Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

Trong những năm gần đây, bảo quản sinh học dùng vi khuẩn và / hoặc các chất chuyển hóa của vi khuẩn để ngăn chặn sự hư hỏng Stiles, 1996 đã đạt được sự quan tâm của người tiêu dùng

-

CÔNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA

LẦN THỨ XIX NĂM 2107

TÊN CÔNG TRÌNH: SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SPP PHÂN

LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG ĐỂ KÉO DÀI THỜI GIAN BẢO QUẢN BÁNH MÌ

Mã số công trình:………

(Phần này do BTC Giải thưởng ghi)

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH vii

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 2

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus 5

1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 7

1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 8

1.1.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 10

1.1.2.1 Quá trình trao đổi chất 10

1.1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 11

1.1.3 Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 12

1.2 Tổng quan về nấm mốc 13

1.2.1 Đặc điểm 14

1.2.2 Tác hại của nấm 15

1.3 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì 15

1.3.1 Giới thiệu chung 15

1.3.2 Quy trình làm bánh mì 17

1.3.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì 21

1.3.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì 22

1.4 Tổng quan về bột chua 23

1.4.1 Đặc tính của bột chua 23

1.4.2 Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua 24

1.4.3 Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với hương vị của bánh mì 25

1.4.4 Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua 26

Chương 2: MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Mục tiêu đề tài, nội dung nghiên cứu 29

2.1.1 Mục tiêu 29

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 29

2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 29

2.2.1 Nguồn vi sinh vật 29

2.2.2 Hoá chất và môi trường sử dụng 29

2.2.2.1 Hoá chất 29

2.2.2.2 Môi trường nuôi cấy (xem ở Phụ lục 1) 30

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 30

2.2.3.1 Thiết bị 30

2.2.3.2 Dụng cụ 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.4 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 32

2.4.1 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp 32

2.4.2 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp 32

2.4.2.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa 32

2.4.2.2 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp in vitro 37

2.4.3 Xây dựng đường chuẩn 39

2.4.3.1 Lactobacillus spp 39

2.4.3.2 Nấm mốc Aspergillus niger 39

2.4.4 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger khi đồng lên men bánh mì của vi khuẩn LAB với nấm men 40

2.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì 43

2.4.5.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau 43

2.4.5.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản 45

2.4.5.3 Độ nở bánh mì 47

2.4.5.4 Độ ẩm bánh mì 47

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp 48

3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát về sinh lý, sinh hóa 48

3.1.2 Khả năng sinh acid 50

3.1.3 Khả năng sinh enzyme protease 50

3.1.4 Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus spp in vitro 51

3.2 Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men bánh mì với nấm men 52

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì 55

3.4.1 Đánh giá cảm quan 55

3.4.1.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 ở các mật độ khác nhau 55

3.4.1.2 Khảo sát mức độ ưa thích về màu sắc, độ xốp, mùi vị của bánh mì có bổ sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường và bánh mì có chất bảo quản 57

3.4.2 Đánh giá độ nở 59

3.4.2 Đánh giá độ ẩm 62

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

1 Kết luận 65

2 Kiến nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

Tài liệu tiếng Việt 67

Tài liệu tiếng Anh 68

PHỤ LỤC 1 1

PHỤ LỤC 2 3

PHỤ LỤC 3 10

PHỤ LỤC 4 11

DANH MỤC VIẾT TẮT

- LAB: Lactic acid bacteria/Lactobacillales

- MRS agar: de Man, Rogosa, Sharpe Agar

- MRS broth: de Man, Rogosa, Sharpe Broth

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men

(Corsetti và cộng sự, 1998) 13

Bảng 2.1: Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì 41

Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn Lactobacillus spp 49 Bảng 3.2: Độ acid (% TA) của chủng Lactobacillus spp 50 Bảng 3.3: Đường kính vòng phân giải protein của chủng Lactobacillus spp 50 Bảng 3.4: Tỉ lệ ức chế của vi khuẩn Lactobacillus spp với nấm mốc theo phương

pháp cấy 2 đường vi khuẩn 51

Bảng 3.5: Bảng mật độ / khối lượng cần bổ sung 53 Bảng 3.6: Kết quả đối kháng nấm giữa các mẫu 54

Bảng 3.7: Mức độ ưa thích của bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus

sp.C1 56

Bảng 3.8: Kết quả đánh giá cảm quan mức độ ưa thích về các chỉ tiêu màu sắc, độ

xốp, mùi, vị của các mẫu bánh mì 58

Bảng 3.9: Đánh giá chung về mức độ ưa thích của các mẫu bánh mì 58 Bảng 3.10: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BML5 60 Bảng 3.11: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của mẫu bánh mì BMC1 60 Bảng 3.12: Kết quả sự thay đổi chiều cao và bề ngang của các mẫu bánh mì 61

Bảng 3.13: Đánh giá độ ẩm của mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 và

Lactobacillus sp.C1 62

Bảng 3.14: Đánh giá độ ẩm của các mẫu bánh mì khi vừa nướng xong và sau 7 ngày

bảo quản 63

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus 5

Hình 1.2: Tế bào nấm Aspergillus niger 14

Hình 1.3: Bánh mì thành phẩm 16

Hình 1.4: Quy trình làm bánh mì 18

Hình 1.5: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid lactic (được chuyển thể từ Liu và cộng sự, 2008) 27

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu 31

Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hoá chủng Lactobacillus spp 33

Hình 2.3: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 37

Hình 2.4: Cách đo đường kính vòng ức chế phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn 39 Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm trên bánh mì 40 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc trên MRS agar 48

