3: ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng c a nồng độ N cố định ết hợp với

đến sự tạo chồi c a lan im Tuyến Anoectochilus setaceus Blume.) 40

3.2 Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng c a bạc nitrate (AgNO3) đến khả năng tăng trưởng ở c y lan im Tuyến Anoectochilus setaceus Blume.) 47

3.3 Thí nghiệm 3 Ảnh hưởng c a giberelin (GA3) đến quá trình kéo dài thân ở cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 56

3.4 Thí nghiệm 4 Ảnh hưởng c a ánh sáng LED đơn sắc đến quá trình tạo chồi c a cây Lan Kim Tuyến nuôi cấy in vitro 63

3.5 Thí nghiệm 5 Ảnh hưởng c a kết hợp c a LED đỏ với LED xanh dương lên quá trình tăng trưởng ở cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 68

3.6 Thí nghiệm 6 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc giai đoạn cảm ứng) và giá thể đến khả năng tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến 73

3.6.1 Thí nghiệm 6.1 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả năng tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến cấy trên giá thể bông gòn 73

3.6.2 Thí nghiệm 6.2 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả năng tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến cấy trên giá thể agar 77

3.6.3 Thí nghiệm 6.3 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng)

lên khả năng tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến cấy trên giá thể

mùn cưa 82

CHƯƠNG 4: ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 87

4.1 Kết luận 87

4.2 Kiến nghị 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO 89

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

ảng 2.1 Ảnh hưởng nồng độ N cố định ết hợp với đến sự tạo chồi c a

lan im Tuyến Anoectochilus setaceus Blume.) 30

trưởng c a c y lan im Tuyến Anoectochilus setaceus Blume.) 31

ảng 2.3 Ảnh hưởng c a giberelin (GA3) đến quá trình kéo dài thân cây Lan

Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 32

ảng 2.4 Ảnh hưởng ánh sáng LED đến quá trình phát sinh chồi c a cây lan im

Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) nuôi cấy in vitro 34

ảng 2.5 Ảnh hưởng c a LED đỏ và LED xanh dương lên quá trình tăng trưởng

và tạo chồi cây Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 35

ảng 2.6 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc đến khả năng hình thành chồi c a đoạn cắt

thân lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus lume.) được cảm ứng

trong môi trường lỏng lắc và sinh trưởng trên giá thể ông g n 36 ảng 2.7 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc đến khả năng hình thành chồi c a đoạn cắt

thân Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus lume.) được cảm ứng

trong môi trường lỏng lắc và sinh trưởng trên giá thể agar 37 ảng 2.8 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc đến khả năng hình thành chồi c a đoạn cắt

thân Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus lume.) được cảm ứng

trong môi trường lỏng lắc và sinh trưởng trên giá thể mùn cưa 39 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ N cố định ết hợp với đến sự tạo chồi c a

lan im Tuyến Anoectochilus setaceus lume.) sau 8 tu n nuôi cấy 42

lan im Tuyến A setaceus Blume.) sau 8 tu n nuôi cấy 50

Bảng 3.3 Ảnh hưởng c a giberelin (GA3) đến quá trình kéo dài thân ở cây lan

kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 58

Bảng 3.4 Ảnh hưởng c a ánh sáng LED đơn sắc đến quá trình tăng trưởng và tạo

chồi c a c y lan im Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) nuôi cấy

in vitro 65

Bảng 3.5 Ảnh hưởng c a tỷ lệ kết hợp LED đỏ với LED xanh dương lên quá

trình tăng trưởng cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 70

Bảng 3.6 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả năng tăng

trưởng c a cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) cấy

trên giá thể bông gòn 75 Bảng 3.7 Ảnh hưởng hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả

năng tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume.) cấy trên giá thể agar 79

Bảng 3.8 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả năng tăng

trưởng c a cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) cấy

trên giá thể mùn cưa 83

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng nồng độ N cố định ết hợp với đến sự tạo chồi

c a lan im Tuyến Anoectochilus setaceus lume.) sau 8 tu n nuôi

cấy 43

c y lan im Tuyến setaceus Blume.) sau 8 tu n nuôi cấy 51 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng c a giberelin (GA3) đến quá trình kéo dài thân ở cây lan

kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 59

Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng c a ánh sáng LED đơn sắc đến quá trình tăng trưởng và

tạo chồi c a c y lan im Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) nuôi

cấy in vitro 66

Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng c a tỷ lệ kết hợp LED đỏ với LED xanh dương lên quá

trình tăng trưởng cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 71

Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả năng

tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.)

cấy trên giá thể bông gòn 76 Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả

năng tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume.) cấy trên giá thể agar 80

Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả năng

tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.)

cấy trên giá thể mùn cưa 84

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Máy lắc 25 Hình 2.2 Các loại giá thể để cấy chuyền sau khi lắc m u 25

Hình 2.3 Mô hình LED đơn sắc để nuôi cấy m u lan kim Tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume.) in vitro 26

Hình 2.4 Hệ thống chiếu sáng LED đơn sắc để nuôi cấy m u lan kim Tuyến

(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro 27

Hình 2.5 Mô hình chiếu sáng LED đỏ kết hợp LED xanh dương để nuôi cấy m u

lan kim Tuyến (A.setaceus Blume.) in vitro 28

Hình 2.6 Hệ thống LED đỏ kết hợp LED xanh dương để nuôi cấy m u lan kim

Tuyến (A.setaceus Blume.) in vitro 29

Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ N cố định ết hợp với đến sự tạo chồi c a

lan im Tuyến Anoectochilus setaceus Blume.) sau 8 tu n nuôi cấy 46

Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ N cố định ết hợp với đến sự tạo chồi c a

lan im Tuyến Anoectochilus setaceus lume.) sau 8 tu n nuôi cấy 47

lan im Tuyến Anoectochilus setaceus lume.) sau 8 tu n nuôi cấy 54

lan im Tuyến Anoectochilus setaceus lume.) sau 8 tu n nuôi cấy 55

Hình 3.5 Ảnh hưởng c a giberelin (GA3) đến quá trình kéo dài thân ở cây lan

kim Tuyến sau 8 tu n nuôi cấy 61 Hình 3.6 Ảnh hưởng c a giberelin (GA3) đến quá trình kéo dài thân ở cây lan

kim Tuyến sau 8 tu n nuôi cấy 62 Hình 3.7 Ảnh hưởng c a ánh sáng LED đơn sắc đến quá trình tạo chồi c a cây

