Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

PHAN THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 62 54 01 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

ĐÀ NẴNG – 2021

Công trình được hoàn thành tại

Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận văn tiến sĩ họp tại

Đại học Đà Nẵng vào ngày tháng năm 2021

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin- Học liệu và Truyền thông, ĐH Đà Nẵng

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Lipase hay Triacylglycerol acylhydrolases (E.C 3.1.1.3) là loại enzyme xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol mạch dài tạo thành diacylglycerol, monoacylglycerol, glycerol và các acid béo tự do tại các bề mặt liên pha giữa nước và dung môi hữu cơ Ngoài ra, lipase còn xúc tác các phản ứng chuyển vị ester và cả phản ứng tổng hợp ester Lipase được thu nhận từ vi khuẩn (45%), nấm (21%), động vật (18%), thực vật (11%) và vi tảo (3%) So với lipase từ vi sinh vật, lipase từ thực vật có những ưu điểm quan trọng như: dễ được người tiêu dùng chấp nhận trong thực phẩm, dược phẩm hơn, ngay ở cả dạng enzyme thô; nguồn nguyên liệu để thu nhận có sẵn trong tự nhiên, không độc hại Lipase thực vật được cho là có tiềm năng ứng dụng tốt trong công nghệ thực phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp các chất hữu cơ, dược phẩm và cả trong sản xuất biodiesel Lipase thực vật được tìm thấy trong các loại hạt chứa dầu, ngũ cốc cũng như mủ các loại quả Trên thế giới đến nay chỉ mới 29 loại lipase từ thực vật đã được xác định khối lượng phân tử cũng như trình tự acid amin trong chuỗi protein Những công trình nghiên cứu trong nước về lipase còn ít, đặc biệt lipase từ thực vật là lĩnh vực hầu như không được quan tâm Do

đó, đề tài được chọn cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc

tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm" có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính lipase thu nhận từ một số nguồn thực vật: hạt có dầu, phụ phẩm nông nghiệp, mủ các loại quả; Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận lipase thô từ nguồn thực vật tiềm năng; Xác định đặc tính của lipase thô và lipase tinh sạch; Đánh giá khả năng ứng dụng lipase thô trong công nghiệp thực phẩm

3 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu thực vật thích hợp để thu nhận lipase; Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase thu được; Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thô có hoạt

độ cao từ nguyên liệu đã lựa chọn; Nghiên cứu khảo sát các đặc tính hoá sinh của lipase thô; Nghiên cứu tinh sạch lipase thô và xác định đặc tính hoá sinh; Nghiên cứu ứng dụng lipase thô trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA và EPA

4 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu trong luận án là phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp với phân tích lý thuyết và tổng hợp tài liệu

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đánh giá được khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn nguyên liệu thực vật, ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt độ của chế phẩm, từ đó xác định được nguồn nguyên liệu thực vật có tiềm năng

để khai thác enzyme lipase; Đề xuất được quy trình thu lipase thô từ nguồn thực vật có hiệu quả cao; Xác định được tính đặc hiệu đối với

cơ chất lipid của lipase thô thu nhận được từ nguồn thực vật; Đề xuất phương pháp tinh sạch lipase thô từ mủ đu đủ và xác định khối lượng phân tử của lipase

Tận dụng phế phẩm của quá trình thu papain từ mủ đu đủ để sản xuất lipase thô Ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi nhằm thu acid béo tạo tiền đề cho quá trình làm giàu DHA, EPA ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

6 Cấu trúc của luận án

Luận án gồm phần mở đầu; Chương 1 Tổng quan; Chương 2 Phương pháp nghiên cứu; Chương 3 Kết quả và thảo luận; kết luận

và kiến nghị

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về lipase

Lipase (Triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) thuộc lớp hydrolase, là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride để tạo glycerol và acid béo tự do tại bề mặt liên pha dầu – nước Ngoài ra, lipase còn xúc tác phản ứng chuyển vị ester và tổng hợp ester

1.2 Lipase thực vật

Lipase thực vật có nhiều ở các hạt có dầu, chứa nhiều triacylglycerol Đối với các hạt ngũ cốc, lipase được xác định có trong lớp vỏ như cám gạo, phôi lúa mì Ngoài ra, lipase còn được tìm thấy trong các loại mủ các loại quả như mủ sung, mủ vả, mủ xương rồng và mủ đu đủ

