Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá tra pangasianodon hypophthamus

RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn Restric

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU HÓA CÁC CẶP MỒI MICROSATELLITE TRONG

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthamus)

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : BÙI THỊ LIÊN HÀ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, hình ảnh và kết quả trong luận văn là trung thực Nếu có bất kỳ sự gian dối nào, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

TP HCM, ngày … tháng … năm 2015

Sinh viên,

Tạ Thanh Thế

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô trong Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong những năm học qua Những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học không chỉ là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này mà còn là hành trang quý báu giúp em vững bước trong tương lai

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II và Ths Bùi Thị Liên Hà đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm

và tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Bên cạnh đó,

em xin gửi lời cảm ơn đến chị Lê Ngọc Thùy Trang cùng các bạn sinh viên tại phòng thí nghiệm Di Truyền Phân Tử đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ và động viên em

trong suốt thời gian qua

Đồng thời, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến những người bạn đã là chỗ dựa vững chắc và cùng sát cánh bên nhau trong suốt những năm học qua

Cuối cùng, con gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến ba mẹ đã động viên và giúp đỡ con vượt qua những khó khăn trong cuộc sống và trong quá trình học tập

TP HCM, ngày … tháng … năm 2015

Sinh viên,

Tạ Thanh Thế

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC CÁC BẢNG xi

DANH MỤC CÁC HÌNH xii

MỞ ĐẦU……… 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus) 3

1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái 6

1.1.3.1 Đặc điểm phân bố 6

1.1.3.2 Đặc điểm sinh sản 7

1.2 Tình hình chọn giống cá tra tại đồng bằng sông Cửu Long 8

1.2.1 Tình hình nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long 8

1.2.2 Tình hình chất lượng con giống cá Tra ở đồng bằng sông Cửu Long 8 1.2.3 Một số chương trình nghiên cứu liên quan đến cá tra 9

1.3 Ứng dụng di truyền phân tử vào trong chọn giống 10

1.3.1 Phân loại 10

1.3.2 RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) 11

1.3.3 Amplifíed Fragment Length Polymorphism (AFLP) 12

1.3.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplifíed Polymorphism DNA) 13

1.3.5 Microsatellite (SSR) 13

1.4 Chỉ thị Microsatellite trong nghiên cứu đa dạng di truyền 14

1.4.1 Khái niệm về Microsatellite 14

1.4.2 Tính chất 15

1.4.3 Sự phát triển của primer Microsatellite 16

1.4.4 Giới hạn của Microsatellite 16

1.4.5 Các loại Microsatellite 18

1.4.6 Cơ chế hình thành microsatellite 18

1.4.7 Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite 19

1.4.8 Ưu và nhược điểm cùa microsatellite 21

1.4.8.1 Ưu điểm 21

1.4.8.2 Nhược điểm 21

1.4.9 Vai trò của microsatellite 22

1.4.10 Ứng dụng của microsatellite 23

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.2 Vật liệu nghiên cứu 24

2.2.1 Nguồn mẫu 24

2.2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 24

2.2.2.1 Mồi 24

2.2.2.2 Thang 25

2.2.2.3 Các hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA 26

2.2.2.4 Hóa chất sử dụng trong PCR 26

2.2.2.5 Hóa chất sử dụng trong điện di agarose 27

2.2.2.6 Dụng cụ và thiết bị 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu 27

2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA 28

2.3.2.1 Quy trình 28

2.3.2.2 Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết 28

2.3.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 29

2.3.3.1 Khái niệm 29

2.3.3.2 Nguyên tắc của phản ứng PCR 29

2.3.3.3 Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR 31

2.3.3.4 Ưu nhược điểm của phản ứng PCR 33

2.3.3.5 Ứng dụng 33

2.3.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 33

2.3.4.1 Nguyên tắc 34

2.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng 35

2.4 Bố trí thí nghiệm 37

2.4.1 Thí nghiệm 1: tách chiết DNA 38

2.4.1.1 Tách chiết DNA 38

2.4.1.2 Kiểm tra DNA tách chiết 38

2.4.2 Thí nghiệm 2: tối ưu hóa phản ứng PCR 39

2.4.2.1 Thí nghiệm 2.1: khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite 39

2.4.2.2 Thí nghiệm 2.2: khảo sát nồng độ MgCl2 42

2.4.2.3 Thí nghiệm 2.3: khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase 42

2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite 43

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Kết quả tách chiết DNA 45

3.2 Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR 46

3.2.1 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite 46

3.2.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 53

3.2.3 Khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase 57

3.3 Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite 58

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60

4.1 Kết luận 60

4.2 Đề nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism

ALP : Amplicon Length Polymorphism

AP-PCR : Arbitrary Primer-PCR

bp : Base pair

DAF : DNA Amplification Fingerprinting

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate

EBV : Estimated Breeding Value

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid

PCR : Polymerase chain reaction

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA

RE : Restriction enzyme

RFLP : RestrictionFragment Length Polymorphism

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

SNP : Single Nucleotide Polymorphism

SSCP : Single Strand Conformation Polymorphism

SSR : Simple Sequence Repeat (Microsatellite)

