Nghiên cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú

Mục đích nghiên cứu Xác định các thành phần trong quy trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic với chủng L... Tuy nhiên, các phương pháp trên vẫn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHỬ KHOÁNG TRONG THU NHẬN

CHITIN BẰNG LÊN MEN LACTIC

TỪ VỎ ĐẦU TÔM SÚ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Ngọc Thu MSSV: 0851110242 Lớp: 08DSH2

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Với hiện trạng các nhà máy sản xuất thuỷ sản, đặc biệt là tôm lột vỏ, đã thải ra môi trường hàng tấn vỏ tôm như là nguồn chất thải đã gây ô nhiễm môi trường trầm trọng Hơn thế nữa, vỏ tôm là một nguồn tài nguyên quý nếu ta biết cách sử dụng Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tái sủ dụng vỏ tôm như làm thức ăn gia súc, gia cầm và đặc biệt là thu nhận các hợp chất quý trong vỏ tôm như chitin, carotenoid Các hợp chất này có rất nhiều ứng dụng trong cuộc sống Vì vậy, em nhận thấy vấn đề thu nhận chitin từ vỏ tôm là việc vô cùng quan trọng hiện nay Nó vừa giúp cải thiện môi trường mà còn đem lại một nguồn lợi vô cùng lớn cho con người

Tuy nhiên, các quy trình sản xuất chitin trước đây thường dùng công nghệ hoá học, vì vậy nó không những không góp phần bảo vệ môi trường mà còn gây hại thêm bởi một lượng lớn các chất hoá học với nồng độ cao thải ra ngoài môi trường trong quá trình chế biến

Trước thực tiễn trên, em nhận thấy cần phải nghiên cứu thêm về các quy trình thu nhận chitin bằng phương pháp sinh học để tránh các thiệt hại cho môi trường

đồng thời thu về nguồn lợi quý từ chitin Do đó, em đã thực hiện đề tài “Nghiên

cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú”

2 Tình hình nghiên cứu

Có rất nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này trên thế giới, đặc biệt là ở Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp… đều tìm được điểm chung là phương pháp lên men lactic vỏ tôm sẽ thu được nguồn chitin dễ dàng tinh sạch và hiệu suất cao hơn

3 Mục đích nghiên cứu

Xác định các thành phần trong quy trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng

phương pháp lên men lactic với chủng L acidophilus Acid lactic sinh ra trong quá

trình lên men sẽ loại các ion khoáng trong nguyên liệu vỏ tôm như: Ca2+, Mg2+, đồng thời các vi khuẩn lactic sẽ phân huỷ một phần protein trong vỏ tôm

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Tìm ra tỉ lệ nước và đường D – glucose thích hợp cho quá trình lên men

So sánh phương pháp xử lý vỏ tôm bằng hoá học và bằng sinh học

5 Phương pháp nghiên cứu

a Phương pháp luận

Trước khi thực hiện đề tài này, em đã được biết qua rất nhiều các ứng dụng của chitin – chitosan được ứng dụng trong cuộc sống và đã tham khảo nhiều quy trình thu nhận chitin của các tác giả trong và ngoài nước Em nhận thấy quy trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic vừa an toàn đối với môi trường vửa dễ dàng áp dụng vào cuộc sống Vì vậy em đã chọn vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus, một chủng vi khuẩn sản sinh nhiều vi khuẩn lactic vừa

thân thiện với con người để lên men vỏ tôm thu nhận chitin

b Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị

Sử dụng phần mềm Statghraphics để xử lý số liệu

6 Các kết quả đạt được của đề tài

Xác định tỉ lệ nước:vỏ tôm và tỉ lệ đường:vỏ tôm thích hợp cho quy trình lên men, từ đó hoàn thiện đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất

chitin với Lactobacillus acidophilus

7 Kết cấu của ĐATN

Đồ án gồm có 4 chương:

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và biện luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Lactobacillus

1.1.1 Giới thiệu về Lactobacillus acidophilus

Loài: Lactobacillus acidophilus

Vi khuẩn này được mô tả lần đầu tiên do công của một bác sĩ là Bruno Oppler

và một nhà nghiên cứu dạ dày ruột là Ismar Isidor Boas Tên gọi Lactobacillus

acidophilus bắt nguồn từ lacto có nghĩa là sữa, bacillus chỉ hình dáng giống cây gậy

và acidophilus nghĩa là một “acid đằm thắm” (acid loving)

L acidophilus là vi khuẩn Gram (+), hình que, không sinh bào tử Nó có khả

năng lên men cả hiếu khí lẫn kỵ khí Trong trường hợp lên men đồng hình, glucose được sử dụng để tạo acid lactic, hoặc tạo thành nhiều sản phẩm khác nhau như acid acetic, ethanol, CO2…trong trường hợp lên men dị hình

1.1.1.2 Hình thái

L acidophilus là trực khuẩn, có kích thước rộng 0,6 - 0,9 µm, dài 1,5 – 6 µm,

lên men đồng hình, nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 - 42 oC Trong tự nhiên, chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi tạo thành chuỗi ngắn có khả năng chuyển động

Lên men cellobiose, galactose, lactose, maltose và sucrose Không lên men được mannitol, melezitose, rhamnose, sorbitol, và xylose

c

Hình 1.1 Hình thái L acidophilus

a Hình thái khuẩn lạc L acidophilus nằm nghiêng

b Hình thái khuẩn lạc L acidophilus

c Hình thái tế bào L acidophilus khi nhuộm Gram

1.1.1.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa

L acidophilus có thể phát triển ở nhiệt độ cao như 45 oC nhưng tối ưu là 35 –

40 oC Tính chịu acid của nó từ 0,3 - 1,9 % chuẩn độ acid, với pH tối ưu từ 5,5 - 6 Chúng có những yêu cầu phát triển phức tạp như: áp lực oxygen thấp, có thể lên men carbohydrate, protein và các phần tử bị phá vỡ từ các chất này, một số vitamin và khoáng như B-complex, acid nucleic, Mg, Mn, Fe cần cho sự phát triển