1.3 Ứng dụng của lipase thực vật

Lipase được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm để tạo ra các acid béo trong các sản phẩm thực phẩm bằng phản ứng thủy phân chọn lọc chất béo và dầu có trong thực phẩm Lipase thô từ mủ đu đủ (CPL) đã được nghiên cứu ứng dụng trong tổng hợp các triacylglycerol chuỗi ngắn và chuỗi dài dùng trong sữa công thức cho trẻ sơ sinh, tổng hợp triacylglycerol cấu trúc CPL còn được sử dụng

để tổng hợp bơ ca cao nhân tạo Từ những ứng dụng trên của CPL cho thấy nó có tiềm năng ứng dụng thương mại lớn trong ngành công nghệ thực phẩm

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới các nghiên cứu về lipase thực vật chủ yếu là chiết tách, xác định đặc tính, tinh sạch và xác định khối lượng phân

tử Trong những năm gần đây, lipase từ mủ đu đủ được quan tâm nghiên cứu nhiều về đặc tính cũng như ứng dụng Năm 2011, Slim

Abdelkafi cũng đã chiết tách enzyme thủy phân từ mủ đu đủ, xác định đặc tính hóa sinh và khẳng định enzyme chiết được thể hiện hoạt tính esterase hơn là lipase Lipase thô được xem là loại lipase

“cố định” tự nhiên trong mủ, mặc dù đã được nghiên cứu nhưng các nhà khoa học chưa thể tách được lipase ra khỏi mủ đu đủ, đó là khó khăn đang cần được nghiên cứu khảo sát Việc nghiên cứu xây dựng quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ vẫn chưa hoàn thiện Nghiên cứu ứng dụng lipase từ nguồn thực vật cho ngành công nghệ thực phẩm vẫn còn hạn chế

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Đậu nành (Glycine max): giống ĐTDH.02 do Viện Khoa học

Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung Bộ cung cấp, đậu

phộng (Arachis hypogaea L.): trồng ở Đắk Lắk, cám gạo: thu nhận từ

nhà máy xay xát lúa ở Quảng Ngãi, phôi lúa mì: thu nhận từ nhà máy bột mì Việt Ý - Đà Nẵng, mủ đu đủ: thu từ một số vườn đu đủ

(Carica papaya) trồng tại xã Đại An, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam, Mủ quả vả (Ficus auriculata) và mủ quả sung (Ficus

racemosa) được thu nhận từ vườn của các hộ nông dân ở các tỉnh

Thừa Thiên Huế

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu: độ

ẩm và hàm lượng tro được xác định theo phương pháp của AOAC 952.08 và AOAC 938.08 (1990), hàm lượng protein thô được xác định bằng phương pháp Kjeldahl, hàm lượng chất béo được xác định bằng phương pháp chiết Soxhlet

- Phương pháp thu nhận lipase từ các nguồn thực vật: đậu

phộng, đậu nành nảy mầm; cám gạo, phôi lúa mì; mủ đu đủ, mủ sung

và mủ vả Mục tiêu: thu lipase, xác định hoạt độ, khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt độ lipase từ đó lựa chọn nguồn nguyên liệu để thu lipase cho nghiên cứu tiếp theo

- Phương pháp xác định hoạt độ lipase:

+ Phương pháp chuẩn độ: Đơn vị hoạt độ lipase (U/g hoặc U/ml) được xác định là lượng enzyme cần thiết để xúc tác giải phóng

ra 1μmol acid béo tự do trong thời gian 1 phút ở điều kiện xác định

Cơ chất sử dụng trong phương pháp chuẩn độ gồm: dầu oliu, dầu cá hồi, triolein, tristearin

+ Phương pháp đo quang: Lipase xúc tác phản ứng thủy phân

cơ chất p-nitrophenyl palmitate (p-NPP) tạo ra p-nitrophenol (p-NP)

biểu hiện màu vàng đặc trưng Hoạt độ của lipase được xác định bằng cách đo cường độ màu của dung dịch chứa p-NP trên máy UV-VIS ở bước sóng λ = 410 nm

Đơn vị hoạt độ được tính là lượng enzyme cần thiết để xúc

tác giải phóng ra 1 µmol p-NP trong một phút

Hiệu suất thu nhận lipase (mU/g) được xác định bằng tổng hoạt độ lipase (mU) thu nhận được từ 1 gam nguyên liệu ban đầu Tổng hoạt độ lipase = hoạt độ lipase thô ×khối lượng lipase thô thu được (2.1)

(2.2)

- Phương pháp xây dựng quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ: xác định phương pháp bảo quản mủ đu đủ bằng phơi nắng, sấy đối lưu, sấy thăng hoa, trữ đông; nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nước để rửa lượng tạp chất, nghiên cứu xác định số lần lặp rửa/ly tâm, nghiên cứu xác định phương pháp sấy để thu lipase thô

- Phương pháp chiết tách và tinh sạch lipase từ mủ đu đủ: dùng dung dịch Tris HCl 0,1M pH 8 có chứa SLS 0,5% để hòa tan lipase thô, kết hợp các phương pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat, thẩm tách qua màn Cellophan, sắc ký trao đổi ion trên cột sắc ký HiTrap Q Sepharose Fast flow Mục tiêu: thu nhận lipase tinh sạch từ mủ đu đủ

- Phương pháp xác định tính chất của lipase tinh sạch: khối lượng phân tử lipase được xác định bằng phương pháp điện di SDS, giá trị Km và Vmax được xác định dựa trên phương trình Lineweaver – Burk

- Phương pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ: phương pháp thu nhận dầu cá hồi, các chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số iod của dầu cá được xác định lần lượt theo TCVN 6127:2010, TCVN 6126:2015, TCVN 6122:2010; thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi được xác định theo phương pháp AOAC 996.06; phương pháp thủy phân dầu cá hồi bằng CPL trong hệ nhũ tương dầu/nước và hệ 2 pha iso-octan/nước được xác định thông qua hiệu suất thủy phân DH %

(2.3)

- Phương pháp xác định năng lượng hoạt hóa (EA) của phản ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL được xác định dựa trên đồ thị phương trình Arrhenius

- Các phương pháp toán học: tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay cấp II theo Box và Hunter, sử dụng phần mềm Minitab 18 để

xử lý số liệu thực nghiệm

Các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp để lấy giá trị trung bình và xác định độ lệch chuẩn bằng Microsoft Excel Sự khác biệt có nghĩa giữa các kết quả thí nghiệm được đánh giá bằng kiểm định Fisher (p 0,05) bằng phần mềm Minitab 18

Các chữ số a, b, c, trên các đồ thị và các bảng thể hiện sự khác biệt có nghĩa của các kết quả nghiên cứu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn thực vật

3.1.1 Hoạt tính lipase từ các loại hạt có dầu nảy mầm

3.1.1.2 Ảnh hưởng của thời gian nảy mầm đến hoạt tính lipase của hạt đậu nành và đậu phộng nảy mầm

Lipase từ hạt chứa dầu được tìm thấy có hoạt độ cao trong giai đoạn nảy mầm Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ lipase tối đa từ đậu nành nảy mầm thu được sau 3 ngày (0,82U/ml) trên cơ chất dầu oliu Giá trị này cao hơn so với hoạt độ lipase tối đa từ hạt đậu phộng nảy mầm (0,72 U/ml) Do đó lipase từ hạt đậu nành nảy mầm được

lựa chọn để nghiên cứu các đặc tính tiếp theo

3.1.1.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy mầm

Từ 20 gam đậu nành nảy mầm thu được 2,08 gam lipase thô

Kết quả nghiên cứu cho thấy lipase từ hạt đậu nành nảy mầm hoạt động tối ưu ở 30 oC, pH 9 trên cơ chất p-NPP Các ion kim loại

Ca2+, Mg2+ ở nồng độ 0,1M làm tăng hoạt độ của lipase từ đậu nành nảy mầm, Na+

và K+ làm giảm hoạt độ của lipase từ đậu nành nảy mầm

3.1.2 Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nông nghiệp: cám gạo và phôi lúa mì

Kết quả nghiên cứu cho thấy từ 40 g cám gạo thu được 176,6 ml dịch enzyme thô; từ 40 g phôi lúa mì thu được 182 ml dịch enzyme thô

Lipase từ cám gạo và phôi lúa mì có cùng nhiệt độ tối ưu ở

45 °C Lipase cám gạo hoạt động tối ưu ở pH 8 với hoạt độ lipase 0,238 mU/ml Lipase từ phôi lúa mì hoạt động tối ưu ở pH 9,5 với hoạt độ 0,199 mU/ml Sự có mặt của các ion kim loại như Mg2+

,

Cu2+, Na+, Mn2+ và EDTA ở nồng độ 0,1M đều làm giảm hoạt độ lipase cám gạo, lipase phôi lúa mì