STR : short tandem repeats

STS : Sequence-Taqged Sites

Ta : Annealing temperature

Taq DNA polymerase: Thermos aquaticus DNA polymerase

TBE : Tris Borate EDTA

UV : Ultra Violet - tia cực tím

VNTR : Variable Number Tamdem Repeat

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005) 11

Bảng 2.1 Thông tin 16 cặp mồi microsatellite dùng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.2 Các thông số điện di DNA bằng gel agarose 36

Bảng 2.3 Gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi microsatellite 40

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của các mồi CB12, CB13, CB14, CB15, CB18, CB19. 40

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt của mồi Pg –13, PSP – G565, PSP – G579, PSP – G593. 41

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của mồi Ph–7, Ph–9, Ph–21, Ph–25 41

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt của mồi Phy01, Phy03 41

Bảng 2.8 Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite 42

Bảng 2.9 Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát 42

Bảng 2.10 Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq polymerase cho một phản ứng PCR 43

Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt cặp của các mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu 52

Bảng 3.2 Bảng kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 12 cặp mồi 56

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1.Cấu tạo răng vòm miệng của cá Tra nuôi (Roberts và Vidthayanon, 1991).

5

Hình 1.2 Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) 5

Hình 1.3 2 đôi râu ở cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus); 1 đôi râu mép dài; 1 đôi râu hàm dưới ngắn 5

Hình 1.4 Vị trí và hình dạng bong bóng khí của cá Tra 6

Hình 1.5 Cấu tạo bong bóng khí của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) 6

Hình 1.6 Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân 18

Hình 1.7 Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã 19

Hình 1.8 Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số 20

Hình 1.9.Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite 20

Hình 2.1 Thang chuẩn 100 bp 26

Hình 2.2 Quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và ctv, 1988) 28

Hình 2.3 Các bước cơ bản của phàn ứng PCR 30

Hình 2.4 Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel 35

Hình 2.5 Kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại mạch thẳng ở bên phải 36

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 37

Hình 2.7 Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi microsatellite 44

Hình 3.1 Kết quả tách chiết DNA 15 mẫu vây đuôi cá tra ngẫu nhiên cho 4 quần đàn G2–2001, G2–2002 , G2–2003, G3–2001 45

Hình 3.2 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB12 46

Hình 3.3 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB13 47

Hình 3.4 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB14 47

Hình 3.5 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB15 48

Hình 3.6 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB18 48

Hình 3.7 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB19 49

Hình 3.8 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy01 50

Hình 3.9 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy03 50

Hình 3.10 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–7 51

Hình 3.11 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–21 51

Hình 3.12 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi PSP–G579 52

Hình 3.13 Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Pg–13 52

Hình 3.14 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB14 54

Hình 3.15.Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB15 54

Hình 3.16 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB12 55

Hình 3.17 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB13 55

Hình 3.18 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB18 55

Hình 3.19 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB19 55

Hình 3.20 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Phy01 55

Hình 3.21 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Phy03 56

Hình 3.22 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Ph-7 56

Hình 3.23 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Ph-21 56

Hình 3.24 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi PSP-G579 56

Hình 3.25 Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Pg–13 56

Hình 3.26 Kết quả điện di thay đổi nồng độ Taq DNA polymerase trên gel Agarose 2,5 % 57

Hình 3.27 Sản phẩm khuếch đại của mồi CB19 trên 12 mẫu cá tra 59

Hình 3.28 Hình kiểm tra đa hình sản phẩm khuếch đại của các mồi CB13, CB14, CB18, CB19, Pg-13, Ph-7 trên 4 mẫu cá tra 59

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Việt Nam đang là một trong năm nước đứng đầu thế giới về sản lượng nuôi trồng thủy sản Sau nghề nuôi tôm thì nghề nuôi cá tra là một trong những nghề phát triển mạnh nhất trong thời gian qua ở vùng đồng bằng sông Cửu Long

Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nước ngọt bản địa của Việt

Nam và được biết phổ biến như là một biểu tượng thương mại của ngành nuôi trồng thủy sản nói riêng, đóng vai trò chủ chốt trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản của Việt Nam

