Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà.

Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà.



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN

TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC THANH THẢO

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

**************************

CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN

TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

ThS TRẦN THỊ BÍCH LIÊN NGUYỄN NGỌC THANH THẢO BSTY HOÀNG THANH HẢI

BSTY LÊ HỒNG PHONG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

iii

 Với tất cả lòng kính trọng và yêu thương, con xin cảm ơn Ba Mẹ, Người đã cho

con có ngày hôm nay

 Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô các Khoa, Bộ môn đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 4 năm học qua

 Xin chân thành cảm ơn ThS Trần Thị Bích Liên đã tận tình dạy bảo, động

viên, giúp đỡ em trong thời gian học tập cũng như trong việc thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

 Em xin chân thành cảm ơn BSTY Hoàng Thanh Hải, người đã luôn bên cạnh,

động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận

 Xin chân thành cảm ơn BSTY Lê Hồng Phong đã hỗ trợ, giúp đỡ em trong thời

gian thực hiện khóa luận

 Xin chân thành cảm ơn cô Lê Thị Hà đã tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt

khóa luận

 Xin cảm ơn các bạn, những người đã chia sẽ mọi buồn vui với Thảo trong suốt

4 năm qua

 Em cảm ơn Anh…!

Tp Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 9 năm 2007

Nguyễn Ngọc Thanh Thảo

iv

Đề tài: “CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ

BÀO XƠ PHÔI GÀ”, đƣợc thực hiện tại Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm, Khoa

Chăn Nuôi – Thú Y, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007

Nội dung:

Thực hiện 2 quy trình trypsin để tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi

và xác định tuổi phôi, quy trình tách tế bào thích hợp nhất

Nuôi cấy, cấy chuyển và theo dõi sự phát triển của tế bào sơ cấp, tế bào thứ cấp

Thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà trong Nitơ lỏng

Hồi phục và khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản

Tế bào xơ phôi gà thứ cấp có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro cao

hơn tế bào sơ cấp

Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi bảo quản trong Nitơ lỏng 5 ngày có khả năng bám và phát triển trên bề mặt bình nuôi cấy

Culture, subculture and observe the growth of the primary cells, the secondary cells

Harvesting and freezing CEF cells in liquid nitrogen

Reviving and surveying the survival of cells after cryoprotected

vi

Trang bìa 1 i

Trang bìa 2 ii

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt tiếng Việt iv

Tóm tắt tiếng Anh v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các hình x

Danh sách các bảng xi

Danh sách các biểu đồ xi

Danh sách các sơ đồ xi

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 3

2.2 Đặc điểm tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào 5

2.2.1 Sự điều hòa trao đổi chất 6

2.2.2 Tính chất cơ học yếu 7

2.2.3 Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng rất chậm 7

2.2.4 Cần giá đỡ trong quá trình phát triển và nhân đôi 8

2.2.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng 8

2.2.6 Khả năng tiếp nhận gene lạ 8

2.2.7 Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo 8

2.3 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật 9

vii

2.3.3 Hệ thống nuôi cấy tế bào 10

2.3.3.1 Nuôi cấy lớp đơn 10

2.3.3.2 Nuôi cấy huyền phù 10

2.3.4 Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật 11

2.3.5 Những đặc điểm chức năng của tế bào nuôi cấy 12

2.3.6 Điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật 13

2.3.7 Vấn đề cần lưu ý khi nuôi cấy tế bào động vật 19

2.3.8 Các pha của sự nuôi cấy tế bào động vật 19

2.3.8.1 Pha ức chế 19

2.3.8.2 Pha phát triển 19

2.3.8.3 Pha ổn định 20

2.3.8.4 Pha suy giảm 20

2.4 Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy 20

2.4.1 Những ưu điểm của việc đông lạnh tế bào nuôi cấy 20

2.4.2 Tiến trình bảo quản lạnh tế bào 21

2.4.3 Một số vấn đề có thể ảnh hưởng đến kết quả bảo quản 22

2.5 Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật 22

2.5.1 Thiết lập hệ thống mô hình 23

2.5.2 Xét nghiệm độc tế bào 23

2.5.3 Nghiên cứu ung thư 23

2.5.4 Virus học 23

2.5.5 Sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào 23

2.5.6 Chẩn đoán di truyền 24

2.5.7 Kỹ thuật di truyền 24

2.5.8 Liệu pháp gene 25

2.5.9 Phát triển và chọn lọc thuốc 25

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

viii

3.1.2 Địa điểm 26

3.2 Vật liệu và hóa chất 26

3.2.1 Đối tượng 26

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 26

3.2.3 Các hóa chất và môi trường 27

3.3 Nội dung nghiên cứu 27

3.4 Phương pháp nghiên cứu 28

3.4.1 Kỹ thuật lấy phôi và tách mô ở phôi gà 28

3.4.2 Phương pháp tạo tế bào sơ cấp 28

3.4.3 Phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer 29

3.4.4 Phương pháp cấy chuyền tế bào 30

3.4.5 Phương pháp bảo quản tế bào 31

3.4.6 Phương pháp hồi phục tế bào 31

3.5 Chỉ tiêu theo dõi 31

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 31

3.7 Quy trình tiến hành thí nghiệm 32

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Xác định tuổi phôi và phương pháp tách tế bào thích hợp 33

4.2.Thời gian tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp 35

4.3 Cấy chuyển, thu hoạch, bảo quản tế bào và khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản 37

4.3.1 Thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp 37

4.3.2.Xác định khả năng sống của tế bào sau bảo quản 39

4.4 Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà trong điều kiện Việt Nam 41

