Nghiên cứu biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp của virus dengue typ 1 để chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán sốt dengue sốt xuất huyết dengue

b, Chẩn đoán nguyên nhân Có thể thể hiện mầm bệnh trong máu và huyết thanh bằng phương pháp phân lập virus, xác định kháng nguyên virus bằng các phương pháp miễn dịch hoặc phát hiện bộ g

N<^uijịưv Ttu' K at K a

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

KHOA SINH HỌC

NGUYỄN THỊ HẢI HÀ

N G H IÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN

PRO TEIN TÁ I TỔ HỢP CỦA VIRUS D ENG UE TYP 1

Chuyên ngành : Di truyền học

LUẬN VĂN THẠC s ĩ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS ĐINH DUY KHÁNG

L Ờ I CẢM ƠƯI

Em xin bảy tố lòng b iết ơn sâu sắc tỏi PGỖ.TỒ Dinh Duy Kháng-

Phòng Vi sinh vật học phân tử- Viện Công nghệ ổinh học- Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã tận tinh giúp đõ và hướng dẫn em hoàn thảnh

luận văn này

Trong thòi gian nghiên cứu em dã nhận dược sự giúp đõ nhiệt tình của

các anh chị công tác tại phòng Vi sinh vật học phân tử, dặc biệt là sự giúp dõ

của CN Phạm Minh Tuấn Nhân dịp này em cũng xin cảm ơn những giúp dơ quý

báu dó

Em cũng xin dược gửi lòi cảm ơn dến các thầy cô giáo trong bộ môn

Di truyền học, các thầy cô giáo trong khoa ỗinh học- Dại học Khoa học tự nhiên

- Dại học Quốc gia Hà Nội dã tận tỉnh dạy dỗ trong thòi gian qua

Cuối cùng xin chân thành cảm ơn gia dinh, bạn b è đã luôn ỏ bên tôi,

dộng viẻn vồ giúp đõ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 27 tháng 12 năm 2 0 0 6

Học viên

Nguyễn Thị Hải Hà

Base pair (Cặp bazo)Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò)Deoxynucleotide

Ethylen diamin tetraacetic acidEnzyme Linked Immunosorbent AssayEthidium bromide

Dengue shock syndrome (hội chứng sốc dengue) Isopropyl- beta- D- thiogalactopyranoside

Kilo DaltonMôi trường Lauria Betanin Optical density (mật độ quang)Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Precursor membrane envelope

Dengue fever (sốt dengue)Dengue hemorrhagic fever (sốt xuất huyết dengue) Sodium Dodecyl Sulfate

Tris- Acetate- EDTA Tris- EDTA

World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)5’- bromo- 4-chloro-3-indolyl- galactopyranoside

MỤC LỤC

M Ở Đ Ầ U 1

C h ư ơ n g 1 TỔ NG QUAN TÀI L I Ệ U 3

1.1 Bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue (SD /SX H D ) 3

1.1.1 Tinh hình dịch b ệ n h 3

1.1.2 Tình hình mắc bệnh trên thế g iớ i 4

1.1.3 Muỗi Aedes aegypti 6

1.1.4 Triệu chứng và chẩn đ o án 8

1.1.5 Điều trị và phòng chống 14

1.2 Virus dengu e 18

1.2.1 Cấu trúc và thành phần 18

1.2.2 Genome của vứus dengue 19

1.2.3 Chu trình nhân lên và cơ chế gây bệnh của virus dengue 21

1.2.4 Đặc điểm kháng nguyên 23

1.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli 23

1.3.1 Chủng E.colỉ biểu hiện protein tái tổ h ợ p 23

1.3.2 Hệ thống pET vector 25

C h ư ơ n g 2 Đ Ố I TUỢNG VÀ PHUƠNG PH Á P N G H IÊN C Ứ U 27

2.1 Đối tượng 27

2.2 Vật liệu 27

2.2.1 Sinh phẩm 27

2.2.2 Hoá c h ấ t 27

2.2.3 Trang thiết b ị 27

2.2.4 Môi trường và dung dịch dùng trong thí nghiệm 28

2.3 Phương p h áp 32

2.3.1 Phương pháp khuyếch đại gen bằng P C R 32

2.3.2 Phương pháp tạo dòng 32

2.3.3 Phương pháp giải trình tự g e n 35

2.3.4 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện trong 36

2.3.5 Phương pháp điện di trên gel agarose 1% 37

2.3.6 Phương pháp biểu hiện gen trong E co li 38

2.3.7 Phương pháp điện di trên gel polyacrilamide 38

2.3.8 Phương pháp tinh sạch protein tái tổ họp bằng cột ái lực Ni2+ 40

2.3.9 Phương pháp Western b lo t 41

2.3.10 Phương pháp Dot blot 43

2.3.11 Phương pháp ELISA 43

C h ư ơ n g 3 K Ế T QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Khuyếch đại đoạn gen E3 bằng cặp mồi biểu hiện 45

3.2 Kết quả tách chiết plasm id 47

3.3 Kết quả cắt kiểm tra dòng plasmid tái tổ họp bằng enzym giới hạn B am ĩíI và X h o1 49

3.4 Tinh sạch plasmid tái tổ h ợ p 50

3.5 Thôi gen đoạn E3 và vector pET-TRX-FuS-E3 xử lý bằng B a m ỉiI và X h o1 51

3.6 Trình tự axit amin của vùng D 1E 3 52

3.7 Chọn dòng plasmid tái tổ hợp pET-TRX-FuS-E3 53

3.8 Biểu hiện protein E3 tái tổ h ợ p 54

3.9 Tinh sạch protein tái tổ h ợ p 55

3.10 Kiểm tra mức độ phản ứng của protein tái tổ hợp bằng kỹ thuật W estern b lot 56

3.11 Sử dụng protein tái tổ hợp để chẩn đoán các bệnh nhân nghi nhiễm virus

dengue bằng kỹ thuật Dot blot và E lisa 57

3.12 Tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán bệnh SD/SXHD bằng Dot blot 60

3.13 Tinh chế và đóng lọ l.OOOml kháng nguyên tái tổ hợp dengue typ 1 dùng trong chẩn đoán SD/SXHD bằng MAC-ELISA hoạc GAC-ELISA 62

K ẾT LUẬN VÀ ĐỂ N G H Ị 64

TÀ I LIỆU TH A M K H Ả O 65

Tiếng v i ệ t 65

Tiếng anh 66

Luận văn cao h ọ c Nguyễn Thị Hải

M Ở ĐẦU

Sốt dengue/Sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở người do 4 typ virus dengue (typ 1, typ 2, typ 3, typ 4) gây nên Tới năm 1997 virus dengue cùng với SD/SXHD đã được lan rộng trên

phạm vi toàn thế giới, bệnh lan truyền chủ yếu do muỗi Aedes aegypti (muỗi vằn, muỗi đốm), thứ yếu là Aedes albopictus và một số muỗi khác Theo Tổ

chức Y tế thế giới, hàng năm có khoảng 100 triệu trường hợp SD và 500.000 trường hợp SXHD, 25.000 trường hợp tử vong xảy ra trên thế giới, trong đó 90% mắc phải sốt xuất huyết là trẻ em dưới 15 tuổi [15,18, 29, 32]