Hiện nay, nghề nuôi cá Tra sản xuất ngày càng phát triển và mở rộng dẫn đến nhu cầu con giống cá Tra càng tăng cao Tuy nhiên, việc sản xuất và cung ứng giống cá tra tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long chủ yếu do người dân tự phát, tự cân đối nên chưa có sự phát triển đồng bộ giữa số lượng cũng như chất lượng con giống Chất lượng con giống có chiều hướng suy giảm trong những năm trở lại đây với những biểu hiện như tỷ lệ dị hình cao, chậm lớn, dễ nhiễm bệnh và tỷ lệ sống thấp Giá cá bột không có sự khác biệt giữa cá có cải thiện di truyền và cá tại địa phương Từ đó ảnh hưởng tới vệc nuôi trồng và sản xuất của các hộ nuôi cá tra thương phẩm cũng như ảnh hưởng tới việc xuất khầu cá tra ra thị trường nước ngoài

Trước tình hình như vậy bên cạnh việc ban hành các thông tư và nghị định về nuôi chế biến và sản xuất cá tra thì hỗ trợ những trang thiết bị, máy móc cần thiết để phục vụ cho công tác kiểm soát chất lượng con giống, kiểm soát môi trường nuôi, đào tạo nghiệp vụ cho các cơ quan quản lý địa phương nhằm chủ động hơn trong nhiệm vụ quản lý cá tra giống là việc rất cần thiết

Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực

hiền đề tài “Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di

truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)” Nghiên cứu này được hy vọng sẽ

tạo tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo trong việc phân tích đa dạng di truyền cá Tra

nhằm góp phần vực dậy chất lượng con giống tra, nâng cao năng suất, tạo ra những sản phẩm có chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường trong và ngoài nước Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Ngiệm Di Truyền Phân Tử, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tối ưu hóa và tuyển chọn các cặp mồi microsatellite có tính đa hình cao từ 16 cặp mồi microsatellite

3 Nội dung nghiên cứu

 Tách chiết DNA mẫu cá Tra từ 4 quần đàn khác nhau

 Tối ưu hóa phản ứng PCR

 Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)

Bộ Siluriformes gồm có 36 họ, 477 giống, 3088 loài cá phân bố rộng khắp trên

toàn thế giới Trong 36 họ cá đã nêu có một số họ cá có giá trị kinh tế được nuôi và

khai thác phổ biến như các họ: Ariidae (cá Úc), Bagridae (cá Chốt), Clariidae (cá Trê), Ictaluriidae (cá Nheo), Pangasiidae (cá Trơn), Plotosidae (cá Ngát),

Silurudae (cá Leo) và Sisoridae (cá Chiên)…(Carl và ctv, 2007)

Cá Tra là loài cá kinh tế phổ biến ở khu vực châu Á và là một trong 30 loài cá

thuộc họ Pangasiidae (http://www.fishbase.org) Pangasiidae được phát hiện đầu

tiên trong thủy vực nước ngọt ở các quốc gia phụ cận khu vực hạ lưu của Ấn Độ Dương; sự đa dạng thành phần loài của họ cá này tập trung chủ yếu ở khu vực Đông Nam châu Á (Roberts và Vithayanon, 1991) Cá Tra có nguồn gốc từ Cambodia, Lào, Thái Lan và Việt Nam (www.fishbase.org) Ngoài ra, cá Tra còn được đưa vào nuôi rộng rãi khắp các nước Đông Nam Á

Kiến thức về sinh học và sinh thái học của loài này trong tự nhiên còn hạn chế (Hung và ctv, 2003) Cá Tra có tính ăn tạp và thức ăn chủ yếu là thực vật và một số loài động vật thân mềm (Vithayanon, 1993)

Cá Tra phân bố tự nhiên ở vùng hạ lưu sông Mekong bao gồm các nước: Cambodia, Lào, Thái Lan, Việt Nam và chúng cũng được phát hiện ở sông Chao Praya – Thái Lan

1.1.1 Hệ thống phân loại

Theo hệ thống phân loại Roberts và Vidohayanon (1991) cá Tra thuộc :

Giới: Animalia Linnaeus

Ngành: Chordata Bateson

Ngành phụ: Vertebrata Cuvier

Tổng lớp: Osteichthyes Huxley Lớp: Actinopterygii Huxley Lớp phụ: Neopterygii Infraclass: Teleostei

Tổng bộ: Ostaryphysi Bộ: Siluriformes Họ: Pangasiidae Bleeker Giống (chi): Pangasius Loài: Pangasius hypophthalmus

Các đồng danh của loài cá Tra :

Tên loài Pangasianodon hypophthalmus được Rainboth sử dụng lần đầu vào

năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được nhiều tác giả khác sử dụng

phổ biến đến nay Tuy nhiên tên khoa học Pangasius sutchi thì không còn sử dụng

nữa Tên đặt cho loài này khác nhau theo các nước trong vùng nó phân bố Ở

Campuchia là Trey pra (tên Khmer), Lào là Pa souay kheo, Pa suay, Thái là Pla saa

wha, Pla suey và Việt Nam là Cá Tra (Nguyễn Văn Thường, 2008)