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

7 PHỤ LỤC 46

ix

HEPES: N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulphonic acid

PBSA: Phosphate bufferd saline solution A

x

Hình 2.1: Mô hình một tế bào động vật điển hình 5

Hình 2.2: Các dụng cụ nuôi cấy tế bào lớp đơn 10

Hình 2.3: Các dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào 11

Hình 2.4: Ống bảo quản tế bào 21

Hình 2.5: Bình Nitơ lỏng bảo quản tế bào 22

Hình 3.1: Buồng đếm Neubauer 29

Hình 3.2: Tế bào CEF trong buồng đếm 30

Hình 4.1: Tế bào sơ cấp sau 15 giờ nuôi cấy 36

Hình 4.2: Tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp 36

Hình 4.3: Tế bào thứ cấp phát triển đầy một lớp 38

Hình 4.4: Tế bào xơ phôi gà sơ cấp sau khi hồi phục 40

Hình 4.5: Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi hồi phục 40

xi

Bảng 4.1: Số tế bào sống trung bình thu được từ các tuổi phôi và các

phương pháp tách tế bào 34 Bảng 4.2: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào sơ cấp

(giờ) 35 Bảng 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp

(giờ) 37 Bảng 4.4: Tỷ lệ tế bào sống sau khi phục hồi 37

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1: Số lượng tế bào thu được từ các độ tuổi phôi và các

phương pháp tách tế bào 33 Biểu đồ 4.2: Thời gian trung bình làm đầy một lớp của tế bào sơ cấp 35 Biểu đồ 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào

thứ cấp 38

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3: Quy trình thực hiện thí nghiệm 32

Sơ đồ 4: Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà 42

vị cấu trúc nhỏ nhất của một cơ thể, là đơn vị chức năng cơ bản của sự sống

Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan đã mở ra khả năng nuôi cấy tế bào ở thực vật và động vật Từ đó, nhiều nhà khoa học đã có những nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc với mục đích cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu sinh học, y học như: nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa, con đường trao đổi chất, kiểm tra ảnh hưởng của các chất lên từng tế bào riêng biệt, nghiên cứu sản xuất mô nhân tạo, tổng hợp các chất sinh học như vaccine, hormone…

Trên thế giới, công nghệ nuôi cấy tế bào động vật đã trải qua một giai đoạn rất dài tìm hướng đi về kỹ thuật, tìm môi trường tương ứng và đang bước vào giai đoạn sản xuất theo quy mô công nghiệp ở giai đoạn vừa và nhỏ Tuy nhiên, ở Việt Nam,

kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật vẫn chưa phát triển, đa số tế bào nuôi cấy được nhập khẩu từ nước ngoài

Tế bào phôi gà là loại tế bào có khả năng phát triển và sinh sản rất cao, dễ dàng bám vào bề mặt bình nuôi cấy và môi trường nuôi không cần nồng độ huyết thanh cao như các dòng tế bào khác (ví dụ các tế bào tách từ phôi chuột, các dòng tế bào ung thư…) (Phan Kim Ngọc, 2002) Do đó, việc sản xuất tế bào xơ phôi gà trong điều kiện ở Việt Nam là hoàn toàn có khả năng thực hiện được nhằm phục vụ cho chẩn đoán, sản xuất vaccine gia cầm trong tình hình hiện nay, cũng như làm nền tảng cho những nghiên cứu sau này

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, được sự phân công của bộ môn Vi Truyền nhiễm, khoa Chăn nuôi - Thú y, dưới sự hướng dẫn của ThS Trần Thị Bích Liên, BSTY Hoàng Thanh Hải, BSTY Lê Hồng Phong, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

sinh-“Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà”

1.2 Mục đích

Xây dựng quy trình nuôi cấy tế bào xơ phôi gà phù hợp với điều kiện tại Việt Nam, từ đó mở rộng khả năng ứng dụng tế bào xơ phôi gà trong nghiên cứu, chẩn đoán bệnh, sản xuất vaccine cho gia cầm

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan (1838) là nền tảng cho nhiều nhà khoa học về thực vật và động vật bắt đầu nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc (tế bào mầm)

Mặt khác, thực tế cuộc sống đòi hỏi vấn đề nuôi tế bào động vật ngày càng trở nên cấp bách Trước đây, người ta nuôi cấy virus trong cơ thể một sinh vật chủ

Từ đó, người ta thu nhận virus và dùng nó để sản xuất vaccine Việc sản xuất vaccine theo phương pháp này đã có những kết quả rất tốt và đóng vai trò rất quan trọng trong phòng và chữa bệnh hàng chục năm qua Hiện nay, người ta vẫn áp dụng có hiệu quả phương pháp này để sản xuất vaccine cho người và gia súc

Tuy nhiên, việc sản xuất vaccine theo phương pháp này vẫn có những hạn chế cần khắc phục Trong đó, khó khăn nhất là phải sử dụng một số lượng lớn động vật cho quá trình nuôi virus Điều đó không chỉ khó khăn về mặt kỹ thuật mà còn khó khăn về tài chính

Việc nuôi cấy tế bào động vật đặt ra cho các nhà khoa học những thách thức không nhỏ Bởi lẽ, nuôi cấy tế bào động vật khó hơn nhiều so với nuôi cấy vi sinh vật và nuôi cấy tế bào thực vật

Kiến thức tổng quát cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật được đưa ra từ thế

kỷ 19 Năm 1855, Roux chứng minh được khả năng giữ toàn vẹn đặc tính sinh học của tế bào phôi gà trong dung dịch nước muối sinh lý Điều này có ý nghĩa rất lớn trong nhận thức về sự sống của tế bào ngoài cơ thể, nó mở ra khả năng phát triển sự sống bên ngoài cơ thể đa bào