L acidophilus phát triển ở pH thấp < 3,5 và lên men trong điều kiện yếm khí

L acidophilus sử dụng đường như một cơ chất cho sự lên men và sống được ở môi

trường phong phú đường Mỗi phân tử glucose trải qua sự lên men trong L

acidophilus tạo ra năng lượng là 2 ATPs Ngoài glucose, L acidophilus còn sử

dụng aesculin, cellobiose, galactose, lactose, maltose, salicin, sucrose và trehalose cho sự lên men

1.1.1.4 Đặc điểm sinh thái

L acidophilus được biết như một loài có vai trò probiotic Sự bám dính và khả

năng liên kết với nhau tạo thành một tập đoàn của vi khuẩn lactic là cơ chế hữu hiệu để hạn chế vi khuẩn có hại Khi vi khuẩn lactic vào trong cơ thể, định cư ở đường ruột, chúng cạnh tranh vị trí gắn kết trên thành ruột với vi sinh vật có hại, làm hạn

chế số lượng tế bào vi sinh vật có hại trong đường ruột L acidophilus có khả năng

sinh tổng hợp một số chất có khả năng kháng khuẩn như acid lactic, hydrogen peroxide, diacetyl và bacteriocin làm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có hại

Ngoài ra, L acidophilus còn có vai trò như một chất bổ trợ cho những người không

chịu được lactose Chúng tập hợp ở đường tiêu hóa, góp phần chuyển hóa và phân giải lactose trong quá trình tiêu hóa thức ăn ở dạ dày và ruột

1.1.1.5 Cơ chế kháng khuẩn của L acidophilus

Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng vi khuẩn sinh acid lactic có khả năng ức

chế sự phát triển của vi sinh vật truyền nhiễm ở gia cầm Chateau et al (1993) phân

lập được 103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp) thương mại và kiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella Khoảng 47 %

Lactobacillus của sản phẩm A và 70 % của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6

serotype E coli

Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L acidophilus,

L casei vàL faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella Jin

et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus có thể ức chế sự phát triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E coli

Các sản phẩm vi sinh từ Lactobacillus có Bacteriocin, acid hữu cơ và

hydroperoxyd Bacteriocin là hỗn hợp của các sản phẩm vi sinh vật có các thành

phần protein sinh học chủ động và hoạt động vi sinh (Tag et al, 1976) Các chủng

Lactobacillus có ở đường ruột của người và một số động vật thí nghiệm khác cũng

sản xuất các chất giống Bacteriocin được gọi là Lactocidin (Vincent et al., 1995) Chất này họat động ở pH 5 - 7,8 và không mẫn cảm với các hoạt động xúc tác

Lactocidin thô có các hoạt động ức chế nhiều loại vi khuẩn bao gồm Proteus spp,

Salmonelle spp, E.coli và Staphylococcus spp vì Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất

rộng

Cơ chế hoạt động cơ bản của bacteriocin chủ yếu tạo nên những lỗ trên màng tế bào chất và enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá trình trao đổi chất của vi

khuẩn khác

Hoạt tính kháng vi sinh vật nhờ cơ chế biểu diễn trên hình 1.2 (Cotter et al.,

2005) Trong đó Bacteriocin class I (đại diện: Nisin của Lactococcus lactics) gắn

vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptidglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, do đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặc do bám được vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; Bacteriocin class II

(đại diện: Sakacin của Lactobacillus sakei) là các peptid lưỡng tính có khả năng

xuyên màng tế bào tạo kênh trên lỗ trên màng Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như lysostaphin) – protein bền nhiệt, tác động trực tiếp lên vách tế bào đích

Hình 1.2 Cơ chế kháng vi sinh vật nhờ khả năng sinh bacteriocin

Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic có liên quan chặt chẽ với sản phẩm cuối của quá trình trao đổi chất Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi

do Lactobacillus có khả năng có hoạt động đối kháng (trong phòng thí nghiệm)

Các sản phẩm phụ được biết tới nhiều nhất là các acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic (Trammer, 1966; Sorrel và speck, 1970) và hydro peroxid (Wheater et

al, 1952; Dahiafa và Speck, 1968; Price và Lee, 1970) Các acid acetic, lactic ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh Gram âm (Sorrel và Speck, 1970; Herrick, 1972; Adams và Hall, 1988) phát hiện ra các hoạt động của các acid này phụ thuộc vào độ pH Nếu độ pH thấp sẽ tăng mức độ acid ở dạng không hòa tan

Khả năng đối kháng các vi sinh vật gây bệnh ở chủng L acidophilus rất quan

trọng trong đề tài này Vì phải lên men trong môi trường vỏ tôm chứa nhiều dinh

dưỡng, nếu L acidophilus có khả năng đối kháng cao sẽ ức chế các VSV cây mùi

hôi thối trong quá trình lên men, đồng thời ngăn các VSV có thể gây hại cho sức khoẻ con người

1.2 Tổng quan về tôm sú và nghề nuôi tôm sú tại Việt Nam

1.2.1 Vị trí phân loại

Tôm sú được định loại là:

Ngành: Arthropoda

Lớp: Crustacea

Bộ: Decapoda

Họ chung: Penaeidea

Họ: Penaeus Fabricius

Giống: Penaeus

Loài: monodon

Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius

1.2.2 Vùng phân bố của tôm sú trên thế giới

Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Án Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan, phía đông Tahiti, phía nam châu Úc và phía tây châu Phi (Racek, 1955; Holthuis và Rosa, 1965; Motoh, 1981, 1985)

Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 30 oE đến 155 oE, từ vĩ độ 35 oN đến

35 oN xung quanh các nước vùng xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaysia, Philippines và Việt Nam