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993) cá Tra được mô tả như sau:

 Đầu rộng, dẹp bằng Mõm ngắn, nhìn từ trên xuống chót mõm tròn

 Miệng trước, rộng ngang, không co duỗi được có dạng hình vòng cung và nằm trên mặt phẳng ngang

 Răng nhỏ mịn, răng vòm miệng chia thành 4 đám nhỏ, mỏng, nằm trên đường vòng cung, đôi khi bị che lấp bởi nếp da vòm miệng (Hình 1.1)

Hình 1.1.Cấu tạo răng vòm miệng của cá Tra nuôi (Roberts và Vidthayanon, 1991)

 Lỗ mũi sau gần lỗ mũi trước hơn mắt và nằm trên đường thẳng kẻ từ lỗ mũi trước đến cạnh trên của mắt

 Có hai đôi râu, râu mép kéo dài chưa chạm đến gốc vi ngực, râu cằm ngắn hơn

 Thân thon dài, phần sau dẹp bên Đường bên hoàn toàn và phân nhánh, bắt đầu từ mép trên của lỗ mang đến điểm giữa gốc vi đuôi Mặt sau của vi lưng, vi ngực có răng cưa hướng xuống gốc vi Vi bụng kéo dài chưa chạm đến khởi điểm của gốc vi hậu môn

Hình 1.2 Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Hình 1.3 2 đôi râu ở cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus); 1 đôi râu mép dài; 1

Hình 1.4 Vị trí và hình dạng bong bóng khí của cá Tra

Hình 1.5 Cấu tạo bong bóng khí của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) 1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái

1.1.3.1 Đặc điểm phân bố

Vùng phân bố tự nhiên của cá Tra giới hạn trong hạ lưu sông Mekong, bao gồm Cambodia, Lào, Thái Lan và Việt Nam, kể cả sông Chao Praya ở Thái Lan (Roberts và Vidthayanon, 1991; Poulsen và ctv, 2004)

Theo Nguyễn Thị Thu Thủy (2009) có ít nhất hai quần thể lớn khác nhau được tìm thấy ở khu vực hạ lưu sông Mekong:

Một quần thể ở khu thượng nguồn sông Mekong (Thái Lan, Lào) Quần thể này có thể mở rộng từ cửa sông Loei đi ngược lên biên giới Myanmar và Trung Quốc

 Quần thể hạ nguồn là quần thể trội hơn, và chiếm ưu thế trong khắp khu vực phân bố của chúng, kéo dài từ đồng bằng sông Mekong ở Việt Nam, trong hệ thống hồ lớn Campuchia và ngược lên Khone Falls (Campuchia) Cũng có thể có một quần thể nhỏ hơn ở khu vục sông Xe Bang Fai và sông Songkhram Quần thể này có thể trùng lặp một phần với quần thể nói trên

do sự di cư chậm về phương diện không gian lẫn di truyền

Hoạt động di cư xuôi dòng của cá xảy ra vào tháng 5 – 8 từ Stung Treng đến Kandal ở Cambodia và sau đó đến hạ lưu sông Mekong ở Việt Nam Trứng cá xuất hiện vào tháng 3 – 8 từ Stung Treng đến Kandal, cho thấy rằng sự di cư xuôi dòng của cá bao gồm cả hai hoạt động: di cư sinh sản và di cư dinh dưỡng và cuối cùng

cá di chuyển đến các cánh đồng ngập nước ở Cambodia và Việt Nam trong mùa lũ

Ở Việt Nam, cá Tra thuộc đàn cá hạ lưu, phân bố rộng khắp trên sông Tiền và sông Hậu Vào mùa mưa (tháng 5 – 6) cá Tra bột trôi theo dòng nước từ bãi đẻ ở đoạn giữa Kra – chê và thác Khône Khi chúng đến biên giới giữa Cambodia và Việt Nam, cá sẽ dạt vào các vùng ngập nước ở đây Sông Tonle Sap chảy theo chiều nguợc lại giúp cho cá bột có thể đi sâu vào vùng ngập thuộc hệ thống này

Sức sinh sản của cá tra là 120.000 – 145.700 trứng/kg cá cái (Huỳnh Quốc Khanh, 2009)