Lan Kim Tuyến nuôi cấy in vitro 65

Hình 3.8 Ảnh hưởng c a ánh sáng LED đơn sắc đến quá trình tạo chồi c a cây

Lan Kim Tuyến nuôi cấy in vitro 66

Hình 3.9 Ảnh hưởng c a tỷ lệ kết hợp LED đỏ với LED xanh dương lên quá

trình tăng trưởng cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 72

Hình 3.10 Ảnh hưởng c a tỷ lệ kết hợp LED đỏ với LED xanh dương lên quá

trình tăng trưởng cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) 72

Hình 3.11 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả năng tăng

trưởng c a cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) cấy trên

giá thể bông gòn 76 Hình 3.12 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả năng tăng

trưởng c a cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) cấy trên

giá thể bông gòn 77 Hình 3.13 Ảnh hưởng hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả

năng tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.)

cấy trên giá thể agar 81 Hình 3.14 Ảnh hưởng hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả

năng tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.)

cấy trên giá thể agar 81 Hình 3.15 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả năng tăng

trưởng c a cây lan kim Tuyến cấy trên giá thể mùn cưa 84 Hình 3.16 Ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên khả năng tăng

trưởng c a cây lan kim Tuyến cấy trên giá thể mùn cưa 85

DANH MỤC CH VIẾT TẮT

BA Benzyladenine

BAP 6 - Benzyl Amino Purin

DNA Deoxyribonucleic Acid

Đ Đối chứng

GA3 Acid gibberellic

IAA cid β-Indolyaxetic

IBA cid β-Indolybutyric

IFR ƣờng độ ánh sáng đỏ xa

IR ƣờng độ ánh sáng đỏ

KH2PO4 Monopotassium phosphate KHCN Khoa học và công nghệ

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lan là nhóm thực vật tự nhiên có hoa lộng l y nhất phân bố khắp thế giới

từ vùng nhiệt đới đến vùng núi cao Sự đa dạng đáng ngạc nhiên c a chúng trong ích thước, hình dạng và màu sắc hoa Dù lan phát triển ch yếu như loài hoa trang trí, nhiều loài cũng được dùng như thảo dược, thức ăn và nhiều loài có giá trị trong các nền văn hóa và ộ lạc khác nhau trên thế giới Lan được dùng ở một

số vùng trong hệ thống chữa bệnh cổ truyền cũng như các liệu pháp chữa một số bệnh từ xa xưa Tuy nhiên Orchidaceae được quan t m như họ lớn nhất trong giới thực vật, một số nghiên cứu đã được thực hiện hướng về dược tính c a chúng Liên kết với kiến thức bản địa về các loài lan dược liệu cho các hoạt động nghiên cứu hiện đại cung cấp các tiếp cận mới đáng tin cậy cho sự khám phá các loại thuốc mới hiệu quả hơn với việc sưu tập ng u nhiên Nhiều loài lan đối mặt với nguy cơ tuyệt ch ng vì khai thác quá mức và mất nơi sinh sống Nuôi cấy mô thực vật có thể là một trong các công cụ hữu hiệu thích hợp để giảm tối đa áp lực lên số lượng tự nhiên c a các loài lan dược liệu và khai thác lâu dài

Trên toàn c u, lan là loài bị đe dọa nhiều nhất trong số các cây có hoa Do nhiều lý do như hai thác quá mức, buôn bán bất hợp pháp và lấn chiếm đất đai, thay đổi khí hậu, các loài lan bị đe dọa ngày càng lan nhanh y lan dược liệu đang ị đe doạ đáng ể do môi trường sống bị phá h y, suy thoái − ph n hu và

thu gom bất hợp pháp cho mục đích thương mại và tiêu dùng (Pant et al., 2002)

H u hết các loài này đều được phân loại là có nguy cơ tuyệt ch ng, hiếm và được liệt kê trong phụ lục II c a CITES (IUCN) Có một khoảng cách lớn giữa cung ứng và nhu c u c a c y lan dược liệu Việc thu gom và bán hoa lan hoang dã từ vùng phong lan phong phú đặc biệt ở khu nông thôn là hoạt động thường nhật, việc nhổ tận gốc để cung cấp một số lượng lớn hoa phong lan cho các thương

nh n trong nước và quốc tế đã làm tuyệt ch ng nhiều loài (Kala, 2004) Do xu hướng sử dụng y học cổ truyền g n đ y ở các nước phương T y, nhu c u c a chúng đang gia tăng Sự cạn kiệt nhanh chóng đ i hỏi các biện pháp bảo tồn khẩn

cấp Nuôi cấy mô thực vật có thể là một trong những công cụ thay thế phù hợp nhất để giảm áp lực lên số lượng cá thể tự nhiên c a c y lan dược liệu và khai thác bền vững

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy các hoạt tính khác nhau c a chất chuyển hóa và chất chiết xuất từ các loài lan hác nhau trong điều trị nhiều bệnh Chúng được sử dụng đa dạng trong các bệnh như chống thấp khớp, chống viêm, chống virus, chống ung thư, chống co giật, lợi tiểu, bảo vệ th n inh, thư giãn, chống lão hóa, chữa lành vết thương, hạ đường huyết, chống khối u và chống lại ung

thư, háng vi trùng, thuốc kháng vi-rút và nhiều hoạt tính khác (Li et al., 2006; Shimura et al., 2007; Wang et al., 2006) Đối với thuốc có nguồn gốc từ hoa lan,

một số nhà nghiên cứu đã áo cáo một số phát hiện mới lạ, cả về tính chất hoá học và dược lý học Các nghiên cứu đã áo cáo sự cô lập c a nhiều chất phytochemicals quan trọng từ các loài lan hác nhau như flavonoid, stile noids, anthocyanins, triterpedoids, orchinol, hircinol, cypripedin, các d n xuất bibenzyl, phenanthrenes, jibantine, nidemin và loroglossin có trong lá, giả hành, rễ, hoa

hoặc trong toàn bộ cây (Okamoto et al., 1966; Zhao et al., 2003; Yang et al.,

2006)

