Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ công anh lactuaca indica

Để giải quyết vấn đề này là sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật kết hợp với y học hiện đại để thay thế dần các loại kháng sinh hiện nay vì vừa có thể mang lại hiệu

CÔNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA

LẦN THỨ XIX NĂM 2017

TÊN CÔNG TRÌNH:

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG OXY HOÁ CỦA CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ

CÂY BỒ CÔNG ANH (Lactuca indica L.)

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: CÔNG NGHỆ HOÁ – DƯỢC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU

Mã số công trình: ………

(Phần này do BTC Giải thưởng ghi)

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH MỤC HÌNH ẢNH iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Giới thiệu về cây bồ công anh (Lactuca indica L) 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây bồ công anh 3

1.1.3 Công dụng 4

1.2.Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc thực vật 5

1.2.1 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 5

1.3.Hoạt tính chống oxi hóa 7

1.3.1 Khái niệm về gốc tự do 7

1.3.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể 7

1.3.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể 7

1.3.4 Chất chống oxy hóa trong thực vật 9

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Địa điểm và thời gian 10

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 10

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 10

2.2 Vật liệu 10

2.2.1 Nguồn mẫu 10

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị 10

2.2.3 Hóa chất, dung môi 10

2.2.4 Thiết bị và dụng cụ 11

2.3 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu 12

2.3.2 Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật 12

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 12

2.3.4 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị 13

2.3.5 Phương pháp pha loãng mẫu 14

2.3.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 14

2.3.7 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết 15

2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết 17

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 20

2.4 Bố trí thí nghiệm 21

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ bồ công anh 22

2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE 24

2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng oxy của LiEE 25

2.4.4 Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của LiEE 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi cao chiết EtOH 70% (LiEE) 29

3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với vi khuẩn chỉ thị 30

3.2.1 Kết quả hoạt tính kháng nhóm E.coli của LiEE 30

3.2.2 Kết quả hoạt tính kháng nhóm Salmonella của LiEE 31

3.2.3 Kết quả hoạt tính kháng nhóm Shigella của LiEE 32

3.2.4 Kết quả hoạt tính kháng nhóm Vibrio spp của LiEE 34

3.2.5 Kết quả hoạt tính kháng nhóm vi khuẩn khác của LiEE 35

3.2.6 Tổng hợp kết quả kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ Bồ Công anh đối với vi khuẩn chỉ thị 37

3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ethanol từ Bồ Công anh 38

3.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá dựa trên sự loại bỏ gốc tự do DPPH của vitamin C 38

3.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của LiEE 40

3.4 Kết quả xác định sơ bộ thành phần hoá học của LiEE 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1: Thân và hoa của cây bồ công anh 4

Hình 1.2: Vị trí các hợp chất trong tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn tác động lên vi khuẩn 6

Hình 2.2: Phản ứng trung hòa gốc DPPH 16

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 21

Hình 2.4: Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây Lactuca indica L 22

Hình 2.5: Mẫu lá bồ công anh 23

Hình 2.8: Quy trình định tính một số thành phần hóa học của LiEE 27

Hình 3.1: Mẫu cao chiết ethanol từ Bồ Công Anh (LiEE) 29

Hình 3.2: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với nhóm E.coli 30

Hình 3.3: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Salmonella 32

Hình 3.4: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Shigella 33

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của LiEE từ các nồng độ khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh 37 Bảng 3.2: Hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương g/ml vitamin C ở các nồng độ cao chiết khảo sát 41 Bảng 3.3: Hiệu quả loại bỏ 50% gốc tự do của LiEE và vitamin C 42 Bảng 3.4: Kết quả định tính một số thành phần hóa học trong LiEE 43