Trong 60 năm qua, sự tác động, sự phân bố và tính dữ dội của bệnh đã tăng một cách đột ngột Sự phát triển dân cư ở các nước nhiệt đới tạo ra nguồn vật chủ nhạy cảm với bệnh, bên cạnh đó sự thành thị hoá không có kế hoạch dẫn tới thiếu sự quản lý nguồn nước và nguồn chất thải đã cung cấp địa điểm cho ấu trùng muỗi phát triển đã làm bệnh SD/SXHD trở nên ngày càng trầm trọng Ở Đông Nam Á, các trường hợp SXHD có xu hướng ngày càng gia tăng Tình trạng tương tự như vậy cũng xảy ra ở các nước trung Mỹ và vùng biển Caribe SXHD có thể gây bệnh cảnh nguy kịch, hội chứng sốc dengue (HCSD) nhanh chóng dẫn tới tử vong nếu không được chẩn đoán và điều trịkịp thời, ở Việt Nam, các tỉnh phía Nam, đồng bằng sông Hồng mà đặc biệt là các tỉnh đồng bằng sông cửu Long đang là điểm nóng của dịch SD/SXHD [20, 39, 48, 57]

Hiện nay vẫn chưa có vaccine đặc hiệu dể chống lại cả bốn typ dengue nên phát hiện sớm và điều trị thích hợp là quan trọng để giảm bớt tỉ lệ tử vong

do SD/SXHD Để có thể phòng chống dịch SD/SXHD có hiệu quả thì việc xác định, chẩn đoán nhanh, chính xác sự có mặt của virus dengue là hết sức cần thiết Kết quả chẩn đoán sẽ giúp cho các bác sĩ lâm sàng có hướng điều trị

% u ỵ ễ n Th M á

ỳ Luận văn h ọ c

thích hợp và đưa ra những biện pháp phòng trừ phù hợp để tránh sự bùng phát dịch SD/SXHD [10, 32]

Protein vỏ (E) của virus dengue là kháng nguyên cực kỳ quan trọng đối với các đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên này nằm trên bề mặt của virus, vì vậy chứa đựng phần lớn các quyết định kháng nguyên quan trọng tạo ra các kháng thể trung hoà virus dengue Chính vì vậy, chúng tôi chọn và tiến hành biểu hiện đoạn gen mã hoá cho domain 3, tạo ra protein tái tổ hợp dùng cho Kit chẩn đoán nhanh SD và SXHD bằng phương pháp Dot blot, Elisa để dần thay thế các phương pháp chẩn đoán truyền thống kém hiệu quả, đồng thời thay thế các kit nhập ngoại có giá thành cao [38, 49]

Nhằm phục vụ cho mục đích trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

"Nghiên cứu biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp của vỉrus dengue typ 1

đ ể c h ế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán sốt dengue/sốt xuất huyết dengue”.

Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Luận văn Nguyen Thị Hẻi Hà

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD)

1.1.1 Tình hình dịch bệnh

Dịch SD và SXHD được xác định và chính thức được thông báo lần đầu

tiên vào năm 1953 ở Philippines, mặc dù đã có những ghi nhận về những vụ dịch SD kèm theo xuất huyết xảy ra ở Australia vào năm 1897, ở Hy Lạp năm

1928, ở Đài Loan năm 1931 Trong vòng 50 năm qua, với những nỗ lực phòng

chống và sự phát triển kinh tế đã làm giảm đáng kể sự đe dọa của dịch ở một

số nước Tuy vậy, những vụ dịch SD/SXHD trầm trọng vẫn xảy ra ở nhiều nước khu vực Đông Nam Á, Thái Bình Dương và vùng vịnh Caribe [22, 25]

Bệnh SD/SXHD trở thành một bệnh dịch lưu hành ở nước ta Bệnhkhông chỉ xuất hiện ở đô thị mà cả vùng nông thôn, nơi có muỗi vectơ truyền

Sự phán bố các typ dengue virus trên toàn thỂ? giói vào năm 1970

r DEN3

> DEN4

- ỘẼN44fA 7: 7 ; :y j p r_2.ír*

OEN1 DEN2 i DEN3,

bệnh D ịch lớn SD/SXHD bùng nổ theo chu kì khoảng 3-5 năm Năm

1998, trên toàn quốc bùng

nổ vụ dịch lớn, số m ắc bệnh và tử vong cao (mắc:

Hình 1 Sự phân bố các typ dengue virus trên toàn thế giới vào 1970 và 2004

Bảng 1: Tình hình dịch bệnh dengue virus trên thế giới

Luận văn h ọ c Nguyên Th Nải Nà

các trường hợp chết ở hầu hết các quốc gia ở Đông Nam Á có giảm đi và hiện nay giảm ít hơn 1%, và tỉ lệ này ở một số thành phố vẫn vượt quá 4% [41,60],

b, Cuba

Vụ dịch dengue đầu tiên xảy ra ở Cuba vào năm 1977, sự lây lan tiếp diễn đến 1981 và có hơn 500.000 trường hợp nhiễm SD (typ 1) được thông báo Vụ dịch thứ 2 xảy ra vào 1981, do virus dengue typ 2 làm cho 344.203 người mắc bệnh, trong đó có 10.312 trường hợp SXHD/HCSD và 158 người (101 trẻ em và 57 người trưởng thành) tử vong [27]

c, Tình hình bệnh ở Châu Mỹ

Sự phân bố của dengue virus ở châu Mỹ tăng từ năm 1970, không chỉ một mà cả 4 typ dengue đều được tìm thấy Trong thời gian đó có vài quốc gia không thấy thông báo có dịch, ví dụ Chile Nhưng đến thế kỉ 20 thì những quốc gia ở vùng châu Mỹ đều thông báo có dịch [43]

d, Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam

Mới bước vào đầu mùa mưa, bệnh SXHD đã xuất hiện ở khắp các tỉnh phía Nam, đặc biệt nó hoành hành dữ dội tại khắp 13 tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông cửu Long Tính đến ngày 15/07/2006, người ta phát hiện 23.426 ca nhiễm bệnh, tăng 52% so vói cùng kì năm ngoái, trong đó có 14 người thiệt mạng (tăng gấp đôi)

Theo nhận định của các nhà chuyên môn thì khả năng SXHD sẽ bùng phát thành dịch do môi trường biến động, tạo điều kiện cho muỗi và bọ có thể phát triển nhanh Chính sự biến đổi của chủng virus làm cho sức đề kháng của nhiều người chưa kịp thời thích ứng khiến bệnh diễn biến vô cùng phức tạp

Trong thời gian tới, SD/SXHD sẽ còn là vấn đề nóng bỏng trên thế giới

vì khả năng hiểu biết để phòng ngừa của người dân vẫn còn thấp và sự tham gia một cách hời hợt cho có lệ của chính quyền từ trung ương đến địa phương [8, 32],

Luận văn CÖO h ọc Nguyễn Thị nải Hà

Hình 2 Sự phân bố dengue trên thế giới giai đoạn 1961-1990 (hình trên) và dự đoán sự

phân bo dengue trên thế gỉối vào năm 2080 (hình dưới), sau khi nhiệt độ nóng lồn

Trong đó vùng màu xanh là vùng hầu như không có sự lưu hành của virus dengue

vùng màu đỏ là vùng có sự lưu hành của virus dengue

Theo thông báo của V iện Hàn lâm Khoa học quốc gia M ỹ, nhiệt độ bề

mặt trái đất đang ấm dần lên và điều này làm cho nhiều loại côn trùng gây

bệnh xuất hiện, có nghĩa nhiều bệnh lạ xuất hiện Thêm vào đó do sự thay đổi

về khí hậu, nguồn nước, dân cư phát triển, sự thành thị hoá không có tổ chức

làm cho các bệnh truyền nhiễm tăng lên như sởi, sốt dengue Hình 2 là dự

báo về tình hình nhiễm bộnh dengue vào năm 2080 [3 3 ,4 6 , 56].

1.1.3 M uỗi Aedes aegyptỉ

a Sinh lý, sinh thái A aegypti

- M uỗi A aegypti xuất phát từ châu Phi rồi sang châu M ỹ, châu Á vào cuối thế kỉ 19 Loài m uỗi này trở nên thích ứng tốt và ngày càng phân b ố sâu

vào lục địa châu Á trước hết là các vùng thành thị Ở châu Á , đã xuất hiện quá

luận văn cao Nguyễn Th Hui Hả

trình thay thế dần m uỗi albopictus

trước sự xuất hiện của A aegypti A.

ap hân b ố chủ yếu ở các điểm dân

cư và các thành phố thuộc m iền duyên hải W HO đã đưa ra những hình ảnh về

sự phân bố mở rộng của m uỗi A aegypti

và tổng kết cho rằng sự phân bố của chúng phù hợp với sự phân bố của bệnh nhân SD/SXHD [5, 12, 55].

- M uỗi A aegypti gặp nhiều ở thành phố nên được gọi là muỗi vằn

thành thị M uỗi còn gặp ở các thị trấn dọc theo các trục đường giao thông có

dân cư đông đúc.

- M uỗi A albopictus về hình thể rất giống muỗi A aegypti. Sinh lý và sinh

thái của muỗi A albopictus tương tự như m uỗi A egypti, nhưng muỗi A

Ibopictus phân b ố chủ yếu ở vùng nông thôn, gặp ít ở ven thành phô'.

- V iệt Nam nằm trong vùng phân bô' của cả hai loài A aegyptỉ và A

albopictus, tuy nhiên sự phân bô' của chúng ở những sinh cảnh và vùng địa lý

khác nhau có khác nhau Gần đây trong báo cáo tại hội nghị quổc gia tổng kết

hoạt động phòng chống SD/SXHD cho biết muỗi A aegypti có mặt ở cả 3 m iền

Bắc, Trung, Nam [6 ,8 ].

b Cơ ch ế lây truyền bệnh dengue

Người nhiễm virus dengue do m uỗi cái thuộc giống Aedes đốt M uỗi

Aedes aegypti là vector truyền bệnh chủ yếu ở hầu hết các khu vực bệnh lưu

hành K hi m uỗi cái Aedes hút máu bộnh nhân nhiễm virus dengue, virus này

sẽ ủ bộnh trong cơ thể m uỗi khoảng 8 - 1 1 ngày Trong khoảng thời gian sống

còn lại sau đó, m uỗi có nguy cơ truyền bệnh cho người K hi virus vào cơ thể

ngưồi, chúng tuần hoàn ữong máu tír 2- 7 ngày Trong khoảng thời gian này

nếu m uỗi Aedes hút máu thì virus được truyền cho m uỗi Người là ổ chứa

Hình 3 Muỗi A aegypti

virus chính mặc dù một số nhà khoa học cũng đưa ra giả thuyết rằng khỉ cũng

có thể là một ổ chứa mầm bệnh cần quan tâm [3, 22]

- Lứa tuổi thụ bệnh có xu hướng ngày càng nhỏ dần.

- Khi địa phương lần đầu tiên có dịch dengue thì lứa tuổi nào cũng có thể mắc và bệnh cảnh thường là sốt dengue.

- G iới tính không khác nhau về tỷ lệ mắc bệnh.

b, Triệu chứng lâm sàng

❖ SD (dengue cổ điển)

- Nung bệnh: từ 3-15 ngày.

- Khởi phát: những biểu hiện lâm sàng phụ thuộc lứa tuổi.

- Toàn phát: sốt cao 39- 40°c, kèm theo các triệu chứng.

❖ Sốt xuất huyết dengue

+ Lâm sàng sốt xuất huyết dengue không sốc (SX H D )

Luận văn cao h ọ c Nguyễn Thị tĩẳ i tỉà

• Hội chứng thần kinh: đau người, đau cơ, đau khớp, nhức đầu, đau quanh hố mắt, trẻ em nhỏ sốt cao, đôi khi co giật, hốt hoảng, không có biểu hiện màng não

• Hội chứng xuất huyết: thường xuất hiện vào ngày thứ 2 của bệnh Trường hợp không có xuất huyết thì có dấu hiệu dây thắt dương tính

+ Sốt xuất huyết dengue có sốc: hội chứng sốc dengue (HCSD)

Khi bị SXHD cần theo dõi sốc là biến chứng nặng dễ đưa đến tử vong

Do đó phải thường xuyên theo dõi huyết áp, mạch, nhiệt độ, hematocrit, số lượng nước tiểu

1.1.4.2 Chẩn đoán

Chẩn đoán nguyên nhân là cực kì quan trọng và cần thiết nếu xét trên phương diện sức khoẻ cộng đồng nhưng lại tỏ ra không cần thiết cho việc thiết lập một chế độ điều trị hỗ trợ sớm cho bệnh nhân Chẩn đoán dengue thường dựa vào các yếu tố dịch tễ, biểu hiện lâm sàng như trình bày ở trên cũng như dựa vào các xét nghiệm đơn giản: số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu và hematocrit

a Xét nghiệm (triệu chứng cận lâm sàng)

- Số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi: SXHD thường có giảm bạch cầu Trường hợp tăng bạch cầu và tăng bạch cầu trung tính thường là cơ sở để loại trừ SXHD

- Giảm tiểu cầu (<100.000/mm3): cần làm số lượng tiểu cầu ở bất kì bệnh nhân nào nghi ngờ bị SXHD Tiểu cầu càng giảm, nguy cơ xuất huyết càng cao

Luận văn cao học Nguỵên Th Hải Hà

- Hematocrit: khi giá trị hematocrit tăng trên 20% so với trị số bình thường trước đó thì bệnh nhân được coi là có cô đặc máu, một tiêu chuẩn chẩn đoán SXHD Nếu không biết được giá trị hematocrit bình thường của bệnh nhân thì có thể xem giá trị > 45% là mốc chẩn đoán

- Một số xét nghiệm khác nhằm đánh giá mức độ bệnh: điện giải đồ, khí máu, chức năng đông máu, men gan, X- quang phổi nhằm phát hiện biến chứng tràn dịch màng phổi

b, Chẩn đoán nguyên nhân

Có thể thể hiện mầm bệnh trong máu và huyết thanh bằng phương pháp phân lập virus, xác định kháng nguyên virus bằng các phương pháp miễn dịch hoặc phát hiện bộ gen của virus bằng kỹ thuật khuếch đại chuỗi ADN (PCR) [44],

và đặc hiệu nhưng tiến hành khá phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao, đầu tư tài chính lớn nên khó đáp ứng và phổ biến rộng rãi trong các phòng thí nghiệm

! chẩn đoán SD/SXHD ở nước ta [11]

❖ Huyết thanh chẩn đoán: phương pháp đơn giản, giúp phát hiện bệnh vànghiên cứu dịch tễ, bao gồm các phương pháp sau [19]:

Ị

Luận văn cao Nguyễn Th tim

+ Phản ứng ức c h ế ngưng kết hồng cầu (HI Haemaglutination inhibition)

Kỹ thuật này nhạy, dễ thực hiện, trang thiết cồng kềnh và cần nhiều kinh phí, nhưng đáng tin cậy cho nên đến nay vẫn là kỹ thuật tốt nhất để chẩn

đoán cơ bản về huyết thanh học cho hầu hết các nhóm Flavivirus Tuy nhiên

kỹ thuật này kém đặc hiệu do có phản ứng chéo giữa các typ virus dengue

+ Phản ứng cô'định bổ th ể (CF= Complement Fixation Technique)