Hình 3.2: Kết quả nhuộm Gram 49

Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 52

Hình 3.4: Đối kháng nấm Aspergillus niger 52

Hình 3.7: Khảo sát đối kháng in vivo 55

Hình 3.8: Mẫu bánh mì bổ sung 2 chủng lactic chuẩn bị đánh giá cảm quan 57

Hình 3.9: Tiến hành thí nghiệm cảm quan mẫu bổ sung 2 chủng lactic 57

Hình 3.10: Mẫu bánh mì chuẩn bị đánh giá cảm quan 59

Hình 3.11: Tiến hành thí nghiệm cảm quan 59

Hình 3.12: Độ nở của bánh mì 62

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men, nhằm lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín Nấm mốc là tác nhân chính gây hư hỏng bánh mì mang lại những thiệt hại lớn về kinh tế đồng thời sản sinh ra các độc tố gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Vì vậy, hóa chất bảo quản được

sử dụng để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì

Trong nghiên cứu này 2 chủng Lactobacillus sp L5 và Lactobacillus sp C1 được phân lập từ nem chua, cơm mẻ có khả năng ức chế nấm mốc Aspergillus niger (môt loài nấm mốc gây hư hỏng bánh mì) 65,15% và 59,87% khi khảo sát in vitro

Khi cảm nhiễm bánh mì với 102 bt/g A niger và sử dụng vi khuẩn lactic đồng lên

men bánh mì với nấm men mật độ 107 tb/g thì mật độ vi khuẩn 109 cfu/g cho kết quả

tốt nhất về kháng nấm và cả về chất lượng bánh mì Mẫu bổ sung Lactobacillus sp.C1

109 cfu/g có khả năng kháng nấm tốt hơn, tuy nhiên trong các khảo sát về độ nở, độ

ẩm thì chủng Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.C1 tương đương nhau chiều

cao (0,97-1,27cm) và bề ngang (1,17-1,30cm) Khi khảo sát mức độ ưa thích, người

tiêu dùng ưa thích mẫu có bổ sung Lactobacillus sp.L5 hơn vì ở mẫu có bổ sung

Lactobacillus sp.C1 có vị chua hơn, mẫu có bổ sung vi khuẩn lactic có mức ưa thích

tương đương với mẫu bổ sung chất bảo quản Canxi propionate với thời gian bảo quản được 7,5-8 ngày Vì vậy, vi khuẩn lactic được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống có thể thay thế chất bảo quản để kéo dài thời gian bảo quản và cải thiện chất lượng sản phẩm bánh mì

Từ khóa: bột chua, chất bảo quản, lactic acid bacteria (LAB), lên men bánh

mì, ức chế nấm mốc

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khoảng một nửa số dân trên thế giới dùng bánh mì làm món ăn vào buổi sáng bởi tính tiện dụng Trên khắp thế giới, bánh mì rất đa dạng về cả hình dạng và công thức chế biến cũng như cách bảo quản Sự hư hỏng của sản phẩm bánh mì chủ yếu là

do sự tăng trưởng của nấm; các loài chủ yếu liên quan đến là Aspergillus, Fusarium,

và Penicillium Ngoài những thiệt hại kinh tế lớn bắt nguồn từ sự hiện diện của nấm

mốc, mối quan tâm khác là việc nấm mốc sản xuất độc tố tiềm năng có thể gây ra vấn đề sức khỏe cộng đồng (Legan, 1993) Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, chất lượng cuộc sống và nhu cầu của con người ngày càng cao, nhất là nhu cầu về lương thực thực phẩm Con người đòi hỏi thực phẩm đa dạng, tiện dụng, an toàn và hiệu quả

Trong những năm gần đây, bảo quản sinh học (dùng vi khuẩn và / hoặc các chất chuyển hóa của vi khuẩn để ngăn chặn sự hư hỏng) (Stiles, 1996) đã đạt được sự quan tâm của người tiêu dùng vì không độc hại và kéo dài được thời hạn sử dụng của thực phẩm LAB có lịch sử lâu dài trong việc bảo quản thực phẩm khỏi các vi sinh vật gây hư hỏng - chúng thường được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm, có thể sản sinh ra một số chất chuyển hóa mang lại lợi ích cho sức khỏe và do

đó thường được coi là an toàn (GRAS) (Belal J Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid Saari, 2011) Thời hạn bảo quản bánh mì được kéo dài khi một số chủng LAB nhất định được thêm vào các công thức bánh mì (Muhialdin và cộng sự, 2011a, Ogunbanwo và cộng sự, 2008, Rizzello và cộng sự, 2010, Ryan và cộng sự, 2011) Việc sử dụng vi khuẩn an toàn trong bánh mì để kéo dài thời gian bảo quản của bánh

mì là một lĩnh vực nghiên cứu tuyệt vời Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện nay chỉ có vài đề tài nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm của LAB, đặc biệt chưa có nghiên cứu nào về ứng dụng vi khuẩn lactic đồng lên men bánh mì với nấm men để ức chế nấm mốc kéo dài thời gian bảo quản của bánh mì Vì những lợi ích của LAB mang lại, tôi đã

chọn hướng cho đề tài nghiên cứu là: “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập

từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì”

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.1.1 Giới thiệu chung

Lịch sử phát hiện ra vi khuẩn lactic:

- Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hoá học người Thuỵ Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua

- Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic

- Vào năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là

Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic)

- Đến năm 1881, ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình thành

Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năng tạo bào tử Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ nghi, không chứa cytochrom

và enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh Chúng phân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển Chính do sự sinh acid lactic, một acid yếu nên vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong các thực phẩm lên men, dùng

để ức chế sự tăng trưởng của các tác nhân gây hư hỏng LAB có thể lên men các loại đường monosaccharide và disaccharide nhưng không phải bất cứ chủng vi khuẩn lactic nào cũng có thể lên men đường disaccharide: một số chủng không thể lên men saccharose, một số lại không thể sử dụng được lactose, các vi khuẩn latic không lên

men được tinh bột (ngoại trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các loại

polysaccharide khác

Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại

cũng được sử dụng trong phân loại Theo khóa phân loại của Bergey, họ

Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacieae

- Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc

- Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus

Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là cỏ khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột Một số loài trong họ vi khuẩn

lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng

gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hình que Phân biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn lactic

từ 1 - 8μm Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi

Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%) Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển

ở nhiệt độ tương đối thấp (5 oC hoặc thấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25 - 35 oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 45 oC Khi gia nhiệt tới 60 – 80 oC hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút Sự phát triển của nó cần

có sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amin Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5.5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5.5 quá trình lên men bị dừng lại Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân huỷ protein của sữa thành các peptid và acid amin Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn cao hơn Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit Một số loài có khả năng tạo thành màng nhầy Một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic, các loài này còn có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta gọi các hợp chất này là bacteriocin) Những chất kháng sinh này không dùng trong y

học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan Các vi khuẩn lactic ngoài việc tạo thành acid còn có 1 số loài tạo được chất thơm ( diacetyl, acetoin,

acid bay hơi ) như Streptococcus diacetylactic

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus

Tuỳ theo hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que Kích thước của chúng cũng thay đổi tuỳ theo từng loài

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus

Phân loại khoa học:

Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L.acidophilus, L.brevis,

L.casei, L.fermentum, L.plantarum, L.bulgaricus,

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase

âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes Các loài

Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt

là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như:

Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, plantarum Sự phân chia của vi khuẩn lactic

dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài

Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm

- Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, chúng được gọi là Thermobacterium, có

fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 45℃

- Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có

FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase) Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình

và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic.


- Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có

phosphoketolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình.


Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus có vai trò hữu ích

trong điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy khi đi du lịch, tiêu chảy do

nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng không dung nạp Lactose, bệnh về da như:

bang đỏ do sốt, chàm, mụn trứng cá, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường

hô hấp

1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Để sinh trưởng bình thường, ngoài nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như nguồn carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà chúng còn

có nhu cầu về một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng

 Nhu cầu dinh dưỡng carbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các monosaccharide (glucose, fructose, manose) và các disaccaride (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccaride (tinh bột, dextrin) Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,

 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ

có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, Hiện nay, cao nấm men

là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

 Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không

có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men

 Nhu cầu các chất hữu cơ khác


Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ.
Một số acid hữu cơ có

ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

 Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

 Nhu cầu dinh dưỡng oxy

Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí (microaerophile), sinh trưởng trên bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí (B.J.B Wood and Holzapfel W.H, 1995) Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí

1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004) Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này

 Thành phần môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic

có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin),

vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men

 Yếu tố môi trường

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng rất lớn đối với vi sinh vật Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây

ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40℃ Một

số có thể sinh trưởng dưới 15℃ và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5℃ (B.J.B Wood and Holzapfel W.H, 1995)

- Ảnh hưởng của pH

Vi khuẩn lactic nói chung có thể phát triển được trong môi trường acid, khoảng

pH của chúng có thể từ 4.5 – 8.5 Trong quá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh ra acid lactic, khi pH thấp hơn 4 một mặt nó sẽ ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nó cũng ức chế sự phát triển của chính nó, do đó cần phải theo dõi suốt quá trình lên men, dùng bazơ để điều chỉnh pH về thích hợp

- Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men

Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men

1.1.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic

1.1.2.1 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm:

 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-acetiyl Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:

𝐶6𝐻12𝑂6 → 2𝐶𝐻3CHOHCOOH + 21,8.104 J Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose được chuyển hóa theo chu trình EMP (Embden-Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho quy trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đến pyruvat Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên acid pyruvic không thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic

 Lên men lactic dị hình


Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài các sản phẩm phụ như acid acetic, ethanol, acid succinic, C𝑂2 Phương trình chung biễu diễn quá trình lên men:

𝐶6𝐻12𝑂6 → 𝐶𝐻3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐶2𝐻5𝑂𝐻 + 𝐶𝑂2

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20%, đôi khi không có các khí mà thay vào đó

là sự tích lũy một lượng lớn acid formic Như vậy, trong quá trình lên men lactic dị hình có nhiều sản phẩm phụ khác nhau đáng kể được tạo thành, chứng tỏ quá trình này phức tạp hơn nhiều so với quá trình lên men lactic đồng hình Theo quan điểm tiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học, người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình

1.1.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược

và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007) Vi khuẩn lactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học Ngoài

ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như reuretin, acid lactic,

1.1.3 Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic

LAB được biết đến bởi khả năng kháng nấm của chúng, điều đó liên quan đến việc sản xuất 1 loạt các loại hợp chất bao đồm acid, alcohol, CO2, diacetyl, H2O2, phenyllactic acid, bacteriocin và cycle peptide Đặc tính nổi bật của hợp chất bề mặt của LAB là tính ổn định nhiệt của các hợp chất kháng nấm có trong nó Điều này thúc đẩy việc sử dụng các hợp chất bề mặt của LAB hoặc các hợp chất chống nấm trong các thực phẩm được xử lý nhiệt Các hợp chất bề mặt của LAB hoạt động trong phổ

pH rộng, kéo dài từ 3 đến 9 tùy thuộc vào từng chủng khác nhau Đây có thể coi là một yếu tố chính khi LAB được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm khi so sánh với chất bảo quản hóa học (Belal J Muhialdin, Zaiton Hassan and Nazamid

Saari, 2011) Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi

đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng Hoạt động

kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt

độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và cộng sự, 2001) Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.2).; Lavermicocca và cộng sự, 2000; Niku- Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003; Sjogren, 2005) Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được

2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng

nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus

subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus

NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được

xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996)

Bảng 1.1: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men

Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-,

formic- and n- valeric acid Lactibacillus sanfranciscensis CB1

1.2 Tổng quan về nấm mốc

Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng

có thành tế bào bằng kitin (chitin) Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi

đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium) Nấm thường sinh sản qua bào tử hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng Quá trình sinh sản có thể là vô tính hay hữu tính Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể) Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường

Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật, thực vật và nấm khác Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất

Tên Khoa Học: Aspergillus niger

Nấm mốc Aspergillus có hình dạng sợi, phân nhánh có vách ngăn (cấu tạo đa

bào) Khi mới phát triển sợi nấm màu trắng, sau đó sẫm lại nhưng không hoàn toàn đen Bào tử của chúng là có màu đen tuyền Từ một sợi đầu tiên chúng phân nhánh

tạo ra 2 - 4 nhánh sợi nhỏ Nấm mốc Aspergillus có hai hình thức sinh sản: hữu tính

và vô tính.