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TSB: Trypticase Soya Broth

TSA: Trypticase Soya Agar

DMSO: Dimethyl sulfoxide

LiEE: Lactuca indica L ethanolic extract

NA: Non Activity

DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

RNA: Ribonucleic Acid

DNA: Deoxyribonucleic Acid

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng các loại cây cỏ thiên nhiên nhằm mục đích trị bệnh, vì đây là một liệu pháp an toàn, dễ tìm, đồng thời mang đến hiệu quả cao Khi xã hội ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật thì các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tạo ra các loại thuốc tây y giúp hỗ trợ điều trị bệnh tốt hơn, trong đó, phần lớn là các loại thuốc kháng sinh Mặc dù kháng sinh giải quyết rất nhiều vấn đề liên quan đến trị bệnh và mang lại lợi ích rất lớn cho con người, nhưng cũng chính việc sử dụng kháng sinh cũng dẫn đến hiện tượng kháng thuốc xảy ra nhiều hơn Nguyên nhân chủ yếu là do việc lạm dụng, sử dụng thuốc kháng sinh tùy tiện, tràn lan của con người Dẫn đến hiện tượng xuất hiện ngày càng nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, kể cả những loại kháng sinh thế hệ mới Để giải quyết vấn đề này là sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật kết hợp với y học hiện đại để thay thế dần các loại kháng sinh hiện nay vì vừa có thể mang lại hiệu quả điều trị bệnh vừa đảm bảo an toàn đồng thời phòng ngừa hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh

Đất nước ta vốn nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có nền thực vật vô cùng phong phú, nguồn dược liệu cùng với nền y học lâu đời Chính vì điều đó nên việc ứng dụng các loại thực vật vào trong thuốc chữa bệnh là một thành phần không thể thiếu trong cuộc sống Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có trên

10000 loài và theo tác giả Võ Văn Chi nước ta có khoảng 3200 loài cây thảo dược Không chỉ riêng ở Việt Nam mà cả trên thế giới, việc nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thực vật đã giúp các nhà khoa học tìm hiểu sâu hơn và sử dụng hiệu quả hơn nguồn dược liệu sẵn có, đồng thời phát hiện thêm các loại thảo dược mới, quý hiếm, có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh hơn Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ hiện đại việc nghiên cứu các loại thảo dược ở nước ta những năm gần đây đã có nhiều bước phát triển Hoạt tính kháng khuẩn của các loại thảo dược đã được nghiên cứu song song cùng việc xác định những thành phần các hoạt chất có trong thực vật Các loại thảo dược

điển hình như trầu không (Piper betle L.), sống đời (Kalanchoe pinnata), lô hội (Aloe barbadensis), dâu tằm (Morus acidosa Griff), khổ qua (Momordica charantia L.) … đã được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp

Cây bồ công anh (Lactuca indica L.) là một cây thuốc mọc hoang ở khắp nước

ta, dược liệu này rất dễ trồng trọt, thu hái, chế biến Mặc dù bồ công anh đã được sử dụng từ lâu đời nhưng những công trình nghiên cứu về cây vẫn còn hạn chế Việc đánh giá hoạt tính sinh học của bồ công anh là điều hết sức cần thiết, góp phần hoàn thiện một phương thuốc dân gian có tiềm năng sử dụng trong điều trị bệnh Với cơ

sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh

giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ công anh (Lactuca indica L)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hoá từ cao chiết từ ethanol

70% của bồ công anh (Lactuca indica L)

- Xác định sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết ethanol từ bồ công anh

3 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết cao từ lá bồ công anh bằng ethanol 70%

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết

- Xác định sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết

4 Phạm vi nghiên cứu

- Chỉ khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết ethanol 70% từ lá bồ công anh

- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên một số chủng vi khuẩn chỉ thị

Escherichia Coli, Samonella spp., Vibrio spp., Shigella spp., Listeria spp., Pseudomonas spp

- Bước đầu định tính và định lượng thành phần hóa học của cao chiết

1.1.1.2 Phân bố

Cây bồ công anh mọc hoang, phân bố chủ yếu ở các nước Châu Á như Nhật

Bản, Indonesia, Philippinnes, Trung Quốc Tại Việt Nam bồ công anh phân bố rải rác khắp mọi nơi Từ miền núi như Đà Lạt, Sa Pa, Tam Đảo (thường ở độ cao dưới 1000m) trung du đến đồng bằng Bắc bộ [3,4,5,8,9]

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây bồ công anh

Bồ công anh là cây thân thảo, thân nhẵn, thẳng không lông, có tuổi thọ trung bình từ 1 đến 2 năm, cao từ 60 cm đến 200 cm, thân thường đơn hoặc chẻ nhánh ở phần trên, ít phân cành Lá mọc so le, gần như không đều Phiến lá thuôn dài hoặc dạng hình mũi mác, kích thước phiến lá dài khoảng từ 13 – 25 cm, rộng từ 1,5 – 11

cm, đầu lá nhọn, đuôi lá hình nêm hoặc men cuống, cuống lá thường ngắn hoặc men cuống tới tận nách lá Mép lá nguyên hoặc xẻ thùy hoặc có răng cưa thô to Mặt trên phiến lá màu xanh lục, mặt dưới có màu xanh xám Các lá mọc ở phía trên gần đỉnh ngọn sinh hoa thường nhỏ hơn và thẳng Hoa mọc ở đầu ngọn và đầu cành Hoa tự hình chùy, đầu cụm hoa rộng khoảng 2 cm; cuống dài 10 – 25 mm, mọc thẳng Kích thước chùm hoa thường cao 10 – 13 cm, rộng 5 – 6 mm, các lá ngoài hình trứng, dài

2 – 3 mm, các lá trong hình trứng – mũi mác Hoa thường màu vàng, kích thước hoa

12 – 13 mm Quả bế màu đen hình elip, phẳng, kích thước quả dài 4 – 4,5 mm, rộng

2,3 mm; mỏ quả dài 1 – 1,5 mm Bồ công anh có số nhiễm sắc thể 2n = 18 (Peng & Hsu, 1978) Mùa hoa vào khoảng tháng 6 – 7 và mùa quả vào tháng 8 – 9

Hình 1.1: Thân và hoa của cây bồ công anh

1.1.3 Công dụng

1.1.3.1 Theo y học cổ truyền

Cây bồ công anh có vị cam khổ, tính hàn, quy vào các kinh can, tỳ, vị Công năng: giải độc, tiêu viêm, thanh nhiệt, lương huyết, tán ứ, trợ tiêu hoá, lợi sữa Có khả năng trị tỳ vị có hoả uất, sưng vú, tràng nhạc, đinh độc nhiệt ung nhọt, ghẻ lở, đầy bụng, khó tiêu Kiêng kị dùng cho người có ung nhọt đã vỡ [2,7Error! Reference

ource not found.]

1.1.3.2 Theo y học hiện đại

Về độc tính, nước lá cây bồ công anh liều 200g/kg trọng lượng chuột không gây ngộ độc [10] Flavonoid của bồ công anh đã được chứng minh có khả năng ức chế men oxy hóa khử peroxidase và catalase máu chuột cống trắng [3], kìm hãm hoạt động của peroxydase và làm tăng lượng nhóm thiol tự do trong huyết thanh thỏ [19, 20] Cao lá với liều lg dược liệu/20g chuột có tác dụng giảm đau và tác dụng này mạnh hơn là flavonoid toàn phần với liều 0,07g flavonoid /20g chuột (thử tác dụng giảm đau nội tạng - theo phương pháp của Kosteng) [10] Trên thế giới các nhà khoa học sử dụng dịch chiết methanol và ethanol của cây bồ công anh để thử tác dụng dược lý, kết quả cho thấy cả 2 dịch chiết có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh tương đương nhau [22] Ngoài ra thành phần serquiterpen lacton là lactucain c, lactucasid trong cây còn có tác dụng chống đái tháo đường [25]

1.2 Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc thực vật

1.2.1 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật

1.2.1.1 Khái niệm

Hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật (Kháng khuẩn thực vật) là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hay kìm hãm, ức chế sự phát triển của vi sinh vật Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010)

1.2.1.2 Cơ chế kháng khuẩn

Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật

đã được nghiên cứu Chúng có thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số quá trình trao đổi chất hoặc có thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đường truyền tín hiệu (Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003)

Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn Gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu

Ức chế chức năng của màng tế bào Gồm có: colistin, polymycin, gentamicin, amphoterricin Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài

Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin) Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA Nhóm

sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic

Không phải tất cả các cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể,

và một số vùng khác của tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi các cơ chế khác được thể hiện ở hình 1.10

Hình 1.2: Vị trí các hợp chất trong tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn tác động lên

vi khuẩn Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau như sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lượng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của

tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008)

1.3 Hoạt tính chống oxi hóa

1.3.1 Khái niệm về gốc tự do

Trong tự nhiên oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống Ngày nay các nghiên cứu khoa học dần chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O), đây là gốc tự

do quan trọng nhất của tế bào Từ superoxyde nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl, hydroperoxyl, peroxyl, alkoxyl, lipoperoxyde, H2O2 Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể Đồng thời, khi một phân

tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi

là phản ứng dây chuyền

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxy

1.3.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể

Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể Nếu được kiểm soát,

nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường hệ miễn dịch

1.3.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể

Ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra

các bệnh thoái hóa như: ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân

tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây tử vong Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và

tế bào

Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo

sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis)

Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng

ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt,

có lợi cho sức khỏe của con người Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm

những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu

1.3.4 Chất chống oxy hóa trong thực vật

Chất kháng oxy hóa tự nhiên có trong ngũ cốc, rau, quả Các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc thực vật như vitamin E, vitamin C, carotenoid, acid phenolic, phytate và estrogen đã được chứng minh làm giảm nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến quá trình lão hóa như ung thư, bệnh tim mạch và bệnh Alzheimer (Moskovitz and Yim, 2002) Một nghiên cứu khác cũng cho thấy chất kháng oxy hóa có trong trái cây, trà, rau quả và rượu vang làm giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính (Prakash et al., 2000) Ngày nay, nhu cầu sử dụng các loại thuốc chống lão hóa ngày càng tăng cao nhưng các loại thuốc làm đảo ngược đồng hồ sinh học này chưa

có những bằng chứng đáng tin cậy về tác dụng của nó cũng như tác dụng phụ có thể

có Các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa không mong muốn trong cơ thể như các chất carotenoid, flavonoid, phenol, vitamin C, vitamin E, đang trở thành mối quan tâm của nền khoa học hiện đại (Đỗ Thị Túy Phượng, 2007)

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 02/2017 đến 07/2017

- Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: E coli, ETEC, E.coli 0208, E.coli

O157:H7

- Nhóm vi khuẩn Salmonella: S enteritidis, S typhii, S typhimurium, S

dublin

- Nhóm vi khuẩn Shigella: S sonnei, S boydii, S flexneri

- Nhóm vi khuẩn Vibrio: V parahaemolyticus, V alginolyticus, V harveyi,

V.cholerae

- Nhóm vi khuẩn Listeria: L monocytogenes, L innocua

- Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da: E feacalis, S aureus, P aeruginosa

2.2.3 Hóa chất, dung môi

a) Hóa chất:

- Môi trường TSB (HiMedia - Ấn Độ)

- Môi trường TSA (HiMedia - Ấn Độ)

- NaCl tinh khiết

- Một số loại thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendroff, Hager, Wagner, Ninhydrin, Natri nitro prusside

- DPPH (Đức)

b) Dung môi:

- Methanol

- Ethanol 50%, 70%, 90% (Việt Nam)

- DMSO (Trung Quốc)

- Bông thấm và bông không thấm nước

- Đũa thuỷ tinh

b) Thiết bị

- Autoclave (Huxky Đài Loan)

-Tủ ấm 300C, 370C (Memmert

mermany)

- Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

- Máy cô cách thủy

- Máy đo UV – VIS (Hach)

- Cân phân tích (Orbital Germany)

- Bếp từ (Billy – England)

- Máy nước cất (Branstead USA)

- Thiết bị cô quay chân không

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu

Mẫu thực vật được thu một lượng lớn toàn bộ các bộ phận thân, lá và cành mang đi rửa sạch và sấy ở nhiệt độ 400C đến khi khối lượng không đổi

Mẫu khô được tiến hành cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột Lượng bột mẫu thu được sẽ được đóng gói trong túi nhựa và bảo quản ở nhiệt độ 40C để tách chiết cao sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo

2.3.2 Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật

Mẫu thực vật được tách chiết trong dung môi ethanol 70 % bằng phương pháp ngấm kiệt ở nhiệt độ phòng và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi của dịch chiết

Nguyên tắc: Mẫu thực vật được ngấm kiệt trong lượng lớn dung môi (w/v) trong khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi, đây là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng gồm 3 giai đoạn: thâm nhập dung môi vào dược liệu, hoà tan các chất trong mẫu, khuếch tán các chất tan (khuếch tán nội bào, khuếch tán phân tử, khuếch tán đối lưu)

Tiến hành: Ngâm một lượng bột mẫu vào dung môi (tỷ lệ 1:20 (w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng Mẫu được ngâm trong thời gian xác định; thỉnh thoảng có khuấy trộn hoặc lắc sau đó đem đi lọc hoặc ly tâm, thu nhận dịch chiết Phần dịch chiết được cô đặc, thu hồi cao bằng phương pháp cô quay chân không (đối với dung môi methanol) và cô cách thủy (đối với dung môi ethanol, nước) Tiếp tục cho thêm lượng dung môi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm một

số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu Sau khi thu hồi mẫu cao được bảo quản ở nhiệt độ -40C

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

2.3.3.1 Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật

Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, dễ thực hiện, các chủng

vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (từ -30C

đến -50C) để bảo quản Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền một lần

Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ ở nhiệt độ 40C Sau 1 đến 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ dao động từ

48 – 72 giờ Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật được bảo quản trong tủ lạnh ở

-40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol

Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

2.3.4 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị

Mục đích: Hoạt hoá các chủng vi khuẩn được giữ giống phát triển lại bình thường vì trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài chúng có thể

bị suy yếu

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp Môi trường dinh dưỡng chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật, đảm

bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường

Đối với các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trong glycerol 40%, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB trong điều kiện vô trùng Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong

24 giờ ở nhiệt độ phòng Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013) Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 600nm

Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland):

Mật độ = OD600nm x 1,02 x 109 (cfu/ml)

2.3.5 Phương pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích

vi sinh vật Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu

Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9

ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết (Phạm Minh Nhựt, 2013)

2.3.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch dựa trên phương pháp của Anonymous (1996) và Hadacek, ctv (2000) có sự điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm

Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các giếng sẽ khuếch tán vào môi trường thạch và tác động lên các chủng khuẩn chỉ thị Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng

vi khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các giếng thạch (vòng ức chế) Từ

đó, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đường kính vòng ức chế (mm)

Tiến hành:

- Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa từ ống giống gốc trong môi trường lỏng TSB, lắc qua đêm Cấy trang 100 µL dịch khuẩn (mật độ tế bào tương đương 106 cfu/ml) lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường TSA và tiến hành đục giếng với đường kính 6 mm Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần

- Đối chứng là dung dịch kháng sinh Ciprofloxacin

2.3.7 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết

2.3.7.1 Phương pháp DPPH

Nguyên tắc:

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu ánh sáng của các gốc tự do tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt [6] Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bước sóng 517nm (Pisoschi and Negulescu, 2012)

