Luận văn thạc sĩ nghiên cứu khả năng ức chế hình thành b amyloid gây bệnh alzheimer bởi một số hoạt chất từ hoa hòe

Người mắc bệnh Alzheimer bị mất dần khả năng tự chăm sóc và ngày càng phụ thuộc vào người khác trong việc thực hiện các hoạt động thể chất và tinh thần cơ bản nhất.. Các nghiên cứu gần đ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đỗ Thị Hải Anh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β-AMYLOID GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ

HOA HÒE (Sophora japonica L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đỗ Thị Hải Anh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β-AMYLOID GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ

HOA HÒE (Sophora japonica L.)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội – 2018

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới người thày đã

luôn tận tâm chỉ bảo, tạo điều kiện cho em được học tập, trau dồi kiến thức trong suốt

thời gian qua – PGS.TS Nguyễn Quang Huy Nếu không có sự hướng dẫn, giúp đỡ và

động viên liên tục của thày, em sẽ khó có thể hoàn thành được luận văn thạc sĩ này

Tiếp đến, em xin chân thành cảm ơn GS Shunsuke Izumi và PGS.TS Kazumi

Saikusa, phòng thí nghiệm Khoa Toán học và Khoa học sự sống, ĐH Khoa học tự

nhiên, ĐH Hiroshima đã hết sức tạo điều kiện, quan tâm và hướng dẫn em làm thí

nghiệm trong thời gian em học tập và trao đổi tại ĐH Hiroshima Dưới sự hướng dẫn

của thầy cô, em đã học được rất nhiều điều hay và bổ ích, phục vụ rất nhiều cho quá

trình thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân

tử, các thày cô giáo tại Khoa Sinh học và chuyên viên phòng Đào tạo Sau Đại học

trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện cho em hoàn thành chương trình học

tập của khóa học

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động

viên, cổ vũ tinh thần cho em mỗi khi em gặp khó khăn trong suốt thời gian em học tập

và thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên cao học

Đỗ Thị Hải Anh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về bệnh Alzheimer 3

1.1.1 Bệnh Alzheimer trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.2 Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer 5

1.1.3 Chẩn đoán và phòng ngừa bệnh Alzheimer 6

1.1.4 Mối liên hệ giữa stress oxi hóa và bệnh Alzheimer 9

1.1.5 Vai trò của β-amyloid trong bệnh Alzheimer 10

1.2 Tổng quan về flavonoids và các nghiên cứu flavonoids từ thực vật 12

1.2.1 Tổng quan về flavonoids 12

1.2.2 Giá trị sinh học của flavonoids 15

1.3 Tổng quan về Hoa hòe (Sophora japonica L.) 19

1.3.1 Giới thiệu chung 19

1.3.2 Thành phần hóa học của cây hoa hòe 20

1.3.3 Công dụng của hoa hòe 21

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên liệu 23

2.1.1 Mẫu thực vật 23

2.1.2 Mẫu peptide 23

2.2 Hóa chất 23

2.3 Thiết bị thí nghiệm 23

2.3.1 Thiết bị tách chiết và xác định hợp chất 23

2.3.2 Thiết bị đánh giá khả năng bắt gốc tự do và giảm sự tích tụ peptide β-amyloid 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Phương pháp tách chiết 24

2.4.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng 25

2.4.3 Phương pháp sắc ký cột 26

2.4.4 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 28

2.4.5 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân 29

2.4.6 Phương pháp khối phổ 31

2.4.7 Phương pháp chuẩn bị mẫu β-amyloid và các dung dịch chất chuẩn, chất tinh sạch 32

2.4.8 Phương pháp bắt gốc tự do DPPH 33

2.4.9 Phương pháp thực nghiệm huỳnh quang Thioflavin T 35

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Phân lập và tinh sạch các hợp chất chính có trong dịch chiết 37

3.1.1 Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký bản mỏng 37

3.1.2 Tinh sạch các chất bằng phương pháp sắc ký cột 38

3.1.3 Tinh sạch chất bằng phương pháp sắc ký lỏng-lỏng 40

3.2 Xác định các hợp chất có trong phân đoạn chính 42

3.2.1 Xác định cấu trúc chất C2 42

3.2.2 Xác định cấu trúc chất C6 45

3.3 Đánh giá khả năng làm giảm sự tích lũy β-amyloid 52

3.3.1 Hoạt tính chống oxi hóa 52

3.3.2 Hoạt tính làm giảm sự tích tụ peptide β-amyloid 54

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả phân tách dịch chiết nụ hoa hòe bằng phương pháp sắc ký cột 38

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký bản mỏng các phân đoạn thu được sau khi chạy sắc ký cột 39 Bảng 3.3 Tổng kết các chất tinh sạch và cao khô thu được từ dịch chiết nụ hoa hòe 41 Bảng 3.4 Bảng so sánh giá trị peak của quercetin chuẩn với chất C2 43

Bảng 3.5 Thành phần nguyên tố của hợp chất C6 47

Bảng 3.6 Bảng so sánh giá trị peak của Neohesperidin chuẩn và chất C6 50

Bảng 3.7 Giá trị quét gốc tự do DPPH của các chất 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ minh họa quá trình tạo nên đám rối tơ thần kinh [4] 7

Hình 1.2 Mảng viêm thần kinh do sự tích tụ β-amyloid ở não bệnh nhân Alzheimer [2] 11

Hình 1.3 Cấu trúc vòng flavonoid 13

Hình 1.4 Cây hoa hòe 20

Hình 2.1 Sơ đồ minh họa cột sắc ký 27

Hình 2.2 Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ ESI-MS/MS 32

Hình 3.1 Kết quả sắc ký bản mỏng dịch chiết nụ hoa hòe 37

Hình 3.2 Các phân đoạn khác nhau sau khi chạy sắc ký cột 39

Hình 3.3 Kết quả sắc ký bản mỏng các chất C2 và C6 khi so sánh với quercetin và rutin chuẩn 40

Hình 3.4 Chất C6 41

Hình 3.5 Phổ 1H-NMR của quercetin chuẩn 42

Hình 3.6 Phổ 1H-NMR của C2 43

Hình 3.7 Công thức cấu tạo của chất C2 – quercetin 45

Hình 3.8 Phổ khối lượng ESI của chất C6 46

Hình 3.9 Phổ 1H-NMR của Neohesperidin chuẩn 48

Hình 3.10 Phổ 1H-NMR của chất C6 48

Hình 3.11 Phổ 13C-NMR của Neohesperidin chuẩn 49

Hình 3 12 Phổ 13C-NMR của chất C6 49

Hình 3.13 Cấu trúc hóa học của C6 – neohesperidin 51

Hình 3.14 Đồ thị đường chuẩn khả năng chống oxi hóa của vitamin C 52

Hình 3.15 Biểu đồ thể hiện sự tích lũy β-amyloid trong các điều kiện khác nhau 54

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DPPH 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

MS Mass Spectrometry – Phổ khối lượng

NMR Nuclear Magnetic Resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

MỞ ĐẦU

Nhờ sự tiến bộ của khoa học công nghệ và sự phát triển của kinh tế xã hội, cuộc sống của con người ngày càng được cải thiện Tuổi thọ trung bình của loài người tăng lên là một thành tựu đối với y tế công cộng và là kết quả của sự phát triển kinh tế, xã hội Tuy nhiên cũng gây thách thức về vấn đề chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cho một số lượng lớn người cao tuổi trong xã hội Tuổi già làm tăng nguy cơ phát triển các bệnh mạn tính và thoái hóa Một trong những bệnh mạn tính không lây nhiễm và thoái hóa thường gặp ở người cao tuổi là hội chứng sa sút trí tuệ (SSTT), trong đó bệnh Alzheimer chiếm tới 50-70%