3.1.3 Hoạt tính lipase từ mủ của các loại quả

Từ 17,25 g mủ đu đủ tươi thu được 0,58 g lipase thô Lipase thô từ mủ đu đủ (CPL) hoạt động tối ưu ở 45 oC, pH 8,5 với hoạt độ

lớn nhất đạt được là 120,43 mU/g trên cơ chất p-NPP

Từ 71,58 g mủ vả thu được 49,34 ml dịch lipase thô Từ 60,25

g mủ sung thu được 41,69 ml dịch lipase thô

Lipase từ mủ sung và mủ vả có cùng nhiệt độ tối ưu 45 oC trên

cùng cơ chất p – NPP Lipase từ mủ sung hoạt động tối ưu ở pH 8,5

còn lipase từ mủ vả hoạt động tối ưu ở pH 9 Sự có mặt của các ion

K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, EDTA ở nồng độ 0,1M đều làm giảm hoạt độ của lipase từ mủ sung và mủ vả

3.1.4 Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật khác nhau

Từ các kết quả nghiên cứu thu nhận lipase và khảo sát các yếu

tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ các nguồn thực vật khác nhau ở các thí nghiệm trên, khả năng thu nhận lipase thô từ các nguồn thực vật có thể được tổng kết ở Bảng 3.4

Bảng 3.4 Hiệu quả thu nhận lipase từ các nguồn thực vật

STT Nguồn

thu nhận

Dạng chế phẩm lipase thô

Điều kiện hoạt động tối ƣu

Hoạt độ riêng của chế phẩm

Hiệu quả thu nhận lipase (mU/g nguyên liệu)

đu đủ là nhiều tiềm năng nhất Vì mủ đu đủ từ lâu đã được khai thác

để thu nhận papain ở quy mô công nghiệp, nên đây là nguồn nguyên

liệu dễ kiếm, rẻ tiền Vì lipase có ở phần rắn không tan của mủ đu

đủ, papain có trong phần hoà tan được trong nước của mủ đu đủ, điều này cho phép thu nhận đồng thời lipase và papain từ một nguồn nguyên liệu và trong một quy trình kết hợp

Cho đến nay, chưa có một quy trình thu nhận lipase từ mủ đu

đủ với đầy đủ các thông số tối ưu được công bố, do đó mủ đu đủ được chọn là đối tượng để nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất lipase thô và đánh giá khả năng ứng dụng của nó trong các nghiên cứu tiếp theo của luận án

3.2 Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ

3.2.1 Nghiên cứu phương pháp sấy để bảo quản mủ đu đủ

Từ nguồn mủ thô ban đầu thu nhận trực tiếp từ quả đu đủ vào lúc sáng sớm, mủ đu đủ được đem đi làm khô đến khối lượng không đổi theo 3 phương pháp khác nhau: phơi nắng, sấy đối lưu (55 oC, 36 giờ), sấy thăng hoa (-40 oC, 16 giờ)

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các phương pháp sấy khác nhau lên

hoạt độ lipase

Phương pháp sấy

nguyên liệu ban đầu

Độ ẩm (%)

Hoạt độ lipase (mU/g CK) Phơi nắng 11,8 27,68 ± 1,02

Sấy đối lưu 11,3 18,22 ± 0,78

Sấy thăng hoa 9,13 120,35 ± 4,59

Mủ đu đủ sau sấy thăng hoa có hoạt độ cao nhất (120,35 mU/g CK), cao gần gấp 4 lần so với phương pháp sấy đối lưu và hơn 6 lần

so với phơi nắng Vậy sấy thăng hoa là phương pháp sấy tốt nhất để làm khô mủ đu đủ trước khi bảo quản trong số các phương pháp sấy

đã nghiên cứu

b) Nghiên cứu bảo quản mủ đu đu tươi bằng phương pháp lạnh đông

Kết quả theo dõi hoạt độ lipase sau các khoảng thời gian trữ đông được thể hiện ở Bảng 3.6

Bảng 3.6 Sự thay đổi hoạt độ lipase của mủ đu đủ

theo gian trữ đông

Thời gian trữ đông (tuần) Hoạt độ lipase (mU/g CK) Mẫu đối chứng 129,61 ± 7,08a

Do đó nếu thu lipase từ nguyên liệu mủ tươi thì mủ đu đủ có thể bảo quản trữ đông đến 5 tuần, còn nếu mủ cần để thời gian dài thì chọn phương pháp sấy thăng hoa mủ là tối ưu

3.2.2 Thu nhận enzyme thô

3.2.2.1 Chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nước

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến hiệu quả

thu nhận lipase thô