Hình 2.1: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

Hình 2.2: Phản ứng trung hòa gốc DPPH

Khả năng kháng oxy hóa của một chất được biểu hiện bằng giá trị EC50, nồng

độ chất kháng oxy hóa để có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH Giá trị EC50 càng nhỏ, hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh EC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát EC50 (Effective Concentration of 50%) được định nghĩa là nồng độ (µg/mL) của chất kháng oxy hoá mà tại đó nó có thể loại bỏ 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị

EC50 sẽ càng thấp Giá trị EC50 được xác định bằng phương pháp lập phương trình đường chuẩn y = ax + b Với các giá trị x bao gồm nhiều nồng độ khác nhau Khi phần trăm (%) ức chế tuyến tính với nồng độ mẫu, cho y = 50% và thay vào phương trình đã có, từ đó được giá trị x chính là EC50

Tiến hành

Chuẩn bị mẫu chiết ở các nồng độ khác nhau trong DMSO Mẫu đối chứng được sử dụng là axit ascorbic Sau đó, 1,0 ml DPPH với nồng độ thích hợp được pha trong methanol vào 0,2 ml dung dịch của mẫu chiết và mẫu đối chứng Để yên

và ủ ở nhiệt độ phòng trong buồng tối khoảng 30 phút Sự thay đổi màu sắc từ màu tím đậm sang vàng sau đó được đo ở 517 nm [18]

DPPHH DPPH

chất kháng oxy hóa

Khả năng ức chế gốc tự do DPPH được xác định thông qua phần trăm ức chế

Q (%) được tính theo công thức sau

Q% = (𝟏 − 𝑶𝑫𝒎ẫ𝒖

𝑶𝑫𝒕𝒓ắ𝒏𝒈) × 𝟏𝟎𝟎

Với ODtrắng: giá trị mật độ quang của mẫu trắng (control)

ODmẫu: giá trị mật độ quang của mẫu thử (sample)

2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết

Các nhóm hợp chất hữu cơ có trong mẫu cao chiết được định tính cơ bản bằng phương pháp tiến hành một số thử nghiệm hóa học của chúng với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng (N.Raaman, 2006)

Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng

các phản ứng hóa học theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất (Lương Văn Tiến và ctv, 2015)

Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến

hành lọc và thu dịch lọc Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng

2.3.8.1 Định tính thành phần carbohydrate

- Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và thêm 5-6 giọt thuốc thử Molisch Sau đó, nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống

nghiệm và quan sát hiện tượng Nếu hình thành vòng màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách

cho thấy có sự hiện diện của carbohydrates

- Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm sau đó thêm lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B Ống nghiệm được đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả Quan sát phần đáy ống nghiệm nếu xuất hiện kết tủa màu đỏ của Cu2O chứng tỏ có sự hiện diện của carbohydrate

- Thử nghiệm Barfoed: 2 ml dịch mẫu được cho vào ống nghiệm, tiến hành thêm 2 ml thuốc thử Barfoed Sau đó, đun cách thủy ống nghiệm chứa hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và quan sát kết quả Thử nghiệm Barfoed dương tính (+) khi đáy ống nghiệm có sự hình thành kết tủa màu đỏ gạch

2.3.8.2 Định tính thành phần alkaloid

- Thử nghiệm Mayer: Cho vài giọt thuốc thử Meyer vào ống nghiệm có chứa 2

ml dịch mẫu, quan sát hiện tượng và đọc kết quả Thử nghiệm Mayer dương tính (+) khi kết tủa màu trắng hoặc trắng đục được tạo thành

- Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch lọc mẫu cho vào ống nghiệm sau đó thêm 1 hoặc 2 ml thuốc thử Dragendorff và quan sát hiện tượng Nếu hình thành kết tủa màu vàng cam chứng tỏ có sự hiện diện của nhóm alkaloid trong mẫu cao, thử nghiệm dương tính (+)

- Thử nghiệm Hager: Thêm 2 ml thuốc thử Hager vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch mẫu Nếu kết tủa màu vàng được tạo thành dưới đáy ống nghiệm thì cho biết thử nghiệm Hager dương tính (+)

- Thử nghiệm Wagner: Tiến hành hút 2 ml dịch cao mẫu cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2ml thuốc thử Wagner và đọc kết quả.Thử nghiệm Wagner dương tính (+) khi phần đáy ống nghiệm có sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ

2.3.8.3 Định tính thành phần saponin

- Thử nghiệm Foam (xà phòng): Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và lắc mạnh Sau 10 - 15 phút, nếu lớp bọt hình thành sau khi lắc vẫn còn, cho thấy sự hiện diện của saponin, thử nghiệm Foam (xà phòng) dương tính (+)

2.3.8.4 Định tính thành phần cardiac glycoside

- Thử nghiệm Legal: 2 ml dịch cao mẫu được cho vào ống nghiệm, sau đó thêm lần lượt 1 ml pyridine và 1 ml Natri nitro prusside, và tiếp tục nhỏ 5 – 6 giọt NaOH 10% vào ống nghiệm, sau đó quan sát và đọc kết quả Nếu dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng đến đỏ đậm thì chứng tỏ có sự hiện diện của cardiac glycoside, thử nghiệm Legal dương tính (+)

- Thử nghiệm Keller Killiani: Thêm 2 ml acid acetic glacial vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch mẫu và tiếp tục thêm 1 ml dung dịch FeCl3 Sau đó cho từ từ 2 ml

H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm trên và quan sát hiện tượng Thử nghiệm Keller Killiani dương tính (+) khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic

2.3.8.5 Định tính thành phần anthraquinone glycoside

- Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml dịch cao mẫu cho vào ống nghiệm và thêm

2 ml H2SO4 loãng và đun sôi ống nghiệm, tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc Tiếp tục thêm vào dung dịch trên 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên.Tiến hành tách lấy lớp benzene và thêm vào 2 ml ammonia và quan sát Nếu màu trong lớp ammonia chuyển sang màu đỏ chứng tỏ có sự hiện diện của Anthraquinone glycoside, thử nghiệm Bontrager dương tính (+)

2.3.8.6 Định tính thành phần flavonoid

- Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và thêm vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng Sau đó, tiếp tục thêm vào vài giọt HCl loãng và quan sát Nếu dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid Nên thực hiện mẫu cao với đối chứng nước cất để so sánh

- Thử nghiệm Ferric chloride: Thêm 2 ml dịch cao mẫu và vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% cho vào ống nghiệm Nếu trong ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím thì chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid

2.3.8.7 Định tính hợp chất phenolic

- Thử nghiệm Chì acetate: Cho 1,5 ml Chì acetate 10% vào ống nghiệm chứa

2 ml dịch mẫu và quan sát hiện tượng Nếu có xuất hiện kết tủa trắng ở phần đáy

ống nghiệm thì chứng tỏ sự hiện diện của hợp chất phenolic

- Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm và thêm một vài giọt gelatin 1% và đọc kết quả Thử nghiệm Gelatin dương tính (+) nếu trong ống nghiệm có xuất hiện kết tủa trắng

2.3.8.8 Định tính thành phần tannin

- Thử nghiệm Ferric chloride: 2 ml dịch cao được cho vào ống nghiệm Sau đó thêm lần lượt 2 ml NaCl 10% và 4 giọt ferric chloride 10% Quan sát hiện tượng nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu xanh chứng tỏ có sự hiện diện của tannin

- Thử nghiệm Chì acetate: 2 ml dịch cao được cho vào ống nghiệm Sau đó thêm lần lượt 2 ml NaCl 10% và 4 giọt chì acetate 10% Quan sát hiện tượng nếu trong ống có xuất hiện kết tủa màu vàng thì chứng tỏ có sự hiện diện của tannin

2.3.8.9 Định tính thành phần steroid

- Thử nghiệm Salkowski: 2 ml dịch mẫu được cho vào ống nghiệm và thêm vào 2 ml chloroform Sau đó, nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc,và lắc mạnh ống nghiệm rồi để yên cho tách thành 2 lớp Tiến hành đọc kết quả ở mặt phân cách Nếu trong ống xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới cho thấy sự hiện diện của sterol Nếu hình thành màu vàng ở lớp dưới cho thấy sự hiện diện của triterpenoid

- Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm và thêm vào 2 ml acetic anhydride Ống nghiệm được đem đi đun sôi và làm nguội nhanh Sau đó, nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm và quan sát, đọc kết quả Nếu trong ống xuất hiện màu đỏ ở mặt phân cách cho thấy sự hiện diện của sterol Nếu hình thành vòng màu nâu đỏ đậm cho thấy sự hiện diện của triterpenoid

2.3.8.10 Định tính thành phần amino acid

- Thử nghiệm Ninhydrin: Thêm vào ống nghiệm 1 ml dịch mẫu và một vài giọt thuốc thử Ninhydrin Đun sôi cách thủy ống nghiệm trong 5 phút và đọc kết quả Thử nghiệm dương tính khi dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu tím

2.4 Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm tiến hành đánh giá sự ảnh hưởng của dung môi EtOH 70% đến

hoạt tính của cây Lactuca indica L được trình bày ở hình 2.3

Mẫu lá bồ công anh

Ngâm trong dung môi EtOH 70%

Tách chiết và thu hồi cao

Cao chiết bồ công anh (LiEE)

Khảo sát hoạt tính

kháng khuẩn

Định tính một số thành phần hóa học

Khảo sát khả năng kháng oxy hóa

Đánh giá kết quả

Định lượng một số thành phần hóa học

Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ bồ công anh

Hình 2.4: Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây Lactuca indica L

Thuyết minh quy trình

- Bồ công anh sau khi được thu nhận tiến hành xử lý mẫu Trước tiên lá được rửa sạch và đem đi sấy khô ở nhiệt độ 400C rồi tiến hành xay nhuyễn

Mẫu lá bồ công anh

Sấy khô, xay nhuyễn

Ngâm với ethanol 70% (1:20) (w/v)

Hình 2.5: Mẫu lá bồ công anh

Ngâm mẫu bột lá bồ công anh trong dung môi EtOH 70% theo tỷ lệ 1:20 (w/v) trong erlen thủy tinh đậy kín để tránh hiện tượng bay hơi khoảng 24 giờ Sau đó, tiến hành lọc chân không mẫu thu nhận dịch chiết, phần bã bột tiếp tục được ngâm, lọc với lượng dung môi như lần đầu cho đến khi dịch chiết mất màu

Sau đó, dịch chiết EtOH 70% của mẫu lá bồ công anh được cô cách thủy ở

nhiệt độ 700C để phần dung môi bay hơi, thu cao chiết (LiEE) có dạng bột màu nâu đen

Xác định hiệu suất thu hồi cao

Lượng cao của các loại dung môi khác nhau sau khi được cô, đem đi cân để xác định hiệu suất thu hồi cao so với khối lượng bột mẫu ban đầu:

Hàm lượng cao thuốc thu được tính như sau:

X = 𝑚1−𝑚0

𝑚 × 100 (%) Trong đó:

m1: Khối lượng cốc thủy tinh có chứa bột cao (g)

m0: Khối lượng cốc thủy tinh ban đầu (g)

m: Khối lượng mẫu bột dùng để ngâm với dung môi (g)

Sau khi xác định hiệu suất thu hồi cao chiết LiEE được bảo quản ở nhiệt độ

-40C trong tủ lạnh để chuẩn bị cho các thí nghiệm khác Mỗi nghiệm thức trong thí

nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần

2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE

Mẫu LiEE thực hiện đánh giá khả năng kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

Quy trình thí nghiệm

Hình 2.6: Cách thức đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE ở các nồng độ

khác nhau