Tôm bột, tôm giống và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và vùng ngập mặn ven bờ Khi tôm trưởng thành, chúng di chuyển xa bờ vì thích sống ở vùng nước sâu hơn

1.2.3 Các vùng nuôi tôm chủ yếu tại Việt Nam

Theo Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn), năm 2011, cả nước thả nuôi được 656.425 ha tôm nước lợ, với sản lượng đạt 495.657 tấn, tăng 2,71 % về diện tích và 5,48 % về sản lượng so với năm 2010 Trong đó, diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha, đạt sản lượng 319.206 tấn, bằng 95,81 % năm 2010 Riêng khu vực đồng bằng sông Cửu Long, tổng diện tích thả nuôi tôm là 602.416 ha (bao gồm 588.419 ha nuôi tôm sú và 18.498 ha nuôi tôm thẻ chân trắng), chiếm 91,8 % diện tích nuôi tôm của cả nước

Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam cho biết, tổng giá trị xuất khẩu tôm của Việt Nam trong năm 2011 đạt 2.396 tỷ USD, tăng 13,7 % so với năm

2010 và đã vượt qua mốc 2 tỷ USD Trong đó, xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷ USD, chiếm gần 60 % tổng giá trị, xuất khẩu tôm chân trắng đạt 704 triệu USD, chiếm 29,3 % tỷ trọng, 12 % còn lại là tôm các loại khác

Về thị trường xuất khẩu, tôm Việt Nam đã thâm nhập sâu hơn và các thị trường khác ngoài 3 thị trường trọng điểm truyền thống là Mỹ, Nhật Bản và châu

Âu Năm 2010, giá trị xuất khẩu tôm sang 3 thị trường này chiếm hơn 71 % tổng sản lượng xuất khẩu tôm cả nước Sang năm 2011, tỷ trọng này còn 66 %

Trong khi đó, xuất khẩu sang một số thị trường khác như Hàn Quốc, các nước Đông Nam Á… và đặc biệt là sang Nga tăng mạnh, xuất khẩu tôm sang Nga tăng

124 % so với năm 2010 Xuất khẩu tôm sang Hàn Quốc tăng 23 %, sang các nước Đông Nam Á tăng 54,7 %

Năm 2011, tôm sú vẫn giữ vị trí chủ đạo trong cơ cấu xuất khẩu tôm Việt Nam Tuy nhiên, tỷ trọng về khối lượng và giá trị đang giảm dần, đặc biệt là các mặt hàng tôm sú sống, tươi hoặc đông lạnh

1.2.4 Các sản phẩm chủ yếu được sản xuất từ tôm sú

Tôm tươi được chế biến lạnh đông dưới nhiều dạng như sau:

 Tôm nguyên con còn đầu và còn vỏ

 Tôm bỏ đầu: tôm bỏ đầu và còn vỏ

 Tôm bỏ đuôi: tôm bỏ đầu, bỏ ruột và bóc một phần vỏ

 Tôm xẻ lưng, bóc vỏ đến đốt áp chót

 Tôm cánh bướm, bóc vỏ đến đốt áp chót, cắt dọc theo chiều dài sống lưng, xẻ banh ra

 Tôm có 4 đốt đầu được bóc vỏ và cắt theo chiều dài

 Tôm bóc noãn: tôm bỏ đầu, bỏ vỏ và bỏ ruột

 Tôm bóc noãn

 Tôm bóc noãn, xẻ lưng

 Tôm bóc noãn không nguyên vẹn

 Tôm bóc noãn và cắt cánh bướm: tôm boc noãn được cắt dọc theo chiều dài đến đốt cuối cùng

 Tôm bóc noãn có 4 đốt đầu tiên được cắt theo chiều dài

1.2.5 Các phương pháp xử lý vỏ tôm thải hiện nay

Trong các quy trình sản xuất tôm lột vỏ, một lượng lớn vỏ tôm bị thải ra ngoài, gây ô nhiễm môi trường, đồng thời trong vỏ tôm thải vẫn còn rất nhiều hợp chất có thể thu nhận lại Các protein, khoáng chất, vi lượng… trong vỏ tôm thải có thể chế biến thành thức ăn gia súc, gia cầm Ngoài ra, các hợp chất quý như carotenoid, chitin… thu nhận từ vỏ tôm có rất nhiều ứng dụng trong y học, công nghiệp và nông nghiệp

Đầu vỏ tôm, phụ phẩm trong ngành chế biến thuỷ hải sản, đã được nhiều tác giả nghiên cứu và sử dụng làm thức ăn gia súc, có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng của đầu và vỏ tôm

Theo Vũ Duy Giảng (1995), bột đầu tôm được chế biến từ đầu, càng, vỏ tôm là nguồn protein động vật rất tốt cho gia súc, gia cầm Giá trị dinh dưỡng của bột đầu tôm thấp hơn bột cá và bột máu Bột đầu tôm có 33 – 34 % protein, trong đó có

4 – 5 % lysin và 2,7 % methionin

Theo Dương Xuân Tuyển, đầu vỏ tôm tươi đem hấp cách thuỷ có chứa chất khô là 26,40 % và protein thô khoảng 11,38 %, trong khi protein thô trong vỏ đầu tôm muối chua là 11,20 %

Chất xơ trong đầu vỏ tôm khá cao và biến động tuỳ theo thành phần đầu vỏ tôm, hàm lượng thay đổi từ 3,3 – 6,0 % Canxi, phospho là thành phần khá quan trọng trong đầu vỏ tôm Đầu vỏ tôm tươi đem hấp chứa 3,68 % canxi và 0,22 % phospho, tro và đầu vỏ tôm ủ chua có hàm lượng canxi 2,15 % và phospho 0,44 % Bột đầu vỏ tôm sấy khô chứa 5,2 % canxi và 0,9 % phospho (Dương Xuân Tuyển, 1992)

Đầu vỏ tôm tươi ít được sử dụng nuôi heo nhưng được sử dụng khá phổ biến như nguồn thức ăn bổ sung đạm trong chăn nuôi vịt đẻ Vỏ đầu tôm tươi đem hấp được Dương Xuân Tuyển (1992) sử dụng đến 46 % và lúa là nguồn thức ăn năng lượng chính nuôi vịt đẻ CV super M tại trại Vigova, cho năng suất trứng 160

quả/năm so với tiêu chuẩn của Anh về năng suất trứng đối với giống vịt bố mẹ 170 quả/năm

Một vài tác giả cũng đã sử dụng vỏ đầu tôm ủ chua nuôi heo thịt Lê Văn Liễn, Nguyễn Thiện (1995), dùng 5 % đầu vỏ tôm ủ chua thay thế bột cá trong khẩu phần thức ăn nuôi heo thịt cho kết quả tăng trọng và tiêu tốn thức ăn tương đương khẩu phần có 10 % bột cá (Theo Nguyễn Thị Thu Vân – 1997)

Tuy nhiên, các phương pháp trên vẫn chưa tận dụng hết các hợp chất trong vỏ tôm như chitin hay carotenoid Những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu trên toàn thế giới về việc thu nhận chitin trong vỏ tôm nhằm tránh lãng phí nguồn tài nguyên này

1.3 Tổng quan về chitin – chitosan

1.3.1 Cấu trúc chitin - chitosan

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó Năm 1823, Odier phân lập một chất từ bọ cách cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống như cellulose

Chitin là polysaccharide phổ biến thứ 2 trên đất sau cellulose, được tìm thấy trong xương người cũng như trong các bộ phận của động vật không xương sống

Nó là sự kết hợp giữa liên kết β (1→4) với 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D – glucose (N – acetylglucosamine)

Chitin thường được coi là dẫn xuất cellulose và có chứa 6,9 % là N (Black và Schwartz, 1950) Nó có cấu trúc giống hệt cellulose vì có gốc acetamide (-NH-CO-

CH3) ở vị trí C2 Một dẫn xuất khác của chitin, chitosan là 1 polymer tuyến tính

α (1 → 4) 2 – annino – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose

Hình 1.3 Công thứ cấu tạo của chitin

1.3.2 Tính chất hoá học của chitin - chitosan

Chitin là 1 polysaccharide chứa nitơ, trắng, cứng, không đàn hồi, không tan trong nước và acid yếu, chỉ tan trong một số dung môi, bền trong môi trường kiềm nhưng kém bền trong môi trường acid

Chitin ở thể rắn có độ kết tinh cao do gốc –NHCOCH3 ở vị trí cacbon thứ hai, làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch với nhau

Chitin ổn định với các chất oxy hoá khử như KMnO4, H2O2, NaClO hay Ca(ClO)2, có thể lợi dụng tính chất này để khử màu chitin

Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bị khử bởi gốc acetyl tạo thành chitosan

Hình 1.3 Cấu tạo của chitin (a) và chitosan (b)

Phản ứng của chitosan linh hoạt hơn so với cellulose nhờ nhóm -NH2, có thể liên kết với chất béo

Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng với iod và acid sulfuric thành phản ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích định tính chitosan

Tính chất chung của chitin và chitosan:

 chuỗi polymer bền,

 các nhóm amin phản ứng,

 có nhóm hydroxyl phản ứng tồn tại, và

 giữ nhiều ion thu kim loại chuyển đổi

Thuộc tính sinh học của chitosan:

a Thích ứng sinh học:

 chuỗi polymer tự nhiên,

 có thể phân hủy sinh học,

 an toàn và không độc

b Có phản ứng liên kết

c Tái tạo các phản ứng keo liên kết

d Tăng hệ hình thành chất osteoblast chịu trách nhiệm cho xương hình thành

e Cầm máu

f Diệt nấm, vi khuẩn, virus

g Diệt tinh trùng

h Ngừa sưng tấy

i Chống các tác nhân gây dị ứng

j Ngừa chotesterol, ngừa tăng huyết áp

k Tăng khả năng tái tạo xương

l Ức chế sự đau đến hệ thần kinh trương ương

m Bổ trợ miễn dịch

1.3.3 Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay

1.3.3.1 Các quy trình sản xuất cổ điển

Có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về sản xuất chitin – chitosan bằng phương pháp hoá học, nhưng nhìn chung phải thực hiện qua các bước sau:

Khử protein → Khử khoáng → Khử màu → Loại gốc acetyl

Ví dụ về một số quy trình sản xuất chitin – chitosan tiêu biểu:

 Quy trình sản xuất chitin từ tôm sông nước ngọt của Mayer và Lee, đại học Louisiana, Hoa Kỳ (1989)

 Quy trình sản xuất của Robert, đại học Nottingham Trent, Vương quốc Anh (1998)

 Quy trình sản xuất của PGS.TS Trần Thị Luyến, đại học Nha Trang

 Ngoài ra còn nhiều nghiên cứu khác đến từ các nước như Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp, Thái Lan…

Ví dụ: Quy trình sản xuất của Robert, đại học Nottingham Trent, Vương quốc

Anh (1998)

Nhận xét:

Đây là quy trình tổng hợp từ cá quy trình sản xuất trước đó Sản phẩm chitosan được sản xuất theo quy trình này có màu sắc đẹp, các chất màu được loại bỏ sạch trong quá trình tẩy màu Hàm lượng protid và khoáng chất còn lại trong chitin thấp

Khử màu

Rửa trung tính

Tẩy bằng NaOCl hoặc H2O2

Chitin Rửa trung tính

Khử gốc acetyl

Rửa trung tính

Nấu trong NaOH

Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình này là sử dụng quá nhiều hoá chất nồng độ cao với số lượng lớn, dẫn đến tăng giá thành sản xuất, đồng thời nếu quá trình xử lý nước thải không tốt sẽ ảnh hưởng rất lớn đến môi trường

1.3.3.2 Quy trình sản xuất chitin hiện đại

Hiện nay, việc bảo vệ môi trường đang là vấn đề lớn và được nhiều người quan tâm Vì vậy, việc tìm ra một quy trình sản xuất chitin ít gây ô nhiễm môi trường đang được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới Thay vì sử dụng các hoá chất với nồng độ cao, các nhà khoa học đang ứng dụng sinh học vào quy trình sản xuất và đã đem lại nhiều thành công trong vấn đề này

H2O 1:1(w/v) Lên men

Hình 1.4 Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar,viện nghiên

cứu công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010

Trong phương pháp này, người ta chủ yếu dùng vi khuẩn lên men lactic để ủ tôm Acid lactic sinh ra sẽ khử khoáng trong nguyên liệu, đồng thời ngăn không cho các vi sinh vật gây hôi thối phát triển Đồng thời các vi sinh vật này sẽ phân huỷ một phần protein còn lại trong nguyên liệu Ngoài ra, có thể sử dụng các enzyme

thuỷ phân protein từ Aspergillus oryzea để thúc đẩy hiệu suất quá trình cao hơn

1.3.4 Ứng dụng của chitin – chitosan

1.3.4.1 Ứng dụng trong công nghiệp

Do có tính chất vật lý và hóa học ưu việt, chitosan đang được sử dụng trong một mảng lớn các sản phẩm và ứng dụng khác nhau, từ dược phẩm, mỹ phẩm và bảo vệ thực vật

Thông thường, các acid hữu cơ được sử dụng làm dung môi cho các ứng dụng

mỹ phẩm như là aminopolysaccharide, chitosan được bao phủ trong lớp keo hydrocolloid, tuy nhiên không giống các loại keo hydrocolloid khác, chitosan tạo tính nhớt khi được trung hòa acid Chúng tạo điều kiện tương tác với da và tóc tốt hơn Ngoài ra chitin và chitosan diệt và kháng nấm rất tốt Chitosan cũng có thể hấp thụ các chất độc hại như tia UV hoặc các loại thuốc nhuộm khác do có thể dễ dàng liên kết chung với gốc amino của chitosan

Chitin và chitosan và các dẫn xuất của chúng được sử dụng trong ba lĩnh vực

mỹ phẩm bao gồm:

-Tóc: dầu gội, dầu xả, thuốc nhuộm tóc, kem tạo kiểu tóc, thuốc xịt tóc, nước dưỡng tóc

-Da: kem dưỡng da, sữa tắm, son môi, phấn nền, phấn mắt, mascara, sơn móng tay, sữa dưỡng ẩm…

-Chăm sóc răng: kem đánh răng, nước súc miệng, kẹo cao su, ngoài ra còn được áp dụng như một chất độn nha khoa

 Xử lý nước

Do tích chất polycationic tự nhiên, chitosan được sử dụng như một tác nhân kết bong, hoặc kết tủa chất bẩn

Weltroswki et al, sử dụng chitosan N_benzyl dẫn xuất sulphonat như các chất hấp thụ để loại bỏ ion kim loại trong môi trường acid Năm 1999, Bhavani và dutta sử dụng chúng như chất hấp phụ loại bổ màu từ nước thải xưởng nhuộm

Ngoài ra, chitosan còn dùng để loại khỏi chất thải các chất như: kim loại nặng, asen, plutoniun, methyl acetate – thủy ngân, acetaldehyd, kể cả dầu mỏ và dầu khí

 Công nghiệp giấy

Do có khả năng phân hủy sinh học nên chitin – chitosan được sử dụng trong ngành sản xuất giấy tái chế thân thiện với môi trường và bao bì thực phẩm

 Công nghiệp dệt Dẫn xuất chitosan được sử dụng để chống tĩnh điện, chống bám bẩn Ngoài ra chitin có thể sử dụng trong quá trình in ấn hoàn thiện sản phẩm Chitosan có khả năng xử lý màu nhuộm trong nước thải

 Chế biến thực phẩm Chitosan được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm vì tính không độc đối động vật máu nóng của nó Các hạt tinh thể chitin siêu nhỏ (MLL) có tính chất nhũ hóa, làm dày và tạo gell cho thực phẩm Nó còn được sử dụng như chất xơ trong thực phẩm nướng Việc sử dụng MLL giải quyết các vấn để như màu sắc, mùi vị và hạn sử dụng dài hơn các loại chất xơ Ngoài ra chitin – chitosan còn kháng vi khuẩn, kháng nấm và cản trở sự hoạt động của enzyme

 Nhiếp ảnh Trong nhiếp ảnh màu, Chitosan đã được sử dụng như một tác nhân cố định màu thuốc nhuộm acid trong gelatin và hổ trợ khuyết tán

 Sắc ký phân cách

Chitosan và chitin là một chất hỗ trợ hữu ích cho sự phân ly trong sắc ký do có sự hiện diện của các nhóm tự do – NH2, - OH chính và – OH thứ cấp

Rhee et al đã sử dụng chitin và chitosan làm vật liệu hấp thụ pha rắn trong khai thác phenol và chloirophenol bằng sắc khí lỏng hiện năng cao HPLC Ngoài ra có thể sử dụng chitosan trong sắc khí lỏng phân tích nucleic acid

 Pin dạng rắn

 Chitin cho các ứng dụng đèn LED và NLO

1.3.4.2 Ứng dụng trong nông nghiệp

 Xử lý hạt Hạt giống xử lý bằng chitin trước khi gieo trồng sẽ thúc đẩy và nâng cao độ tăng trưởng Bổ sung chitin trong bầu đất sẽ dẫn đến giảm đáng kể sâu hại rễ, vi khuẩn gây bệnh và nấm mốc

 Chất mang trong sản xuất phân bón Trong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón, chất điều hoà tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết Chitosan được sử dụng như chất mang tự nhiên để kết hợp và phóng thích từ từ các hợp chất mong muốn vào trong đất Chitosan bị phân huỷ sinh học trong đất khoảng hai tháng, kèm theo là sự phogs thích các chất Do đó, người ta tiết kiệm được đáng kể lượng chất sử dụng và thời gian bón lặp khi sử dụng chitosan làm chất mang