Hiện nay tỉ lệ mắc SSTT tăng theo tuổi theo hàm số mũ rên toàn thế giới, theo báo cáo của Hiệp hội Alzheimer thế giới, có khoảng 50 triệu người mắc bệnh Alzheimer trong năm 2016, và ước tính sẽ lên đến khoảng 150 triệu người vào năm

2050 Sa sút trí tuệ thật sự là một thảm hoạ đối với người cao tuổi Bệnh gây suy giảm trí nhớ và nhiều lĩnh vực nhận thức khác, kèm theo với những rối loạn về hành vi, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng hoạt động và chất lượng sống của bệnh nhân Người mắc bệnh Alzheimer bị mất dần khả năng tự chăm sóc và ngày càng phụ thuộc vào người khác trong việc thực hiện các hoạt động thể chất và tinh thần cơ bản nhất Chi phí cho điều trị bệnh Alzheimer rất tốn kém, chỉ đứng sau các bệnh tim mạch và ung thư Vì vậy việc tìm ra các phương pháp phòng ngừa và chữa trị bệnh Alzheimer là

vô cùng cần thiết đối với xã hội hiện nay

Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú

với trữ lượng lớn, có nhiều tiềm năng về cây thuốc Cây hoa hòe (Sophora japonica L.)

là một loại cây được trồng phổ biến ở Việt Nam Cây vừa cho bóng mát, vừa cung cấp các giá trị khác đặc biệt về kinh tế và y học Hoa hòe là một vị thuốc được sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc y học cổ truyền từ xưa đến nay Mọi bộ phận của cây, đặc biệt là quả khô, hoa và chồi có giá trị rất lớn trong y học như nụ hoa hòe được dùng làm thuốc cầm máu cho các bệnh đổ máu cam, ho ra máu, ruột chảy máu, tiểu tiện ra

máu ở dạng thuốc sắc Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng thành phần flavonoids ở trong thực vật có khả năng giúp chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, và đặc biệt

là khả năng giảm sự tích lũy peptide β-amyloid – một loại peptide gây bệnh Alzheimer

Vì các lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ức chế hình

thành β-amyloid gây bệnh Alzheimer bởi một số hoạt chất từ hoa hòe (Sophora

japonica L.)” với mục đích:

 Tách chiết và tinh sạch các chất có hoạt tính sinh học từ nụ cây hoa hòe

 Đánh giá khả năng ngăn chặn sự tích tụ peptide β-amyloid in vitro từ một

số chất tách từ nụ hoa hoè

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về bệnh Alzheimer

1.1.1 Bệnh Alzheimer trên thế giới và Việt Nam

Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh, biểu hiện bằng giảm trí nhớ và những rối loạn nhận thức khác, kèm theo các thay đổi về hành vi, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động nghề nghiệp và xã hội của bệnh nhân Bệnh tiến triển nặng dần và không hồi phục

Bệnh do bác sĩ Alois Alzheimer phát hiện lần đầu năm 1901, ông là người đầu tiên mô tả lâm sàng và đặc điểm giải phẫu bệnh lý của bệnh bao gồm các búi tơ thần kinh (neurofibrillary tangles) và các mảng dạng tinh bột (amyloid plaque) Sau này bệnh được mang tên ông, gọi là bệnh Alzheimer [18]

Trước kia, bệnh Alzheimer thường được dùng chỉ các trường hợp SSTT với người ở độ tuổi 45-65 với những tổn thương mô học điển hình nên còn được gọi là SSTT trước tuổi già (presenile dementia) Còn khái niệm SSTT tuổi già (senile dementia) được xem là do quá trình lão hoá bình thường của não, chủ yếu do các mạch máu trong não bị “xơ cứng” trong quá trình lão hóa Từ những năm 70 – 80 của thế kỷ

XX, người ta thấy biểu hiện lâm sàng cũng như đặc điểm tổn thương giải phẫu bệnh tương tự ở người trẻ cũng như ở người già nên danh từ bệnh Alzheimer được dùng để chỉ các trường hợp có đặc điểm lâm sàng, tiến triển và giải phẫu bệnh điển hình, bất kể

ở lứa tuổi nào [23]

Tuổi càng cao, tỷ lệ mắc SSTT càng nhiều Cứ sau mỗi năm năm, tỷ lệ mắc bệnh của sa sút trí tuệ toàn bộ lại tăng gần gấp đôi, từ 1,5% ở độ tuổi 60-69 lên 40% ở

độ tuổi 90 Một nhóm chuyên gia đã ước tính tỷ lệ mắc bệnh toàn bộ của sa sút trí tuệ ở những người từ 60 tuổi trở lên trên toàn thế giới là 3,9%, Châu Phi là 1,6%, Đông Âu

là 3,9%, Trung Quốc 4,0%, Mỹ La tinh 4,6%, Tây Âu 5,4% và Bắc Mỹ 6,4% Trong các nguyên nhân gây sa sút trí tuệ, bệnh Alzheimer hay gặp nhất chiếm từ 50 đến 70%,

tiếp đến là sa sút trí tuệ do mạch máu từ 14 đến 25%, còn lại là các nguyên nhân khác [42]

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, hiện số người mắc SSTT trên toàn thế giới vào khoảng 50 triệu người Con số này ước tính sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030 (65,7 triệu) và tăng gấp hơn ba lần vào năm 2050 (115,4 triệu người) [60] Với xu hướng già hoá dân số, cứ sau mỗi khoảng hai mươi năm số người mắc sa sút trí tuệ sẽ tăng gấp đôi Mặc dù tỷ lệ mới mắc sa sút trí tuệ ở khu vực các nước phát triển cao hơn, nhưng đa số người bị sa sút trí tuệ sống ở các nước đang phát triển Trung Quốc

và các nước khu vực Tây Thái Bình Dương có số người mắc sa sút trí tuệ cao nhất (6 triệu người), tiếp theo là Cộng đồng Châu Âu (5 triệu), Hoa kỳ (2,9 triệu) và Ấn Độ (1,5 triệu) Tỷ lệ tăng số lượng bệnh nhân sa sút trí tuệ dao động rất nhiều theo vùng, ở các nước đang phát triển cao hơn các nước phát triển từ ba đến bốn lần Hậu quả là tỷ

lệ người bị sa sút trí tuệ ở các nước đang phát triển dự đoán sẽ tăng từ 61% (năm 2000) lên 65% (năm 2020) và 71% (năm 2040) Tình hình mắc bệnh Alzheimer cũng có bức tranh tương tự [7]

Ở Việt Nam, theo khảo sát của Bệnh viện Tâm thần tiến hành trên 258 người từ

65 tuổi trở lên được chọn ngẫu nhiên từ cộng đồng tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy

tỷ lệ mắc SSTT là 7,8% [3] Nghiên cứu của Bệnh viện Lão khoa Trung ương về tỷ lệ mắc và một số yếu tố liên quan đến SSTT ở người cao tuổi tại huyện Ba Vì, Hà Nội năm 2005 - 2006 cho thấy tỷ lệ người cao tuổi (từ 60 tuổi trở lên) sống tại cộng đồng

có SSTT là 4,63% Cứ sau mỗi khoảng cách 5 tuổi, tỷ lệ mắc bệnh lại tăng lên 1,78 lần [2, 5] Trong một nghiên cứu về một số đặc điểm dịch tễ học sa sút trí tuệ và suy giảm nhận thức nhẹ ở người cao tuổi Hà Nội (thực hiện trong giai đoạn 2009- 2010) cho thấy tỷ lệ người cao tuổi có sa sút trí tuệ tại xã Thanh Xuân huyện Sóc Sơn, Hà Nội là 5,1% trong tổng số 410 người cao tuổi, ở phường Phương Mai quận Đống Đa, Hà Nội

là 3,2% trong tổng số 556 người cao tuổi [7]

Tuy chưa có một điều tra mang tính đại diện cho thực trạng sa sút trí tuệ ở người cao tuổi tại Việt Nam nhưng qua một số nghiên cứu đã được tiến hành thì tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ và bệnh Alzheimer tại Việt Nam cũng tương tự như ở các nước khác trong khu vực

1.1.2 Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer biểu hiện bằng giảm trí nhớ và những rối loạn nhận thức khác, kèm theo các thay đổi về hành vi [4, 5]

 Giảm trí nhớ: là biểu hiện đầu tiên làm cho bệnh nhân và người nhà chú ý Đây

là triệu chứng đặc trưng nhất của bệnh Trong giai đoạn đầu chủ yếu giảm trí nhớ gần (không còn khả năng ghi nhận các thông tin mới), giảm khả năng hiểu ngữ nghĩa, nhắc đi nhắc lại một chi tiết Khi bệnh tiến triển nặng hơn, bệnh nhân quên cả những thông tin đã tiếp thu được từ trước, thậm chí quên tên người thân

 Mất ngôn ngữ (aphasia): Giảm ngôn ngữ là triệu chứng nổi bật trong bệnh cảnh lâm sàng của bệnh Alzheimer Bệnh nhân diễn đạt ý nghĩ của mình ngày càng khó khăn, ngôn ngữ nghèo nàn, không lưu loát, khó tìm từ, nói vòng vo, không hiểu hết lời nói của người đối diện, không thể tiếp xúc cùng lúc với nhiều người Trong giai đoạn muộn, bệnh nhân không nói gì, mất giao tiếp hoàn toàn gây khó khăn lớn cho mối quan hệ giữa bệnh nhân và người chăm sóc

 Mất sử dụng động tác (apraxia): Gần như tất cả bệnh nhân Alzheimer ở giai đoạn nặng đều có mất sử dụng động tác (apraxia) Hay gặp nhất là mất sử dụng động tác ý-vận (ideomotor apraxia), bệnh nhân không có khả năng chuyển một

ý định thành động tác có định hướng không gian chính xác, làm cho bệnh nhân khó thực hiện các hoạt động sinh hoạt hàng ngày

 Mất nhận biết (agnosia), mất khả năng tổng hợp suy luận và rối loạn chức năng thực hiện Bệnh nhân than phiền là không nhìn rõ đồ vật và vì vậy khó khăn trong việc xác định đồ vật đó Họ không thể sao chép hoặc miêu tả đồ vật một

cách chính xác, không thể phân biệt các đồ vật tương tự nhau, không thể nhận biết được tất cả các chi tiết của đồ vật, không thể nhận ra được đồ vật dưới các góc nhìn bất thường hoặc không thể phân biệt các hình chồng lên nhau… Bệnh nhân mất khả năng nhận mặt những người quen, mất khả năng nhận diện loài hoa, loại ô tô…

 Suy giảm khả năng thực hiện hoạt động: biểu hiện bằng không có khả năng quản lý các nhiệm vụ phức tạp như chi tiêu trong gia đình hoặc chuẩn bị bữa ăn

 Các triệu chứng về hành vi: là những biểu hiện lâm sàng quan trọng và đôi khi bệnh nhân đến khám vì những triệu chứng này: không thừa nhận bệnh, thờ ơ, rối loạn tâm thần (hoang tưởng, ảo giác), rối loạn cảm xúc (trầm cảm, lo âu), kích động,…

Biểu hiện lâm sàng điển hình của bệnh Alzheimer theo mức độ:

 Nhẹ: Trí nhớ giảm, có thể không rõ với những người thường xuyên tiếp xúc với bệnh nhân, không thực hiện được các hoạt động phức tạp (ví dụ chuẩn bị bữa

ăn, chi tiêu), vẫn tự chăm sóc được bản thân, tính tình trở nên thụ động, ít hoặc không có các biểu hiện về hành vi

 Trung bình: Trí nhớ giảm rõ, không thực hiện được các hoạt động thông thường (như sử dụng bếp, gọi điện thoại), không tự chăm sóc được bản thân (như tắm rửa, trang điểm), có rối loạn hành vi (hội chứng hoàng hôn, hoang tưởng hệ thống - paranoia), kỹ năng giao tiếp xã hội thay đổi, cần người giám sát

 Nặng: Trí nhớ giảm nhiều, chỉ còn những mảnh vụn, không nhận biết được người thân, không thực hiện được mọi hoạt động phức tạp, giảm vận động, cần

có người chăm sóc thường xuyên

1.1.3 Chẩn đoán và phòng ngừa bệnh Alzheimer

 Chẩn đoán

Xác định bệnh Alzheimer chỉ dựa trên giải phẫu bệnh học Hai tổn thương đặc trưng nhất của bệnh Alzheimer là mảng lão hóa và đám rối tơ thần kinh Các tổn

thương này thường xuất hiện trong não nhiều năm trước khi bệnh biểu hiện đầy đủ trên lâm sàng Ở các tế bào thần kinh bệnh lý xảy ra hiện tượng các vi ống tan rã, tức là các đơn vị vi quản tách rời nhau, hình thành nên đám rối tơ thần kinh (hình 1.1)

Hình 1.1 Sơ đồ minh họa quá trình tạo nên đám rối tơ thần kinh [4]

Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh hiện đại cũng được xem là có giá trị

hỗ trợ chẩn đoán các trường hợp có khả năng là bệnh Alzheimer (probable Alzheimer’s disease) Phương pháp chụp cộng hưởng từ (MRI) sọ não cũng giúp nhận dạng được tình trạng teo vỏ não thùy trong rãnh mũi và teo hồi hải mã ở bệnh nhân Alzheimer Các chụp hình hệ thần kinh như chụp cắt lớp phát điện tử dương (Positron Emission Tomography/PET) và chụp cắt lớp phát photon đơn (Single Photon Emission Tomography/SPECT) giúp cho thấy có hình ảnh của giảm chuyển hóa hay giảm tưới máu tại các vùng thái dương đỉnh phía sau

 Phòng ngừa: Có rất nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã và đang

cố tìm những biện pháp nhằm giảm, hạn chế các yếu tố nguy cơ:

 Liệu pháp hóc môn thay thế: Nhiều nghiên cứu trên thế giới cùng ghi nhận kết quả ở phụ nữ khi dùng liệu pháp thay thế hóc môn đều giảm được triệu chứng sa sút trí tuệ DHEA (dehydroepiandrosterone) là hóc môn dùng chống lão hóa ở

nữ có tác dụng làm giảm nguy cơ bệnh Alzheimer Ở nam giới thì liệu pháp thay thế bằng testosteron có hiệu quả tương tự như nữ giới [40]

 Thuốc kháng viêm không có thành phần steroid: Nhiều nghiên cứu cho thấy dùng các thuốc kháng viêm không có thành phần steroid sẽ chống lại sự tích tụ beta Amyloid trong não [24]

 Statin: đây là thuốc làm giảm cholesterol máu Một vài nghiên cứu cho thấy những người dùng statin giảm được 70% nguy cơ bị sa sút trí tuệ [20]

 Chế độ ăn uống

 Chất béo: Một nghiên cứu ở Hà Lan cho thấy có mối liên hệ giữa sa sút trí tuệ và chế độ ăn nhiều chất béo toàn phần, chất béo bão hòa và cholesterol Tuy nhiên mỡ dạng omega-3 có tác dụng chống lão hóa cho

tế bào não Người ta khuyến cáo năng lượng từ chất béo chỉ nên ở mức dưới dưới 30% tổng nhu cầu hàng ngày [46]

 Rau quả sậm màu: Nghiên cứu cho thấy các loại rau quả có mầu sẫm có tác dụng bảo vệ não chống lại sự lão hóa

 Đậu nành: Có chứa một thành phần giống estrogen; trên động vật thí nghiệm cho thấy có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh Alzheimer Đậu nành đặc biệt tốt cho phụ nữ sau mãn kinh [16]

 Rượu: Nếu dùng lượng vừa phải (một đến hai ly mỗi ngày) thì có tác dụng tốt bảo vệ não do kích thích phóng thích acetylchotine (chất dẫn truyền thần kinh bị khiếm khuyết trong bệnh Alzheimer [47]

 Folate và vitamin B12: có tác dụng làm giảm hemocysteine (chất làm tăng nguy cơ Alzheimer và bệnh tim mạch) [45]

 Vitamin chống oxi hóa: chủ yếu là vitamin E và C, chống sự giải phóng gốc tự do làm tổn thương tế bào.Vắc xin: Dùng vắc xin giúp kích thích

cơ thể tạo ra kháng thể đặc hiệu tiêu hủy các phân tử protein liên quan đến bệnh Alzheimer [37]

1.1.4 Mối liên hệ giữa stress oxi hóa và bệnh Alzheimer

Chuyển đổi năng lượng là một trong những quá trình rất cơ bản của cuộc sống Chuyển đổi năng lượng có từ khi bắt đầu sự sống thông qua các cơ chế đơn giản, ví dụ như việc dịch chuyển các ion trong màng bán thấm có mặt trong tất cả các sinh vật sống Sự chuyển đổi này là những phản ứng oxi hóa khử, trong đó các electron được truyền trong một chuỗi từ chất cho đầu tiên thông qua các chất trung gian để đến chất nhận cuối cùng

O2 + 4 e- + 4H+ → 2H2O

Ở người và các động vật, thường chất nhận cuối cùng là O2 Trong các phản ứng, một phần O2 bị khử để tạo ra O2-, H2O2 và ion OH-

Những chất trung gian này ẩn chứa nguy hiểm vì chúng hoạt động mạnh và do

đó khó kiểm soát (ví dụ như OH-), hoặc chúng là tiền chất dễ dàng hình thành các chất phản ứng không kiểm soát được ví dụ như O2•- + NO  peroxynitrite Các chất oxi hóa khử như O2•-, H2O2, HO• được gọi là các tác nhân oxi hóa (ROS) Các tác nhân oxi hóa được định nghĩa rộng rãi là các chất chứa oxy với khả năng phản ứng hóa học tích cực Sự sống trong môi trường hiếu khí và với O2 là chất nhận điện tử cuối cùng dẫn đến việc sản xuất ROS liên tục trong cơ thể Do tầm quan trọng của chuyển đổi năng lượng, hầu hết ROS có nguồn gốc từ chuỗi hô hấp và có khả năng gây nguy hiểm Vì vậy một số enzyme và các phân tử nhỏ tồn tại để kiểm soát mức ROS Nhìn chung, ROS được giữ ở mức thấp nhưng chưa loại bỏ được hoàn toàn Sự tích tụ nồng độ ROS quá cao là nguy hiểm và được xác định là stress oxi hóa

Xem xét vai trò trung tâm của oxy, các hệ thống sản xuất và loại bỏ ROS khác nhau, cách điều hòa các tác nhân này, sự stress oxi hóa được quan sát thấy trong vô số

các bệnh Đặc biệt, trong các bệnh thoái hóa thần kinh như Alzheimer và Parkinson, não bộ cho thấy sự tổn thương do oxi hóa và stress oxi hóa một cách rõ ràng Bộ não có thể đặc biệt nhạy cảm với stress oxi hóa do sự tiêu thụ oxy rất cao của não (chiếm 20% tổng lượng tiêu thụ cơ thể) Quá trình oxi hóa các phân tử sinh học trong bệnh Alzheimer chủ yếu liên quan đến các phân tử sinh học của màng tế bào thần kinh và làm gián đoạn tính toàn vẹn của màng tế bào Nó liên quan đến quá trình oxi hóa chất béo, protein và axit nuleic Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng stress oxi hóa đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học Alzheimer và có liên quan đến sự hiện diện của peptide β-amyloid (Aβ) [12]

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu đã cung cấp các bằng chứng về việc tăng các stress oxi hóa bao gồm:

 Tăng sắt, nhôm và thủy ngân trong não bệnh nhân Alzheimer, các ion này kích thích tạo gốc tự do

 Tăng lipid peroxide và giảm axit béo không bão hòa, tăng hydroxynonenal – một sản phẩm aldehyde của peroxi hóa lipid

4- Tăng sự xuất hiện các protein và tăng quá trình oxi hóa DNA

 Giảm chuyển hóa năng lượng và giảm cytochrome C oxidase

Nghiên cứu cho thấy rằng peptide β-amyloid có khả năng kích hoạt tạo thêm các gốc tự do Các bằng chứng gián tiếp hỗ trợ cho kết luận này xuất phát từ các nghiên cứu in vitro cho thấy gốc tự do là trung gian thoái hóa thần kinh và liên quan đến sinh bệnh học trong bệnh Alzheimer [61]

1.1.5 Vai trò của β-amyloid trong bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer được coi như một dạng thoái hóa amyloid – kết quả của quá trình biến đổi bất thường của protein tiền thân amyloid (APP), một protein xuyên màng

mà chức năng cho đến nay vẫn chưa được hiểu rõ Mảng viêm thần kinh (neuritic plaque) nằm ngoài tế bào, chủ yếu chứa amyloid, một chất liệu chứa protein và các yếu

tố tế bào (hình 1.2) Dạng amyloid lắng động trong não bệnh nhân Alzheimer là

β-amyloid (Aβ) Aβ là một peptid chứa các đoạn gồm 39-43 axit amin, được phân giải từ APP Quá trình phân giải APP là quá trình phân cắt protein trong màng liên quan đến 3 loại enzyme: α-, β- và γ- secretase Trước tiên APP bị cắt bởi α- hoặc β- secretase Sản phẩm của lần phân cắt đầu tiên được cắt lại 1 lần nữa nhờ γ- secretase Sảm phẩm thu được bao gồm 1 phân đoạn protein tan hình thành từ đoạn cắt α- γ- và 1 phân đoạn không tan tự kết tụ (Aβ40 và Aβ42) từ đoạn cắt β- γ- Đoạn protein vùng carboxyl còn lại từ quá trình biến đổi của APP di chuyển vào trong nhân và hoạt hóa sự biểu hiện các gen [11]

Hình 1.2 Mảng viêm thần kinh do sự tích tụ β-amyloid ở não bệnh nhân Alzheimer [2]

Aβ40 là dạng phổ biến nhất của Aβ trong dịch não tủy và huyết tương ở người Aβ42 kết tụ thành các sợi amyloid nhanh hơn so với Aβ40, Aβ42 có mặt ở cả những mảng lan tỏa mới hình thành cũng như những mảng viêm thần kinh đã hình thành đầy đủ [51] Aβ sợ có tính chất gây độc ở mức độ in vitro và in vivo [17] Sự lắng đọng của

Aβ cho phép tiên lượng trước các triệu chứng lâm sàng của bệnh Alzheimer Tổng hàm lượng Aβ trong vỏ não tăng lên trong quá trình tiến triển bệnh tương ứng với sự suy giảm nhận thức, và thường xuất hiện trước khi hình thành các đám rối tơ thần kinh [36] Điều này gợi ý rằng sự bất bình thường trong quá trình biến đổi từ APP đến Aβ

hoặc sự thoái hóa và phân giải của Aβ có thể là sự biến đổi hóa sinh đầu tiên của bệnh Alzheimer [35] Sự suy giảm các peptid Aβ cũng có thể góp phần dẫn tới trường hợp mắc Alzheimer thể muộn [27]

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng β-amyloid 1-42 cảm ứng quá trình stress oxi hóa và gây độc thần kinh thông qua các biểu hiện sau:

 Aβ1-42 gây ra oxi hóa protein: Khi thêm Aβ1-42 vào các neuron thần kinh dẫn đến sự tăng biểu hiện protein carbonyl và giảm sự sống sót của tế bào so với mẫu đối chứng [57, 62, 63]

 Aβ1-42 gây ra peroxi hóa lipid trong màng não: Thêm Aβ1-42 vào môi trường nuôi neuron hoặc màng synaptosomal dẫn đến sự hình thành 4-hydroxy-2-nonennal (HNE) hoặc isoprostanes, cả hai sản phẩm của peroxi hóa lipid [33, 34]

1.2 Tổng quan về flavonoids và các nghiên cứu flavonoids từ thực vật

1.2.1 Tổng quan về flavonoids

1.2.1.1 Khái niệm và nguồn gốc

Khái niệm: Là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong dược liệu nguồn gốc

thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa… Phần lớn các flavonoid có màu vàng (bắt nguồn từ flavus có nghĩa là màu vàng), tuy vậy, một số sắc tố xanh, tím đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn

cơ bản Flavonoid là hợp chất phenol có cấu trúc khung cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là hai vòng benzene A và B nối nhau qua dây có 3 carbon, nên thường được gọi

là C6-C3-C6 [19]

Nguồn gốc: Cũng giống vitamin C, các flavonoid được phát hiện bởi Albert

Szent-gyorgyi (1893-1986) Ông nhận giải Nobel năm 1937 với những khám phá quan trọng về đặc tính của vitamin C và flavonoid Trong quá trình phân lập vitamin C, Szent-Gyorgyi đã khám phá ra các flavonoid Ban đầu ông gọi chất này là “vitamin P”,

do có khả năng làm giảm tính thấm thành mạch của nó, một trong những triệu chứng

thường gặp của bệnh Scurvy do thiếu vitamin C Sau này ông đã công bố bệnh Scurvy xảy ra không chỉ do thiếu vitamin C mà còn do thiếu flavonoid Tuy nhiên vì flavonoid không có đầy đủ tính chất của một vitamin nên sau này người ta bỏ tên vitamin P Giống như hầu hết các vitamin và khoáng chất, flavonoid là một chất cần thiết cho cơ thể người [19]

1.2.1.2 Phân loại và tính chất

Phân loại: thường các flavonoid mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và

7 trên nhân A và vị trí 3,4,5 trên nhân B Các flavonoid có thể hiện diện dưới dạng tự

do hoặc dạng glycoside Các đường thường gặp nhất là glucose, kế đó là galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và acid uronic Các flavonoid được phân thành nhiều nhóm với cấu trúc cơ bản khác nhau, dựa vào việc sinh tổng hợp Có nhiều cách phân loại khác nhau, cách phân loại thường dùng là dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxi hóa của mạch 3C

D-Hình 1.3 Cấu trúc vòng flavonoid

 Euflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2 Trong phân nhóm này gồm các nhóm phụ: flavan, flavan 3-ol (catechin), flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, anthocyanidin, flavanone, flavone, flavonol, 3-hydroxy flavanon, chalcon, dihidrochalcon, aurone

 Isoflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3 Trong phân nhóm này gồm các nhóm phụ: iso flavan, iso flavan-4-ol, isoflavon, isoflavanon, rotenoid…Thường gặp nhất là isoflavon trong cây họ đậu

 Neoflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4 Chỉ giới hạn trong một số cây gồm các nhóm phụ 4-aryl-chroman, 4-aryl-coumarin, dalbergion

Tính tan: aglycon kém tan trong dung môi kém phân cực (hexan, benzen, ether

dầu hỏa), tan trong dung môi phân cực vừa và mạnh (ethyl acetate, dimethyl ether, methanol, ethanol), tan trong kiềm loãng, kém tan trong dung dịch acid Glycoside: tan trong ethanol, methanol Các glycoside càng có nhiều nhóm đường và mạch đường càng dài thì tan tốt trong nước nóng Các flavonoid glycoside có nhóm -OH tại vị trí C7 còn tan được trong dung dịch NaOH, Na2CO3, NaHCO3 do có tính axit Các flavonoid dạng aglycon thường dễ kết tinh, trong khi các glycoside thường khó kết tinh hơn [19]

Màu sắc: Các flavonoid thường có màu Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu

cam; flavonol có màu vàng đến vàng nhạt; chalcon có màu vàng đến cam đỏ Các isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycosid: pelargonidin, cyanidin, delphinidin…tạo màu xanh dương, đỏ, tím cho hoa và trái

Các flavonoid dễ tạo muối tan trong nước với các hydroxyd kiềm, nhạy cảm với

pH, nhiệt độ và ánh sáng Có khả năng tạo phức với các ion kim loại cho sản phẩm có màu đặc trưng

Hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen và vòng pyron làm cho flavonoid có khả năng hấp thụ tia tử ngoại Thường thu được 2 dải hấp thu cực đại, dải

1 có λmax = 320 - 380 nm, dải 2 có λmax = 240 - 280 nm [19]

1.2.1.3 Phân bố, tổng hợp và vai trò của flavonoids trong thực vật

Flavonoids là các chất chuyển hóa thứ cấp có trọng lượng phân tử thấp được sản xuất bởi thực vật và thường được miêu tả là không cần thiết cho sự sống còn của thực vật, không giống như các chất chuyển hóa chính Các sản phẩm thứ cấp có hoạt tính sinh học theo nhiều cách, và hơn 10000 biến thể cấu trúc của flavonoids đã được báo cáo Sự tổng hợp của chúng phổ biến ở thực vật và phát triển sớm trong quá trình tiến hóa của thực vật, trợ giúp thực vật bằng cách bảo vệ hoặc tín hiệu Do tính chất vật lý

và sinh hóa của chúng, flavonoids cũng có thể tương tác với nhiều các mục tiêu đa

dạng để tham gia hoạt động trong vi khuẩn, thực vật và động vật Chúng đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh mức độ gốc oxi hóa (ROS) trong các mô thực vật, ảnh hưởng đến sự vận chuyển auxin và cung cấp màu sắc cho các mô khác nhau của thực vật bao gồm hoa [31]

Con đường sinh tổng hợp flavonoids đã được nghiên cứu khá rõ ràng, so sánh với các con đường sinh tổng hợp khác của các hợp chất thứ cấp Flavonoids được tổng hợp thông qua con đường chuyển hóa phenylpropanoid hoặc acetate-malonate, đã được nghiên cứu trên mô hình Arabidopsis Ở thực vật bậc cao, flavonoids được tổng hợp khi phức hợp enzym được hình thành ở phía ngoài của tế bào nội chất lưới, và sau đó được cố định ở tonoplast để glycosyl hóa và lưu trữ trong không bào Trong các mô cụ thể, flavonoids được tổng hợp và tích lũy ở các ô riêng biệt Tiểu phần flavonoid đã được tìm thấy trong nhân, không bào, thành tế bào, màng tế bào và tế bào chất

Trong khi flavonoid glycosides được lưu trữ trong không bào không thể hiện vai trò tích cực thì aglycone lại thể hiện chức năng trong tế bào chất, ví dụ điều hòa hoạt động enzyme, hình thành các phản ứng oxi hóa, vận chuyển auxin Sự tích lũy flavanol thường được tìm thấy trong nhân, đặc biệt là trong thực vật hạt trần Vai trò của chúng

có thể bao gồm sự điều hòa biểu hiện gen thông qua tái tạo chromatin và ảnh hưởng lên các phức hợp protein và enzyme Trong các mô rễ, flavonoids có thể tích lũy ở gốc rễ

và trong các tế bào gốc từ nơi chúng có thể được tiết ra hoặc trút vào đất Flavonoid cũng được cố định trong các loại tế bào cụ thể của rễ và có thể nghiên cứu bằng hình ảnh huỳnh quang Flavonoids được sản xuất ở rễ đóng vai trò trong báo hiệu cho vi khuẩn và thực vật, cũng như bảo vệ cây khỏi các mầm bệnh từ đất [31]

1.2.2 Giá trị sinh học của flavonoids

1.2.2.1 Hoạt tính chống oxi hóa

Gần đây, các hợp chất flavonoid đã được coi là chất chống oxi hóa mạnh mẽ và được chứng minh là chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và carotenoids Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hoãn, ức chế hoặc ngăn chặn quá trình oxi

hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa Stress oxi hóa là một trạng thái mất cân bằng do số lượng gốc tự do sản sinh quá nhiều vượt qua khả năng chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến quá trình oxi hóa của một loại đại phân tử sinh học, như các enzyme, protein, DNA và lipid Stress oxi hóa là nguyên nhân quan trọng trong sự phát triển của các bệnh thoái hóa mãn tính bao gồm bệnh mạch vành tim, ung thư và lão hóa [14]

Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể được giải thích dựa vào các đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng:

 Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp chúng có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do

 Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp chúng có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxi hoạt động và các gốc tự do

 Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như catechol…giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động Quá trình chống oxi hóa của flavonoid chủ yếu theo 3 cơ chế sau [1]:

 Khử và vô hoạt các gốc tự do nhờ thế oxi hóa khử thấp: các hợp chất flavonoid nhờ thế oxi hóa khử thấp nên có thể khử các gốc tự do bằng cách nhường ngyên tử hidro hoặc một electron cho gốc tự do

 Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách liên kết với các ion kim loại vi lượng tham gia vào quá trình sản xuất các gốc tự do

 Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzyme tham gia vào quá trình sản xuất các gốc tự do

1.2.2.2 Tác dụng ức chế vi sinh vật, chống viêm nhiễm

Trong các năm gần đây, các bằng chứng dịch tễ học cho thấy rằng hấp thu thức

ăn có nguồn gốc từ thực vật giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính Cộng đồng các

nhà khoa học đã đưa ra nhiều bằng chứng về các tác dụng chống viêm của flavonoids trong ống nghiệm hoặc trong mô hình tế bào Cơ chế của phản ứng chống viêm này liên quan đến sự ức chế tổng hợp và hoạt động của các chất trung gian gây viêm như eicosanoids, cytokine, các phân tử bám dính và các protein phản ứng C [53]

Dịch chiết flavonoid từ quả mơ cho thấy khả năng ức chế đối với sự phát triển

của Staphylocooccus aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Candida albicans với

đường kính vòng ức chế tương ứng là 23, 21, 26 và 29 mm [8] Kết quả tương tự đối

với dịch chiết flavonoid của cây diếp cá trên sự phát triển của E.coli, P aeruginosa,

B.subtilis và S.aureus với giá trị MIC lần lượt là 100, 200, 200 và 50 μg/ml [44]

Quercetin làm giảm đáng kể tình trạng viêm nhiễm và sự peroxyd lipid gây ra bởi

Helicobacter pylori trong niêm mạc dạ dày của chuột bạch [50]

1.2.2.3 Tác dụng đối với enzym

17 loại flavonoids thuộc năm loại cấu trúc cho thấy khả năng ức chế hoạt động của ACE (enzyme chuyển đổi angiotensin), đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa huyết áp động mạch Khả năng ức chế của chúng dao động từ 17 đến 95% ở 500 μM

và từ 0 đến 57% ở 100 μM Các giá trị IC50 đối với luteolin, quercetin, rutin, kaempferol, rhoifolin và apigenin K lần lượt là 23, 43, 64, 178, 183 và 196 μM Nghiên cứu cho thấy mối liên hệ giữa cấu trúc khung flavonoids và hoạt động của chúng phụ thuộc vào nhóm catechol trong vòng B, liên kết đôi giữa C2 và C3 tại vòng C và nhóm cetone trong C4 tại vòng C [66]

Dẫn xuất 6-hydroxy luteolin của luteolin có thể ức chế sự hoạt động của glucosidase đến 92% ở nồng độ 500 μM [6] Một số flavonoid cũng đã cho thấy hoạt tính ức chế đối với xanthine oxidase, enzyme xúc tác cho sự oxi hóa xanthine và hypoxanthine thành axit uric [21]

α-Kaempferol, quercetin, myricetin và rutin trong flavonol ức chế phản ứng hyaluronidase đặc biệt, trong khi apigenin, luteolin, baicalin và baicalein trong flavon cho thấy sự ức chế đặc hiệu đối với phản ứng collagenase Quercetin và luteolin cho

thấy các hoạt động ức chế mạnh nhất trên 15 ‐ lipoxygenase (LOX), và quercetin cho thấy sự ức chế tương đối mạnh trên phản ứng cyclooxygenase-1 (COX-1) Nghiên cứu

đã chỉ ra các flavonoids này thể hiện hoạt tính chống lại các enzyme viêm rất tốt [28]

1.2.2.4 Tác dụng đối với các bệnh tim mạch, tiểu đường

Tác động bảo vệ của các flavonoid đối với tim mạch có thể do khả năng của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng ngừa xơ vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp Năm 2012, Arranz S và cộng sự đã chỉ ra mối liên hệ giữa việc tiêu thụ polyphenols/flavonoids giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim [9] Hấp thu 10 mg flavonol và 500 mg flavonoids một ngày giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch [58] và bệnh tiểu đường [56] là 5%

Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid có vai trò như chất kích thích insulin hay có chức năng tương tự như insulin; ngoài ra chúng còn có sự ảnh hưởng đến hoạt động của các enzyme trong quá trình chuyển hóa đường [21] Năm

2015, Ramachandran và cộng sự đã chỉ ra cơ chế của flavonoids trong điều trị tiểu đường bao gồm tăng tiết insulin, giảm apoptosis và thúc đẩy sự phát triển của tế bào tụy, giảm sự kháng lại insulin, viêm và stress oxi hóa trong cơ và thúc đẩy các con đường chuyển hóa khác nhau [43]

1.2.2.5 Tác dụng đối với ung thư

Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hợp chất flavonoid, gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in vitro và in vivo của flavonoid lên các dòng tế bào ung thư khác nhau Quercetin có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thu tuyến tụy, chế độ ăn bổ sung quercetin cũng có tác dụng làm giảm khả năng phát triển của các khối u [34] Quercetin có khả năng tương tác với DNA, bắt giữ tế bào và giảm khối u thông qua hoạt hóa con đường apoptosis [54]

Naringenin và kaempferol-3-O- (2”, 6”-di-O-p-trans-coumaroyl) glucoside thu

nhận từ hoa của cây Melastoma malabathricum L cũng đã được tìm thấy là có khả

năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư vú MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,28 μM và 1,3 μM [35]

Một trong những cơ chế quan trọng nhất mà flavonoids có thể tác động là thông qua tương tác của chúng với enzym chuyển hóa giai đoạn I (ví dụ cytochrome P450), kích hoạt một số lượng lớn các chất gây ung thư để kích hoạt lại các chất trung gian tương tác với nucleophiles tế bào và cuối cùng là gây ung thư Flavonoids ức chế hoạt động của một số isozyme P450, chẳng hạn như CYP1A1 và CYP1A2 (đóng vai trò kích hoạt chất gây ung thư) Một cơ chế hoạt động khác là cảm ứng enzyme chuyển hóa pha II (ví dụ GST, quinone reductase và UDP-GT), do đó các chất gây ung thư được giải độc

và lại bỏ khỏi cơ thể [32]

1.3 Tổng quan về Hoa hòe (Sophora japonica L.)

1.3.1 Giới thiệu chung

Phân loại khoa học

Giới (regnum): Plantae

(không phân hạng): Angiospermae

(không phân hạng): Eudicots

(không phân hạng): Rosids

Bộ (ordo): Fabales

Họ (familia): Fabaceae

Phân họ (subfamilia): Faboideae

Tông (tribus): Sophoreae

Chi (genus): Styphnolobium

Loài (species): S japonicum

Danh pháp hai phần

Styphnolobium japonicum

Hoa hòe là thực vật thân gỗ, cao 6 – 10 m, sữa lâu năm Thân thẳng, chỏm lá tròn, cành cong queo, lá kép long chim lẻ, mọc so le, mỗi lá có 1 – 17 lá chét Hoa nhỏ, cụm hoa hình chùy ở đầu cành, tràng hoa hình bướm màu trắng ngà, đài hoa hình chuông, màu vàng xám Quả hòe loại đậu, không mở, dày và thắt nhỏ lại ở giữa các hạt Nụ hoa hình trứng, có cuống nhỏ, ngắn, một đầu hơi nhọn, dài 3 - 6mm, rộng 1 - 2mm màu vàng xám (Hình 1.4)

Hoa chưa nở dài từ 4 - 10mm, đường kính 2 - 4 mm Cánh hoa chưa nở màu vàng, mùi thơm, vị hơi đắng Hòe trồng cây lấy nụ hoa và quả làm thuốc chữa được nhiều bệnh, song chủ yếu dược liệu dùng nụ hoa [48]

Cây hòe phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc, trong đó trồng nhiều ở Thái Bình, tập trung ở các huyện Thái Thụy, Vũ Thư Cây cũng được trồng ở các tỉnh Tây Nguyên làm cây bóng mát

Hình 1.4 Cây hoa hòe

1.3.2 Thành phần hóa học của cây hoa hòe

Chi Sophora giàu alkaloid và flavonoid Khoảng 153 hợp chất hóa học, bao gồm flavonoids, isoflavonoids, triterpenes, alkaloid, polysaccharides, amino acid và các hợp

chất khác, đã được phân lập từ lá, cành, hoa, chồi, và hoa quả của S japonica [22]

Trong số các chất chuyển hóa thứ cấp này, flavonoids và isoflavonoids được coi là thành phần có hoạt tính sinh học chính của các loại thuốc phổ biển hiện nay, thể hiện hiệu ứng dược lý khác nhau Các flavonoid chủ yếu được tìm thấy trong hoa và chồi

của S japonica, trong khi isoflavonoid glycosides có trong quả và hạt

Cho đến nay, ngoài các hợp chất kể trên, chỉ rất ít các hợp chất hóa học khác

được tìm thấy trong Sophora japonica, khoảng 14 loại axit amin được tìm thấy trong

quả của cây hoa hòe, bao gồm: Lysine, asparagine, arginine, serine, aspartic acid, glutamic acid, threonine, alanine, proline, tryptophan, valine, phenylalanine, leucine,

and isoleucine [29]

1.3.3 Công dụng của hoa hòe

Theo đông y, hoa hòe có vị đắng, tính bình (còn quả vị đắng tính hàn) Do có nhiều tác dụng sinh học và dược lý, từ lâu hoa hoè đã được sử dụng làm thuốc Mọi bộ phận của cây, đặc biệt là hoa quả khô, hoa và chồi có giá trị rất lớn trong y học Trong dân gian, hoa hòe được dùng làm thuốc cầm máu cho các bệnh đổ máu cam, ho ra máu, ruột chảy máu, tiểu tiện ra máu với liều lượng từ 5-20g mỗi ngày ở dạng thuốc sắc

Dựa trên bằng chứng về việc sử dụng phổ biến hoa hòe trong dân gian, các nhà khoa học đã tiến hành các nghiên cứu lâm sàng hiện đại để xác định các hoạt tính sinh học này Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid và isoflavonoid chi phối hoạt tính

sinh học chính của S japonica, như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống

loãng xương, chống oxi hóa, triệt tiêu, hạ huyết áp, chống nôn, chống ung thư, và tác dụng cầm máu [22] Tác dụng của dịch chiết hoặc hợp chất có hoạt tính sinh học được phân lập từ hoa hòe đã được thí nghiệm trên một số mô hình động vật cũng như nghiên

cứu in vitro

In vitro, dịch chiết ethanol của hoa hòe thể hiện hoạt tính chống viêm đáng kể

bằng cơ chế ức chế sản xuất NO và TNF-α trong mô hình đại thực bào RAW 264,7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,06 và 0,18 mg/ml [64] Dịch chiết trong ethyl acetate thể hiện

hoạt tính kháng khuẩn E coli và K pneumoniae với giá trị ức chế tối thiểu (MIC) lần

lượt là 125 và 120 µg/ml Đồng thời dịch chiết ethyl acetate còn thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh và khả năng quét gốc tự do mạnh nhất với RC50=3,13 µg/ml [38]

Loãng xương là một căn bệnh do thiếu hormone, đặc biệt là ở phụ nữ mãn kinh Nghiên cứu in vivo chỉ ra rằng, dịch chiết nước nóng của hoa hòe với liều dùng 0,556

g/kg/ngày trong 8 tuần đã cải thiện tăng diện tích xương thắt lưng của chột OVX [55]

Wang và cộng sự đã chứng minh rằng sử dụng flavonoids từ hoa hòe theo đường uống với liều 40, 80 và 120 mg/kg mỗi ngày trong 6 tuần có thể giảm cholesterol tổng số, triglyceride và lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL-C) và tăng lipoprotein tỉ trọng cao (HDL-C) trong máu ở những con chuột có hàm lượng mỡ máu

cao [59]

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thuốc nhuộm peptide Thioflavin T (Sigma-Aldrich Mỹ)

Các chất chuẩn: Quercetin (WAKO, Nhật Bản), Rutin (WAKO, Nhật Bản), Neohesperidin (WAKO, Nhật Bản), Quercetin chuẩn (Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, Việt Nam), Rutin (Trung Quốc)

Các muối Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl được cung cấp bởi Merck, Đức

Các hoá chất còn lại đảm bảo độ tinh khiết cho phân tích

2.3 Thiết bị thí nghiệm

2.3.1 Thiết bị tách chiết và xác định hợp chất

 Máy cô quay chân không (Eyela, Nhật Bản)

 Máy đo pH (Horiba, Nhật Bản)

 Tủy sấy (Memmert, Đức)

 Máy vortex (Ika, Đức)

 Cân phân tích (Shimadzu, Nhật Bản)

 Cột chạy sắc kýNhật Bản)

 Đèn tử ngoại hai bước sóng 245 nm và 368 nm (Trung Quốc)

 Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân có độ phân giải siêu cao (JEOL, Nhật Bản)

 Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân bán rắn JNM-ECA50 (JEOL, Nhật Bản)

 Thiết bị đo phổ khối lượng LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher Scientific, Mỹ)

2.3.2 Thiết bị đánh giá khả năng bắt gốc tự do và giảm sự tích tụ peptide amyloid

β- Máy đọc tín hiệu huỳnh quang

 Máy đo UV/VIS (Bionate, Anh)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp tách chiết

Nguyên lý: Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra

khỏi các mô thực vật Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật có độ phân cực khác nhau, vì vậy dung môi dùng cho các quá trình chiết được lựa chọn với các đặc điểm là dễ thấm vào dược liệu, hòa tan chọn lọc (hòa tan nhiều hoạt chất, ít tạp chất), dễ dàng bay hơi khi cần cô đặc dịch chiết và có tính trơ về mặt hóa học Về nguyên tắc, để chiết được các chất phân cực (Flavonoids, alkaloids, glycoside…) thì phải sử dụng các dung môi phân cực Qua khảo sát một số dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexane, ethyl actate, ethanol, methanol, dung môi methanol được chọn làm dung môi chiết do đáp ứng đầy đủ các yêu cầu nêu trên

Mục đích: Tách chiết, thu các thành phần chính từ nụ hoa hòe khô bằng phương

pháp ngâm chiết Với mục đích này, chúng tôi không tiến hành nghiền nhỏ nụ hoa hòe

để tránh việc thu quá nhiều tạp chất trong quá trình chiết

Quy trình:

 10 g nụ hoa hòe khô được ngâm chiết trong bình tam giác với 100 ml dung môi methanol, tỉ lệ mẫu/dung môi là 1:10 (đảm bảo khả năng chiết các hợp chất chính) trong 24 giờ, thỉnh thoảng lắc đều để tăng sự khuếch tán

 Lọc thu dịch chiết bằng giấy lọc Whatman và phễu lọc, loại bỏ bã, thu được dịch chiết methanol nụ hoa hòe khô

 Cất quay dung môi methanol có trong dịch chiết với hệ thống cô quay chân không Eyela – Nhật Bản, nhiệt độ 70oC, tốc độ quay 400 vòng/phút cho đến khi thu được cao khô Làm khô cao bằng khí N2 lỏng Lưu trữ cao khô này trong bình thủy tinh ở 4oC

Đánh giá kết quả: Tiến hành cân khối lượng cao khô thu được, so sánh với khối

lượng nụ hoa hòe khô mang đi chiết xuất thu được tỉ lệ cao khô/nguyên liệu

2.4.2 Phương pháp sắc ký bản mỏng

Nguyên tắc: Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography - TLC) là kỹ thuật

sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp Phương pháp sắc ký bản mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxit hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn theo tỉ lệ thích hợp Trong quá trình di chuyển các chất trong mẫu thử được di chuyển qua lớp mỏng, theo chiều của pha động, tuy nhiên di chuyển với tốc độ khác nhau Sau quá trình ta thu được một sắc ký đồ bản mỏng Cơ chế của sự chia tách là hấp thụ, phân bố trao đổi ion, sàng lọc phân tử, hay sự phối hợp của nhiều cơ chế tùy vào tính chất của pha tĩnh và dung môi của pha động

Mục đích: Dựa vào sự phân tách khác nhau của các chất trên bản TLC, xác định

số lượng các hợp chất có trong dịch chiết Đồng thời, định hướng xác định nhóm hợp chất dựa vào màu sắc quan sát được dưới bước sóng 365 nm, cũng như màu sắc các hợp chất khi sử dụng thuốc thử Vanillin và AlCl3,

Quy trình:

 Sử dụng ống mao quản, chuyển dịch chiết methanol lên bề mặt bản silica gel kích thước 36 cm Cố định độ dài đường chạy trên bản silica gel là 4,5 cm

 Chuẩn bị 5 ml hỗn hợp dung môi khai triển, ổn định trong bình khai triển trước

30 phút để đảm bảo bão hòa dung môi Hỗn hợp bao gồm ethyl acetate/axit acetic/ethanol với tỉ lệ 4/1/1,

 Đặt bản silica gel vào bình khai triển, đậy nắp, đợi đến khi dung môi chạy hết

độ dài đường chạy thì lấy bản silica gel ra, để khô

 Quan sát các băng chất trên bản silica gel trong điều kiện thường, dưới bước sóng dài 365 nm, sau khi phun thuốc thử Vaniline và thuốc thử AlCl3

Đánh giá kết quả: Xác định hệ số di chuyển - giá trị Rf của từng chất dựa vào tỉ lệ

độ dài đường chạy của chất với độ dài đường chạy của dung môi Từ giá trị Rf xác định được, so sánh với giá trị Rf của các chất chuẩn Quercetin và Rutin

Xác định nhóm chức có thể có trong các hợp chất dựa vào màu sắc khi quan sát được dưới các điều kiện: ánh sáng thường, bước sóng 365 nm, sau khi phun thuốc thử

2.4.3 Phương pháp sắc ký cột

Nguyên tắc: Sắc ký cột là phương pháp sắc ký được sử dụng để phân lập một

hợp chất hóa học đơn lẻ từ hỗn hợp dựa trên sự hấp phụ khác nhau Các hợp chất di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau, cho phép chúng được tách thành các phân đoạn Tương tự sắc ký bản mỏng, sắc ký cột bao gồm pha động và và pha tĩnh Pha tĩnh là các loại chất hấp phụ khác nhau (thường là silica gel SiO2 hoặc alumina Al2O3) được nhồi vào cột thủy tinh thẳng đứng, pha động – dạng lỏng, được rót vào từ trên đỉnh cột

và chảy xuống dưới cột nhờ tác dụng của trọng lực hoặc của áp suất bên ngoài, là hệ các dung môi dùng để rửa giải (hình 2.1) Kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi vì tính

đa dạng của chất hấp phụ (pha thường, pha đảo) và các loại dung môi Ưu điểm chính của sắt ký cột là chi phí tương đối thấp và dễ thao tác

Hình 2.1 Sơ đồ minh họa cột sắc ký Mục đích: Tách hỗn hợp cao chiết methanol thành các phân đoạn khác nhau

trong các hệ dung môi, tiến hành tinh sạch để thu được các hợp chất

Quy trình:

 Chuẩn bị hệ dung môi để chạy cột, thể tích mỗi hệ là 200 ml, bao gồm:

 Hệ dung môi 1: n- hexane/ethyl acetate với tỉ lệ 5/5

 Hệ dung môi 2: n-hexane/ethyl acetate với tỉ lệ 2/8

 Hệ dung môi 3: ethyl acetate 100%

 Hệ dung môi 4: ethyl acetate/ethanol với tỉ lệ 5/5

 Hệ dung môi 5: ethanol 100%

 Hệ dung môi 6: ethanol/nước với tỉ lệ 8/2

 Cân 30g silica gel, hòa cùng hệ dung môi 1, để ổn định trong 30 phút