Đến năm 1907, Ross Harrison đã tách thành công tế bào thần kinh ếch để làm thí nghiệm thử nuôi chúng ngoài cơ thể Nhưng cho đến đầu những năm 1950, chỉ có vài công trình nhằm tăng cường khả năng nuôi cấy tế bào được nghiên cứu Đầu tiên là sự phát triển của thuốc kháng sinh để tránh các tác nhân gây nhiễm trong giai đoạn đầu nuôi cấy tế bào Thứ hai là sự phát triển các kỹ thuật, như dùng trypsin để tách tế bào từ bình nuôi cấy Kỹ thuật này rất quan trọng khi cần thu hoạch các dòng tế bào đang phát triển liên tục Thứ ba là thông qua việc nuôi cấy tế bào với các loại môi trường khác nhau để tìm ra thành phần môi trường thích hợp nhất cho dòng tế bào đó

Một đột phá có tính chất làm nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động vật thuộc về những nghiên cứu của Carrel (1913) Ông đã làm rất nhiều thí nghiệm

và cuối cùng ông đã đưa ra một kết luận có tính chất mở đường cho những thí nghiệm tiếp theo của rất nhiều tác giả đương thời: tế bào động vật hoàn toàn có thể

sống trong một khoảng thời gian dài trong điều kiện in vitro nếu ta thường xuyên

cung cấp các chất dinh dưỡng vô trùng cần thiết

Đến năm 1948, bằng những kỹ thuật mới, Earle đã tiến hành phân lập các tế bào và nuôi chúng trong những điều kiện môi trường đặc biệt, tác giả đã thu nhận được những dòng tế bào biệt lập Kỹ thuật này mở ra khả năng tách tế bào của từng loại mô và phát triển chúng trong những môi trường nhân tạo

Năm 1952, Gey đã tách tế bào ung thư ở người và nuôi chúng thành công Sau đó hai năm (1954), Levi – Moutalcini đã đi xa hơn trong nghiên cứu bằng cách tìm hiểu ảnh hưởng của những chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát triển của tế bào

trong nuôi cấy in vitro Ông dùng yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGE – Nerve Growth Factor) để kích thích sự tăng trưởng của tế bào thần kinh khi nuôi chúng in

vitro

Những nghiên cứu sau này của Eagle (1955), Puck (1956), Temin và Rubin (1958), Hayflick (1961), Littlefield (1964), Ham (1965), Kohler (1975), Sato (1976), Wigler (1977) rất thành công trong những lĩnh vực cơ bản sau:

- Tìm ra được nhiều loại môi trường thích hợp cho sự phát triển in vitro của

nhiều loại mô khác nhau của người và động vật

- Hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô động vật

Tương lai, hướng nghiên cứu này sẽ đem lại những thành tựu khoa học cũng như lợi ích kinh tế rất lớn Trước mắt, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật sẽ phục vụ cho hai ngành: ngành y và ngành chăn nuôi Hai ngành này đang cần những kỹ thuật hiện đại để phát triển

2.2 Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào

Hình 2.1 Mô hình một tế bào động vật điển hình

Các bào quan gồm: (1)hạch nhân, (2) nhân, (3) ribosome, 4) túi tiết,(5) mạng lưới nội chất (ER) hạt, (6) bộ máy Golgi, (7) khung xương tế bào, (8) ER trơn, (9) ty thể, (10) không bào, (11) tế bào chất, (12) lysosome, (13) trung thể

(Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%BF_b%C3%A0o)

2.2.1 Sự điều hòa trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào

Sự chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại của cơ thể sống

Ở vi sinh vật, quá trình trao đổi chất là quá trình xảy ra giữa tế bào và môi trường sống Do đó, ngoài các yếu tố ảnh hưởng từ bên ngoài (nhiệt độ, pH, nồng

độ các chất dinh dưỡng, các chất độc…), tế bào còn phụ thuộc rất nhiều vào các hoạt động của enzyme

Ở tế bào thực vật, ngoài tác động của enzyme, quá trình trao đổi chất còn chịu tác động rất mạnh bởi hệ dịch bao quanh tế bào

Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme, hệ dịch quanh tế bào như ở thực vật, chúng còn bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao đổi chất ở tế bào Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh Do đó, việc điều khiển trao đổi chất của tế bào động vật trong cơ thể sống trở nên hết sức phức tạp

Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dưỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác quá trình dinh dưỡng tế bào trong cơ thể Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình

trao đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, không tuân theo quy luật của mô và của cơ thể đa bào Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt động của enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng như khả năng phân chia tế bào

Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng quyết định đến kết quả:

- Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào

- Những yếu tố môi trường quyết định đặc trưng riêng biệt của tế bào

Sự hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hướng sản phẩm cuối, còn sự hiểu biết về đặc trưng riêng biệt giúp ta điều chỉnh (hay điều khiển) để tính trạng

đó được biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy

Trong nuôi cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát triển của chính tế bào đó trong cơ thể Mọi yếu tố tác động lên tế bào nuôi cấy in

vitro là những tác động trực tiếp Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này

không chỉ chịu tác động trực tiếp mà còn chịu những tác động gián tiếp Do đó, mọi

tác động của môi trường đến tế bào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh và mãnh liệt, cần

tạo ra sự hài hòa trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào được nuôi cấy

Tế bào động vật hoàn toàn không có thành tế bào, mà chúng chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào – thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với các tế bào khác trong mô Mặt khác, kích thước tế bào động vật thường rất lớn, trung bình khoảng 10 μm, lại không có vách nên tế bào động vật có tính chất cơ học yếu Do

đó, khi nuôi cấy cần nhẹ nhàng, tránh sự phá vỡ tế bào, trong trường hợp việc nuôi cấy tế bào cần khuấy hay quay thì tốc độ không được quá 100rpm (vòng/phút) (Phan Kim Ngọc, 2002)

2.2.3 Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng rất chậm

Do đặc điểm di truyền, các tế bào vi khuẩn thường phân chia với tốc độ rất nhanh, khoảng 20-50 phút Ở động vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thường kéo dài 20-70 giờ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nếu trong một điều kiện nào đó, một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lượng một cách bất thường, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý

2.2.4 Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi

Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi Tuy vậy, một số dòng tế bào như tế bào ung thư hoặc dòng tế bào kiên tục từ mô bình

thường (sau khi được thuần hóa) có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cần bám vào giá đỡ (Phan Kim Ngọc, 2002)

2.2.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng

Đây là cơ chế kiềm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (negative feed – back) Bất kỳ tế bào sinh vật nào cũng biểu hiện cơ chế này, điểm khác biệt của tế bào động vật là ở chỗ quá trình tổng hợp sản phẩm thừa ít xảy ra và thường thì các sản phẩm trao đổi chất thoát ra khỏi tế bào rất chậm

2.2.6 Khả năng tiếp nhận gene lạ

Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự nhiên Chúng được bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trường hợp chúng tồn tại ở trạng thái tự do, chúng có khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (từ virus…) hoặc khi cho những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau ở gần nhau, sẽ xảy ra hiện tượng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế bào lai

2.2.7 Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo

Khác với tế bào vi sinh vật và tế bào thực vật, tế bào động vật cần phải được bảo quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới có thể giữ được những đặc tính riêng của nó

Bằng cách sử dụng Nitrogen lỏng (-1960C), tế bào động vật vẫn duy trì được đặc tính của chúng trong thời gian rất dài Phương pháp này được áp dụng nhiều ở các ngân hàng giống động vật trên thế giới

Khi sử dụng, tế bào động vật được tiến hành giải đông và được hoạt hóa để phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như trước khi đem bảo quản

Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi trường, rất nhạy cảm với kim loại Trong quá trình phát triển trong môi trường nhân tạo, chúng rất cần huyết thanh, hormone

2.3 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật

2.3.1 Nuôi cấy sơ cấp

Định nghĩa: nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào vừa được tách ra từ mô hay cơ quan (Phan Kim Ngọc, 2002)

Việc nuôi cấy được bắt đầu tiến hành khi các tế bào được tách ra từ mô bằng phương pháp cơ học hay bằng phương pháp xử lý enzyme, và có thể tăng trưởng trong môi trường thích hợp

Có nhiều loại enzyme để tách tế bào như collagenase, elastase, hyaluronidase, pronase… nhưng trypsin được dùng nhiều nhất vì hiệu quả tách tế bào cao và giá thành rẻ Trypsin (và pronase) có thể tách hoàn toàn tế bào từ mô bằng cách thủy phân các protein liên kết các tế bào với nhau (Phan Kim Ngọc, 2002)

Dù tế bào được tách ra bằng bất kỳ phương pháp nào thì đây vẫn là giai đoạn chọn lọc đầu tiên của quá trình nuôi cấy để cuối cùng có thể thu các dòng tế bào tương đối đồng dạng

Trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp, sự chọn lọc dựa vào đặc tính của tế bào như

dễ tách rời nhau, sống và bám vào cơ chất thành một lớp mỏng hoặc tồn tại được trong dịch huyền phù Những tế bào đó là đối tượng cơ bản của quá trình nuôi cấy

sơ cấp Các tế bào nuôi cấy sơ cấp không đồng nhất với nhau do chúng là các thế hệ con của nhiều loại tế bào ban đầu khác nhau Ở giai đoạn này, tế bào nuôi cấy có hình thái gần với mô cha mẹ nhất

2.3.2 Sự cấy chuyển

Khi những tế bào trong bình nuôi cấy sơ khởi phát triển và làm đầy bề mặt bình nuôi cấy, chúng cần được cấy chuyền để có bề mặt cho sự phát triển Qua mỗi lần cấy chuyền, những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ dần dần chiếm ưu thế và những tế bào không tăng sinh hoặc tăng sinh chậm sẽ chết dưới tác động của trypsin và thao tác cấy chuyền Mặc dù vẫn có sự chọn lọc và tiến triển về hình thái, nhưng từ lần cấy chuyển thứ ba, tế bào trở nên ổn định hơn, có khả năng tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ

Tiến hành cấy chuyền bằng cách tách rời các tế bào từ bình nuôi cấy bằng enzyme (tương tự enzyme đã dung khi tách tế bào để nuôi cấy sơ khởi), enzyme này phá hủy cấu trúc protein gắn kết tế bào với bề mặt cơ chất Ngay sau khi tế bào được tách rời, enzyme được bất hoạt nhờ môi trường nuôi cấy (có chứa huyết thanh), huyền phù tế bào được chia nhỏ ra và cho vào bình nuôi cấy mới

2.3.3 Hệ thống nuôi cấy tế bào

2.3.3.1 Nuôi cấy lớp đơn

Thường sử dụng các dụng cụ như đĩa, bình T – flask, hệ thống trục xoay hay

vĩ nhiều giếng được xử lý cho nuôi cấy mô Các dụng cụ này được chọn tùy vào số lượng tế bào, bản chất môi trường nuôi cấy, giá thành và thói quen của người sử dụng

Đĩa Bình T - flask

Trục xoay Vĩ nhiều giếng

Hình 2.2 Các dụng cụ nuôi cấy tế bào lớp đơn

(Nguồn:

www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_cell_culture.pdf)

2.3.3.2 Nuôi cấy huyền phù

Thường được tiến hành trong:

- Bình có cánh quạt xoay từ hoặc bình lắc Erlenmeyer Trong đó, tế bào được giữ ở trạng thái huyền phù trong môi trường

Bình Erlenmeyer Bình có cánh quạt xoay

Hình 2.3 Các dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào

(Nguồn:

www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_cell_culture.pdf)

- Bình nuôi cấy tĩnh như bình T – flask hoặc chai, mặc dù tế bào không được giữ ở trạng thái chuyển động nhưng chúng không thể nào bám vào bề mặt bình nuôi cấy được

Nhiều dòng tế bào, đặc biệt là những dòng từ mô bình thường được xem là dòng phụ thuộc chỗ bám (Anchorage – Dependent), chúng chỉ có thể phát triển khi bám vào một chất nền thích hợp

Vài dòng tế bào không được xem là tế bào bình thường (Transformed Cells)

có thể phát triển nhanh mà không cần bám vào bề mặt hoặc di chuyển tự do trong dịch huyền phù (ví dụ: tế bào máu)

2.3.4 Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật

Những tế bào nuôi cấy thường được mô tả dựa trên hình thái (hình dạng và biểu hiện) hoặc đặc điểm chức năng của chúng Có 5 dạng hình thái cơ bản:

- Dạng biểu mô (Epithelial – like): những tế bào này bám trên bề mặt có dạng

- Tế bào thần kinh (Neuron): cấu tạo có mấu lồi và sợi trục đặc trưng, ít quan sát được sự phân chia trong môi trường

- Tế bào cơ (Muscle – like): dạng ống nhỏ có nhiều nhân, biệt hóa thành dạng ống trong quá trình nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hình dạng và nuôi cấy nhiều tế bào có khả năng biểu hiện sự đa dạng về hình thái

Sử dụng kỹ thuật đồng nhất tế bào cũng có thể lai các tế bào với nhau bằng cách kết hợp những tế bào từ bố mẹ khác nhau, cho biểu hiện đặc điểm của cha hoặc mẹ hoặc cả cha và mẹ Kỹ thuật này được sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng theo mong muốn Những tế bào lai này gọi là Hybridomas được kết hợp từ hai

tế bào khác nhau Thứ nhất là một lympho bào lách (có khả năng sản xuất kháng thể mong muốn) Thứ hai là một tế bào myeloma đang phân chia nhanh (một loại tế bào ung thư) Kết quả, thể lai có thể sản xuất số lượng lớn kháng thể mong muốn Những kháng thể này gọi là kháng thể đơn dòng bởi sự tinh sạch của nó, ứng dụng nhiều trong điều trị, chẩn đoán bệnh, và công nghiệp với giá trị hằng năm trên một

tỉ đô la

2.3.5 Những đặc điểm chức năng của tế bào nuôi cấy

Đặc điểm của những tế bào nuôi cấy phụ thuộc vào nguồn gốc (gan, tim…)

và khả năng thích nghi của chúng với điều kiện môi trường Những marker hóa sinh được sử dụng để kiểm tra xem tế bào có mang những đặc điểm chức năng mà chúng

có trong cơ thể sống hay không (ví dụ: tế bào gan tiết albumin) Những dấu hiệu hình thái học hay siêu cấu trúc cũng có thể được xác định (chẳng hạn sự đập của tế bào tim) Thông thường, những đặc điểm này có thể thay đổi hoặc mất đi khi đặt tế bào trong điều kiện nhân tạo

Sau một số lần cấy chuyền nhất định, vài dòng tế bào sẽ ngừng phân chia và biểu hiện sự hóa già Những dòng tế bào này được gọi là “có hạn” (Finite); tế bào CEF là một dòng tế bào có hạn và số lần phân chia của tế bào CEF là từ 16 – 18 lần (Christman và ctv, 2006) Những dòng tế bào khác có thể phân chia không giới hạn (hoặc trở thành bất tử) và được gọi là dòng tế bào liên tục (Continuous Cell Line)

Khi một dòng tế bào “có hạn” bình thường trở thành bất tử, nó trải qua một sự thay đổi không thể đảo ngược (Transformation) Nó có thể xảy ra tự phát hay do sử dụng thuốc, bức xạ hay virus có chủ định Những tế bào biến đổi thường phát triển dễ hơn và nhanh hơn, thường có Chromosome lớn hoặc không bình thường và có thể phát triển trong dịch huyền phù

2.3.6 Điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật

Một điều kiện thích hợp (“happy”) là điều kiện tốt hơn so với điều kiện cho phép tế bào tồn tại trong nuôi cấy Thông thường, nó là điều kiện cho phép những tế bào - ở số lượng rất ít – tăng số lượng thông qua sự phân chia Đúng hơn là, khi có những điều kiện xác định, tế bào nuôi cấy sẽ biểu hiện sự thích hợp của chúng với điều kiện sống, như mang các chức năng sinh lý, sinh hóa quan trọng như trong cơ thể sống, chẳng hạn sự co cơ hay sự tiết hormone và enzyme Để có điều kiện sống này, cần cung cấp cho tế bào nhiệt độ thích hợp, chất bám tốt và môi trường nuôi cấy chuẩn xác

 Nhiệt độ thường là tương tự nhiệt độ cơ thể vật chủ mà tế bào được tách ra Với sinh vật máu lạnh, nhiệt độ thường thay đổi từ 18 – 250C, hầu hết động vật hữu nhũ đòi hỏi nhiệt độ từ 36 – 370C Phạm vi nhiệt độ này được bảo đảm bằng nhiệt

kế và tủ ấm phải được kiểm tra thường xuyên

 Những tế bào phụ thuộc chỗ bám cũng đòi hỏi một chất nền tốt để bám và phát triển Thủy tinh và plastic (được xử lý đặc biệt) thường được sử dụng nhất Tuy nhiên, những yếu tố bám như collagen, gelatin, fibronectin cũng có thể được sử dụng như “áo khoác” cho bề mặt bám để cải tiến sự phát triển và chức năng của những tế bào lấy từ não, máu, thận, gan, da… Thường thì những tế bào phụ thuộc chỗ bám bình thường sẽ có chức năng tốt hơn nếu chúng được phát triển trên một chất nền xốp hay có dạng tổ ong

Tế bào cũng có thể phát triển trên các hạt trong huyền phù (hạt thủy tinh, plastic, polyacrylamide và hệ thống các phân tử dextrin) Bằng cách này, các tế bào phụ thuộc chỗ bám có thể phát triển trong hệ thống nuôi cấy huyền phù và làm tăng khả năng sản xuất tế bào bằng phương pháp sinh học

 Môi trường nuôi cấy là yếu tố phức tạp và quan trọng nhất để kiểm soát khả năng làm tế bào phát triển tốt Bên cạnh những đòi hỏi dinh dưỡng cơ bản của tế bào, môi trường nuôi cấy phải có nhiều yếu tố phát triển cần thiết, điều chỉnh pH và

áp suất, cung cấp các khí thiết yếu (O2 và CO2) Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy gồm amino acid, vitamine, khoáng và carbohydrate Chúng cho phép tế bào tạo ra những protein mới và các thành phần thiết yếu khác cho sự phát triển và các hoạt động chức năng – tương tự như sự cung cấp năng lượng cho trao đổi chất

Amino acid: các amino acid cần thiết là các amino acid không được tổng

hợp trong cơ thể nên cần phải được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Nhu cầu về cysteine và tyrosine thay đổi khác nhau tùy theo dòng tế bào Các amino acid không cần thiết khác cũng được bổ sung vào môi trường để bù đắp cho những dòng tế bào không có khả năng tổng hợp Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào, hiện nay, một số bằng chứng cho thấy glutamine được sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào như nguồn cung cấp năng lượng và carbon (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Vitamine: môi trường MEM của Eagle (EMEM) chỉ có các vitamine

thuộc nhóm B, các vitamine từ nhóm khác sẽ được bổ sung từ huyết thanh Khi tăng thành phần môi trường lên (mục đích để giảm lượng huyết thanh xuống) thì danh sách các vitamine trong môi trường cũng phải tăng theo Khi giảm lượng huyết thanh trong môi trường thì việc bổ sung các vitamine khác ngoài những vitamine đã

có sẳn trong môi trường là rất cần thiết Khi mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy thấp (trong giai đoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng lượng vitamine cho dù trong môi trường đã có sự hiện diện của huyết thanh Sự hạn chế về vitamine có ảnh hưởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trưởng của tế bào hơn là trên mật độ tế bào

Muối: các loại muối chủ yếu như Na+

, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO32-, PO43- và HCO3- là thành phần chính tạo ra áp suất thẩm thấu của môi trường Trong huyền

phù tế bào, lượng Ca2+ thường được giảm xuống để hạn chế sự kết cụm của tế bào Nồng độ của HCO3-

được xác định bởi nồng độ CO2 ở dạng khí

Glucose: glucose được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cung cấp

năng lượng Glucose được chuyển hóa chủ yếu bởi quá trình đường phân (glycolyse) tạo ra acid lactic để đi qua chu trình Krebs giải phóng CO2 Nghiên cứu lượng acid lactic tích tụ trong môi trường, đặc biệt là khi nuôi các tế bào phôi và các

tế bào biến đổi, người ta thấy rằng chu trình Krebs ở đây hoạt động không trọn vẹn như in vivo, và carbon trong acid lactic chủ yếu là chuyển hóa từ glutamine, chỉ một phần nhỏ là từ glucose Điều này giải thích cho nhu cầu về glutamine và glutamate của tế bào nuôi cấy

Khoáng chất: cũng như một vài loại vitamine, hầu hết các khoáng chất

cần thiết cho tế bào được cung cấp bởi huyết thanh Việc bổ sung các chất này vào môi trường nói chung không cần thiết lắm, trừ khi có sự giảm lượng huyết thanh trong môi trường Trong môi trường có hàm lượng huyết thanh thấp hoặc hoàn toàn không có huyết thanh thì lúc đó cần phải bổ sung sắt, đồng, kẽm, selenium và các nguyên tố khác vào môi trường nuôi cấy

Các chất hữu cơ khác: các hợp chất khác nhau như nucleoside, các chất

trung gian của chu trình Krebs, pyruvate và lipid cũng có mặt trong các môi trường nuôi cấy phức tạp Những hợp chất này cần thiết khi giảm lượng huyết thanh trong môi trường nuôi cấy Các chất này có vai trò trong nhân dòng và duy trì các dòng tế bào chuyên biêt

Trong hầu hết các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật đều cần đến

huyết thanh vì nó có những vai trò quan trọng như sau (Phan Kim Ngọc, 2002):

- Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…

- Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân chia

- Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzyme gây tổn thương tế bào

- Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

- Cải thiện tính dích của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng

độ dính của tế bào lên giá đỡ

- Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy

Huyết thanh được sử dụng trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô là huyết thanh bê, huyết thanh phôi bò, huyết thanh ngựa và huyết thanh người Huyết thanh bê thường được sử dụng nhiều nhất, kế đến là huyết thanh bò (tùy theo nhu cầu của dòng tế bào) và huyết thanh người được sử dụng trong nuôi cấy một số dòng tế bào của người

Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm tăng giá thành nuôi cấy lên rất nhiều Ngoài ra, huyết thanh còn dể bị nhiễm virus, mycoplasma và khó ổn định chất lượng của những lô môi trường khác nhau cũng như còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợp, không chứa yếu tố ức chế đối với dòng tế bào nuôi cấy)

Hormone: hormone có những ảnh hưởng khác nhau trên tế bào và thường

khó có thể nhận ra được tác động chính của chúng Insulin kích thích sự hấp thu glucose và amino acid và có lẽ khả năng kích thích sự phân chia tế bào của nó đã ảnh hưởng đến thuộc tính này Một vài yếu tố tăng trưởng kết hợp với chất nhận của insulin trên bề mặt của tế bào và có những hoạt động tương tự Các hormone tăng trưởng có thể có mặt trong huyết thanh, đặc biệt là trong huyết thanh bò và cùng với somatomedine ảnh hưởng trên sự phân bào Hydrocortisone cũng có trong huyết thanh với hàm lượng thay đổi Chất này có thể kích thích sự bám dính của tế bào và

sự tăng sinh của tế bào Nhưng trong những điều kiện nhất định (như khi mật độ tế bào cao) thì cản sự phân bào và có thể cảm ứng sự biệt hóa tế bào

Trong các thí nghiệm giảm hoặc bỏ hẳn huyết thanh trong môi trường nuôi cây cho thấy các hormone cần thiết cho sự nuôi cấy có thể cũng có mặt trong thành

phần của huyết thanh nên việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy là cần thiết

Các chất biến dưỡng và các dưỡng chất: trong huyết thanh cũng có các

amino acid, glucose, ketoacid và một số các dưỡng chất, các chất biến dưỡng trung gian Những chất này quan trọng trong các môi trường đơn giản, nhưng ít quan trọng hơn trong các môi trường phức tạp, đặc biệt là những môi trường có ít các chất bổ sung khác và các amino acid với nồng độ cao

Các yếu tố kiềm hãm: huyết thanh có thể có chứa những cơ chất có tác

dụng kiềm hãm sự tăng sinh của tế bào Một số chất có thể được tạo ra trong quá trình chuẩn bị môi trường như độc tố của các loại vi khuẩn nhiễm vào môi trường trước khi qua lọc vô trùng, các phân đoạn của γ – globulin có thể chứa các loại kháng sinh gây trở ngại cho việc nuôi cấy Hơi nóng có thể làm phân hủy một vài phức chất trong huyết thanh và làm giảm tính độc của immunoglobulin mà không gây hại đến các yếu tố tăng trưởng là polypeptide, hơi nóng có thể làm phân hủy một số chất dễ bị biến tính bởi nhiệt và thành phần của huyết thanh sẽ không còn giống như trước khi xử lý

Sự tác động của những yếu tố kiềm hãm chuyên biệt trong mô lên sự tăng sinh của tế bào hoặc những hormone ức chế ở trong huyết thanh chưa thể xác định được, mặc dù một số hormone có thể ức chế theo cách không chuyên biệt

Môi trường cũng góp phần kiểm soát pH và là chất đệm cho tế bào tránh sự thay đổi pH đột ngột Chất đệm trong môi trường thường là CO2 – bicarbonate hay

là đệm hữu cơ như HEPES (Hydroxy – Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulphonic acid), được sử dụng để giữ pH môi trường trong khoảng 7,0 – 7,4 tùy loại tế bào nuôi cấy Đệm CO2 – bicarbonate điều chỉnh lượng CO2 hòa tan trong môi trường, thường được sử dụng khi dùng tủ ấm kiểm soát CO2 và được cung cấp từ 2 – 10%

CO2 (với đệm của Earle), còn môi trường sử dụng đệm CO2 – bicarbonate của Hank không đòi hỏi CO2, nhưng phải được đặt trong bình kín

Cuối cùng, áp suất thẩm thấu rất quan trọng với việc điều chỉnh dòng chất trong và ngoài tế bào Nó được kiểm soát bởi sự thêm hay bớt một lượng muối

trong môi trường nuôi cấy Sự bay hơi của môi trường ở hệ thống nuôi cấy hở (đĩa…) sẽ làm tăng nhanh áp suất, làm cho tế bào bị stress, biến dạng hoặc chết Với

hệ thống nuôi cấy hở, cần có tủ ấm với ẩm độ cao để hạn chế sự bay hơi của môi trường

Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy

Ước lượng trạng thái sức khỏe nói chung hay sự “happy” của tế bào nuôi cấy thường dựa trên 4 đặc điểm: hình thái, tỷ lệ phát triển, năng suất che phủ và biểu hiện chức năng đặc biệt

 Dựa vào hình thái học (hình dạng tế bào) là dễ xác định nhất nhưng thường ít được sử dụng nhất Tuy đặc điểm này được theo dõi thường xuyên khi nuôi cấy nhưng rất khó đưa ra kết luận dựa vào những quan sát này Ngoài ra, đặc điểm này không thể hiện một số lượng hay đo lường chính xác nào Phương pháp này thỉnh thoảng sai khi quan sát tế bào bằng kính hiển vi và vi trường quan sát xấu hay có biểu hiện bất thường Khi nghi ngờ, có thể nhuộm những tế bào đó với crystal violet hoặc các chất nhuộm mô khác để xác định vấn đề bất thường

 Đếm tế bào để ước lượng số lượng tế bào, cho phép xác định tỷ lệ phát triển –

tỷ lệ này nhạy cảm với những thay đổi cơ bản của điều kiện nuôi cấy Dựa vào đó

để thiết lập các thí nghiệm xác định điều kiện (môi trường, chất nền, huyết thanh…) tốt hơn cho tế bào

 Năng suất che phủ là phương pháp kiểm tra dựa trên số lượng nhỏ tế bào (từ

20 – 200) bám trên bình nuôi cấy và số lượng các cụm tế bào đặc trưng được xác định Phần trăm các cụm tế bào đặc trưng biểu hiện cho khả năng tồn tại, trong khi kích thước cụm tế bào đặc trưng cho tỷ lệ phát triển Phương pháp này tương tự phương pháp phân tích tỷ lệ phát triển, nhưng nhạy cảm hơn với sự khác biệt nhỏ của điều kiện nuôi cấy

 Đặc điểm cuối cùng là sự biểu hiện chức năng đặc biệt: thường khó quan sát

và đo lường nhất, được xác định bằng các xét nghiệm hóa sinh và miễn dịch Những tế bào được nuôi cấy có thể phát triển rất tốt trong điều kiện gần tối ưu,

trong khi chức năng đặc biệt thường đòi hỏi điều kiện nuôi cấy hoàn chỉnh và thường nhanh chóng mất đi khi tế bào bám lên bề mặt bình nuôi cấy

2.3.7 Vấn đề cần lưu ý khi nuôi cấy tế bào động vật

Tránh sự tạp nhiễm: sự tạp nhiễm trong nuôi cấy tế bào có hai loại chính là nhiễm hóa học và nhiễm sinh học

Nhiễm hóa học là khó phát hiện nhất, nó gây ra bởi nhiều tác nhân như: endotoxin, ion kim loại hoặc thuốc tẩy hóa học - những chất này không thể nhìn thấy được

Nhiễm sinh học: nấm, vi khuẩn phát triển nhanh và thường có thể thấy biểu hiện trong nuôi cấy (thay đổi pH hoặc đục môi trường) và do đó dễ phát hiện (thường xảy ra nếu thiếu kháng sinh trong môi trường nuôi cấy) Tuy nhiên, hai dạng khác của nhiễm sinh học là mycoplasma và virus thì không dễ phát hiện và đòi hỏi những phương pháp xác định đặc biệt

Hai yêu cầu chính để tránh tạp nhiễm: thứ nhất là đảm bảo vô trùng tốt trong khu vực làm việc, thứ hai là môi trường, dụng cụ phải được tiệt trùng, cất giữ và sắp xếp hợp lý Sử dụng kháng sinh cẩn thận và có giới hạn trong nuôi cấy mô có thể giúp tránh tổn thất do tạp nhiễm sinh học

2.3.8 Các pha của sự nuôi cấy tế bào động vật

2.3.8.1 Pha ức chế

Pha ức chế là pha đầu tiên, nó phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thành phần, mật

độ, trạng thái ban đầu của tế bào Pha này xảy ra sớm, không tăng về số lượng tế bào (số lượng tế bào có thể giảm)

Nếu mật độ nuôi cấy và khả năng sống của tế bào nuôi cấy thấp thì pha này sẽ kéo dài hơn

2.3.8.2 Pha phát triển

Sau 3 – 4 ngày nuôi cấy, số lượng tế bào sẽ bắt đầu tăng lên nhanh chóng Trong chẩn đoán, thường sử dụng bình tế bào đã phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát triển)

2.3.8.3 Pha ổn định

Mật độ tế bào không tăng, tốc độ chết bằng tốc độ sinh trưởng

Sự sinh trưởng của tế bào bị hạn chế do:

2.3.8.4 Pha suy giảm

Số lượng tế bào chết tăng, mật độ tế bào sống giảm

2.4 Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy

Để bảo đảm sức khỏe nói chung hay sự phát triển của tế bào nuôi cấy nói riêng cần chú ý giảm thiểu khả năng rủi ro và sự tạp nhiễm Bên cạnh đó, khả năng phát triển nhanh của tế bào sẽ thay đổi, như tất cả mọi sinh vật, những biến đổi do tuổi tác hay sự thay đổi môi trường có thể làm giảm khả năng và sự phát triển liên tục của tế bào

Có thể giải quyết những vấn đề này bằng cách bảo quản lạnh để dừng hoạt động sinh học tế bào, đặt chúng vào trong điều kiện ngừng hoạt động thật sự Trong một thời gian dài, ý tưởng này được xem là giả tưởng cho đến năm 1949, Polge, Smith và Parkes phát hiện rằng glycerol ngăn chặn được sự phá hủy tế bào khi đông lạnh (John A Ryan, 2004) Và từ đó, người ta đưa ra nhiều quy trình đông lạnh tế bào, và đạt dược kết quả rất tốt

2.4.1 Những ưu điểm của việc đông lạnh tế bào nuôi cấy

- Tiết kiệm thời gian và tiền của

- Có nguồn để đáp ứng ngay khi cần

- Cung cấp một loại tế bào thuần nhất và giảm thiểu sự phát triển và hóa già của tế bào nuôi cấy

2.4.2 Tiến trình bảo quản lạnh tế bào

2.4.2.1 Lựa chọn tế bào

Chọn bình tế bào nuôi cấy ở gần cuối giai đoạn log phase (đầy 90%) và thay môi trường phát triển mới trước thu hoạch 24 giờ Kiểm tra sự nhiễm (đặc biệt là Mycoplasma), kiểm tra sự đồng nhất của tế bào và cả một vài biểu hiện đặc biệt

2.4.2.2 Thu hoạch tế bào

Phải tiến hành đúng cách và thao tác thật nhẹ nhàng

2.4.2.3 Đưa vào chất bảo quản lạnh:

Các chất có tác dụng bảo quản lạnh là methyl acetamide, methyl alcohol, ethylene glycol và polyvinyl pyrrolidone… Tuy nhiên, DMSO (dimethylsulfoxide)

và glycerol là thuận tiện và được sử dụng nhiều nhất Cần chú ý, DMSO là chất phân cực mạnh, dễ dàng thấm qua da và mang theo các chất có độc tính hay chất gây ung thư

2.4.2.4 Đưa vào ốngbảo quản

Hình 2.3 Ống bảo quản tế bào

(Nguồn:

http://www.corning.com/lifesciences/technical_information/TechDocs/t_cryoanimalcc.pdf)

2.4.2.5 Dán nhãn và ghi sổ

2.4.2.6 Đưa vào bình bảo quản lạnh: