Nghiên cứu một số đặc điểm của bệnh care ở chó nuôi tại hà nội và chế kháng thể phòng trị bệnh TT

Đồng thời nghiên cứu chế tạo chế phẩm kháng thể kháng virus Care để điều trị bệnh Care cho chó mắc bệnh đạt hiệu quả cao.. Đồng thời nghiên cứu chế tạo kháng thể Care từ chủng virus thực

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Công trình hoàn thành tại:

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hữu Nam

PGS.TS Phạm Ngọc Thạch

Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan

Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên

Phản biện 2: PGS.TS Cù Hữu Phú

Hội Thú y

Phản biện 3: PGS.TS Lại Thị Lan Hương

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2021

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh Sài sốt chó (Canine Distemper) hay Care là một trong những bệnh nguy hiểm và phổ biến nhất trên chó Bệnh phân bố ở nhiều quốc gia trên thế giới và gây bệnh trên hầu hết các loại thú ăn thịt như chồn, cáo, hổ, báo, sư tử, Do đó, bệnh được tổ chức thú y thế giới (OIE) quan tâm và cập nhật tình hình trong những năm qua

Ở Việt Nam, bệnh Care được phát hiện từ năm 1920 Chó mắc bệnh thường chết với tỷ lệ rất cao, có thể lên đến 100% nếu không được điều trị kịp thời

Trong những năm gần đây, phong trào nuôi chó cảnh ở nước ta tăng nhanh khiến

số lượng chó giống ngoại nhập tăng lên đáng kể Các giống chó ngoại phổ biến ở nước

ta thường là giống có kích thước lớn như Bergie, Alaska,… và một số giống chó nhỏ như Phốc, Poodle, Corgi hay Pomeranian Theo đó, nguy cơ về bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lây lan như Care bùng phát cũng tăng lên

Tuy vậy, nghiên cứu về đặc điểm của bệnh Care vẫn còn hạn chế Thông tin về tỷ

lệ chó mắc bệnh Care, đặc điểm lưu hành và phân bố bệnh vẫn chưa được thống kê đầy đủ tại khu vực Hà Nội Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm xác định

sự lưu hành của bệnh Care ở khu vực nội thành Hà Nội làm cơ sở khoa học cho việc phòng và trị bệnh, tìm ra các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh Đồng thời nghiên cứu chế tạo chế phẩm kháng thể kháng virus Care để điều trị bệnh Care cho chó mắc bệnh đạt hiệu quả cao

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Hoàn thiện nghiên cứu về các đặc điểm của bệnh Care trên địa bàn Hà Nội Với mục đích mô tả bệnh và sự phân bố của bệnh dưới ảnh hưởng của thời tiết mùa vụ, lứa tuổi chó Đồng thời xác định được tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các giống chó nội và chó ngoại nhập Đồng thời nghiên cứu chế tạo kháng thể Care từ chủng virus thực địa, xác định liều điều trị cho chó mắc bệnh Xây dựng phác đồ điều trị thử nghiệm bệnh Care cho từng giai đoạn của bệnh Phục vụ cho công tác phòng và trị bệnh có hiệu quả cao

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu:

- Chó mắc bệnh trong tự nhiên được mang đến khám và điều trị tại hệ thống Bệnh viện thú cảnh của Công ty Hanvet tại Hà Nội, Bệnh viện Thú y Petheath, Bệnh viện Thú y Hải Đăng, Phòng khám Thú y Hà Nội; Bao gồm tất cả các giống chó nội và chó ngoại ở các lứa tuổi trong 6 năm liên tục (từ tháng 1/2013 tới tháng 12/2018) Thông tin về thời gian khám, giống, lứa tuổi, lịch tiêm phòng được ghi chép đầy đủ và chi tiết

- Chó từ 2 tháng tuổi được nuôi thí nghiệm tại trung tâm nghiên cứu công ty Hanvet;

và được nuôi tại trại thực nghiệm Khoa Thú y - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

- Thỏ từ 2 tháng tuổi được nuôi thí nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu Công ty Hanvet

* Địa điểm nghiên cứu:

+ Phòng Thí nghiệm Trung tâm của Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

+ Phòng Thí nghiệm Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam + Trung tâm Nghiên cứu Sinh phẩm, Công ty cổ phần Dược Hanvet

+ Bệnh viện Thú cảnh Hanvet - Công ty Dược Hanvet

* Thời gian nghiên cứu:

- Thời gian tiến hành đề tài luận án từ tháng 6/2014 - tháng 12/ 2018

- Số liệu của đề tài được thu thập từ tháng 01/2013 đến tháng 12/2018

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đây là công trình nghiên cứu hoàn chỉnh và có hệ thống về bệnh Care trên chó ở khu vực Hà Nội Kết quả khảo sát thực trạng của bệnh Care, đánh giá mô tả được các đặc điểm của bệnh ở trên tất cả các giống chó, lứa tuổi chó, mùa vụ mắc bệnh Bên cạnh đó xây dựng được quy trình chế tạo kháng thể kháng virus Care bằng chủng phân lập ở Việt Nam chữa bệnh cho chó đạt hiệu quả cao

1.5.Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc hiểu biết rõ hơn về đặc điểm của bệnh Care (CDV) tại Việt Nam Đây cũng là tư liệu khoa học có giá trị cho các nghiên cứu tiếp theo về bệnh Care và trong nghiên cứu vaccine phòng bệnh Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ nghiên cứu khoa học và là tư liệu tham khảo dùng trong giảng dạy chuyên ngành thú y Là tài liệu cần thiết cho những người làm công tác thú y thực hành tại các Bệnh viện Thú y và các Phòng khám thú y

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài là cơ sở khoa học để đưa ra những biện pháp phòng chống bệnh Care ở chó Từ đó khuyến cáo người nuôi chó sử dụng vaccine Care phù hợp theo từng lứa tuổi Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được một sản phẩm kháng thể kháng virus Care để phòng và trị bệnh, đồng thời xây dựng được phác đồ điều trị hiệu quả trên đàn chó mắc bệnh Care

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE

2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Care trên thế giới

Care là một bệnh truyền nhiễm cấp tính trên chó do Canine distemper virus (CDV) gây ra Bệnh lây lan rất nhanh, xảy ra ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu ở chó non với các các triệu chứng sốt, viêm phổi, viêm ruột và cuối cùng thường có hội chứng thần kinh (Greene & cs., 2006; Appel & cs., 1978) Đặc biệt bệnh gây chết với tỷ lệ rất cao Bệnh Care được báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel Max Jg & cs., 1972) Bệnh cũng xuất hiện ở một số nước châu Á và Nam Mỹ từ giữa thế kỷ 18 (Timothy, 2008; Woma & cs., 2009) Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã được mô tả từ năm 1809 bởi Edward Jenner (Shell, 1990) Năm 1905, bác sĩ thú y người Pháp Henri Carré đã phân lập được virus Care từ nước mũi của chó bị bệnh Sau đó năm

1923, Putoni lần đầu tiên chế vắc xin nhược độc, tuy nhiên virus vắc xin này độc tính vẫn còn cao Từ năm 1948 về sau, với sự phát triển mạnh mẽ của virus học, nhiều vắc xin phòng bệnh Care có hiệu quả đã ra đời

Hiện nay bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, không những xảy ra ở chó nuôi mà còn ở nhiều quần thể động vật hoang dã

Bệnh Care cũng thường thấy ở châu Á Dịch bệnh diễn ra ở các vùng khác nhau của Nhật Bản Lan NT & cs (2006), Thái Lan Keawcharoen & cs (2005), Hàn Quốc

An & cs (2008) và Ấn Độ Latha & cs (2007)

2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Care ở Việt Nam

Bệnh Care được phát hiện tại Việt Nam từ năm 1920 Nghiên cứu của Hồ Đình Chúc (1993) đã chỉ ra thời kỳ ủ bệnh Care thường là 3 - 6 ngày (dài nhất là 17 - 21 ngày) và có thể kéo dài trong khoảng thời gian trên dưới 1 tháng Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ 50 - 80%, thậm chí lên đến 100% nếu không điều trị kịp thời Cho đến nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006) Tất cả các loài chó đều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm ở là loài chó lai, chó cảnh, chó nội ít mẫn cảm hơn (Tô Du & Xuân Giao, 2006)

Trong nghiên cứu của Lan & cs (2009), hai chủng virus Care là Vn86 và Vn99

đã được phân lập từ chó 4 tháng tuổi có đặc điểm là viêm não không mưng mủ, viêm phổi, suy giảm tế bào lympho và viêm dạ dày ruột Kết quả phân tích sinh học phân tử

đã chỉ ra 2 chủng phân lập được này đều thuộc nhóm cổ điển (Classic type), khác xa với nhóm Asia 1 và Asia 2

Theo Trần Văn Nên & cs (2017), vắc xin vô hoạt Care được chế từ chủng VNUA-768 đã được đánh giá có khả năng bảo hộ trên chó bằng công cường độc với chủng CDV-HUA-04H Thí nghiệm tiêm vắc xin vô hoạt Care chế từ chủng CDV-VNUA-768 cho những chó becgie cái 6 tuần tuổi, sau đó 3 tuần công cường độc bằng chủng virus CDV-HUA-04H Đáp ứng miễn dịch kháng thể của chó thí nghiệm sau khi tiêm vắc xin

CDV-vô hoạt Care gây ra được khảo sát bằng phản ứng ELISA phát hiện kháng thể

2.2 BỆNH CARE TRÊN CHÓ

2.2.1 Dịch tễ học

Trong tự nhiên các giống chó đều cảm thụ, nhưng mẫn cảm nhất là chó nhập ngoại, chó nhập nội ít mắc hơn Trần Thanh Phong (1996) Ngoài ra cáo, cầy và các loài động vật ăn thịt khác cũng mắc, đặc biệt là loài chồn vô cùng mẫn cảm, thú ăn thịt

Tô Du & Xuân Giao (2006), khi nghiên cứu về dịch tễ bệnh Care cho rằng tất cả các loài chó đều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm hơn là chó lai và chó ngoại nhập, chó nội ít mẫn cảm hơn Bệnh xuất hiện nhiều khi có sự thay đổi thời tiết đặc biệt vào những ngày mưa

2.2.2 Cơ chế sinh bệnh

Thời kỳ ủ bệnh của Care thường là từ 3-6 ngày (dài nhất là 17-21 ngày) và có thể kéo dài khoảng trên dưới 1 tháng Bệnh có tỷ lệ chết từ 50-80%, thậm chí 100% nếu không được phát hiện và điều trị sớm Hồ Đình Chúc (1993) Lúc bệnh phát ra ở dạng

kế phát (thường kết hợp cùng bệnh pavovirus, viêm gan truyền nhiễm) thì tỷ lệ chết của bệnh càng cao Tô Du & Xuân Giao (2006)

Theo Trần Thanh Phong (1996), sau khi virus xâm nhập vào cơ thể qua đường mũi, miệng và ngay lập tức nhân lên trong đại thực bào và những tế bào lympho của đường hô hấp, trong vòng 24 giờ virus dã tới các hạch lympho của phổi Vào ngày thứ 6 virus đã di

cư tới lách, dạ dày, ruột non và gan Vào thời điểm này thì chó bắt đầu sốt

kế phát, cơn sốt kéo dài 3-4 ngày, lúc này bệnh trầm trọng hơn, không chỉ do độc lực của virus mà còn do số lượng và độc lực của các vi khuẩn bội nhiễm cùng xuất hiện với cơn sốt thứ hai, chó bắt đầu biểu hiện các triệu chứng ở đường hô hấp, tiêu hóa,

da và thần kinh

2.2.3.2 Bệnh tích

Theo Appel Max Jg & Summers (1995), bệnh tích đại thể có thể gặp sừng hoá ở mõm và gan bàn chân Tuỳ theo mức độ kế phát các vi khuẩn có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột, mụn mủ ở da v.v

Bệnh tích đường tiêu hóa: Viêm cata ruột, loét ruột, hạch ruột sưng, gan thoái hóa mỡ

Đường hô hấp: Viêm mũi, thanh quản, khí quản, viêm phổi, có mụn mủ trong phổi, có khi vỡ ra gây viêm phế mạc

Thần kinh: Viêm não, não tụ máu, các tế bào thần kinh bị hoại tử

Tế bào thượng bì đường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt có thể tìm thấy tiểu thể lenst trong nguyên sinh chất

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.1.1 Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh Care ở chó tại Hà Nội

- Đánh giá tình hình nhiễm bệnh Care trên chó nuôi tại khu vực Hà Nội

- Xác định tỷ lệ mắc bệnh care ở các giống chó nội và chó ngoại nhập

- Xác định lứa tuổi mắc bệnh, mùa vụ mắc bệnh

- Các yếu tố nguy cơ mắc bệnh

- Mô tả một số đặc điểm bệnh tích đại thể và vi thể của chó mắc bệnh Care

3.1.2 Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care

- Nghiên cứu quy trình chế tạo kháng thể Care

+ Nghiên cứu lựa chọn động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể

+ Nghiên cứu xác định độ tuổi động vật sử dụng chế tạo kháng thể

+ Nghiên cứu xác định quy trình tiêm động vật phù hợp sử dụng cho chế tạo kháng thể

+ Xây dựng quy trình sơ bộ chế tạo kháng thể

- Chế tạo thử nghiệm kháng thể Care quy mô Pilot

3.1.3 Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm và điều trị thử nghiệm bệnh Care bằng kháng thể kháng virus Care

- Nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm

- Nghiên cứu điều trị thử nghiệm kháng thể Care trong phòng và trị bệnh

3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

lạnh, máy đo pH, máy khuấy từ, máy Elisa, máy PCR, kính hiển vi các loại, pipetman

các loại

- Ngoài ra còn có các dụng cụ thông thường phục vụ cho sản xuất vacxin như ống

Valcol 15ml và 50ml Ống eppendorf 1,5 ml.ống nghiệm, bình tam giác

(250,500,1000ml) Đĩa pettri, dầu Tip các loại, dĩa 96 giếng, Pank, kéo

3.2.2 Vật liệu và hóa chất

* Vật liệu và hóa chất:

- Chó mắc bệnh Care ở các lứa tuổi mang tới khám tại các Bệnh viện thú y, phòng

khám thú y ở Hà Nội

- Chó 2 tháng tuổi khỏe mạnh chưa tiêm phòng vắcxin

- Thỏ 2-4 tháng tuổi khỏe mạnh không mắc bệnh truyền nhiễm

- Test chẩn đoán nhanh bệnh Care CDV Ag (Asan Pharmaceutical Co., LTD; Hàn Quốc)

- Các chủng virus CDV-Hanvet cường độc phân lập từ mẫu bệnh phẩm chó mắc

bệnh Care trong tự nhiên, được lưu giữ tại trung tâm nghiên cứu sinh phẩm công Ty

Hanvet - Do công ty Hanvet cung cấp

- Chủng virus Care nhược độc lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu sinh phẩm - công

- Môi trường nuôi tế bào, gây nhiễm virus, dung dịch đếm số: MEM, M199,

DMEM, LH3E, EMEM, FBS, BS, CMF Hank, TE 0.025%

- Sinh phẩm, hóa chất cần thiết từ nhiều công ty uy tín như Meck, Sigma, Oxoid,

Idexx Dùng cho các quá trình gây nhiễm virus

* Số liệu và phần mềm

- Số liệu thu thập về: là chó mắc bệnh Care và chó bị chết do bệnh Care tại bệnh

viện thú cảnh của công ty Hanvet và một số phòng khám thú y, Bệnh viện thú y trên

địa bàn nghiên cứu

- Phần mềm sử dụng trong xử lý số liệu Excel 2007 và Minitab 16.0

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm của bệnh Care

3.3.1.1 Phương pháp điều tra phát hiện bệnh

Điều tra phát hiện bệnh dựa vào thống kê hồ sơ bệnh án, mô tả bệnh, thống kê

sinh học, phương pháp hồi cứu và phương pháp cắt ngang (điều tra theo dõi và phỏng

vấn chủ vật nuôi, kết hợp theo dõi và quan sát trực tiếp) Cụ thể như sau:

* Phương pháp xác định chó mắc bệnh Care

Xác định chó bệnh được dựa vào lịch tiêm phòng vacxin, những triệu chứng lâm

sàng đặc trưng của bệnh, bệnh tích điển hình như các tác giả (Appel Max Jg & cs., 1994; Frölich & cs., 2000; Martella & cs., 2002); (Trần Văn Nên & cs., 2017) đã mô

tả Mặt khác, trong phòng thí nghiệm, test chẩn đoán nhanh được dùng để xác định bệnh những con chó có các triệu chứng bệnh Care điển hình Những trường hợp chó

có triệu chứng bệnh Care điển hình khi chẩn đoán bằng test chẩn đoán nhanh cho kết quả âm tính thì chúng tôi tiến hành chẩn đoán bằng phản ứng RT- PCR để loại trừ Tất cả những chó bị bệnh ở các lứa tuổi và các mùa trong năm, đưa đến khám tại Bệnh Viện Thú cảnh của công ty Hanvet, Bệnh viện thú y Petheath, Bệnh viện thú y Hải Đăng, Bệnh viện thú 2 vet tại Hà Nội được tiến hành kiểm tra thăm hỏi bệnh từ chủ vật nuôi và khám lâm sàng

Trong nghiên cứu chúng tôi đã thực hiện nội dung theo các bước: Lập bệnh án theo dõi và điều trị; Lấy mẫu làm test chẩn đoán nhanh; Thống kê tổng số chó mang đến và số chó mắc bệnh Care

* Phương pháp chẩn đoán bệnh Care bằng test CDV Ag

Dựa trên kết quả khám lâm sàng sau đó dùng Test thử CDV Ag để xác định bệnh: Lấy mẫu chẩn đoán nhanh bệnh Care bằng test CDV Ag (ASAN PHARMACEUTICAL CO., LTD; Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà cung cấp

3.3.1.2 Phương pháp kiểm tra bệnh tích đại thể và vi thể ở chó bị bệnh Care

Mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể của chó được gây nhiễm theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học & Công nghệ, 2010) Mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể đối với chó chết nghi mắc bệnh Care qua chẩn đoán lâm sàng và test thử CDV Ag có kết quả dương tính với virus Care Sau đó lấy mẫu ở các cơ quan: Não, hạch ruột, ruột non, ruột già, phổi, hạch phổi… ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản kiểm tra biến đổi bệnh lý vi thể

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu chế tạo kháng thể Care

3.3.2.1 Thiết kế thí nghiệm

a Nghiên cứu lựa chọn động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể

Trong nghiên cứu này, hai đối tượng vật nuôi được sử dụng để gây tối miễn dịch

là chó và thỏ Nhóm 1 gồm chó 02 tháng tuổi, giống Becgie lai, khỏe mạnh Số lượng 05 con Nhóm 2 gồm thỏ 02 tháng tuổi, giống Newzealand, khỏe mạnh Số lượng 05 con Chó âm tính với kháng thể Care, Thỏ âm tính với virus gây xuất huyết thỏ Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc của công ty Hanvet, có hiệu giá 104.0TCID 50/ml

để gây miễn dịch bằng cách tiêm dưới da

b Nghiên cứu chọn độ tuổi động vật sử dụng để tối miễn dịch thu kháng thể kháng virus Care

Động vật sử dụng là chó hoặc thỏ Sử dụng 15 động vật khỏe mạnh chia làm 3 nhóm: + Nhóm 1: 05 con 02 tháng tuổi;

+ Nhóm 2: 05 con 03 tháng tuổi;

+ Nhóm 3: 05 con 04 tháng tuổi

‐ Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc của công ty Hanvet, có hiệu giá

104.0TCID 50/ml để tiêm động vật nhằm mục đích tạo kháng thể

c Nghiên cứu quy trình tiêm động vật phù hợp sử dụng cho chế tạo kháng thể kháng virus Care

‐ Sau khi lựa chọn được đối tượng và độ tuổi động vật phù hợp, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu các quy trình tối miễn dịch khác nhau để nhằm tìm ra quy trình miễn

dịch cho hiệu giá kháng thể tốt nhất Sử dụng 15 động khỏe mạnh chia làm 3 nhóm,

miễn dịch với 03 quy trình khác nhau

3.3.2.2 Phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng Elisa

Các bước thực hiện phản ứng Elisa theo bộ kít ELISA INGEZIM MOQUILLO

IgG Prod Ref: 15.CDG.K1

3.3.2.3 Phương pháp định lượng kháng thể kháng virus Care bằng phản ứng

trung hòa

‐ Huyết thanh pha loãng trong môi trường nuôi cấy tế bào theo cơ số 10 hoặc cơ số

2: huyết thanh dương và huyết thanh âm, thao tác pha trên đĩa 96 giếng;

‐ Virus pha trong môi trường nuôi cấy tế bào 100 TCID50/50 µl liều trung hòa:

nhỏ vào mỗi giếng thí nghiệm 50 µl;

‐ Điều kiện trung hòa 370C /1 giờ/ 5%C02 (20 phút láng một lần);

‐ Nuôi đĩa phản ứng 370C /1 giờ / 5%C02;

‐ Đọc kết quả hàng ngày: ngày thứ nhất CPE bắt đầu xuất hiện: tế bào vỡ vụn

thành mảnh nhỏ li ti, ngày thứ 2 CPE rõ tế bào bị phá hủy cả giếng, ngày thứ 3 đọc và

kết luận

3.3.2.4 Phương pháp kiểm nghiệm kháng thể Care

* Kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết

Phương pháp kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết được thực hiện căn cứ

theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8684:2011

* Kiểm nghiệm chỉ tiêu an toàn

Kháng thể được tiêm với liều gấp 05 lần và 10 lần trên thỏ và chó Sau 10 ngày

liên tục theo dõi biểu hiện lâm sàng Nếu chó và thỏ không có biểu hiện gì, mức độ

ăn, uống và thể trạng bình thường thì kháng thể được coi là đã đạt yêu cầu về chỉ tiêu

an toàn

* Kiểm nghiệm chỉ tiêu hiệu lực

Chỉ tiêu hiệu lực được đánh giá gián tiếp qua kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng

phương pháp ELISA hoặc phản ứng trung hòa

3.3.3 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm và điều trị thực nghiệm

3.3.3.1 Thiết kế thí nghiệm

Động vật thí nghiệm gồm 20 con, chó 2 tháng tuổi có trọng lượng từ 2- 3 kg/con

Chó thí nghiệm được chọn là chó không mắc virus Care và các virus khác (bệnh

Parvovirus, bệnh viêm gan chó ) và không có kháng thể kháng virus Care

Hai mươi chó thí nghiệm được chia thành 4 lô:

Lô đối chứng âm không gây nhiễm

Lô đối chứng dương gây nhiễm mà không điều trị để nghiên cứu các đặc điểm bệnh lý để so sánh

3.3.3.2 Gây bệnh thực nghiệm

Trước khi gây nhiễm chó được nuôi 7 ngày để theo dõi tình hình sức khỏe, đo nhiệt độ, và đồng thời để chó thích nghi với điều kiện mới (trong phòng thí nghiệm) Lấy máu kiểm tra các chỉ tiêu huyết học, chắt huyết thanh kiểm tra kháng thể Care bằng phương pháp ELISA, kiểm tra sự có mặt của virus Care và một số mầm bệnh khác (virus dại, Leptospira, virus viêm gan, ) bằng phương pháp RT - PCR để khẳng định chó thí nghiệm chưa từng tiếp xúc với virus Care

3.3.3.3 Phương pháp khám triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care được xác định thông qua theo dõi, quan sát và nghi chép đầy đủ từ bước bắt đầu nuôi chó, sau khi gây nhiễm cho đến khi chó có triệu chứng bệnh điển hình hoặc chết Những chỉ số lâm sàng cơ bản được chúng tôi kiểm tra là thân nhiệt, nhịp tim, tần số hô hấp và biểu hiện hoạt động của chó Đồng thời chúng tôi theo dõi chó lô đối chứng để so sánh với chó lô thí nghiệm

3.3.3.4 Phương pháp RT-PCR xác định sự có mặt của virus Care trong mẫu bệnh phẩm

a Thu thập và xử lý mẫu

+ Đối với mẫu swab và mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng lấy dịch mắt và mũi của chó nghi bệnh Care, cho tăm bông đã lấy mẫu vào ống eppendorf vô trùng có chứa sẵn 300 μl dung dịch đệm PBS (Phosphat buffer saline) Mẫu được bảo quản lạnh có

đá khô và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu

b Thực hiện phản ứng RT-PCR

Để xác định sự có mặt của virus Care trong máu, dịch swab (nhử mắt, mũi) và phân của chó bằng các cặp mồi đặc hiệu với chủng virus Care

3.3.3.5 Phương pháp kiểm tra một số chỉ tiêu huyết học của chó

Phương pháp lấy máu: lấy máu chó vào buổi sáng trước khi cho ăn Mỗi con lấy 3ml dùng máy phân tích 21 chỉ tiêu để chạy kết quả

3.3.3.6 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

Sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) đối với các mẫu bệnh phẩm (phổi, hạch, ruột, lách ) theo phương pháp của Carpenter (1998), Lan (2009) Khi có mặt virus trong tổ chức đem làm hóa mô miễn dịch kết quả dương tính sẽ là sự hiện màu nâu vàng trên lát cắt tổ chức (màu của DAB) Virus tập trung càng nhiều, màu càng rõ, mức dương tính càng cao

3.3.4 Phương pháp điều trị thử nghiệm bằng kháng thể Care

* Cách tính liều điều trị

Chúng tôi dùng kháng thể đã được định lượng ở hiệu giá cao nhất 9 log2, sau đó chia liều điều trị như sau:

+ Với chó bệnh được phát hiện sớm tiêm liều 0,5ml / 2-5kg Thể trọng;

+ Với chó bệnh phát hiện muộn tiêm liều 1ml -1,5 ml/2- 5kg Thể trọng;

Tất cả liều trên sử dụng liệu trình tấn công 5-7 ngày liên tiếp tùy theo mức độ bệnh Sử dụng ngày 2 lần (sáng - chiều), hoặc tiêm ngày 1 lần

3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SAS 9.0 (2002) Phân tích Khi bình phương (Chi-square) được sử dụng để phân tích cho trường hợp dung lượng mẫu lớn (với các giá trị mong đợi theo lý thuyết lớn hơn 5) và phép thử chính xác của Fisher (Fisher's exact test) được sử dụng để phân tích với trường hợp dung lượng mẫu bé (có ít nhất

một giá trị mong đợi theo lý thuyết nhỏ hơn hoặc bằng 5)

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH CARE 4.1.1 Kết quả xác định tỷ lệ mắc bệnh Care của chó đến khám tại phòng mạch trên địa bàn Hà Nội

Để đánh giá tình hình mắc bệnh Care trên chó nuôi tại khu vực Hà Nội, trên từng giống và lứa tuổi của chó Chúng tôi nghiên cứu tổng hợp theo dõi bệnh án điều trị từ năm 2013- 2018 tập hợp và phân loại 18.244 ca bệnh là chó đến khám tại các phòng khám của Bệnh Viện Thú cảnh Công ty Hanvet., Bệnh viện thú y Petheal, Bệnh viện thú y Hải Đăng Phòng khám thú y Hà Nội Kết quả được trình bày tại bảng 4.1

Tỷ lệ (%)

Nhóm chó Điều trị Ngoại Nội Khỏi Chết Không

Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo dõi ở khu vực Hà Nội có xu hướng giảm dần trong

6 năm qua Điều này có thể do hiểu biết và điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng của người nuôi chó ở thủ đô đã được nâng cao Chó nuôi được quan tâm, chú trọng trong việc tiêm vắc-xin phòng bệnh, chăm sóc nuôi dưỡng và khám chữa bệnh định kỳ đầy đủ Tỷ lệ chó mắc Care nghiên cứu ở khu vực Hà Nội là 3,15% Trong đó, số điều trị khỏi là 157 con,

số chết là 261 con, còn 157 con không điều trị do bệnh đã rất nghiêm trọng trả lại chủ nuôi hoặc chủ nuôi không muốn điều trị

4.1.2 Kết quả kiểm tra chó mắc bệnh Care bằng test chẩn đoán nhanh CDV-Ag

4.1.2.1 Kết quả kiểm tra bằng test chẩn đoán nhanh

Kết quả thực hiện theo quy trình của bộ kít thương mại CDV-Ag (Asan Pharm, Hàn Quốc)

4.1.2.2 Tỷ lệ chó bị bệnh do virus Care bằng kit CDV-Ag

Kết quả thử nghiệm test CDV-Ag được trình bày ở bảng 4.2 Tổng số mẫu được thử bằng phương pháp kít chẩn đoán nhanh là 354 mẫu (từ năm 2013 - 2018), mẫu đại diện trên cả hai đối tượng là chó nội và chó ngoại nhiễm virus Care

Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra chó mắc bệnh Care bằng test chẩn đoán nhanh

CDV Ag

Năm

Số mắc Số test

Số dương tính

Tỷ lệ (%) Số mắc Số test Số

dương tính

Tỷ lệ (%)

Ghi chú: a, b: thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05

Qua bảng 4.2 có thể thấy, trong số chó được xác định nhiễm Care bằng triệu chứng lâm sàng, tỷ lệ dương tính với test CDV Ag khá cao Ở các giống chó ngoại tỷ

lệ dương tính với test CDV Ag từ 88,24% đến 95,24% (trung bình 91,64%) Ở các giống chó nội từ 81,82% đến 90,91% (trung bình 87,50%)

4.1.3 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo địa bàn điều tra

Trong quá trình điều tra, phỏng vấn chủ nuôi chó, chúng tôi đã ghi chép lại địa điểm xuất hiện ca bệnh theo khu vực Quận, Huyện của Hà Nội Số liệu thu thập được tính toán theo tỷ lệ phần trăm và thể hiện tại Bảng 4.3