 Bảo quản nông sản Trong bảo quản nông sản, chitosan không những phát huy khả năng kháng khuẩn và nấm, mà còn giúp điều chỉnh môi trường bên trong rau củ thông qua kiểm soát quá trình trao đổi khí giữa rau quả và môi trường Ở Nhật, dung dịch chitosan được phun lên táo và cam nhằm kháng nấm và vi khuẩn gây hư hỏng André Bégin cũng đề xuất quy trình bảo quản dâu bằng chitosan Ngoài ra, chitosan còn được sử dụng để làm bao bảo vệ chống sương giá

1.3.4.3 Ứng dụng y sinh học

Màng chitosan đã được đề xuất làm màng thận trong sản xuất thận nhân tạo vì có độ thấm phù hợp và độ bền cao

 Mô nhân tạo Chitosan và một số dẫn xuất đã được nghiên cứu để sử dụng trong một số ứng dụng y sinh bao gồm băng bó vết thương và làm đầy không gian cấy ghép Chitosan được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật mô xương và hệ thần kinh trung ương, ngoài ra chúng còn được nghiên cứu để chữa sụn khớp

Chitosan đã được nghiên cứu để sản xuất chỉ may vết thương và cho thấy tốc độ chữa lành vết thương nhanh hơn bình thường

 Điều trị bỏng

Do chitosan có thể hình thành màng thấm nước, có khả năng tương tác sinh học Màng phim có thể hình thành trực tiếp trên vết bỏng bằng cách sử dụng dịch nước của chitosan acetate Một lợi thế nữa của chitosan là khả năng thẩm thấu oxy tốt đây là điều quan trọng để các mô bị thương không bị thiếu oxy Ngoài ra, lớp màng phim chitosan có khả năng hấp thụ nước và bị phân hủy tự nhiên bởi các enzyme trong cơ thể nên không cần phải phẫu thuật loại bỏ

 Da nhân tạo

Do nhiều tính chất như: tạo màng, có khả năng thẩm thấu oxy, thấm nước, diệt khuẩn, làm mau lành vết thương… hiện nay chitosan đang được nghiên cứu để sản xuất da nhân tạo phục vụ cho y học

 Nhãn khoa Sử dụng làm kính áp tròng do có đặc tính quang học rõ rang, ổn định cơ học , có độ thấm khí, có thể điều chỉnh quang, có thể thấm ướt, và có khả năng tương thích với hệ miễm dịch, Ngoài ra khả năng kháng khuẫn và dễ chữa lành vết thương cũng giúp ích rất nhiều trong trường hợp này

 Màng bao thuốc Chitosan có đặc tính kháng khuẩn kháng nấm, không độc, chitosan là chất vô cùng thích hợp để sản xuất màng bao thuốc

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc trường Đại Học

Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM

2.1.2 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ ngày 1/05/2012 đến ngày 20/07/2012

2.1.3 Giống vi sinh vật

Giống L acidophilus được sử dụng trong các thí nghiệm được lấy từ dược

phẩm ANTIBIO Đây là một dạng chế phẩm sinh học dạng bột, chứa 109 CFU/g (theo như khuyến cáo của nhà sản xuất)

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ

2.1.4.1 Nguyên liệu và hoá chất

Vỏ tôm sau khi thu nhận được bảo quản trong thùng lạnh từ chợ về đến phòng thí nghiệm, rửa sơ, loại bỏ các tạp chất như sỏi, đá nhỏ… sau đó được xay nhuyễn (≤2 mm) và bảo quản lạnh -4 oC Quá trình này cần làm nhanh để tránh vỏ tôm bị

hư hỏng Nếu vỏ tôm có hiện tượng hỏng như có mùi hôi thối hay tăng pH, cần

chỉnh pH về 6 – 6,5 trước khi thực hiện lên men với L acidophilus

 Hoá chất

 Môi trường MRS

Bảng 2.1: Thành phần môi trường MRS

Thành phần môi trường MRS (1 l)

H2SO4 đậm đặc

NaOH 45 %

H2SO4 0,1 N chuẩn

NaOH 0,1 N chuẩn

Thuốc thử Tashiro

Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4:CuSO4 (3:1)

 Xác định protein hòa tan bằng phương pháp Bradford:

Dung dịch albumin 0,1 mg/ml: cân chính xác 10 mg albumin pha trong 100 ml nước cất, lắc đều cho tan, giữ ở 20 0C Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0,01 mg/ml

Dung dịch thuốc thử Bradford:

- Coomassie Brilliant Blue: 0,001 g

- Ethanl tuyệt đối 4,7 g

- Acid phosphoric 85%: 8,5 g

Phẩm màu Coomassie Brilliant blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85 % và chỉnh tới 100ml bằng nước cất

 Xác định hàm lượng N amin theo phương pháp chuẩn độ formol:

Dung dịch NaOH 0,05 N

Dung dịch phenolphtalein 0,1% trong etanol 90%

Dung dịch formaldehyde trung hòa 30 %: Lấy 50 ml dung dịch formaldehyde

30 % cho thêm vài giọt phenolphtalein và chỉnh bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu phớt hồng

 Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men:

NaOH 0,1 N

Thuốc thử phenolphtalein

 Thí nghiệm xác định lượng đường khử có trong dịch lên men:

Thuốc thử DNS

2.1.4.2 Thiết bị

Tủ cấy vi sinh (Brlad France)

Tủ ủ (Memmert Germany)

Máy chạy Kjeldahl

Tủ lạnh Toshiba

Kính hiển vi quang học (Olympus)

Autolave (Huxky Đài Loan)

Máy đo quang (Hach-Germany)

Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

Máy đo pH (Hach-Germany)

Cân phân tích (Orbital Germany)

Bếp từ (Billy – England)

Máy nước cất (Branstead USA)

Pipet thủy tinh 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml

Ống ly tâm eppendorf

Que cấy, que gắp, que trang

Đũa thủy tinh

Bông thấm nước, bông không thấm nước

Bao nilong hấp, bao nilon kích thước 5x7 cm, dây thun, giấy gói

2.2 Phương pháp luận

2.2.1 Mục đích

Nghiên cứu quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất chitin bằng

phương pháp lên men với L acidophilus

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: xác định các thông số về thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ

tôm Các yếu tố cần phân tích trong mục tiêu này:

1 Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm

2 Xác định hàm lượng N - tổng có trong vỏ tôm bằng phương pháp Kjeldahl

3 Xác định hàm lượng N - amin có trong vỏ tôm theo phương pháp chuẩn độ formol

4 Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong vỏ tôm bằng phương pháp Bradford

Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ

tôm bằng L acidophilus Thực hiện quy trình lên men với các tỉ lệ nước 0,5:1; 1:1;

1,5:1; 2:1 và 2,5:1 (v:w) Các yếu tố cần phân tích:

1 Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N

2 Xác định hàm lượng N - protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford

3 Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mức độ thuỷ phân protein

4 Xác định hàm lượng N - tổng có trong dịch sau lên men

Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ

tôm bằng L acidophilus Thực hiện lên men với các tỉ lệ đường 15 %, 20 %, 25 %,

30 % và 35 % Các yếu tố cần phân tích:

1 Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N

2 Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp Bradford

3 Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mức độ thuỷ phân protein

4 Xác định hàm lượng N - tổng có trong dịch sau lên men

5 Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương pháp acid dinitro – salisylic (DNS)

Nội dung 4: So sánh hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng phương pháp

lên men lactic với các quá trình hóa học tương đương

Đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất chitin

Tìm được tỉ lệ nước thích hợp cho quá trình lên men

Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước

đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng LA

Xác định lượng acid lactic sinh

ra trong quá trình lên men

Xác định hàm lượng N- protein hoà tan trong dịch lên men

Xác định hàm lượng

N - amin có trong dịch lên men

Xác định hàm lượng

N - tổng có trong dịch sau lên men

Nội dung 1: xác định các thông số về thành

phần hoá học của nguyên liệu vỏ tôm

Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm

Xác định hàm lượng

N – tổng có trong vỏ tôm

Xác định hàm lượng

N – amin có trong vỏ tôm

Xác định hàm lượng

N - protein hoà tan có

trong vỏ

tôm

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm của toàn bộ đồ án

Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường

đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng LA

Xác định hàm lượng N - amin có

trong dịch lên men

Xác định hàm lượng N - tổng có

trong vỏ

tôm

Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men

Tìm được tỉ lệ đường thích hợp cho quá trình lên men

Nội dung 4: So sánh hiệu quả

khử khoáng và khử protein bằng phương pháp lên men lactic với các quá trình hóa học tương đương

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung 1: xác định các thông số về thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ tôm

Tiến hành: vỏ tôm đã qua xử lý được thêm vào 20 ml nước cất, sau đó đem ly

tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, lặp lại 2 lần Phần dịch sau hai lần ly tâm được trộn lẫn và định mức tới 50 ml gọi là dịch D1, rắn sau ly tâm gọi là R1

Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt của nội dung 1

Các yêu cầu của nội dung nghiên cứu 1 được thực hiện theo sơ đồ hình 2.2:

1 Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm

2 Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong vỏ tôm bằng phương pháp Kjeldahl

Vỏ tôm đã xử lý (10g)

Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút

Khuấy trộn

20 ml nước cất

Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút

Khuấy trộn

20 ml nước cất

Định mức 50 ml

Dịch D1

3 Xác định hàm lượng N - amin có trong vỏ tôm theo phương pháp chuẩn độ formol

4 Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong vỏ tôm bằng phương pháp Bradford

Các phương pháp thực hiện được trình bày ở phần phương pháp tiến hành

2.3.2 Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L acidophilus

Thực hiện quy trình lên men với các tỉ lệ nước 0,5:1; 1:1; 1,5:1; 2:1 và 2,5:1 (v:w)

 Chuẩn bị:

Vỏ tôm đã xử lý và bảo quản ở -4 oC được đem rã đông

Giống L acidophilus được hoạt hoá bằng cách cho gói ANTIBIO 1 g vào 100

ml nước cất, khuất đều (10 8CFU/ml)

 Tiến hành:

Cho vào bao nilon các thành phần sau:

 Bột vỏ tôm: 10 g

 Đường D – glucose: 1,5 g

 NaCl: 0,2 g

 Nước:đầu tôm với các tỉ lệ thí nghiệm (v:w): 0,5:1; 1:1; 1,5:1; 2:1; 2,5:1

 Giống L acidophilus đã hoạt hoá: 1 ml

Trộn đều các thành phần trên, sau đó cột chặt bằng thun để tạo điều kiện kị khí và đem ủ ở nhiệt độ phòng

Sau các khoảng thời gian 24, 48, 60, 72 giờ, đem dịch lên men đi ly tâm 4000 vòng trong 10 phút, thu dịch, sau đó cho thêm 20 ml nước cất vào, trộn đều và ly tâm thêm 4000 vòng trong 10 phút thu dịch Cả 2 phần dịch sau ly tâm được trộn đều và định mức đến 50 ml (dịch D2), phần cặn sau đó được rửa nhiều lần bằng nước (cặn R2)

Hình 2.4 Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm của nội dung nghiên cứu 2

Tổng số nghiệm thức cần thực hiện: 1 giống x 5 tỉ lệ x 3 lặp lại x 4 thời gian =

120 nghiệm thức

Các yếu tố cần xác định trong phần thí nghiệm này:

1 Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N

2 Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford

10 g vỏ tôm đã xử lý

(nhiệt độ phòng, ở các thời gian

24, 48, 72, 96 giờ)

Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút

Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút

Khuấy trộn

20 ml nước cất

Định mức 50 ml

Dịch D2

3 Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mứ độ thuỷ phân protein

4 Xác định hàm lượng tổng nitơ có trong dịch sau lên men

Dựa vào kết quả của các thí nghiệm trên, ta tìm ra tỉ lệ nước thích hợp nhất cho quá trình lên men

2.3.3 Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L acidophilus

Thực hiện lên men với các tỉ lệ đường 15 %, 20 %, 25 %, 30 % và 35 %

 Chuẩn bị:

Vỏ tôm đã xử lý và bảo quản ở -4 oC được đem rã đông

Giống L acidophilus được hoạt hoá bằng cách cho gói ANTIBIO 1g vào

100ml nước cất, khuất đều (108CFU/ml)

 Tiến hành:

Thực hiện thí nghiệm như hình 2.4, nhưng khác phần nguyên liệu và thời gian

lên men

Cho vào bao nilon các thành phần sau:

 Bột vỏ tôm: 10 g

 Đường D – glucose với các tỉ lệ thí nghiệm: 1,5 g; 2 g; 2,5 g; 3 g; 3,5

g

 NaCl: 0,2 g

 Nước:đầu tôm với tỉ lệ (v:w): 2,5:1

 Giống L acidophilus đã hoạt hoá: 1 ml

Trộn đều các thành phần trên, sau đó cột chặt bằng thun để tạo điều kiện kị khí và đem ủ ở nhiệt độ phòng

Sau các khoảng thời gian 48, 60, 72, 96 giờ, lấy các bao nilon đi ly tâm 4000 vòng trong 10 phút, thu dịch, sau đó cho thêm 20 ml nước cất vào, trộn đều và ly

đều và định mức đến 50 ml (dịch D3), phần cặn sau đó được rửa nhiều lần bằng nước (cặn R3)

Tổng số nghiệm thức cần thực hiện: 1 giống x 5 tỉ lệ x 3 lặp lại x 4 thời gian =

120 nghiệm thức

Các yếu tố thí nghiệm:

1 Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N

2 Xác định hàm lượng N protein hoà tan có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp Bradford

3 Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mứ độ thuỷ phân protein

4 Xác định hàm lượng tổng nitơ có trong dịch sau lên men

5 Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương pháp acid dinitro – salisylic (DNS)

Từ các kết quả đạt được, ta tính toán được tỉ lệ đường nào thích hợp nhất cho quá trình lên men

2.3.4 Nội dung 4: so sánh phương pháp khử protein và khoáng bằng phương pháp lên men lactic với phương pháp hoá học

Khử khoáng và khử protein được thể hiện bằng tỉ lệ phần trăm như mô tả của Rao và cộng sự (2000):

%𝐷𝑀 = [𝐴𝑂 × 𝑂] − [𝐴𝑅× 𝑅]

%𝐷𝑃 = [𝑃𝑂 × 𝑂] − [𝑃𝑅 × 𝑅]

Với: %DM: tỉ lệ phần trăm khử khoáng

%DP: tỉ lệ phần trăm khử protein

PO và PR: nồng độ protein trước và sau lên men

AO và AR: % tro trong mẫu trước và sau lên men

O và R: khối lượng mẫu trước và sau lên men

Từ công thức trên ta tính được hiệu suất khử khoáng và khử protein của cả hai phương pháp xử lý vỏ tôm bằng hoá học và sinh học

2.3.4.1 So sánh hiệu suất khử khoáng của quy trình thí nghiệm với quy trình phương pháp hoá học

 Phương pháp lên men lactic

Từ các nội dung nghiên cứu 2 và 3, ta tìm ra được tỉ lệ nước : vỏ đầu tôm và tỉ lệ đường thích hợp cho quá trình lên men, dùng nghiệm thức đã chọn để xác định khoáng trong mẫu còn lại nhằm so sánh hiệu suất với quá trình khử khoáng của phương pháp hoá học

 Phương pháp hoá học

Hình 2.5 Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm 4.1

Cân 10 g vỏ tôm đã qua xử lý vào bình tam giác 1 l, cho thêm HCl 0,25 M với tỉ lệ 1:40 w:v Lắc ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 giờ, lọc chân không và thu cặn Phần cặn sau đó được đem đi xác định hàm lượng khoáng (cách xác định được trình bày ở phần phương pháp tiến hành)

10 g Vỏ tôm đã được xử lý

Lắc 2 giờ ở nhiệt độ phòng HCl 0,25 M tỉ lệ 1:40 w:v

Lọc

Thu cặn

Xác định hàm lượng khoáng

2.3.4.2 So sánh hiệu suất xử lý protein của quy trình thí nghiệm với quy trình từ phương pháp hoá học

 Phương pháp lên men lactic

Tương tự như khi so sánh hiệu suất khử khoáng, dùng nghiệm thức này để định lượng N tổng số nhằm so sánh hiệu suất với quá trình xử lý protein của phương pháp hoá học

 Phương pháp hoá học

Cân 20 g vỏ tôm đã qua xử lý vào bình tam giác 1 l, cho thêm NaOH 1 M với tỉ lệ 15 mg/l Ủ ở 70 oC trong 24 giờ, lọc chân không và thu cặn Phần cặn sau đó được đem đi xác định hàm lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (cách xác định được trình bày ở phần phương pháp tiến hành)

Hình 2.6 Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm 4.2

2.4 Phương pháp tiến hành

2.4.1 Xác định độ ẩm của mẫu cần phân tích

 Tiến hành

Cốc đã được sấy khô và cân đo trước (m0)

Cân mẫu Rx chính xác đến 0,001 g, cho vào cốc trên (m1)

20 g Vỏ tôm đã được xử lý

Ủ 70 oC trong 24 giờ

NaOH 1 M với tỉ lệ 15mg/l

Lọc

Thu cặn

Xác định hàm lượng N tổng số