Hình 1.2: Tế bào nấm Aspergillus niger

1.2.2 Tác hại của nấm

Những tổn thất về kinh tế và các nguy cơ sức khoẻ do độc tố nấm gây ra là mối quan tâm chính của ngành công nghiệp thực phẩm (Gray & Bemiller, 2003) Theo Gerez và cộng sự (2009) sự hư hỏng do nấm của các sản phẩm bánh mì xảy ra phổ biến nhất ở các nước có độ ẩm và nhiệt độ cao Pitt và Hocking (1999) ước tính rằng khoảng 5-10% sản lượng lương thực bị hư hỏng do sự tăng trưởng của men và nấm trong các nguyên liệu thực phẩm Tương tự, ở Tây Âu, sự gia tăng của sự hư hỏng của bánh mì ước tính đạt hơn 200 triệu Euro một năm (Legan, 1993; Schnürer

& Magnusson, 2005) Aspergillus và Penicillium là những loại nấm phổ biến nhất gây hư hỏng thức ăn trong khi các loài Fusarium được báo cáo là gây hư hại các hạt

ngũ cốc trong ruộng (Samson và cộng sự, 2000) Ngoài ra, nấm tạo ra hương vị khó chịu, sản xuất mycotoxins và các hợp chất gây dị ứng Có hơn 400 loại độc tố nấm gây ra bởi các loại nấm khác nhau (Filtenborg và cộng sự, 1996) Sáu loại chất độc độc hại thường gặp trong các loại thực phẩm khác nhau là: aflatoxins, fumonisins, ochratoxins, patulin, trichothecenes và zearalenone (Dalié và cộng sự, 2009)

Aspergillus niger là một loại nấm và một trong những loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),

ochratoxin A, stermatocystin, axit cyclopianxoic Aspergillus niger chứa nhiều độc

tố, một số vô hại Các độc tố nó chứa malformin C, và ochratoxin A

1.3 Tổng quan về công nghệ sản xuất bánh mì

1.3.1 Giới thiệu chung

Bánh mì là sản phẩm chế biến từ bột mì nhào với nước, muối và nấm men, để lên men cho nở xốp, sau đó nướng hay hấp chín Bột mì và nấm men là hai nguyên

liệu chính ảnh hưởng nhiều nhất đến quy trình sản xuất và chất lượng sản phẩm

do đó làm giảm chất lượng bánh

 Thuyết minh quy trình:

1 Nguyên liệu:

Các thành phần khô gồm bột mì, men, đường, muối được trộn trước để đảm bảo sự phân bố đều các hạt khô trong bột mì Cho men khô vào bột trước khi cho sữa vào sẽ giúp cho khả năng hoạt động của men tốt hơn

Sau đó trộn bơ, sữa, trứng và vani Lưu ý: Bơ lúc này đã được làm tan chảy và sữa đã được gia nhiệt đến 80℃ Sau khi trộn, dùng dụng cụ đậy kín để bột nghỉ 10 phút tạo điều kiện cho độ ẩm có thể phân tán hết khối bột

2 Nhào bột:

 Mục đích: Phân bố đều các nguyên liệu tạo thành khối bột nhào đồng nhất

Tạo thành mạng gluten có tính đàn hồi và nhớt dẻo, cố khả năng giữ khí

 Cách làm: Khoảng 30 – 45 phút, đến khi nào không còn ảm giác bột dính tay

và trở nên trơn mịn, dẻo dai có thể cảm nhận được Đây là khâu quan trọng nhất trong việc làm bánh nở bông và mềm Bột nhào chưa đủ hoặc nhào quá kỹ đều làm giảm khả năng nở của bột

3 Lên men ổn định sơ bộ:

 Mục đích: tạo khí CO2 làm nở bột, tạo độ xốp cho bánh Tạo mùi vị thơm ngon cho bánh mì Tăng độ tiêu hóa của bánh mì đối với cơ thể người

 Cách làm: khối bột nhào sau khi đã đạt mức độ thích hợp được để yên trong

5 Vê bột, tạo hình:

 Mục đích: sau khi chia cấu trúc của bột nhào bị phá vỡ, phải qua quá trình vê

để ổn định lại cấu trúc

 Cách làm: Sau khi chia bột thành những khối đồng đều nhau, từng khối được

vê thành các khối cầu tròn có bề mặt nhẵn mịn để tránh tình trạng bánh bị nứt sau lên men Hình dáng cầu cũng là hình dáng giúp cho khối bột nở tốt nhất trong quá trình lên men

6 Lên men kết thúc:

 Mục đích: lên men ổn định là bước kỹ thuật quan trọng có ảnh hưởng quyết định tới chất lượng bánh Trong quá trình chia và tạo hình thì hầu hết lượng CO2

trong cục bột thoát ra ngoài Muốn cho bánh nở và có thể tích, hình dáng cần thiết thì phải để cục bột lên men kết thúc rồi mới đưa vào lò nướng

 Cách làm: Vệ sinh, đặt vào lò 1 cốc chứa nước để cấp ẩm và bật lò nướng ở nhiệt độ 150℃ trong vòng 10 phút để làm nóng môi trường ủ, mở cửa lò cho nhiệt độ giữ ở mức vừa phải không quá nóng để bánh lên men tốt hơn Cho bánh đã tạo hình vào ủ trong 35-400C/40 – 45 phút