Lan dược liệu ch yếu là các chi: Anoctochilus, Bletilla, Calanthe,

Coelogyne, Cymbidium, Cypipedium, Dendrobium, Ephemerantha, Eria, Galeola, Gastrodia, Gymnadenia, Habenaria, Ludisia, Luisia, Nevilia và Thunia

(Szlachetko, 2001) Loài Anoectochilus được sử dụng trong các loại thuốc dân gian Trung Quốc, như Anoectochilus formosanus Hayata, Anoectochilus

koshunensis Hayata, và Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl Anoectochilus roxburghii phân bố ở miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Sri Lanka, Ấn Độ và

Nepal (Li và Zou, 1995), c n được gọi là "Vua dược liệu" ở Trung Quốc (Tseng

et al., 2006)

Sự phát triển c a y học cổ truyền đặc biệt là Đông y Trung Quốc đã hiến

cho lan kim Tuyến, đặc biệt là loài lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus

Blume.) trở thành một loài dược liệu quý Theo y học cổ truyền Đài Loan,

Anoectochilus setaceus Blume tươi hoặc khô nấu nước uống trị các chứng ệnh

đau ngực, đau ụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và chứng đau nhói ngực (Lin và Wu 2007) Đại học Công nghệ Y dược và ao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan đã sử dụng

Anoectochilus setaceus Blume làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ

thể và kháng virus cúm A Anoectochilus setaceus Blume chứa hợp chất chuyển

hoá arachidonic acid liên quan đến chức năng tim mạch Dịch chiết

Anoectochilus setaceus Blume có khả năng háng virus, háng sưng viêm và

bảo vệ gan (Takatsuki, 1992) Ngoài ra trên thị trường còn có một số thực phẩm

chức năng chiết xuất từ lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) có tác

dụng mát gan giải độc, tăng cường sức hỏe…

hi lan im Tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống ê được 12 loài, trong đó có loài lan im Tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác là

Anoectochilus roxburghii Wall ex Lindl phân bố rộng ở h u hết các t nh trong

cả nước Loài lan này được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc c a nó Theo các tài liệu y học thế giới, lan gấm là loài cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng 2 huyết áp, đau nhức khớp xương,… Hơn nữa mới đ y người ta đã phát hiện

ra khả năng ph ng và chống ung thư c a loại thảo dược này Như vậy, lan kim

Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) là loại thảo dược có giá trị và có tiềm năng rất lớn.Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam cây lan kim Tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume.) ch yếu dùng làm cảnh, chưa có tài liệu nghiên cứu và chưa

dùng làm thuốc Với nhu c u nguyên liệu lớn, Trung Quốc tận thu nguồn lan Gấm trong khu vực Đông Nam Á mà ch yếu ở Việt Nam Lan kim Tuyến

(Anoectochilus setaceus lume.) tươi được thu mua từ 200 – 300 USD/ kg (thân,

rễ, lá, hoa), cây khô có giá 3.200 USD/ kg, nếu thu hái trong tự nhiên giá cao gấp

3 l n Với giá trị kinh tế cao d n đến việc hai thác quá mức nguồn nguyên liệu

này đã hiến lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus lume.) đứng trước nguy

cơ tuyệt ch ng nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, lan kim

Tuyến (Anoectochilus setaceus lume.) được xếp trong nhóm IA c a Nghị định

32/2006/CP; và nhóm thực vật đang nguy cấp EN 1a, c, d trong Sách Đỏ Việt Nam 2007

Hiện nay, các loài lan kim Tuyến không ch được nghiên cứu về nuôi cấy

lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro để bảo tồn giống loài cũng như nguồn dược liệu Đã có nhiều công trình nghiên cứu về nuôi cấy in vitro

cây lan kim Tuyến với mong muốn tạo ra số lượng lớn cây lan kim Tuyến để đáp ứng được nhu c u tiêu dùng c a thị trường Vì vậy, để đáp ứng được những yêu

c u chúng ta phải nghiên cứu ổ sung các nhóm hoocmon như auxin, cyto inin

phát triển c a c y lan im Tuyến

ên cạnh đó, đ n hu nh quang là nguồn chiếu sáng chính trong các ph ng nuôi cấy mô thực vật Tuy nhiên, nó v n c n tồn tại một số nhược điểm nhất định như: tuổi thọ thấp, tiêu tốn nhiều điện năng, phát nhiệt, có những phổ ánh sáng không c n thiết,… Việc sử dụng ánh sáng đơn sắc đ n LED) có thể hắc phục được những hạn chế trên cũng như cải thiện hả năng và sinh trưởng c a c y

Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng c a một số yếu tố và thiết ế hệ thống LED

để hảo sát ảnh hưởng c a ánh sáng lên sự tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến

(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro”

2 Tình hình nghiên cứu

Hiện nay, các loài lan kim Tuyến không ch được nghiên cứu về hoạt tính

sinh học mà còn về các phương pháp nuôi cấy in vitro Đã có nhiều công trình nghiên cứu về nuôi cấy in vitro cây lan kim Tuyến với mong muốn tạo ra số

lượng lớn cây lan kim Tuyến để đáp ứng được nhu c u tiêu dùng c a thị trường Trong đó phải kể đến các công trình nghiên cứu như:

Chow và cộng sự 1982), đã nh n giống in vitro thành công loài lan kim Tuyến Anoectochilus formosannus từ hạt

Ket và cộng sự 2004) đưa ra quy trình nh n nhanh lan im Tuyến loài

Anoectochilus formosanus bằng phương pháp tạo đa chồi với nguồn m u an đ u

là chồi đ nh

Phùng Văn Phê và cộng sự 2010) đã nghiên cứu thành công ĩ thuật nhân

nhanh chồi in vitro loài lan kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl,

với nguyên liệu là thể chồi

Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Niệm 2012), đã thiết lập quy trình

nhân nhanh in vitro hoàn ch nh loài lan kim Tuyến Anoectochilus setaceus với

nguyên liệu là chồi và mắt đốt ngang thân

Trương Thị ích Phượng, Phan Ngọc Khoa 2013) cũng đã nhân lan kim Tuyến qua nuôi cấy cụm protocorm 2,0 × 2,0 mm) được hình thành từ hạt Trước nhu c u rất lớn về lan kim Tuyến dùng để làm thuốc, thực phẩm chức năng c a các công ty dược và người dân, một số Trung tâm nuôi cấy mô đã

chuyển hướng nghiên cứu nhân nhanh giống lan kim tuyến in vitro

Trong nhân giống in vitro thực vật, ánh sáng khác nhau về chất lượng,

cường độ và thời gian chiếu sáng đều có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển

c a thực vật Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự sinh trưởng và năng suất c a cây

Nguồn sáng nhân tạo sử dụng phổ biến trong nhân giống in vitro hiện nay là đ n

hu nh quang Mặc dù một số đ n hu nh quang thích hợp cho sự tăng trưởng thực vật nhưng tất cả các đ n hu nh quang đều tỏa nhiệt, lại phải tiêu tốn thêm một

ph n điện năng để làm giảm nhiệt độ nóng do các đ n này g y ra Theo Dương Tấn Nhựt 2002), chi phí điện năng ước tính khoảng 65% dùng cho thắp sáng trong phòng nuôi cây và khoảng 25% để làm mát ph ng nuôi Do đó, sự phát triển nguồn bức xạ hiệu quả hơn được sử dụng trong các phòng nuôi cấy mô sẽ mang lại nguồn lợi đáng ể để giảm chi phí sản xuất trong vi nhân giống

Các nghiên cứu trong nước về lĩnh vực nuôi cấy mô hiện nay ch yếu tập trung vào nghiên cứu ảnh hưởng c a các phytohormone trong quá trình phát sinh hình thái hay sinh trưởng và phát triển c a thực vật mà chưa đi s u tìm hiểu vai

trò c a ánh sáng trong nhân giống in vitro, đặc biệt là nguồn chiếu sáng từ đ n

LED (Light Emitting Diode) Hiện nay, đ n LED là thiết bị chiếu sáng đ y hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô và nâng cao khả năng tăng trưởng sinh học nhờ vào ích thước nhỏ, cấu trúc rắn, an toàn và tuổi thọ cao LED có những đặc tính

tốt hơn so với các nguồn sáng hác như: đ n hu nh quang, đ n sợi đốt, đ n natri cao áp ước sóng c a nó phát ra rất đặc biệt, chiều rộng c a vạch quang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang sinh học như là sự tổng hợp chlorophyll, quang hợp và phát sinh hình thái

3 Mục đích nghiên cứu

tăng trưởng c a c y lan im Tuyến Nhằm rút ngắn thời gian thu các đợt cây giống, số lượng cây giống, giúp hạ giá thành cây giống, góp ph n bảo tồn nguồn gen lan kim tuyến Cung cấp cây giống với số lượng không giới hạn cho các nhà vườn trồng làm nguyên liệu dược và thực phẩm chức năng Thiết ế mô hình chiếu sáng đ n LED trong nuôi cấy lan im Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro

4 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng c a nồng độ N cố định ết hợp với đến sự tạo chồi c a lan im Tuyến

cây

- Khảo sát ảnh hưởng c a giberelin (GA3) đến quá trình kéo dài thân ở cây

- Khảo sát ảnh hưởng c a ánh sáng LED đơn sắc đến quá trình nh n đa chồi

c a cây lan kim Tuyến

- Khảo sát tỷ lệ chiếu sáng tối ưu c a LED xanh dương và LED đỏ cho quá trình sinh trưởng c a c y lan kim Tuyến

- Khảo sát ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên hả năng tăng trưởng c a c y lan im Tuyến cấy trên giá thể ông g n

- Khảo sát ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên hả năng tăng trưởng c a c y lan im Tuyến cấy trên giá thể agar

- Khảo sát ảnh hưởng c a tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên hả năng tăng trưởng c a c y lan im Tuyến cấy trên giá thể mùn cưa

5 Các kết quả đạt được

- Xác định nồng độ N cố định ết hợp với đến sự tạo chồi c a lan

im Tuyến

- Xác định nồng độ c a bạc nitrate (AgNO3) đến khả năng tăng trưởng ở cây

- Xác định nồng độ c a giberelin (GA3) đến quá trình kéo dài thân ở cây

- Xác định loại ánh sáng LED đơn sắc đến quá trình tạo chồi c a cây lan kim Tuyến

- Xác định tỷ lệ chiếu sáng tối ưu c a LED xanh dương và LED đỏ cho quá trình sinh trưởng c a c y lan im Tuyến

- Xác định tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên hả năng tăng trưởng

c a c y lan im Tuyến cấy trên giá thể ông g n

- Xác định tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên hả năng tăng trưởng

c a c y lan im Tuyến cấy trên giá thể agar

- Xác định tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên hả năng tăng trưởng

c a c y lan im Tuyến cấy trên giá thể mùn cưa

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về đề tài

Lan kim tuyến còn gọi là Lan kim tuyến lông cứng, Kim tuyến tơ, Giải

thùy tơ, Lan gấm, Cỏ nhung, Kim cương (Anoectochilus setaceus) là một loài thực vật điển hình c a chi cùng tên (Anoectochilus) Lan kim Tuyến là một

loài lan đất Chúng sinh sống trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dưới các tán cây to trong rừng ẩm, ở độ cao 500 − 1.600 mét Hiện ở Việt Nam thống

kê gồm có 12 loài, trong đó loài Anoectochilus setaceus Blume phân bố ở Hà

Nội, Lào Cai, Hà Giang, Phú Thọ, KomTum, Gia Lai,… Thị trường lan kim Tuyến hiện đang rất thu hút bởi do lan kim Tuyến là loài lan dược liệu có chứa một số hoạt chất để phòng và ngừa trị bệnh ung thư nên việc nghiên cứu nuôi cấy

mô, nhân giống lan kim Tuyến cũng rất phát triển, một số giống lan kim Tuyến

có giá thành rất cao, giá thu mua từ vài trăm cho đên vài nghìn USD

Các chất điều h a sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển c a c y, đồng thời nó cũng thay đổi theo loài và bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa c a mô cấy, tùy theo việc muốn duy trì mô ở trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo m m hay muốn tái sinh cây hoàn

ch nh

Tất cả những môi trường nuôi cấy bao giờ cũng gồm các thành ph n: các muối hoáng đa lượng và vi lượng; các vitamin; các amino acid; nguồn carbon đường); các chất điều h a sinh trưởng thực vật; agar, than hoạt tính Ngoài ra có thể sử dụng phương pháp lắc m u ( lắc cảm ứng) nhằm phục vụ cho sự tăng trưởng c a cây

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo bốn hướng

Hướng nghiên cứu thứ nhất c a chúng tôi là tiến hành tạo chồi từ đốt thân dưới tác dụng c a BA ở các nồng độ khác nha và cố định 1 mg/l NAA, nhằm tạo

ra nguồn nguyên liệu an đ u và là tiền đề cho các thử nghiệm sau Kết quả cho

thấy BA 2 mg/l và NAA 1mg/l là thích hợp cho quá trình tạo chồi c a cây lan kim Tuyến

Hướng nghiên cứu thứ hai c a chúng tôi là từ các chồi trên tiến hành thử nghiệm về ảnh hưởng c a bạc nitrate (AgNO3) và gibberellin (GA3) bổ sung vào môi trường nhằm tìm ra nồng độ AgNO3 và GA3 thích hợp cho sự tăng trưởng

cho sự tăng trưởng c a cây

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển c a cây, việc chiếu sáng có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng c a tế bào, mô thực vật và sự sinh tổng hợp chất biến

dưỡng sơ cấp và thứ cấp (Ouyang et al., 2003) ường độ ánh sáng: từ 1000 –

2500 lux được dùng phổ biến trong nuôi cấy mô, với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng chồi chậm lại nhưng thúc đẩy quá trình tạo rễ Sự phân phối phổ ánh sáng, quang k và hướng chiếu sáng cũng đóng vai tr quan trọng trong quá trình sinh trưởng c a thực vật nuôi cấy mô Hiện nay, ánh sáng trắng c a đ n

hu nh quang được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm nuôi cây

mô

Hướng nghiên cứu thứ ba c a chúng tôi là thay đổi điều kiện nuôi cấy như: tiến hành chiếu sáng dưới các loại ánh sáng LED hác nhau và các điều kiện chiếu sáng khác nhau Ánh sáng là nhân tố vô cùng quan trọng trong quá trình quang hợp để tổng hợp các chất hữu cơ c n thiết cho c y sinh trường và phát triển Bên cạnh đó, ánh sáng có tác động rất lớn lên sự phát sinh hình thái thực vật rất c n thiết trong nuôi cấy mô và lan kim Tuyến là loài c n nhiều ánh sáng cho nên việc xác định loại ánh sáng và điều kiện chiếu sáng thích hợp cho

sự nhân chồi lan sẽ nâng cao chất lượng cây giống và giá trị kinh tế Kết quả cho thấy chồi nhân nhanh và phát triển mạnh ở ánh sáng LED đỏ và tỷ lệ kết hợp 50% LED đỏ với 50% LED xanh dương

Hướng nghiên cứu thứ tư c a chúng tôi là các cây lan kim Tuyến in vitro thu được tiến hành nhân nhanh chồi trong thí nghiệm ảnh hưởng c a tốc độ lắc giai đoạn cảm ứng) lên sự tăng trưởng c a cây lan kim Tuyến ở các loại giá thể (bông gòn, agar và mùn cưa) Mục đích nhằm tăng độ tiếp xúc với môi trường

cũng như g y tổn thường nhằm kích thích việc tạo thành các chồi mới, tốc độ lắc

100 – 150 vòng/phút ( m u lắc sau 7 ngày đem cấy chuyền lên các loại giá thể) cho tỷ lệ nhân nhanh chồi tốt nhất sau 8 tu n nuôi cấy

1.2 Các công trình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

Lê Linh Dung và Nguyễn Thị Kiều Linh 2013) đã nghiên cứu về vi nh n giống

lan Gấm Anoectochilus formosanus Hayata hảo sát vai tr các chất điều h a

sinh trưởng đến sự tái sinh c y lan Gấm hoàn ch nh trong điều iện in vitro Môi trường TS5 sử dụng môi trường nền Knudson có ổ sung 2 ppm P 0,2 ppm Kinetin 0,1 ppm G 3 thích hợp cho sự tái sinh chồi Kết quả đạt 94,3 %

số lượng m u tái sinh Môi trường K 7 sử dụng môi trường nền Knudson có

Tao và Li 2006) cũng quan sát được hiệu quả hi cho ạc nitrate lên sự

tạo chồi c a loài Torenia Fournieri ở nồng độ 25 mg/l

Theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012), cho biết cơ quan và

m u phù hợp nhất là thể chồi và mắt đốt ngang th n đối với loài lan kim Tuyến

Anoectochilus setaceus được khử trùng và đưa vào các môi trường nền khác nhau

(MS, Knudson C, Knud*) Các chồi và mắt đốt được chuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung , Kinetin, αN trong 4 tu n Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là Knud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kin + 0,3 mg/l NAA + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 0,5 g/l than hoạy tính cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/ m u Các chồi có chiều cao từ 3 – 4 cm

được sử dụng để ra rễ in vitro Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/ chồi là 4,21 (rễ/

chồi) đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung 1 mg/l αN

Theo Thomass và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích

25 ml, tốc độ phù hợp nhất c a máy lắc là 100 − 150 v ng/phút Thể tích c a môi

trường lỏng phải phù hợp với ích thước bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình

Theo Vũ Ngọc Lan (2012) nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều h a sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng hai loài

lan bản địa ( Dendrobium Nobile Lindl., Dendrobium Chrysanthum Lindl.) tại

Hà Nội cho kết quả là phương pháp nh n nhờ nuôi cấy lỏng lắc nút bông và nuôi

cấy lỏng lắc thoáng hí đã tăng hệ số nhân thể sinh chồi c a Dendrobium Nobile

Lindl đạt 1,9 l n và 2,3 l n so với đối chứng

Dương Tấn Nhựt và Nguyễn á Nam 2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng

c a hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và phát triển c a cây hoa Cúc

(Chrysanthemum morifoliumcv “Nút”) nuôi cấy in vitro Dưới các điều kiện

chiếu sáng hác nhau: 100% LED đỏ, 100% LED xanh, 50% LED đỏ + 50% LED xanh, 70% LED đỏ 30% LED xanh, 80% LED đỏ + 20% LED xanh, 90% LED đỏ 10% LED xanh và ánh sáng đ n hu nh quang (neon) Những chồi Cúc phát triển tốt nhất dưới điều kiện chiếu sáng 90% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 10% ánh sáng LED xanh, cho trọng lượng tươi và số lá lớn nhất so với các điều

kiện chiếu sáng còn lại

Nguyễn Bá Nam và cộng sự 2012) đã nghiên cứu thành công ảnh hưởng c a các loại m u cấy và hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên khả năng tái sinh

chồi cây hoa Cúc (Chrysanthemum morifolium ramat.cv “Jim a”) nuôi cấy in

vitro Dưới các điều kiện chiếu sáng hác nhau: 100% LED đỏ, 100% LED xanh,

50% LED đỏ 50% LED xanh, 70% LED đỏ 30% LED xanh, 80% LED đỏ + 20% LED xanh, 90% LED đỏ 10% LED xanh, ánh sáng đ n hu nh quang (neon) và trong tối Kết quả 70% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 30% ánh sáng LED xanh là tỷ lệ phù hợp cho sự tái sinh chồi trực tiếp từ m u lá và gián tiếp từ lớp mỏng tế bào thân cây Cúc so với các điều kiện chiếu sáng còn lại

Hoàng Văn ương và cộng sự 2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng c a ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả năng tích lũy hoạt chất saponin thông qua

nuôi cấy mô sẹo c a cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) in

vitro Các m u mô sẹo và c y được nuôi cấy dưới 5 loại ánh sáng khác nhau:

100% ánh sáng LED xanh, 100% ánh sáng LED đỏ, ánh sáng LED xanh và ánh sáng LED đỏ kết hợp với tỷ lệ 50 : 50, 30 : 70, 20 : 80; ánh sáng hu nh quang được sử dụng làm đối chứng Kết quả cho thấy trọng lượng tươi và trọng lượng khô c a mô sẹo thu được là cao nhất khi các m u lá được nuôi cấy dưới ánh sáng

xanh và ánh sáng đỏ kết hợp với tỷ lệ 50 : 50

Năm 2002, Tsay và cộng sự đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây

Anoectochilus Formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung

tích 500 ml + 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA + 2% than hoạt tính

Với công trình nghiên cứu gieo hạt in vitro cây A roxburghii tác giả

Huang và cộng sự 2002) đã tìm ra được môi trường Knudson C có bổ sung 0,5

mg/l BA + 20% dịch khoai tây là thích hợp cho sự phát triển protocorm từ hạt A

roxburghii

Huang và Liu 2002) đã thành công trong việc tìm ra môi trường cảm ứng sản sinh m m rễ (protocorm) từ hạt c a loài lan kim Tuyến là môi trường Knudson C bổ sung 0,5 mg/l 6 - BA và 20% dịch chiết khoai tây

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài thực hiện tại ph ng nuôi mô cấy tế bào Thực vật

2.2 Vật liệu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

M u lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro do phòng Công nghệ tế bào thực vật, khu Nông nghiệp Công nghệ cao TP HCM cung

cấp

2.2.2 Hóa chất và môi trường

 Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường MS Murashige and S oog, 1962) làm môi trường cơ bản

 Dụng cụ pha môi trường và khử trùng

Cân phân tích có tải cân từ 0,0001g đến 250g

Máy đo pH

Ống đong có dung tích 1000 ml, 500 ml, 100 ml, 50 ml

Cốc th y tinh 50 – 1000 ml

Bình nuôi cấy bằng th y tinh dung tích 100 ml, 250 ml

2.2.4 Điều kiện trong phòng thí nghiệm

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày

Môi trường nuôi cấy được điều ch nh về pH = 5,7 – 5,8 bằng NaOH (1N), hoặc H l 1N) Môi trường được chuẩn bị và hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm, trong vòng 20 phút

Môi trường sau khi hấp sẽ được trữ ở phòng lạnh ≥ 48h sẽ đem cấy

Chuẩn bị môi trường lỏng lắc: cho 40 ml môi trường (không bổ sung agar) vào ình 250 ml, sau đó cấy m u vào môi trường và để lên hệ thống lắc ta điều

ch nh tốc độ như hảo sát) như ở hình 2.1

Hình 2.1 Máy lắc

Chuẩn bị môi trường giá thể: cho 25 ml môi trường vào ình 100 ml, sau đó để giá thể sao cho vừa ngập như ở hình 2.1

Hình 2.2 Các loại giá thể để cấy chuyền sau khi lắc mẫu

a Bông gòn; b Agar; c Mùn cưa

2.3.2 Thiết kế thí nghiệm chiếu sáng

a Thiết kế hệ thống chiếu sáng LED đơn sắc

Trong thiết kế hệ thống chiếu sáng, đ u tiên tôi tạo những buồng tối có kích thước 35 x 70 x 50 cm tương ứng l n lượt là chiều rộng, chiều cao, chiều dài)

Hệ thống buồng tối phải ín, đảm bảo không có sự ảnh hưởng c a ánh sáng ngoài

tự nhiên đến kết quả nghiên cứu Chúng tôi sử dụng LED trên mỗi buồng nuôi cấy, bố trí như ở hình 2.3 và hình 2.4

Hình 2.3 Mô hình LED đơn sắc để nuôi cấy mẫu lan kim Tuyến

(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro

a Hệ thống LED trắng; b Hệ thống LED vàng; c Hệ thống LED anh

dương; d Hệ thống LED đỏ

Hình 2.4 Hệ thống chiếu sáng LED đơn sắc để nuôi cấy mẫu lan kim Tuyến

(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro

a Hệ thống LED trắng; b Hệ thống LED vàng; c Hệ thống LED anh

dương; d Hệ thống LED đỏ

b Thiết kế hệ thống chiếu sáng LED đỏ kết hợp LED anh dương

Trong thiết kế hệ thống chiếu sáng, đ u tiên tôi tạo những buồng tối có kích thước 35 x 70 x 50 cm tương ứng l n lượt là chiều rộng, chiều cao, chiều dài)

Hệ thống buồng tối phải ín, đảm bảo không có sự ảnh hưởng c a ánh sáng ngoài

tự nhiên đến kết quả nghiên cứu Chúng tôi sử dụng LED trên mỗi buồng nuôi cấy, bố trí như ở hình 2.3 và hình 2.4

Hình 2.5 Mô hình chiếu sáng LED đỏ kết hợp LED anh dương để nuôi cấy

mẫu lan kim Tuyến (A.setaceus Blume.) in vitro

a Hệ thống LED đỏ ĐC ; b Hệ thống ết hợp 70% LED đỏ và 30% LED anh dương; c Hệ thống ết hợp 50% LED đỏ và 50% LED anh dương; d

Hệ thống ết hợp 30% LED đỏ và 70% LED anh dương

Hình 2.6 Hệ thống LED đỏ kết hợp LED anh dương để nuôi cấy mẫu lan

kim Tuyến (A.setaceus Blume.) in vitro a Hệ thống LED đỏ ĐC ; b Hệ

thống ết hợp 70% LED đỏ và 30% LED anh dương; c Hệ thống ết hợp 50% LED đỏ và 50% LED anh dương; d Hệ thống ết hợp 30% LED đỏ

và 70% LED anh dương

2.3.3 Bố trí thí nghiệm

Đề tài được thực hiện trên m u lan kim Tuyến in vitro các thí nghiệm được

bố trí theo kiểu hoàn toàn ng u nhiên

2.3.3.1 Thí nghiệm 1: hảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA cố định ết hợp

với BA đến sự tạo chồi của lan im Tu ến (Anoectochilus setaceus

 Đoạn cắt th n c y lan im Tuyến được nuôi cấy trên môi trường MS

có ổ sung glucose 30 g/l), agar 9 g/l), than 1 g/l) và nồng độ và

N như ảng 2.1

vào ình th y tinh có thể tích 100ml, có chứa 25 ml môi trường, mỗi ình cấy 1 m u

Bảng 2.1 Ảnh hưởng nồng độ NAA cố định ết hợp với BA đến sự tạo chồi

của lan im Tu ến (Anoectochilus setaceus Blume.) Nghiệm thức Nồng độ BA mg/l Nồng độ NAA mg/l

2.3.3.2 Thí nghiệm 2: hảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate AgNO 3 đến hả

n ng t ng trưởng chồi ở c lan im Tu ến

Mục đích:

giúp ức chế sự sản sinh ethylene ở c y lan im Tuyến và ích thích sự tăng trưởng c a m u cấy

ách tiến hành:

 Từ ết quả thí nghiệm 1, chúng tôi thấy nồng độ 2 mg/l) ết hợp

N 1 mg/l) là thích hợp cho sự tạo chồi, nên chúng tôi chọn môi

sự tăng trưởng chồi lan im Tuyến

MS có ổ sung glucose 30 g/l), agar 9 g/l), than 1 g/l), 2 mg/l),

cấy vào các ình th y tinh có thể tích 100ml, có chứa 25 ml môi trường, mỗi ình cấy 1 m u

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của bạc nitrate AgNO 3 đến hả n ng phát triển đ nh sinh trưởng của c lan im Tu ến (Anoectochilus setaceus Blume.)

2.3.3.3 Thí nghiệm 3: hảo sát ảnh hưởng của giberelin GA 3 đến quá

trình éo dài th n ở c lan im Tu ến (A setaceus Blume.)

Mục đích

đến quá trình éo dài th n ở c y c y lan im Tuyến

ách tiến hành

này ết hợp với G 3 để hảo sát G 3 ảnh hưởng đến quá trình éo dài

th n c a lan im Tuyến

MS có ổ sung glucose 30 g/l), agar 9 g/l), than 1 g/l), 2 mg/l),

cấy vào các ình th y tinh có thể tích 100ml, có chứa 25 ml môi trường, mỗi ình cấy 1 m u

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của giberelin (GA 3 đến quá trình kéo dài thân cây

Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.)

 Ghi nhận ết quả sau 8 tu n nuôi cấy

2.3.3.4 Thí nghiệm 4: hảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đến quá trình

tạo chồi của c Lan im Tu ến (A setaceus Blume.) nuôi cấy in vitro

mg/l) cho ết quả tốt nhất, hi nuôi cấy trên môi trường MS, ánh sáng

đ n hu nh quang Trong thí nghiệm này, chúng tôi thay đổi nguồn sáng, sử dụng ánh sáng từ đ n LED đơn sắc để hảo sát ảnh hưởng

c a ánh sáng đến hả năng tăng trưởng và tạo chồi c a c y lan im Tuyến

có ổ sung glucose 30 g/l), agar 9 g/l), than 1 g/l), 2 mg/l), NAA (1 mg/l), AgNO3 (3 mg/l), GA3 (15 mg/l) Sau hi cấy xong chuyển tất cả vào hệ thống đ n như đã ố trí ở ảng 2.4 và như ở hình 2.6

dài 1,0 – 1,5 cm Mỗi ình cấy a m u ng u nhiên, được cấy vào các ình có thể tích là 250 ml, có chứa 40 ml môi trường, mỗi ình cấy 3

m u

Bảng 2.4 Ảnh hưởng ánh sáng LED đến quá trình phát sinh chồi của cây

lan im Tu ến (Anoectochilus setaceus Blume.) nuôi cấy in vitro

2.3.3.5 Thí nghiệm 5: hảo sát tỷ lệ ết hợp của LED đỏ và LED anh dương lên quá trình t ng trưởng và tạo chồi c lan im Tu ến

(Anoectochilus setaceus Blume.)

Mục đích

Thí nghiệm này tiến hành nhằm xác định tỷ lệ ết hợp c a LED đỏ với LED xanh dương lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi c y lan im Tuyến

ổ sung glucose 30 g/l), agar 9 g/l), than 1 g/l), 2 mg/l), N 1 mg/l), AgNO3 (3 mg/l), GA3 (15 mg/l) Sau hi cấy xong chuyển tất cả vào hệ thống đ n như đã ố trí ở ảng 2.5 và như ở hình 2.7

M u cấy ng u nhiên đốt th n, chồi ngọn) c a c y lan im Tuyến dài 1,0 – 1,5 cm, được cấy vào các ình có thế tích 250 ml, mỗi ình chứa

40 ml môi trường, mỗi ình cấy a m u

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của LED đỏ và LED anh dương lên quá trình t ng

trưởng và tạo chồi cây Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.)

2.3.3.6 Thí nghiệm 6: hảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc giai đoạn cảm ứng và giá thể lên hả n ng t ng trưởng của c lan im Tu ến

(Anoectochilus setaceus Blume.)

a Thí nghiệm 6.1: hảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc mẫu giai đoạn cảm ứng lên hả n ng t ng trưởng của c lan im Tu ến

(Anoectochilus setaceus Blume cấ trên giá thế bông gòn

Mục đích

Thí nghiệm này tiến hành nhằm xác định tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên hả năng tăng trưởng c a c y lan im Tuyến và sự tăng trưởng c a m u cấy trên giá thế ông g n

ách tiến hành

huẩn ị môi trường lỏng và môi trường giá thể:

- Môi trường tiền nuôi cấy lỏng): MS 30 g đường 2 mg/l

- Môi trường giá thể ông g n: MS 30 g đường 2 mg/l 1

- ước 1: ảm ứng trong môi trường lỏng lắc: cắt đốt th n c a c y Lan Kim Tuyến dài 1,0 – 1,5 cm được nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc trên máy lắc trong thời gian 7 ngày Tốc độ lắc được ố trí như ở ảng 2.6

- ước 2: ác đoạn cắt th n c y lan im Tuyến sau hi được cảm ứng tạo trong môi trường lỏng lắc 7 ngày được cấy chuyền sang môi trường giá thể ông g n

Bảng 2.6 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả n ng hình thành chồi của đoạn

cắt thân lan kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume được cảm ứng trong

môi trường lỏng lắc và sinh trưởng trên giá thể bông gòn

b Thí nghiệm 6.2: hảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc mẫu giai đoạn cảm ứng lên hả n ng t ng trưởng của c lan im Tu ến

(Anoectochilus setaceus Blume cấ trên giá thế agar

ách tiến hành

- Môi trường tiền nuôi cấy lỏng): MS 30 g đường 2 mg/l +

- Môi trường giá thể agar: MS 30 g đường 2 mg/l 1 mg/l NAA + 15 mg/l GA3 + 3 mg/l AgNO3 + 1 g than + 9 g/l agar

- ước 1: ảm ứng trong môi trường lỏng lắc: cắt đốt th n c a c y lan im Tuyến dài 1,0 – 1,5 cm được nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc trên máy lắc trong thời gian 7 ngày Tốc độ lắc được ố trí như ở ảng 2.7

- ước 2: ác đoạn cắt th n c y lan im Tuyến sau hi được cảm ứng tạo trong môi trường lỏng lắc 7 ngày được cấy chuyền sang môi trường giá thể agar

Bảng 2.7 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả n ng hình thành chồi của đoạn cắt thân Lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus Blume được cảm ứng

trong môi trường lỏng lắc và sinh trưởng trên giá thể agar

 Ghi nhận ết quả sau 8 tu n nuôi cấy

c Thí nghiệm 6.3: hảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc mẫu giai đoạn cảm ứng lên hả n ng t ng trưởng của c lan im Tu ến

(Anoectochilus setaceus Blume.)

Mục đích

Thí nghiệm này tiến hành nhằm xác định tốc độ lắc m u giai đoạn cảm ứng) lên hả năng tăng trưởng c a c y lan im Tuyến và sự tăng trưởng c a

m u cấy trên giá thế mùn cưa

ách tiến hành

- Môi trường tiền nuôi cấy lỏng): MS 30 g đường 2 mg/l

- Môi trường giá thể agar: MS 30 g đường 2 mg/l + 1 mg/l NAA + 15 mg/l GA3 + 3 mg/l AgNO3 + 1 g than + 9 g/l agar

- ước 1: ảm ứng trong môi trường lỏng lắc: cắt đốt th n c a c y Lan Kim Tuyến dài 1,0 – 1,5 cm được nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc trên máy lắc trong thời gian 7 ngày Tốc độ lắc được ố trí như ở ảng 2.8

- ước 2: ác đoạn cắt th n c y Lan Kim Tuyến sau hi được cảm ứng trong môi trường lỏng lắc 7 ngày được cấy chuyền sang môi trường giá thể mùn cưa

Bảng 2.8 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả n ng hình thành chồi của đoạn

cắt thân Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume được cảm ứng

trong môi trường lỏng lắc và sinh trưởng trên giá thể mùn cưa

Nghiệm thức Tốc độ lắc vòng/ ph t

- Số chồi chồi/m u)

- hiều cao chồi cm)

ác m u tự hác nhau a, ,…) ch sự sai hác có ý nghĩa thống ê với p < 0,05