Là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể xảy ra trong điều kiện có mặt của bổ thể Phản ứng này có hai hệ thống tham gia: hệ thống 1 gồm kháng nguyên và kháng thể Hệ thống 2 gồm hồng cầu cừu và huyết thanh kháng hồng cầu cừu Trung gian giữa hai hệ thống là bổ thể Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể thì kháng thể sẽ kết hợp với kháng nguyên, bổ thể sẽ gắn vào phức hợp kháng nguyên- kháng thể Phản ứng này kém nhạy cảm hơn phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu hoặc phản ứng trung hoà nhưng lại tồn tại lâu hơn mặc dù ở một số trường hợp nó có tồn tại ở nồng độ rất thấp do đó

CF chỉ dùng để chẩn đoán những bệnh nhân trong vụ dịch có tính chất dịch tễ

CF đặc hiệu khi nhiễm virus nguyên phát nhưng lại kém đặc hiệu khi nhiễm vừus thứ phát Kỹ thuật này khó thực hiện nên ít được sử dụng

+ Phản ứng trung hoà (N T = Neutralization T

Virus dengue có khả năng tạo ra những đám hoại tử trên tế bào nuôi cấy một lớp cảm thụ, khả năng này bị mất đi khi có mặt của kháng thể đặc hiệu huyết thanh bệnh nhân

Kỹ thuật này nhạy hơn 2 kỹ thuật trên nên có thể phát hiện được kháng thể trung hoà ngay cả khi không phát hiện được kháng thể HI ở một số người trước đây đã nhiễm virus dengue

Luận văn cao Nguyên Th tlù

-NT tồn tại lâu nên kỹ thuật này được sử dụng cho các nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học Tuy nhiên do tính đặc hiệu của kháng thể nên phải sử dụng

cả 4 typ kháng nguyên dengue để phát hiện kháng thể

+ K ỹ thuật ELISA phát hiện IgM IgM Antibody Capturre

_

ELISA)

Kháng thể IgM là kháng thể xuất hiện sớm nên kỹ thuật này có ý nghĩaj

trong việc chẩn đoán bệnh Sự xuất hiện kháng thể IgM nhanh hay chậm thay

đổi tuỳ từng bệnh nhân nhưng ở lần nhiễm virus nào (nguyên phát hay thứ

phát) thì IgM cũng được hình thành sớm và cũng sớm mất đi

Với kỹ thuật này chỉ cần lấy máu bệnh nhân một lần vào nhữnơ ngày đầu của bệnh Kỹ thuật này nhanh, cần ít trang thiết bị vì vậy kỹ thuật này có

giá trị đặc biệt trong việc giám sát bệnh SD/SXHD/HCSD Ở các vùng mà SD

không phải là bệnh địa phương thì kỹ thuật này được dùng để giám sát, phát

hiện những trường hợp nhiễm virus ở các bệnh nhân Còn ở các vùng bệnh có

tính chất địa phương kỹ thuật này có thể dùng để điều tra sàng lọc một lượng

lớn mẫu huyết thanh

Kỹ thuật MAC-ELISA kém nhạy hơn kỹ thuật HI nhưng có ưu điểm là chỉ cần huyết thanh đơn, thực hiện kỹ thuật nhanh, cần ít trang thiết bị Tuy

nhiên kỹ thuật MAC-ELISA không giúp chúng ta phân biệt được giữa những

trường hợp nhiễm virus dengue nguyên phát hay thứ phát [15, 28, 53]

+ K ỹ thuật ELISA phát hiệnỊgG (GAC-ELISA= IgG Antibody Capture Enzymelinked Immunosorbent Assay)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: kháng thể IgG đặc hiệu của virus dengue có trong huyết thanh bệnh nhân được phát hiện bằng kỹ thuật IgG

người gắn trước vào bản nhựa, sau đó kháng thể IgG được phát hiện bằng

kháng nguyên dengue và kháng thể dengue gắn enzyme cho thêm vào sau Khi

có cơ chất, phản ứng dương tính sẽ xuất hiện màu

i

Luận văn cao h ọ c Nguyễn Thị tím nà

Kỹ thuật này có độ nhạy thấp, chủ yếu là do sự cạnh tranh với IgG không đặc hiệu Tuy nhiên kỹ thuật này cũng có những ưu điểm là có thể dùng để phân biệt giữa nhiễm dengue nguyên hay thứ phát, đồng thời lại đơn giản, chỉ cần một lượng nhỏ huyết thanh và có thể nhận định kết quả bằng mắt thường [8, 28, 51]

Kháng thể IgG kháng dengue xuất hiện muộn hơn và tồn tại nhiều năm hoặc suốt đời và có miễn dịch với typ dengue gây bệnh Kháng thể IgG kháng dengue xuất hiện trong nhiễm trùng tiên phát và thứ phát, nhưng trong nhiễm trùng thứ phát hiệu giá rất cao so với nhiễm trùng tiên phát Khi bị bệnh do một typ huyết thanh nào đó của vừus dengue thì sẽ có miễn dịch suốt đời với typ dengue đó, nhưng không có miễn dịch với các typ khác [42],

Nhưng có một điều đặc biệt là IgG và IgM ở huyết thanh người phản

ứng chéo với cả 4 typ huyết thanh của virus dengue và thậm chí với

Flaviviruse khác Sự phân biệt typ huyết thanh có thể làm được chỉ nhờ kiểm

tra phản ứng miễn dịch bằng các kiểm tra trung hoà hoặc RT- PCR của typ đặc hiệu Glycoprotein E, một kháng nguyên có tính đặc hiệu dengue vừus cao, vùng B hoặc vùng n i là đặc trưng Trình tự của nó ngắn khoảng 100

amino acid được biểu hiện ở E.coli cho virus viêm não Nhật Bản bởi Mason et

al và cho các virus dengue bởi Fonseca et al Bằng cách sử dụng những kháng nguyên này, các kháng thể đặc hiệu typ được tìm thấy ở huyết thanh siêu miễn dịch Nghiên cứu này được tiếp tục bởi Simsons et al., ông đã ứng dụng một hỗn hợp của cả 4 tái tổ hợp vùng B của dengue virus để thiết lập một phản ứng ELISA đặc hiệu dengue virus [31]

+ K ỹ thuật Dot blot và Western blot

Ngoài những kỹ thuật trên thì gần đây nhiều phương pháp miễn dịch khác dùng cho chẩn đoán nhiễm dengue trở nên phổ biến, dễ sử dụng bao gồm que thử, phương pháp miễn dịch enzyme, sắc kí miễn dịch và Dot blot, Western blot Đây là những phương pháp để thử khả năng phản ứng của kháng

nhiễm virus dengue và một virus khác trong chi Flavivirus hay chưa dùng vaccine Flavivirus, IgM hiệu giá cao hơn hẳn IgG hoặc là đáp ứng miễn dịch

thứ phát đối với người có tiền sử nhiễm virus dengue hay đã dùng vaccine Vì vậy phản ứng Dot blot, ELISA rất có ý nghĩa trong việc đánh giá nhiễm trùngị

hiện tại của virus [17, 19, 41]

1.1.5 Điều trị và phòng chống

1.1.5.1 Điều trị

Vì SXHD là một bệnh do virus nên hiện tại chưa có thuốc điều trị đặc hiệu Điều trị chủ yếu là triệu chứng và điều trị biến chứng bệnh Các biện pháp điều trị chung gồm:

- Thuốc hạ sốt

ỉ

- Điều trị với corticosteroids methylprednisolone, hydrocortisone hemisuccinate hoặc carbazochrome sodium sulfonate (AC-17) (những thuốc này làm giảm tính thấm mao mạch)

- Bồi phụ nước bằng con đường uống hoặc bằng đường tĩnh mạch trong trường hợp cần thiết nhằm đề phòng và điều chỉnh mất nước

Ị - Nếu có xuất huyết nặng và rối loạn đông máu trầm trọng, cần phải

truyền máu tươi hoặc khối tiểu cầu

- Theo dõi bệnh nhân chặt chẽ nhất là trong giai đoạn bắt đầu hạ sốt

[29].

1.1.5.2 Nghiên cứu chế tạo vaccine dự phòng

Ở người, mỗi typ virus đều có thể gây SD và SXHD, chưa rõ typ nào gây bệnh mạnh hơn Tuy 4 typ rất gần nhau về phương diện kháng nguyên

Luận văn Cäo h ọ c Nguỵên Th nải Hà

(chung nhau khoảng 60- 74% gốc amino acid), nhung cũng đủ khác nhau để chỉ có một phần gây miễn dịch chéo [40] Virus dengue còn có chung một số

đặc điểm kháng nguyên với các Flavivirus khác Kháng nguyên virus dengue

đã được thấy khu trú ở đại thực bào phổi, lách, gan, tuyến ức, tế bào Kupffer,

tổ chức đại thực bào của da và bạch cầu đơn nhân to ở máu ngoại vi Virus dengue có khả năng phát triển rất nhanh trong những bạch cầu đơn nhân to thực bào khi có mặt phân nhóm dengue (hoặc cùng nhóm Tinhtrạng này dẫn đến tăng hoạt thực bào, tăng nhiễm các tế bào, bạch cầu đơn nhân to sẽ giải phóng ra những chất trung gian hóa học làm tăng tính thấm huyết quản, kích hoạt bổ thể, hoạt hóa thromboplastin tổ chức (nguồn gốc của đông máu rải rác nội mạch), từ đó bệnh nặng hơn Trong khi chưa rõ độc lực

và tính gây bệnh của các typ virus dengue có khác nhau không, đáng lưu ý là bệnh cảnh lâm sàng SXHD rất khác nhau tùy theo vụ dịch, tùy theo vùng địa

lý [47],

Kháng thể dengue tồn tại cả đời với typ virus gây bệnh và không có cơ chế bảo vệ chéo do đó vaccine phải bao gồm cả 4 typ mà chỉ cần tiêm một lần bảo vệ được 4 typ Thực tế việc sản xuất ra một vaccine đạt yêu cầu thực sự là một vấn đề phải nghiên cứu, đánh giá thật chặt chẽ Nếu ta chỉ sản xuất một vaccine đơn giá và tiêm riêng biệt thì có nhiều người lo ngại về trình tự nhiễm các typ virus dengue Việc đề xuất một phác đồ tiêm vaccine tạo miễn dịch chắc chắn vẫn còn là một vấn đề lớn đang được nghiên cứu Một số tác giả cho rằng trong tự nhiên có sự phối hợp ngẫu nhiên các trình tự nhiễm 2 typ dengue nào đó dẫn đến kết quả một số ít người mắc SD/SXHD Mặt khác, có câu hỏi đã được đặt ra rằng liệu trong số các virus vaccine có làm cho người

đã tiêm phòng bị mẫn cảm và gây ra nhiễm trùng tăng cường khi tiếp xúc với virus dengue hoang dại hay không? Đến nay đã có ít nhất 15 chương trình nghiên cứu vaccine dengue đang được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Thái Lan, Trung Quốc song cũng có những khó khăn về kỹ thuật,

việc đưa vào sản xuất và sử dụng rộng rãi một vaccine như mong muốn có lẽ

sẽ chưa dạt được trong vài năm tới [5, 8, 14, 16, 24, 45]

I

Vaccine dengue đầu tiên được phát triển sau một thời gian ngắn khi virus dengue được phân lập đầu tiên bởi các nhà khoa học Nhật và Mỹ MặcI

dù đã cố gắng qua nhiều năm nhưng một vaccine hiệu quả mà an toàn vẫn chưa được phát triển Với sự giúp đỡ của WHO, công trình lổn cho sự phát triển một vaccine dành cho SD và SXHD đã được thực hiện trong những năm

;

gần đây Vaccine làm giảm độc lực đầy hứa hẹn đã được phát triển và được

định giá ở giai đoạn 1 và 2 được dùng thử ở Thái Lan Sự tiến triển đầy hứa

I

hẹn trong chiến lược phát triển vaccine khác sử dụng công nghệ phân tử mới cũng được thực hiện trong những năm gần đây Các phương pháp gần đây bao gồm sử dụng các vaccine có các virion bị bất hoạt, tổng hợp peptides, các vaccine cấu trúc siêu phân tử, vector biểu hiện, các hệ thống vector tái tổ hợp sống, và ADN trần [22, 26],

1.1.5.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

Để có thể giám sát dịch tễ học của virus dengue nhằm phát hiện kịp thời

và có biện pháp phòng chống hiệu quả thì việc tạo ra các Kit chẩn đoán và ứng dụng các kỹ thuật hiện đại trong chẩn đoán và phát hiện virus dengue là cực

kỳ quan trọng Tại Viện Vệ sinh Dịch tễ học Trung ương, các bộ sinh phẩm dùng trong chẩn đoán sốt xuất huyết như MAC-ELISA Đặc biệt các sinh phẩm cao cấp như kháng thể đơn dòng cũng được sản xuất tại đây và ứng dụng trong chẩn đoán nhanh SD Các kỹ thuật hiện đại như hiển vi điện tử, trung hòa giảm đám hoại tử, phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT- PCR) cũng đã được ứng dụng trong chẩn đoán SD Bệnh SD/SXHD là bệnh do muỗi truyền, vì vậy phương pháp phòng chống vectơ cũng được xem là một biện pháp cực kỳ quan trọng Việc ứng dụng thành công các chủng vi sinh vật

tái tổ hợp như E.coli và nấm men p.pastoris để sản xuất các loại protein tái tổ

hợp phục vụ sản xuất và đời sôrig trong đó có các kháng nguyên và vaccine tái

Luận văn h ọ c Nguyễn Th Hả

tổ hợp đã được thực hiện thành công ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới

Tuy nhiên, để có thể có được một lượng kháng nguyên lớn và đủ độ tinh sạch

để sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán, đặc biệt chẩn đoán với các kỹ thuật hiện đại như MAC-ELISA hay GAC-ELISA thì việc ứng dụng công nghệ ADN tái

tổ hợp là hết sức cần thiết [7]

1.1.5.4 Kiểm soát vector truyền bệnh

Hiện tại, kiểm soát vector truyền bệnh được xem là phương pháp phòng

bệnh duy nhất có hiệu quả Kiểm soát các vector Aedes có thể làm giảm đáng

kể tỉ lệ mắc bệnh dengue Trong những năm 1950-1960 Tổ chức Y tế toàn châu

Mỹ {Pan American Health Organization) đã thành công trong việc diệt sạch Aedes aegypti ở nhiều vùng thuộc Trung và Nam Mỹ và trong thời gian này,

các vụ dịch dengue rất hiếm ở châu Mỹ Tuy nhiên sau khi chương trình

ngừng lại thì Aedes aegypti và sau đó là dengue lại tái xuất hiện.

Diệt và chống đốt đối với muỗi A aegypti lại không dễ dàng, rất tuỳ

thuộc vào trình độ kinh tế xã hội của từng vùng như hệ thống cấp và thoát nước; riêng ở Việt Nam có những khó khăn đặc biệt do tỷ lệ gia đình dùng trực tiếp nước máy còn thấp, số hộ sử dụng nước dự trữ trong thùng, bể chum, vại còn nhiều, nhất là nông thôn; nhiều hộ ở thành phố mặc dù có ống dẫn nước tói nhà nhưng bơm có giờ nên vẫn phải có bể chứa trong nhà, ngoài sân Tinh hình này buộc công cuộc phòng chống bệnh dengue ở nước ta phải phát huy tối ưu mọi biện pháp có hiệu lực- như các biện pháp diệt muỗi chống đốt, cải thiện vệ sinh hoàn cảnh môi trường, phát hiện và điều trị sớm bệnh nhân, mặt khác về lâu dài và cơ bản, phải cải tạo hệ thống cấp thoát nước ỏ các thành phố, thị trấn, việc này đi liền với sự phát triển đời sống kinh tế xã hội và đòi hỏi sự đầu tư của nhiều ngành ngoài y tế [20, 23]

TRƯỜNG ĐHĐlẾu DƯỜNG

ị:: U •

S ỏ

Luận văn cao Nguyễn Thị H ải Hả

Khi bị nhiễm virus các tế bào còn sản sinh ra một loại protein không cấu trúc, TLPT là 39.000 Dal, protein này mang những quyết định kháng nguyên đặc hiệu nhóm và đặc hiệu typ

Khi virus xâm nhiễm vào cơ thể, các kháng nguyên virus kích thích cơ thể hình thành kháng thể đặc hiệu tương ứng, kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu typ có tác dụng trung hoà lẫn nhau, còn kháng thể đặc hiệu nhóm và thứ nhóm thì không có tác dụng trung hoà [8]

- Virus dengue thuộc nhóm Flavivirus (họ Flaviviridae) genome có 3

gen protein có cấu trúc (protein lõi- c , protein màng M và protein vỏ E) và 7 gen protein không cấu trúc Protein E có chức năng trung hòa và tương tác với các thụ thể Hiện nay phân biệt được 4 typ huyết thanh virus dengue đã gây bệnh: DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 W.M, Hammon, 1966 đã phân lập từ

Luận văn cao Nguyền Th

bệnh nhân sốt xuất huyết ở Thái Lan thêm 2 typ (TH 36, TH Sman) đề nghị coi

là typ 5 và 6, tuy rằng chúng gần tương tự với 1 và 2; nhưng Succhinda Udomsakdi và S.B Halstead (1966) bằng phản ứng kết hợp bổ thể nhận thấy giống nhau về kháng nguyên giữa virus dengue typ 1 với 1 H Sman, giữa typ 2

B) PoHyprorânFlavivjrus: các chúc năng cùa protein.

Sự saochép, khả dổngnhân N"*" a nàng sinh bẹnh IỔNS3- Kháng IFN(?)

Kháng IFN- (?) Protease Mcthyl-txansfcrasc

Helicase Guanylyl-uansfcrase ARN-ưiphosphatase

c ) Polyprotein Fia viviru »

x £ bảo c h ít

Hình 5 Cấu tạo genome của dengue virus, polyprotein và hình học màng của các protein

cùa virus; (a): sơ đồ genome ARN sợi đơn với các nhân tố A R N cấu trúc ò đầu 5 ’và đầu 3* NTRs;

(b): cấu trúc genom e của dengue virus và các chức năng của các protein virus, một vài protein mà chức năng của chúng trong chu trình sống của virus còn chưa rồ, kí hiệu là (c): các protein của dengue ở khu vực màng và proteinase tạo thành polyprotein cắt [2 6 ,5 8 ].

Virus dengue có hệ gen của Flavivirus điển hình Genome là m ột sợi

R N A đơn, dương có chiều dài xấp xỉ 10.200 ribonucleotit H ệ gen chứa một khung đọc mở mã hoá thành một chuỗi polyprotein duy nhất Chuỗi này sau đó

sẽ được phân cắt bởi các enzym của tế bào vật chủ và các enzym của virus thành

10 phân tử protein chức năng, bao gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu

Luân văn cao hoc Nguỵễn Th

- Khoảng m ột phần tư chiều dài của genom e tính từ đầu 5 ’ mã cho các protein cấu trúc: protein lõi (C), protein màng (M ), protein vỏ (E) Đoạn sen này đã được hiểu rõ và đã được giải trình tự Đoạn này chứa nhiều vùng đặc hiệu loài và đặc hiệu typ Người ta dựa vào các vùng đặc biệt này để phân biệt cấu trúc gen của các virus trong nhóm và các typ virus trong loài.

- Phần còn lại của genom e mã hoá cho 7 protein phi cấu trúc thực hiện các chức năng sinh học xác định vòng đời của virus Chức năng của các protein này đến nay vẫn chưa được biết đầy đủ.

Khoảng 1/4 chiều dài của genom e tính từ đầu 5 ’ (khoảng hơn 2.000 nucleotide) mã hoá cho các protein cấu trúc Đoạn gen này chứa nhiều vùng quyết định kháng nguyên quan trọng góp phần đánh giá đặc hiệu typ Tính chất đặc trưng của vùng này cho phép phân biệt cấu trúc gen của các virus trong nhóm và trong cùng typ huyết thanh [25].

Protein cấu trúc

Bao gồm protein lõ i (C), protein vỏ (E), protein màng (M ).

+ Protein lõi (C): là protein có kích thước nhỏ và là thành phần cơ bản tạo nên lõ i nucleocapsit của vửus.

Luân văn Nguyễn Th

+ Protein vỏ (E): có nguồn gốc từ màng tế bào chủ, được glycosyl hoá ở

pH thấp, mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu và tương tác với các thụ thể gây ra các triệu chứng của SD/SXHD.

+ Protein màng (M): Có hai dạng phụ thuộc vào độ sinh trưởng của virus bao gồm M có khối lượng phân tử 8 kDa và preM có khối lượng phân tử

19 - 23 kDa.

Protein phi cấu trúc

Chức năng của nhóm protein này chưa được biết m ột cách đầy đủ Các chức năng sinh học này xác định vòng đời của virus Cấu trúc đoạn gen nàv khá giống nhau ở các typ virus dengue khác nhau, đây chính là nguyên nhàn gây nên các phản úng chéo nhau trong chẩn đoán huyết thanh học.

+ NS1 là m ột glycoprotein, khoảng 46- 50kD al, là glycoprotein được biểu hiện ở dạng chất tiết (sN S l) hoặc không tiết (m N S l), có thể liên quan đến vai trò trong quá trình sao chép [59].

+ NS2 có thành phần là các enzym quan trọng trong việc sao chép

R N A , helicase và R N A triphotphatase tạo thành cấu trúc đầu 5 \ protease để phân cắt polyprotein và liên kết với màng.

+ NS5 thành phần là các enzym polym erase phụ thuộc R N A có chức năng phiên mã A D N và enzym m ethyltransíerase m etyl hoá đầu 5 ’.

+ N goài ra cồn có các vị trí của N S2A , N S2B, N S4A , NS4B Các protein này cùng phối hợp thực hiện các chức năng sinh học trong vòng đời của virus.

1.2.3 Chu trình nhân lên và cơ ch ế gây bệnh của virus dengue

Lúc đầu virus gắn vào bề mặt tế bào nhờ m ột thụ thể đặc hiệu của màng

tế bào Sau đó dưới tác động giữa protein vỏ capsit của virus và enzym của tế bào sẽ phá huỷ vỏ capsit, phân tử A R N của virus được thâm nhập vào bào tương tế bào vật chủ T iếp theo là quá trình nhân lên của virus vói tế bào G iai đoạn đầu này được g ọi là giai đoạn hấp thụ và giải phóng vật liệu di truyền

Luận văn cao học Nguyễn Th

virus vào tế bào chủ Sau đó ARN của virus và các protein vỏ capsit dần xuất hiện, rồi đến các virion hoàn chỉnh đó là các giai đoạn tổng hợp ARN, vỏ capsit virus và hình thành virus mới Cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh virus mói trong toàn bộ chu kì nhân lên của virus dengue [29, 30]

Hình 7 Quá trình nhân lên của virus dengue

Chu trình nhân lên của virus trong tế bào gồm các bước sau:

1 Sự hấp thụ (hút bám)

2 Thực ẩm bào nhờ thụ quan trung gian

3 Dung hợp trong lysosome ở pH thấp

4 Cởi áo

5 Dịch mã và sao chép

6 Sự tạo hình

7 Giải phóng các virus

Luận văn cao Nguyễn Thị H ai Hà

virus vào tế bào chủ Sau đó A R N của virus và các protein vỏ capsit dần xuất hiện, rồi đến các virion hoàn chỉnh đó là các giai đoạn tổng hợp ARN, vỏ capsit virus và hình thành virus m ới Cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh virus mới trong toàn bộ chu kì nhân lên của virus dengue [29, 30].

Hình 7 Quá trình nhân lên của virus dengue

Chu trình nhân lên của virus trong tế bào gồm các bước sau:

1 Sự hấp thụ (hút bám)

2 Thực ẩm bào nhờ thụ quan trung gian

3 Dung hợp trong lysosom e ở pH thấp

4 Cởi áo

5 D ịch mã và sao chép

6 Sự tạo hình

7 Giải phóng các virus

Luận vănc.ao Nguyễn Thị N ải Nả

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus dengue tăng sinh trong các đại thực bào Khi cơ thể bị nhiễm virus dengue typ khác thì những kháng thể có sẵn trong cơ thể không có khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên nên không trung hoà được kháng nguyên của virus Virus xâm nhập vào bạch cầu đơn nhân, số lượng bạch cầu đơn nhân to tăng lên Hoạt hoá các CD4, CD8, lym pho độc tế bào Các lym pho T hoạt hoá giải phóng ra nhiều cytokinin, các bạch cẩu đơn nhân to nhiễm virus bị phân giải qua trung gian tế bào Xuất hiện thoát huyết tương và xuất huyết.

1.2.4 Đ ặc điểm kháng nguyên

Virus dengue mang các kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên kết hợp bổ thể trên protein màng (E) [6, 21] Virus dengue có nhiều kháng nguyên, trong đó có kháng nguyên đặc hiệu typ, kháng nguyên chung của phân nhóm và của nhóm , dựa vào sự khác biệt giữa các đặc điểm quyết định kháng nguyên người ta phân chia virus dengue thành 4 typ khác nhau Khi xâm nhập vào cơ thể các kháng nguyên của virus

là kháng nguyên trung hoà, kháng nguyên ngưng kết hồng cầu và kháng nguyên kết hợp bổ thể sẽ kích thích cơ thể hình thành các kháng thể đặc hiệu tương ứng [2, 9, 25].

1.3 Biểu hiện proteỉn tái tổ hợp trong E.coli

1.3.1 Chủng E co libiểu hiện protein tái tổ hợp

E.coli dễ biến nạp, sinh trưởng nhanh trong m ôi trường đơn giản và các thiết bị nuôi cấy, giữ chủng không đắt tiền N goài ra, tế bào E.coli dễ dàng bị phá vỡ để thu sản phẩm protein tạo ra trong tế bào Nhưng E.coli lại không cắt trình tự không mã hoá (intron) và không có các biến đổi sau dịch mã ở tế bào sinh vật nhân chuẩn như gly co sy l hoá, phosphorin hoá hoặc hình thành cầu disulíua [21].

Luận văn cao học Ngu/ễn Th Hi

Sau khi các plasm id đã được đưa vào trong m ột vật chủ không biểu hiện hầu hết chúng thường được chuyển vào m ột vật chủ mang gen T7 ARN polym erase (thể tiềm tan A.DE3) cho sự biểu hiện của các protein đích Hình 8

m ô tả ở dạng sơ đồ vật chủ và các yếu tố vector có thể dùng để điểu khiển các mức T7 A R N polym erase và sự phiên mã tiếp theo của m ột gen đích trong

m ột vector pET V à để điều khiển nghiêm ngặt hơn nếu có các tế bào vật chủ

m ang pLysS hoặc pLysE Các plasm id pLys mã hoá lysozym T7 là m ột chất

ức ch ế tự nhiên T7 A R N polym erase và vì vậy làm giảm khả năng phiên mã gen đích trong các tế bào không cảm ứng Các vật chủ pLysS tạo ra lượng T7 lysozym e thấp trong khi các vật chủ pLysE sản xuất ra enzym nhiều hơn và vì vậy hay được dùng hơn [35].

Hình 8 Hệ thống T7 biểu hiện protein ờ E.coli

Cảm ứng bằng IPTG dẫn đến:

• Giải ức ch ế của gen T7 A R N polym erase ở NST vật chủ

• Giải ức ch ế gen đích dưới sự điều hoà của lac o

Gen đích phiên mã nhờ T7 A R N pol

Luận văn h ọ c Nguyên Thị Lia i Hả

1.3.2 H ệ thống pET vector

H ệ thống pET là hệ thống mạnh nhất dùng cho nhân dòng và biểu hiện các protein tái tổ hợp trong E.coli. Gen đích được nhân dòng trong các plasm id pET dưới sự điều khiển của các tín hiệu phiên mã và dịch mã của T7 bacteriophage T7 AR N polym erase có tính chọn lọc và linh hoạt đến nỗi hầu hết tất cả các nguồn tế bào được chuyển vào gen đích đều được biểu hiện.

Các vector pET được xây dựng ban đầu bởi Studier và cộng sự (Studier

& M offatt 1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al 1990) Các vector pET

m ới hiện nay do N ovagen cải tiến có vị trí gắn ribosom e hiệu quả cao từ protein capsit chính của thực khuẩn thể T7, được dùng để biều hiện gen đích

mà không cần vị trí gắn ribosom e của gen đó, cùng với đặc điểm mạnh để tách dòng, phát hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp dễ dàng hơn.

H ệ thống pET có những nhân tố quan trọng sau:

p L ĩ n k

1 /

• Dấu chuẩn chọn lọc (kháng kháng sinh)

• Vùng khỏi đầu sao chép C olE l

• Vùng khởi đầu sao chép f l

• Gen lacl (protein ức ch ế lac)

• Promoter phiên mã T7 (đặc hiệu cho phage T7 A R N polym erase)

• Vùng 3’ điều khiển lac của T7

promoter

V ị trí đa tách dòng (vùng nối) liền

[13].

Luận văn cao học Nguyễn Thị N ải Nà

Để tinh sạch protein tái tổ hợp dùng S- tag, T7- tag hoặc HSV- tag để dễ dàng xác định trên Western blot Những peptide này (các đoạn dung hợp) có kích thước nhỏ và các thuốc thử xác định chúng là có tính đặc hiệu và độ nhạy cao Các đoạn S- tag và T7- tag cũng được sử dụng cho quá trình tinh sạch ái lực nhờ các gốc tương ứng và các kit buffer Trình tự His- tag là rất có ích như một phần của protein dung hợp Gen quan tâm đã được nhân dòng như một protein dung hơp vói 6- 10 gốc histidine liên tiếp được gọi là một “đuôi” và vị trí của tag thường là đầu tận cùng amino hoặc carboxyl của protein để tránh phá vỡ chức năng protein, nhưng có thể nằm giữa protein nếu vùng đó không cần thiết cho chức năng protein Tinh sạch protein dễ dàng dựa vào các gốc histidine liên tiếp

có khả năng liên kết mạnh với những cation có hoá trị 2 như nickel

Hệ thống này là phổ biến vì nó có thể được thực hiện dưới những điều kiện khác nhau Ta có thể gắn hoặc giải phóng một protein từ cột dưới những điều kiện nhẹ nhàng mà vẫn duy trì được cấu trúc và chức năng của protein hoặc ta chọn lọc dưới những điều kiện biến tính và hơn nữa sử dụng tag không cản trở chức năng thông thường của protein tái tổ hợp [18, 34, 35]

Luận văn cao h ọ c Nguyễn Thị H ải Hà

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là gen mã hóa kháng nguyên vỏ của virus dengue typl đã được Phòng Vi sinh Vật học Phân tử tạo dòng và đăng ký trong ngân hàng Gen quốc tế

2.2 Vật liệu

2.2.1 Sinh phẩm

Trong quá trình thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện chúng tôi đã sử dụng một số sinh phẩm của các hãng nổi tiếng trên thế giới như: Kit tách dòng- TA cloning của hãng Invitrogen, Kit xác định trình tự- BigDye Terminator v3.1 của hãng Applied Biosystem, Vector biểu hiện pET-TRX- FUS do hãng Novagen cung cấp, Kit tinh sạch plasmid - S.N.A.P.TM của hãng Invitrogen, Kit thôi gen - S.N.A.P free u v của hãng Invitrogen

2.2.2 Hoá chất

Các hóa chất tinh khiết được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử của hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio-Rad bao gồm IPTG, ethanol, acetat natri, cao nấm men, trypton, chloroform, EDTA, agarose, natriclorua, agar- bacter, tris-HCl, SDS, MgCl2, acrylamide, bis-acrylamide

2.2.3 Trang thiết bị

Trong quá trình thực hiện đề tài này chúng tôi đã sử dụng các trang thiết bị, máy móc của phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ Gen thuộc Viện Công nghệ Sinh học như:

Máy lắc ổn nhiệt 37°c

Máy khuấy từ (RotoLab, OSI)Máy ly tâm (Sorvall)

Luận văn học Nguyễn Th H ả' Hà

Máy khuấy trộn Vortex (RotoLab, OSI)Máy hút chân không (Speed VAC Se 110A-Savant) Máy quang phổ (Hewlett Packard, Mỹ)

Máy soi chụp ảnh gel (Pharmacia)Máy ly tâm lạnh (Sorvall)

Máy khuếch đại gen 9700 (Applied Biosystem) Máy xác định trình tự ADN tự động (ABI 3100) Cân phân tích 10^g (Mettler Toledo)

Cân điện 10'‘g (Ohaus)Nồi khử trùng (Nhật Bản)

10 mM NaCl 2.5 mM KC1

10 mM MgCl2

10 mM MgSƠ4

20 mM Glucose

Luận văn hoc N g u y ễ n Th fia i M ả

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (LB):

1% Yeast extract 1% Trypton 1% NaCl

pH = 7.4 (chỉnh bằng NaOH 5N)

Đối với môi trường thạch, cần bổ sung 2% agar bacter

2.2.4.2 Các loại dung dịch

- Dung dịch dùng trong tách chiết ADN plasmit từ vi khuẩn:

Dung dịch Sol I: Tris-HCl 50mM, EDTA lOmM Dung dịch Sol II: NaOH 200mM, SDS 1%

Dung dịch Sol III: CH3COOK 3M, pH 5.5 Dung dịch chloroform: isomylalcohol (24:1)Dung dịch CH3COONa (Natri acetat) 3M, pH 5.2 Dung dịch TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0; 1 mM EDTA pH 8.0) Dung dịch TE-RNase: 100 pl RNase 10mg/ml trong 10 ml dung dịch TE

Đệm tra mẫu (Loading buffer) 10X:

Tris-HCl IM, pH 8.0 : 2 mlEDTA 0.5 M; pH 8.0 : 0,4 ml

Bromephenol Blue 1% : 5 mlH20 khử ion vừa đủ : 20 mlDung dịch dùng cho điện di protein:

Luận văn h oc Nguyen Thị H ải

+ Dung dịch đệm tra mẫu (SDS-PAGE sample) 2X:

Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 : 1 ml

2-Mercaptoethanol : 0,4 mlBromphenol Blue 1% : 0,2 mlH20 khử ion vừa đủ : 4 mlDung dịch acrylamide-bisacrylamide 30%:

Biacrylamide : 1 gH20 khử ion vừa đủ : 100 ml + Dung dịch tẩy màu:

500 ml metanol

100 ml axit axêtic

400 ml H20 khửion Bảo quản ở nhiệt độ phòng

+ Dung dịch nhuộm Coomassie brilliant blue (CBB) 0.25%: Cân0.25 g CBB (Merck) hoà tan trong 100 ml dung dịch tẩy màu

- Dung dịch dùng cho Western blot:

+ Đệm chuyển protein sang màng bloting buffer 10X:

Glycine : 144.13 gH20 khử ion : 1000 ml+ Đệm chuyển protein sang màng 1 lần:

100 ml đệm chuyển bloting buffer 10X

200 ml metanol

700 ml H20 khử ion+ Dung dịch đệm TBS 2X: 50 mM Tris-HCl pH 7.5; 1 M NaCl

Luận văn h ọ c Ngu/ên Th

+ Dung dịch đệm TTBS IX:

250 ml TBS 2X

250 ml H20 khử ion

250 jll1 Tween 20+ Dung dịch Ponceau: 50 mg Ponceau (Merck) hoà trong 50 ml dung dịch axit axêtic 2%

- Dung dịch hiện màu:

5 ml metanol để trên đá + 15 mg chất hiện màu (4-chloronaphtol)

25 ml TBS IX + 15 pl H20 2 30%

Trộn 2 thành phần vào với nhau trước khi hiện màu

- Dung dịch dùng cho ELISA:

+ Dung dịch gắn bản, pH = 9.6:

Na2C 0 3NaHCO

1.18g3.47g0.20g

l i f t

H20(để trong tủ lạnh trong 2 tuần) + Dung dịch rửa bản, pH = 7.2 - 7.5:

NaN-Tween 20 Nước cất 2 lần

Na2HPO4.2H20NaH2PO4.H20NaN3

1.650g0.220g0.200g0.5ml

l i f t+ Dung dịch che chắn bản (Skim milk 5%):

Skim milk Dung dịch rửa

: 5g: 100ml

Luận văn hoc Nguyễn Th

- Dung dịch màu dùng cho định lượng protein bằng phương pháp Bradford:

Dung dịch này được bảo quản ở 4 °c và có thể dùng trong nhiều năm.2.3 Phương pháp

2.3.1 Phương pháp khuyếch đại gen bằng PCR

PCR hay là kỹ thuật nhân ADN đặc hiệu được Kary Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80 và đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học

phân tử Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự

hiện diện của tế bào

Các giai đoạn cơ bản trong một chu kỳ của phản ứng PCR gồm:

+ Biến tính ADN: Giai đoạn hình thành đoạn ADN sợi đơn đóng vai trò làm khuôn, giai đoạn này cần nhiệt độ từ 94°c đến 95°c, thời gian kéo dài từ

30 giây đến 1 phút

+ Bắt cặp: Giai đoạn để mồi bắt cặp với khuôn, cần nhiệt độ từ 40-70°C, phụ thuộc vào độ dài và tỷ lệ G+C của mỗi mồi, thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút

+ Tổng hợp: Giai đoạn ADN polymerase (Taq polymerase) tổng hợp sợi ADN mới trên khuôn, thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau (thường từ 25 - 45 chu kỳ) để tạo được lượng sản phẩm cần thiết [1,4]

2.3.2 Phương pháp tạo dòng

Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng TA Topo trong

bộ Kit TA cloning, sau đó được biến nạp vào tế bào E.coli chủng D H 5 aT \

Coomassi-Brillian-BlueSERVAN-35050(G250) Ethanol.95 %