7 Nướng:

 Mục đích: tiêu diệt hệ vi sinh vật và ức chế hệ enzyme trong khối bột nhào Làm chín bánh, tạo hương vị, màu sắc cho sản phẩm

 Cách làm: Nhiệt độ sử dụng là 150 - 170℃ trong vòng 10 – 15 phút Nhiệt độ

và thời gian nướng phụ thuộc và khối lượng mỗi bánh Bánh nhỏ thì nhiệt độ buồng nướng cao, thời gian nướng ngắn Bánh to thì phải hạ nhiệt độ xuống đồng thời kéo dài thời gian nướng vì nếu nhiệt độ cao, vỏ bánh sẽ cháy nhưng ruột bánh lại không kịp chín

8 Làm nguội:

 Mục đích: chuẩn bị cho quá trình bao gói bánh sau khi nướng

1.3.3 Ảnh hưởng của vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì

Trong điều kiện độ ẩm không khí dưới 79% và nhiệt độ dưới 20℃, ẩm độ của hạt dưới 15% vi sinh vật trong bột sẽ không tăng lên mà dần dần chết đi khi bảo quản bột trong thời gian dài Nếu ẩm độ của bột chỉ cần tăng lên 1 – 2% thì vi khuẩn và nấm mốc trong bột sẽ phát triển mạnh Để bảo quản bột tốt cần bảo quản bột ở độ ẩm không khí dưới 79%, ẩm độ của bột không quá 14 – 15% trong điều kiện nhiệt độ ổn định Ở điều kiện này, giữ bột được 3 – 5 tháng, ở điều kiện ẩm độ bột từ 12 – 13% giữ được 1 năm

1.3.3.1 Hệ vi sinh vật bánh mì

Hệ vi sinh vật bánh mì bắt nguồn từ bột mì, man bánh mì và tạp nhiễm Khi làm bột nhào men bánh mì hoạt động mạnh tạo ra rượu và khí carbonic làm nở bột nhào Khi nắn bánh và đem nướng hầu hết vi sinh vật đều bị tiêu diệt trừ một số bào

tử chịu nhiệt còn tồn tại Khi nướng bánh nhiệt độ bên ngoài tới 180 – 200℃, các vi sinh vật ngoài vỏ bánh chết hết và trong ruột bánh nóng dần lên nhưng bào tử của chúng vẫn còn sống Khi gặp điều kiện thuận lợi, các bào tử của trực khuẩn khoai tây

và trực khuẩn cỏ khô phát triển làm hỏng bánh mì Trong quá trình vận chuyển và bảo quản còn bị tạp nhiễm các vi sinh vật trong đó có cả trực khuẩn đường ruột rất nguy hiểm Vì vậy khi vận chuyển và bảo quản cần đảm bảo vệ sinh an toàn

1.3.3.2 Hư hỏng bánh do vi sinh vật

Do bánh mì thành phẩm còn một số bào tử của các trực khuẩn không bị tiêu diệt khi nướng bánh hay các tế bào sinh dưỡng của một số vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình vận chuyển và bảo quản Đó chính là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì

- Bệnh nhớt ruột bánh mì do vi khuẩn Bacillus: bệnh này do trực khuẩn khoai

tây và trực khuẩn cỏ khô gây ra Khi chúng phát triển sẽ tiết ra enzyme protease thuỷ phân protein làm ruột bánh mì bị dính nhớt, thẫm màu và có mùi khó chịu

Để hạn chế cần tăng độ axit của bột nhào, làm pH giảm xuống khoảng 4,5 - 5 sẽ

kiềm hãm trực khuẩn Bacillus mesentericus và Bacillus subtilis phát triển

- Ruột bánh mì bị đỏ: có một số vi khuẩn và nấm sinh sắc tố phát triển trong ruột bánh mì và làm ruột bánh mì có màu đỏ Bệnh này không nguy hiểm đối với

người, thường gặp vi khuẩn Bacillus prodigiosum

- Mốc bánh mì: thường bị mốc bên ngoài do tạp nhiễm các bào tử nấm mốc và bảo quản trong điều kiện nóng ẩm cũng như ẩm độ của bánh mì cao

- Bệnh say bánh mì: bệnh này do nấm Fusarium sporotrichioides có lẫn trong

bột mì từ những hạt lúa mì ở những cây có nấm này ký sinh trên đồng ruộng Nấm này chiụ nhiệt cao và không bị chết khi nướng bánh Khi chúng phát triển trên bánh mì không thấy dấu hiệu hư rõ rệt nhưng chúng tiết ra độc tố khi ăn phải người bị ngộ độc thấy ngây ngất như say rượu

1.3.4 Vai trò của nấm men trong lên men bánh mì

Chức năng chính của nấm men là sinh khí CO2 làm tăng thể tích khối bột nhào Ngoài ra, các sản phẩm của quá trình lên men được tích lũy trong khối bột sẽ tạo nên các hương vị đặc trưng cho bánh mì thành phẩm Vì vậy, nấm men có vai trò rất quan trọng trong lên men bánh mì Nấm men sử dụng đường có trong bột mì làm cơ chất chủ yếu để tạo ra sản phẩm là cồn và CO2 theo phương trình:

𝐶6𝐻12𝑂6 → 2𝐶2𝐻5 + 2𝐶𝑂2Lượng CO2 tích tụ trong khối bột nhào tạo nên những túi khí, do đó khối bột trở nên xốp và thể tích tăng lên rõ rệt Khi nướng bánh ở nhiệt độ cao, CO2 có trong mạng lưới gluten tăng thể tích làm cho mạng gluten cũng căng lên và trở thành túi chứa CO2 Nhiệt độ càng tăng, CO2 bắt đầu thoát khỏi mạng gluten sẽ tạo nên những lỗ xốp trong bột bánh làm cho bánh có độ xốp

Trong suốt quá trình lên men bột nhào và lên men kết thúc, luôn xảy ra những phản ứng sinh hóa sinh ra các sản phẩm như: rượu, acid, este, andehyde, ceton, furfurol nhằm tích tụ hương thơm và mùi vị đặc trưng cho bánh mì Đặc biệt khi nướng bánh, gần 70 chất gây hương vị được tạo thành và có xảy ra phản ứng Maillard sinh ra melanoidin (là các polymer không no hòa tan được trong nước, sau đó là các polymer không no và không hòa tan trong nước, nhưng đều có màu đậm và gọi chung

là melanoidin) Nấm men cũng giúp chuyển hóa những chất có cấu trúc phức tạp trong bột mì thành những chất đơn giản giúp cho hệ tiêu hóa của người sử dụng

1.4 Tổng quan về bột chua

Lên men bột và nước dựa trên một quá trình tức thời để tạo ra bột nhào chua

là một phương pháp quan trọng hiện nay (Vogel và cộng sự, 1999) Khối bột lỏng sẽ được bổ sung chủng khởi động, sử dụng các công thức và điều kiện lưu giữ để làm mới men cái theo chu kỳ (Hammes & Ganzle, 1995; Onno & Rouseel, 1994; Ottogalli, Galli, & Foschino, 1996) Trong các vi khuẩn lên men chính, ngoại trừ nấm men còn có vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) Trong quá trình tạo bột chua truyền thống, một phần bột được trộn lẫn với men và bổ sung đủ nước để tạo độ xốp, sau đó

để lên men trong vài giờ, thường là để qua đêm và cho tiếp xúc với không khí Khối bột xốp sau đó sẽ được trộn chung với phần bột còn lại, ngoài ra còn có nước, muối

và chất béo đến một độ dẻo nhất định và được cho lên men trong một thời gian ngắn trước khi kiểm tra lại và đem đi nướng Kết quả, bánh mì có hương vị tuyệt vời hơn nhờ vi khuẩn lên men xâm nhập từ không khí hoặc do việc bổ sung vào 2-5% phần sản phẩm lên men của mẻ trước (Bruemmer & Lorenz, 1991) Trong quá trình chuẩn bị nướng bánh mì, một khối bột nhào xốp nên có mật độ vi khuẩn lactic vào khoảng

108 – 109 cfu/g còn nấm men thì 106 – 107 cfu/g, để có thể làm acid hóa giúp lên men khối bột và làm nở bột Tuy nhiên, LAB có thể nhiễm vào bột 1 cách tự nhiên, từ 1 sản phẩm sữa lên men hoặc từ các chủng khởi động thương mại có chứa các dòng LAB đặc trưng được sản xuất trong quá trình lên men công nghiệp (Vuyst & Neysens, 2005)

1.4.1 Đặc tính của bột chua

Đặc trưng điển hình bột chua (bột bánh mì) chủ yếu là do VSV của nó, về cơ bản đại diện bởi LAB và nấm men Do sự có mặt của VSV, bột được chuyển hóa Những VSV này đảm bảo sản xuất acid khi đun sôi hỗn hợp bột và nước Cơ chế chua rất phức tạp (Hammes và Gänzle, 1998) Trong quá trình lên men, các thay đổi

sinh hóa xảy ra trong các thành phần carbohydrate và protein của bột nhờ hoạt động của vi khuẩn và các enzyme (Spicher, 1983) Nhiều tính chất vốn có của bột chua dựa vào các hoạt động trao đổi chất của LAB: lên men lactic, thủy phân protein, và tổng hợp các hợp chất dễ bay hơi, chất chống mốc là một trong những hoạt động quan trọng nhất trong quá trình lên men chua (Hammes và Gänzle, 1998; Gobbetti và cộng sự, 1999) Sự lên men bột, cụ thể là bột chua, bị chi phối bởi LAB đặc biệt với nồng độ thích hợp 108 cfu/g, có thể cùng tồn tại hoặc có thể cộng sinh với các loại nấm men thông thường có nồng độ thấp hơn (Gobbetti và cộng sự, 1999; Vogel và cộng sự, 2002) Nấm men thường kết hợp với LAB trong bột chua với tỷ lệ nấm men/LAB thường là 1:100 (Gobbetti và cộng sự, 1994; Ottogalli và cộng sự, 1996)

1.4.2 Các loại hợp chất hương liệu trong bột chua

Quá trình lên men bột chua là yếu tố quan trọng trong việc tạo ra mùi vị cho bánh mì (Lund và cộng sự, 1989; Rothe & Ruttloff, 1983) Các hoạt động trao đổi chất kết hợp của các vi sinh vật, tạo ra sự acid hóa hoặc tạo chua có ảnh hưởng đến đặc tính của bánh mì, đặc biệt là kết cấu, tăng thời hạn sử dụng bằng cách giảm sự tăng trưởng của mốc trong quá trình bảo quản (Corsetti và cộng sự, 2000; Oura, Soumalainen & Wiskari, 1982; Rochenck và Voysey, 1995) và tạo ra các thành phần hương vị điển hình mang lại đặc điểm cảm quan chua đặc trưng (Gobbetti, 1998; Katina và cộng sự, 2005) Trong quá trình lên men có hai loại hợp chất hương vị được sản xuất Hợp chất không bay hơi bao gồm acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn đồng hình (Gobbetti, Corsetti, & De Vincenzi, 1995a) và dị hình (Gobbetti, Corsetti,

& De Vincenzi, 1995b) làm acid hóa, giảm độ pH và đóng góp hương vị cho bột bánh

mì (Barber, Benedito de Barber, Martinez-Anaya, Martinez, và Alberola, 1985; Galal, Johnson, và Varriano-Marston, 1978) Loại thứ hai các hợp chất dễ bay hơi của bánh mì từ bột chua chứa rượu, aldehyde, ketones, este và lưu huỳnh Tất cả các hợp chất này được sản xuất bằng phương pháp sinh học và các hoạt động sinh hóa trong quá trình lên men và đóng góp vào hương vị (Spicher, 1983)