1.2 Tình hình chọn giống cá tra tại đồng bằng sông Cửu Long

1.2.1 Tình hình nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long

Việt Nam đang là một trong năm nước đứng đầu thế giới về sản lượng nuôi trồng thủy sản Sau nghề nuôi tôm thì nghề nuôi cá tra là một trong những nghề phát triển mạnh nhất trong thời gian qua ở vùng đồng bằng sông Cửu Long Đây là loài cá nước ngọt bản địa của Việt Nam thường được nuôi trong ao hoặc trong lồng

bè và xu hướng hiện nay chủ yếu là nuôi trong ao

Theo Tổng cục Thủy sản: ước tính tổng diện tích thả nuôi cá tra tháng 1/2015

là 1.701 ha, tăng nhẹ 3,5 % so với cùng kì năm 2014 Trong đó tỉnh Đồng Tháp có diện tích nuôi cá tra đạt 1.072 ha chiếm 63% diện tích nuôi cá tra, tăng 10,7% so với năm 2014 Sản lượng thu hoạch lũy kế tính ước tính đạt 73 nghìn tấn, năng suất bình quân đạt 300 tấn/ha, tăng 1,6 lần so với năng suất bình quân năm 2014, trong

đó tỉnh Đồng Tháp có năng suất cao nhất đạt 410 tấn/ha và năng suất thấp nhất của Bến Tre đạt 205,2 tấn/ha

Đến đầu năm 2015, giá cá tra nguyên liệu tăng thêm 500 đồng/kg so với cuối tháng 12 năm 2014, phổ biến ở mức 24.000 – 25.000 đồng/kg tùy theo địa phương, doanh nghiệp và thời điểm Sau khi trừ chi phí sản xuất, người nuôi có thể thu lãi từ 2.000 – 2.500 đồng/kg, tương đương lợi nhuận 600 – 900 triệu đồng/ha Với mức giá này, khả năng diện tích nuôi cá tra thâm canh sẽ gia tăng trong thời gian tới

1.2.2 Tình hình chất lượng con giống cá Tra ở đồng bằng sông Cửu Long

Chất lượng cá tra giống là một trong những yếu tố quan trọng để nâng cao hiệu quả nghề nuôi cá tra thâm canh, từ đó góp phần phát triển bền vững nghề nuôi

và chế biến cá tra xuất khẩu Tuy nhiên, hiện nay cá tra giống vẫn chưa đạt yêu cầu

về chất lượng mặc dù ngành chức năng các cấp đã có nhiều nỗ lực

Việc sản xuất và cung ứng giống cá tra tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long phần lớn do người dân tự phát, tự cân đối nên phát triển chưa đồng bộ giữa số lượng cũng như chất lượng Chất lượng con giống có chiều hướng suy giảm trong những năm gần đây với những biểu hiện như tỷ lệ dị hình cao, chậm lớn, dễ nhiễm bệnh và

tỷ lệ sống thấp

Năm 2014, cả nước có 230 cơ sở sản xuất giống cá tra, trên 4.000 hộ ương dưỡng cá giống trên diện tích 2.250 ha, sản xuất được hơn 2 tỷ con cá tra giống Sản lượng cá tra giống tập trung nhiều nhất ở Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Tiền Giang Tuy nhiên, tỷ lệ sống trong ương dưỡng khá thấp, tỷ lệ ương từ cá bột lên cá hương chỉ đạt 20 – 24 % và từ cá hương lên cá giống trung bình chỉ 21 % (http://www http://thuysanvietnam.com.vn)

1.2.3 Một số chương trình nghiên cứu liên quan đến cá tra

Chương trình nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá tra được bắt đầu từ năm 1978 với sự tham gia của nhiều Viện và trường Đại học trong khu vực (Đại học Nông Lâm, Viện NCNTTS II, Đại học Cần Thơ, tổ chức CIRAD (Pháp))

Thông qua sự tài trợ của SUFA_Bộ Thuỷ sản trong 5 năm (2001 – 2005), Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã thực hiện chương trình chọn giống về tính trạng tăng trưởng bằng phương pháp chọn lọc cá thể (2001 – 2004) Ba quần đàn gốc cho chọn giống năm 2001, 2002 (chọn theo tăng trưởng) và 2003 (chọn theo tỷ lệ philê) đã được hình thành Hiệu quả của chọn lọc thực tế đã được tính toán trong năm 2006 – 2008

Các nghiên cứu thăm dò về sinh học phân tử nhằm đánh giá biến dị di truyền của cá tra cũng đã được tiến hành Kỹ thuật microsatellite với 10 primer đặc hiệu cho cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long được phát triển bởi BIOTEC_Thái Lan để đánh giá biến dị cá đã được thực hiện trong năm 2004 Các primer đều cho kết quả

đa hình, đặc biệt primer 10 cho kết quả đa hình rất cao Kết quả này mở ra triển vọng sử dụng những primer để đánh giá biến dị di truyền và tìm ra chỉ thị liên kết với tính trạng có ý nghĩa về mặt kinh tế trên cá tra bằng kỹ thuật microsatellite

Đề tài ‘‘Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cá tra thương phẩm đạt tiêu chuẩn thịt trắng phục vụ xuất khẩu (2001 – 2003)”

Dự án sản xuất thử “Nuôi cá tra thâm canh đạt tiêu chuẩn xuất khẩu và giảm ô nhiễm môi trường” được thực hiện bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II năm 2006 – 2007

Dự án ‘‘Thử nghiệm mô hình nuôi cá tra thương phẩm phục vụ xuất khẩu và hạn chế ô nhiễm môi trường, 2007 – 2008’’

Dự án “Xây dựng qui phạm thực hành nuôi cá tra tốt hơn (BMP) ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam” đã bắt đầu thực hiện từ năm 2007

1.3 Ứng dụng di truyền phân tử vào trong chọn giống

Di truyền phân tử là một lĩnh vực được quan tâm và được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu

Các kỹ thuật di truyền phân tử được sử dụng gồm các kỹ thuật về DNA, các

kỹ thuật về tách dòng gene, về biểu hiện gene, về RNA và chủ yếu là RNA thông tin, về enzyme …

Các kỹ thuật về DNA hiện được sử dụng phổ biến là đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RestrictionFragment Lenth Polymorphism – RFLP) và các kỹ thuật dựa vào chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) như: đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphim DNA – RADP), đa hình

độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Frangment Length Polymorphism – AFLP), Microsatellite

1.3.1 Phân loại

Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể xem như một DNA marker Những marker có tính chất như vậy rất cần thiết vì số lượng của chúng lớn hơn rất nhiều so với các marker hình thái, marker ở dạng protein (isoenzyme) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005)

Dựa vào kỹ thuật thực hiện các DNA marker có thể chia làm hai nhóm (Phạm Thành Hổ, 2005):

 Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP

 Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD

Dựa trên kiểu hình có thể chia DNA marker thành hai nhóm (Phạm Thành Hổ, 2005):

 Marker đồng trội: Những marker có thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử

và cá thể dị hợp tử Bao gồm marker allozyme, Microsatellite, RFLP

 Marker trội: Những marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử

và dị hợp tử Bao gồm RAPD, AFLP

Bảng 1.1 Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005)

Chỉ thị (marker) Tên đây đủ

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

AP-PCR Arbitrary Primer-PCR

DAF DNA Amplification Fingerprinting

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

ALP Amplicon Length Polymorphism

SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite)

SSCP Single Strand Conformation Polymorphism

RFLP RestrictionFragment Length Polymorphism

SNP Single Nucleotide Polymorphism

STS Sequence-Taqged Sites

1.3.2 RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP)

Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme – RE) khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác (Wayne Powell

và ctv,1996)

Ngày nay, RFLP là kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền được sử dụng phổ biến nhất Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt

giới hạn (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gene DNA bộ gene sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau (Wayne Powell và ctv,1996)

RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp Do kích thước khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo

ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (do phải sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các Restriction enzyme, điện di

và phân tích trên gel nhuộm Ethidium bromide hoặc bạc PCR – RFLP bỏ qua bước lai phóng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP

1.3.3 Amplifíed Fragment Length Polymorphism (AFLP)

AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt ( Povvell và ctv, 1996; Winfield và ctv, 1998)

Thông thường, trong AFLP sử dụng một cặp Restriction enzyme gồm một enzyme cắt thường xuyên và một enzyme cắt không thường xuyên Enzyme cắt thường xuyên tạo ra những trình tự nhỏ và enzyme cắt không thường xuyên sẽ hạn chế số lượng các đoạn cắt Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI – Msel Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần

trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích (Matthes và ctv, 1998; Karp và ctv, 1997)

AFLP nhanh, không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gene Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu Tuy nhiên, thông tin di truyền phải được biết rõ để chuẩn bị primer tương ứng, và AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp

1.3.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplifíed Polymorphism DNA)

Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb Các đoạn với kích thước khác nhau được nhận biết bằng điện di Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình có thể được dùng như những marker để xác định sự

đa dạng di truyền RAPD được xem như một phương pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã được thương mại hóa trên thị trường và các primer cũng rất dễ được tổng hợp Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao (Harris, 1999)

1.3.5 Microsatellite (SSR)

Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene Eukaryote là những vùng có tính biến dị cao Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable

lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA như: (AC)n, (AG)n, (AT)n, (TAT)n, (TCT)n, (CAG)n Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phương pháp này là rất cao

Dựa trên trình tự DNA, microsatellite được bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gene, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite Kích thước các đoạn DNA được khuếch đại thường từ 100 – 200 bp Kết quả tạo ra các đoạn DNA

có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide

1.4 Chỉ thị Microsatellite trong nghiên cứu đa dạng di truyền

1.4.1 Khái niệm về Microsatellite

Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên trên hầu hết genome thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005), là một đoạn DNA được mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lượng bản copy biến thiên (từ một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn (gọi là đơn vị lặp lại) Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình Ở bất kì một

vị trí nào (locus), thường xuyên có khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles

có thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại Những alleles này có thể phát hiện bởi PCR , sử dụng primers được thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của microsatellite Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, alleles được ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại, …

Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng được phát hiện bằng PCR và chúng có khuynh hướng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của genome Hàng ngàn SSR đã được lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau

Tóm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu

tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (short tandem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats) (Edward, 1991) Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 – 6 bp và kích thước tại mỗi locus

là 20 – 100 bp Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gene lớn và phân bố đều trên genome

Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-alleles hay alleles đồng trội (bao gồm 2 loại: alleles đồng hợp và alleles dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker Tần số đột biến từ 104

– 5x106, tuân theo định luật Mendel Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR

từ một lượng DNA rất nhỏ Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng

1.4.2 Tính chất

Những markers này thường hiện diện với mức độ cao của hiện tượng đa hình, đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10 Trình tự được lặp lại thường đơn giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tương ứng với việc lặp lại di-, tri-, và tetranucleotide), và có thể được lặp lại từ 10 đến 100 lần Sự lặp lại của nucleotide

CA xảy ra rất thường xuyên trong bộ gene người và các loài khác, và được hiện diện trong khoảng vài ngàn bases pair Như vậy có sự xuất hiện thường xuyên của nhiều alleles tại vị trí microsatellite, kiểu gene trong phả hệ thường cung cấp đầy đủ thông tin về di truyền, trong đó alleles đặc thù của tổ tiên có thể được nhận biết dễ dàng Bằng cách này, microsatellite là marker lý tưởng để xác định nguồn gốc, nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp Nó còn là marker phân tử dùng

để cung cấp đầu mối về những alleles có mối quan hệ gần nhau hơn

Microsatellite thường thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của DNA Tỉ lệ đột biến cao này có thể được giải thích bởi sự bắt cặp sai trong bộ phận trượt (slipped strand mispairing – sự giữ không đúng mục tiêu) trong suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép Sự đột biến cũng xảy ra suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân Một vài lỗi sai mục tiêu được sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhưng một vài đột biến có thể không được sửa chữa Kích thước của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng như là tính thường xuyên của sự dịch mã trong khu vực của DNA lặp lại Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến,

có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình Tuy nhiên, cơ chế tương tự này thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu

sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác của microsatellites có thể được khuếch đại

1.4.3 Sự phát triển của primer Microsatellite

Primer của microsatellite được phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm Những đoạn này được chèn vào plasmid hoặc phage vector, và được chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli Khuẩn lạc sau

đó phát triển và được chụp lên phim với những trình tự nucleotide được đánh dấu huỳnh quang được lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên đoạn DNA Nếu dòng dương tính có thể thu được từ quy trình này, đoạn DNA được đọc trình tự và primers PCR sẽ được chọn từ vùng trình tự liên kết như vùng để xác định vị trí đặc trưng Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi trình tự lặp lại của microsatellites phải được dự đoán trước và primers được thu nhận ngẫu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa Vị trí microsatellite được trải xuyên suốt genome và có thể được thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch đại thông qua PCR

Primer microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alleles) đối với từng cá thể trong loài Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking – vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer – được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể

1.4.4 Giới hạn của Microsatellite

Microsatellite là marker phân tử hữu hiệu và đặc biệt trong nghiên cứu quần thể Thế nhưng chúng không phải không có hạn chế Microsatellite được phát triển cho những chủng đặc trưng, có thể được ứng dụng thường xuyên với những chủng

có mối quan hệ họ hàng gần nhau Tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền được khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền

Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẫn đến sự cố alleles không giá trị(null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên kết có thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo dài bắt đầu Sự khuếch đại ưu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử được ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ phận không có giá trị) (Hayden và Sharp, 2001) Sự thất bại của phản ứng PCR có thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù được khuếch đại

Tuy nhiên, ảnh hưởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết giới tính cũng cần được xem xét để không đưa ra giá trị sai của alleles không giá trị

do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể Sự khác nhau trong kích thước alleles cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự Đột biến có thể có từ sự thêm vào hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều dài Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá Vùng trung tính của một số vùng microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lượng hoặc sự cố trong vùng exon của gene dưới sự chọn lọc

Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhưng số vị trí khuếch đại thành công trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các loài nghi vấn Đột biến trong alleles microsatellite có thể bị ảnh hưởng xấu trong trường hợp có một đoạn alleles lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể được dịch sai trong quá trình phiên mã DNA Một alleles nhỏ hơn tham gia vào việc làm tăng kích thước, trong khi một alleles lớn hơn tham gia để làm giảm kích thước, khi

mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thước; sự ép buộc này

đã được xác định nhưng giá trị khẳng định là chưa chuyên biệt Nếu có một sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa alleles của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân

Trong tế bào khối u – nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thường xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền

1.4.5 Các loại Microsatellite

Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2 – 6 lần) có :

Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT) 6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG) 4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC) 4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv, 1996)

1.4.6 Cơ chế hình thành microsatellite

Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện

và hình thành microsatellite là do 2 quá trình sau:

 Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing - over during meiosis) Quá trình này được mô tả trong hình 1.6

Hình 1.6 Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân

 Quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage)

Hình 1.7 Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã

Hình 1.7 mô tả quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage) Đây được coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand) Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp mà phân tử enzyme polymerase không nhận biết được Sự trượt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc

là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn

1.4.7 Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite

Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế mồi microsatellite đặc trưng cho một locus trong bộ gene Vì vậy một cặp mồi microsatellite có thể áp dụng cho mọi cá thể trong loài, và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước khác nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite

Hình 1.8 Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số

Hình 1.8 hai mồi của PCR (2 mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo toàn nằm 2 bên trình tự microsatellite Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm PCR sẽ có chiều dài là 100 bp Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm PCR là 116 bp)

Hình 1.9.Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite

Mồi microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alleles) đối với từng cá thể trong loài Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking (vùng sườn – vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế mồi) được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài Vùng sườn rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể

Sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di trên gel Thông thường sản phẩm PCR có 2 vạch, 1 vạch chính và 1 vạch phụ nhỏ hơn vạch chính 2 bp (Murray

và ctv, 1993) Sự xuất hiện của vạch phụ là do quá trình trượt lỗi của DNA

polymerase (Tautz, 1989), vạch phụ có thể gây trở ngại cho việc xác định kích thước chính xác của vạch chính, nhưng vạch phụ cũng có thể được xem như một dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại đúng là microsatellite Bằng cách này thì chúng ta cũng xác định được kích thước của sản phẩm PCR đồng thời đếm được

số lần lặp lại của các nucleotide trên mỗi alleles

1.4.8 Ưu và nhược điểm cùa microsatellite

1.4.8.1 Ưu điểm

 Microsatellite có số đơn vị trình tự lõi từ 1 – 6bp, số lần lặp lại của microsatellite khoảng 70 lần Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng kỹ thuật này là rất cao

 Microsatellite có khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra nên kỹ thuật này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gene và phân tích mối quan hệ huyết thống

 Microsatellite là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định Tính đồng trội của microsatllite gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể so với những marker khác như: AFLP và RAPD Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gene trở nên dễ dàng hơn

1.4.8.2 Nhược điểm

 Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bước đầu tiên rất quan trọng trong kỹ thuậtnnày Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhược điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình

 Không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau

1.4.9 Vai trò của microsatellite

Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở phần phía trên các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số có quan hệ với vùng mã hoá Chức năng rõ

rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa biết rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy

chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền

Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gene Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gene và chức năng của gene

Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gene

Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này được giải phóng thì gene được khởi động và sao mã Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao

mã thông qua ảnh hưởng đến protein bám Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó Như một trình tự mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gene, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể

Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gene Những tính chất đặc biệt của microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite

có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv, 1997) Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gene đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King

và ctv, 1997) Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa

Trong chuẩn đoán bệnh: vì DNA microsatellite thay đổi về chiều dài trong sự phát triển của một số bệnh ung thư Nên chúng là những marker rất hữu ích trong việc dò tìm, phát hiện ung thư sớm Tính đa hình của microsatellite hữu ích trong nghiên cứu các liên kết để định vị những gene chiụ trách nhiệm về nhiều sự mất trật

tự di truyền học

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Địa điểm nghiên cứu: đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Ngiệm Di Truyền Phân Tử, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II (116 Nguyễn Đình Chiểu, Phường Đakao, Quận 1, TP Hồ Chí Minh)

 Thời gian nghiên cứu: đề tài được thực hiện từ tháng 04/2015 đến tháng 07/2015

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Nguồn mẫu

Mẫu vây đuôi cá Tra sử dụng trong nghiên được cung cấp bởi Trung tâm quốc gia giống thủy sản nước ngọt Nam Bộ tại xã An Thái Trung, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang

2.2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.2.1 Mồi

Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê dưới bảng sau:

Bảng 2.1 Thông tin 16 cặp mồi microsatellite dùng trong nghiên cứu

Loci Sequencing 5’-3’ Size range Ta (0 C)

Hình 2.1 Thang chuẩn 100 bp

2.2.2.3 Các hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA

 Dung dịch tách chiết 1 (Solution 1): 50 mM Tris – HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 2 % SDS

 Dung dịch tách chiết 2 (Solution 2): dung dịch NaCl bão hòa 6 M