 Hợp chất không bay hơi

Phản ứng giữa vi khuẩn lactic với các enzyme ngoại bào ảnh hưởng đến hoạt tính của vi sinh vật trong quá trình acid hóa, sản sinh acid acetic và các đặc tính kết cấu bánh mì Nó thể hiện sự tăng cường các hoạt động enzyme nội sinh trong bột đã thu được khi kết hợp LAB với glucose oxidase VSV, lipase, endo xylanase, amylase

và protease

 Hợp chất bay hơi

Sự chuyển hóa ở vi khuẩn chứng minh việc sản xuất các hợp chất dễ bay hơi khác nhau cho sự lên men của nhóm vi khuẩn lactic Các sản phẩm được tạo ra của quá trình lên men là 2-metyl-1-propanol; 2,3 methyl-1-butanol và các iso-alkoho khác Các dòng LAB có sự khác biệt trong sự trao đổi chất và các hợp chất thơm Sản xuất các hợp chất thơm dễ bay hơi trong quá trình lên men với sự kết hợp của các

chủng đơn lẻ S cerevisiae và C guilliermondii, Lb Plantarum đã được thử nghiệm,

được sử dụng trong cả bột lúa mì và các chất nền đơn giản như maltose và glucose (Stolz và cộng sự, 1993) Chỉ sử dụng men trong bánh mì, bảy chất dễ bay hơi đã được tìm thấy nhiều: acetaldehyde, aceton, ethyl acetat, ethanol, hexanal, rượu isobutyl, và propanol

1.4.3 Ảnh hưởng của phản ứng giữa Maillard và Caramel hóa đối với hương vị của bánh mì

Các phản ứng Maillard và Caramel hóa ảnh hưởng chính đối với sự hình thành hương vị trong các sản phẩm từ hạt khi có sự đun nóng thì phản ứng liên quan đến các tiền chất đơn giản như acid amin và aldose đơn giản hoặc ketose đường (Rothe

& Ruttloff, 1983) Số lượng acid amin tự do cao nhất đã được tạo ra trong quá trình

lên men bột chua với sự kết hợp giữa LAB và S exigus M14 (Gobbetti, Corsetti và

cộng sự, 1994; Gobbetti, Simonetti và cộng sự, 1994; Kratochivil & Holas, 1983, Rothe, 1974) Các acid amin này là đơn chất của iso-alcohols (Gobbetti, Corsetti, &

De Vincenzi, 1995b; Hansen & Schieberle, 2005) góp phần trực tiếp cho hương vị

bánh mì trong quá trình lên men và nướng bánh mì (Bredie, Mottram & Guy, 2002; Damiani và cộng sự, 1996) Các sản phẩm phản ứng Maillard từ quá trình xử lý nhiệt độ cao bao gồm pyrazines, pyrrole, furan và các hợp chất chứa sunfur và các sản phẩm khác như alkanals, alkenals 2 và 2,4-alkadienal (Parker, Hassell, Mottram, & Guy, 2000) Hơn nữa, ở nhiệt độ cao hơn thì pyrrole, thiophenes, thiophenones, thiapyrans và thiazolines tăng lên và furan và aldehyde giảm (Bredie và cộng sự, 2002) Pyrazin là các hợp chất có chứa nitơ có đặc tính mùi và hương vị rất mạnh (Ji

và Berhard, 1992) Do đó, việc sản xuất các hợp chất này có ảnh hưởng đáng kể đến hương vị của bánh mì

1.4.4 Con đường trao đổi chất của vi khuẩn LAB trong bột chua

Các carbohydrate có trong bột mì gồm maltose tiếp theo sucrose, glucose, fructose và, cùng với một số trisaccharides như maltotriose và raffinose Lượng glucose tăng quá trình lên men, trong khi giảm sucrose trong sự hiện diện của nấm men do tác động của VSV Các nấm men có mặt trong bột chua không thể lên men maltose, một loại đường phổ biến trong bột Tuy nhiên, tế bào nấm men vẫn có thể phát triển vì glucose cung cấp vào môi trường bởi một số loài LAB, đáng chú ý

L sanfranciscensis Bắt đầu từ glucose, LAB lên men đồng hình sản xuất acid lactic

qua đường phân (lên men đồng hình), trong khi LAB lên men dị hình cũng sản xuất, ngoài acid lactic, CO2, acid aCetic, và/hoặc ethanol thông qua con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase(6-PG/PK) (lên men dị hình) Hexoses khác với glucose đi vào những con đường chính ở mức glucose-6-phosphate hoặc fructose-6-phosphate sau khi đồng phân hóa và/hoặc phosphoryl (Axelsson, 1999) Disaccharides được chia bởi hydrolases và/hoặc phosphohydrolases cụ thể đối với monosacarit rằng sau đó nhập vào con đường chính Pentoses là phosphoryl hóa

và chuyển đổi sang ribulose-5-phosphate hoặc xylulose-5-phosphate bởi epimerases hoặc isomerase và sau đó chuyển hóa phần sau của con đường 6-PG/PK (Axelsson, 1999) Sử dụng pentoses không chỉ giới hạn đối với các loài LAB có chứa phosphoketolase cấu thành, các enzyme quan trọng của con đường 6-PG/PK (lên men

dị hình bắt buộc); LAB lên men dị hình tùy nghi, tạo ra hexose lên men thông qua glycolysis vì chúng có chứa một aldolase fructose-1,6-diphosphate cấu thành (enzyme chính của glycolysis), pentoses lên men giống như loài lên men dị hình bắt buộc Trong những trường hợp như vậy, phosphoketolase của LAB lên men dị hình tùy nghi được gây ra bởi các đường pentose sẵn có (Hammes và Vogel, 1995) Quá trình lên men của pentoses tạo ra một lượng cân bằng của acid lactic và acid axetic; không có CO2 được hình thành, và vì không có bước khử là cần thiết để đạt được các trung gian xylulose-5-phosphate, acetyl phosphate được sử dụng bởi kinase acetate trong một bước phosphoryl mức bề mặt năng suất acetate và adenosine triphosphate Buộc LAB lên men đồng hình không lên men pentoses (Axelsson, 1999) Cho đến nay, một số nghiên cứu đã được nhắm vào các trình tự của bộ gen

hoàn chỉnh của lactobacilli, bao gồm L brevis (Makarova và cộng sự, 2006), L

plantarum (Kleerebezem và cộng sự, 2004), và Lb reuteri cũng được tìm thấy trong

bột chua, hoàn chỉnh

Hình 1.5: Các con đường lên men dị hình bột chua điển hình bởi vi khuẩn sinh acid

lactic (được chuyển thể từ Liu và cộng sự, 2008)

Các con đường trao đổi chất của LAB ảnh hưởng đến chất lượng bánh mì được kết hợp với nguồn cacbon trung tâm sẵn có của các đồng yếu tố ảnh hưởng đến thế oxi hóa khử tế bào và môi trường Chuyển hóa đồng hình và dị hình khác nhau về yêu cầu tái tạo đồng phân giảm, giảm nicotinamide adenine dinucleotide hoặc nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Việc sử dụng các chất đồng nhất, như oxy hoặc fructose, như chất nhận electron bởi LAB lên men dị hình bắt buộc phải kết hợp với việc gia tăng sản xuất acetat trong bột nhão Dựa trên các yêu cầu trao đổi chất khác nhau cho sự tái tạo cofactor, LAB lên men đồng hình và dị hình có ảnh hưởng đến các phản ứng oxi hóa khử trong bột chua có ảnh hưởng đến chất lượng bánh mì ngoài sự hình thành của acetate

Chương 2: MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu đề tài, nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu

Sử dụng Lactobacillus spp kết hợp nấm men trong lên men bánh mì nhằm kéo

dài thời gian bảo quản bánh mì và cải thiện cảm quan sản phẩm

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn lên men lactic từ nem chua và cơm mẻ

- Khảo sát đặc điểm hình thái; sinh lý, sinh hóa vi khuẩn phân lập

- Khả năng kháng nấm mốc của vi khuẩn LAB in vitro

- Khảo sát khả năng đối kháng nấm A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng lên men

bánh mì với nấm men

- Khảo sát ảnh hưởng của LAB lên chất lượng bánh mì

2.2 Vật liệu – thiết bị - hóa chất

2.2.1 Nguồn vi sinh vật

2.2.1.1 Nguồn phân lập vi khuẩn lactic

Chủng vi khuẩn lên men Lactobacillus sp.L5, Lactobacillus sp.C1 được phân

lập từ nem chua, cơm mẻ

2.2.1.2 Nguồn nấm bệnh

Nấm mốc Aspergillus niger được phân lập từ đậu nành nhiễm mốc

2.2.1.3 Nấm men

Nấm men Saccharomyces cerevisiae của nhà sản xuất Saf-Instant.

2.2.2 Hoá chất và môi trường sử dụng

2.2.2.1 Hoá chất

- Thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal violet), Fushin, Malachite green

- Chất bảo quản Natri benzoate và Canxi propionate

- NaOH 0,01N

- NaCl

- Cồn 70, cồn 96

2.2.2.2 Môi trường nuôi cấy (xem ở Phụ lục 1)

- Môi trường de Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS – broth)

- Môi trường de Man, Rogosa, Sharpe cải tiến (MRS cải tiến)

- Môi trường de Man, Rogosa, Sharpe Agar (MRS agar)

- Môi trường Potato Dextrose agar (PDA)

- Môi trường Potato Dextrose broth (PDB)

- Tủ sấy (Memmert Germany)

- Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

- Autoclave (Memmert Germany)

- Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, pipetman 100 – 1000μl

- Que cấy, que trang, cây đục thạch, đèn cồn, eppendorf 1ml, ống ly tâm lớn

- Bông thấm nước, bông không thấn nước, giấy lọc, lam, lamell, buồng đếm hồng cầu, giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa

2.3 Phương pháp nghiên cứu

 Phương pháp luận

Chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ nem chua, cơm mẻ nên bản thân chủng

vi khuẩn đã có tính an toàn thực phẩm Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của

vi khuẩn lactic đối với các nấm gây hư hỏng thực phẩm, người thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm thực phẩm Từ đó ứng dụng chủng vi khuẩn lactic để ức chế nấm mốc trên thực phẩm và cụ thể là bánh mì

 Bố trí thí nghiệm

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu

- Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa

- Khả năng đối kháng

Aspergillus niger in vitro

Xây dựng đường chuẩn tế bào LAB

Xây dựng đường chuẩn bào tử

Aspergillus niger

Khảo sát ảnh hưởng của LAB

lên chất lượng bánh mì

Khảo sát khả năng kháng nấm

A.niger của vi khuẩn LAB khi đồng

lên men bánh mì với nấm men

104 (bt/ml)

Tăng sinh trong MRS Broth

Cấy truyền sang MRS agar

Phân lập giống thuần khiết

Chủng chọn lọc L5

C1

2.4 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm

2.4.1 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp

Mẫu là những sản phẩm lên men truyền thống có chứa VSV được dùng làm nguồn phần lập vi khuẩn lactic gồm: cơm mẻ (C), nem chua (L)

Tiến hành:

- Tăng sinh: Sử dụng môi trường MRS Broth bổ sung 0,02% NaN3, hút 10ml cho vào mỗi ống nghiệm đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút Với các mẫu cơm mẻ, nem chua: Nghiền nhỏ 2g rồi cho vào ống nghiệm chứa MRS Broth Quấn màng PVC (màng bọc thực phẩm) quanh nắp ống nghiệm cho kín rồi đem

2.4.2 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp

2.4.2.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm sinh lý, sinh hóa

 Quy trình thí nghiệm: