Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG    PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

  

PHAN THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA

LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

ĐÀ NẴNG 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

PHAN THỊ VIỆT HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA

LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

ĐÀ NẴNG 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Người cam đoan

Phan Thị Việt Hà

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Phương pháp nghiên cứu 4

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 4

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 4

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5

6 Bố cục của luận án 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan về lipase 6

1.1.1 Nguồn thu nhận lipase 7

1.1.2 Cấu trúc và cơ chế xúc tác của lipase 8

1.1.3 Tính đặc hiệu của lipase 10

1.1.4 Các hệ phản ứng cho lipase xúc tác 11

1.2 Lipase thực vật 12

1.2.1 Khả năng xúc tác của lipase thực vật 12

1.2.2 Một số nguồn lipase từ thực vật 13

1.2.3 Phương pháp chiết tách lipase từ thực vật 17

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của lipase thực vật 19

1.2.5 Ứng dụng của lipase thực vật 21

1.2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 21

1.2.5.2 Trong công nghiệp dược 22

1.2.5.3 Trong các lĩnh vực khác 23

1.3 Dầu cá và ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá 24

1.3.1 Dầu cá 24

1.3.2 Ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá 26

1.4 Lược sử vấn đề nghiên cứu 28

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 28

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 34

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Nguyên liệu 38

2.1.1 Nguyên liệu hạt 38

2.1.2 Nguyên liệu phụ phẩm nông nghiệp (cám gạo, phôi lúa mì) 38

2.1.3 Nguyên liệu mủ từ các loại quả 39

2.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 40

2.2.1 Hóa chất 40

2.2.2 Thiết bị 40

2.3 Nội dung nghiên cứu 41

2.4 Bố trí thí nghiệm 42

2.4.1 Phần 1: Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật: đậu nành, đậu phộng nảy mầm, cám gạo, phôi mì, mủ sung, mủ vả, mủ đu đủ 42

2.4.2 Phần 2: Nghiên cứu thu nhận lipase thô từ mủ đu đủ 49

2.4.3 Phần 3: Chiết tách và tinh sạch lipase từ lipase thô mủ đu đủ 51

2.4.4 Phần 4: Nghiên cứu tính chất của lipase tinh sạch 52

2.4.5 Phần 5: Phương pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô 53

2.5 Phương pháp phân tích 61

2.5.1 Phương pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu 61

2.5.2 Phương pháp xác định hoạt độ lipase bằng phương pháp chuẩn độ 61

2.5.3 Phương pháp xác định hoạt độ lipase bằng phương pháp đo quang 62

2.5.4 Phương pháp xác định hoạt độ lipase bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch 62

2.5.5 Phương pháp xác định điểm đẳng điện của lipase 62

2.5.6 Phương pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat 63

2.5.7 Phương pháp tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion 63

2.5.8 Phương pháp điện di 64

2.5.9 Phương pháp xác định đặc tính hóa lý của dầu cá 64

2.5.10 Phương pháp xác định thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi 65

2.5.11 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác bởi CPL 65

2.5.12 Phương pháp xác định các thông số động học Km và Vmax của phản ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL 65

2.5.13 Phương pháp xác định năng lượng hoạt hóa 66

2.5.14 Phương pháp phân tích số liệu thực nghiệm 67

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68

3.1 Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn thực vật 68

3.1.1 Hoạt tính lipase từ các loại hạt có dầu nảy mầm 68

3.1.2 Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nông nghiệp: cám gạo và phôi lúa mì 74

3.1.3 Hoạt tính lipase từ mủ của các loại quả 79

3.1.4 Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật khác nhau 86

3.2 Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 87

3.2.1 Các phương pháp bảo quản mủ đu đủ 87

3.2.2 Thu nhận enzyme thô 90

3.2.3 Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của lipase thô từ mủ đu đủ trên các cơ chất khác nhau 96

3.3 Tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ 99

3.3.1 Chiết tách lipase mủ đu đủ bằng muối sodium lauroyl sarcosinate (SLS) 99

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ SLS lên hoạt độ lipase 101

3.3.3 Tủa lipase bằng dung dịch amoni sunfat (AS) 102

3.3.4 Kết quả xác định điểm đẳng điện của protein enzyme 103

3.3.5 Kết quả tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ bằng sắc ký trao đổi ion 104

3.4 Tính chất của lipase tinh sạch 104

3.4.1 Kết quả xác định khối lƣợng phân tử lipase 104

3.4.2 Xác định Km và Vmax 105

3.5 Đánh giá khả năng ứng dụng lipase mủ đu đủ trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA và EPA 106

3.5.1 Một số đặc điểm của dầu cá hồi thô 106

3.5.2 Xác định thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi 107

3.5.3 Ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi 109

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 127

A KẾT LUẬN 127

B NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 128

C KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 128

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 129

TÀI LIỆU THAM KHẢO 130

DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DHA Docosahexaenoic acid

EPA Eicosapentaenoic acid

PUFAs Polyunsaturated fatty acids Acid béo không bão hòa

nhiều nối đôi

p-NPP Para-nitrophenyl palmitate

p-NP Para-nitrophenol

TAG Triacylglycerol

SLS Sodium Lauroyl Saccosine

CHAPS

3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate

EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid Acid

etylenediaminetetraacetic

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất của một số lipase có nguồn gốc từ hạt [72] 14 Bảng 1.2 Tính chất của lipase từ một số loại hạt chứa dầu 30 Bảng 1.3 Tính chất của lipase từ một số loại hạt ngũ cốc 31 Bảng 1.4 Tính chất của lipase từ một số loại mủ 32 Bảng 2.1 Một số hóa chất chính d ng trong nghiên cứu 40 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt

độ, pH và các ion kim loại đến hoạt độ lipase 48 Bảng 2.3 Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 55

Bảng 2.5 Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 56

Bảng 2.7 Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm 60

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của hạt đậu nành, đậu phộng 68 Bảng 3.2 Thành phần hóa học của cám gạo và phôi lúa mì 75

Bảng 3.4 Hiệu quả thu nhận lipase từ các nguồn thực vật 86 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các phương pháp sấy khác nhau lên hoạt độ

Bảng 3.14 Thành phần và hàm lượng acid béo trong dầu cá hồi 108 Bảng 3.15 Phần trăm acid béo có trong dầu cá hồi trước và sau khi

thủy phân

110

Bảng 3.16 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 111 Bảng 3.17 Giá trị các hệ số b trong phương trình hồi quy và xác suất p 112 Bảng 3.18 Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 114 Bảng 3.19 Giá trị các hệ số b trong phương trình hồi quy và xác suất p 114 Bảng 3.20 Hiệu suất thủy phân dầu cá trong các hệ phản ứng khác

nhau

116

Bảng 3.21 Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 120 Bảng 3.22 Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm 121 Bảng 3.23 Tốc độ ban đầu phản ứng thu được ở các nồng độ cơ chất

khác nhau trong thủy phân dầu cá hồi bằng CPL trong thời gian 60 phút

123

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hằng số tốc độ (k) 125

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase 9 Hình 1.2 Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết ester xúc tác bởi esterase

Hình 1.5 Quy trình tổng hợp glyceride giàu DHA, EPA [37] 27 Hình 2.1 Hạt đậu nành (a) và hạt đậu phộng (b) 38

Hình 2.6 Sơ đồ quy trình thu lipase từ hạt đậu phộng, đậu nành nảy

Hình 2.10 Sơ đồ khảo sát quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme

lipase thô từ mủ đu đủ

Hình 3.6 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ lipase từ hạt đậu

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ 80 Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ 81 Hình 3.13 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ của lipase từ mủ đu

đủ

82

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ sung và mủ vả 83 Hình 3.15 Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ lipase từ mủ sung và mủ vả 84 Hình 3.16 Ảnh hưởng của ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ sung,

Hình 3.27 Sắc ký đồ của phân đoạn lipase tủa ở 50-60% AS 104

Hình 3.29 Đồ thị Lineweaver-Burk xác định Km (mM) và Vmax

(mM/min/mL) của lipase từ mủ đu đủ

106

Hình 3.30 Điều kiện tối ưu nhiệt độ, pH của phản ứng thủy phân dầu cá

trong hệ nhũ tương dầu – nước

113

Hình 3.31 Điều kiện tối ưu tỷ lệ nước/cơ chất và nồng độ enzyme của

phản ứng thủy phân dầu cá trong hệ nhũ tương dầu – nước

Hình 3.36 Biểu đồ thể hiện sự thay đổi tốc độ phản ứng theo thời gian

trong thủy phân dầu cá hồi bằng CPL

123

Hình 3.37 Biểu đồ Lineweaver-Burk thủy phân dầu cá bằng CPL 124 Hình 3.38 Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá bằng CPL 125 Hình 3.39 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của quá trình

thủy phân

126

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Lipase hay Triacylglycerol acylhydrolase (E.C 3.1.1.3) là loại enzyme có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol mạch dài tạo thành diacylglycerol, monoacylglycerol, glycerol và các acid béo tự do tại các bề mặt liên pha giữa nước và dung môi hữu cơ Khác với esterase ở cơ chất thủy phân, lipase được định nghĩa là carboxylesterase có khả năng xúc tác thủy phân acylglycerol với gốc acyl có mạch dài trên 10 nguyên tử carbon Ngoài ra, lipase còn tham gia xúc tác các phản ứng chuyển vị ester và cả phản ứng tổng hợp ester trong môi trường ít nước [105]

Năm 2010, thị phần enzyme toàn cầu trong công nghiệp được ước tính khoảng 3,3 tỷ đô la Lipase đứng thứ ba trong số các enzyme đang được thương mại hóa chỉ sau protease và carboxylase [35] Đến năm 2016, thị phần enzyme trên thế giới được sản xuất và ứng dụng trong công nghiệp ước tính đạt 5 đến 5,5 tỷ đô la Trong đó, lipase chiếm gần 10% thị phần enzyme toàn cầu, với một loạt các ứng dụng trong các ngành công nghiệp như sản xuất chất tẩy rửa, chế biến dầu, chế biến thực phẩm và dược phẩm [56] Điều này cho thấy ngành công nghệ enzyme, trong

đó có lipase đang phát triển đầy triển vọng

Lipase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như: vi khuẩn (45%), nấm (21%), động vật (18%), thực vật (11%) và vi tảo (3%) [91] Lipase trong công nghiệp chủ yếu được phân lập từ vi sinh vật và một phần từ thực vật So với lipase

từ vi sinh vật, lipase từ thực vật có những ưu điểm quan trọng như:

- Dễ được người tiêu dùng chấp nhận trong thực phẩm, dược phẩm hơn, ngay

Do đó, lipase thực vật thu hút sự quan tâm ngày càng nhiều của các nhà nghiên cứu

Lipase thực vật thường được tìm thấy trong các loại hạt chứa dầu, ngũ cốc (hạt cải, đậu phộng, đậu nành, yến mạch, v.v…) cũng như các thực vật có chứa

nhiều mủ như Asclepiadaceae, Sapotaceae, Euphorbiaceae, Moraceae,

Papaveraceae và Asteraceae

Nhiều nghiên cứu về đặc tính và ứng dụng lipase thực vật thu được từ mủ cho thấy chúng có thể thay thế cho các lipase vi sinh vật Lipase đã được tìm thấy trong mủ xương rồng, mủ sung và đã được tinh sạch và xác định được khối lượng phân tử [52], [53] Lipase từ mủ đu đủ được xác định là enzyme cố định trong mủ [18], được sử dụng trong điều chỉnh cấu trúc của glycerolipid [50], tổng hợp ester terpene [127], tổng hợp bơ ca cao nhân tạo [94]

Trong hạt có dầu, lipase có chức năng thủy phân triglyceride để tạo glycerol

và acid béo, cung cấp năng lượng cần thiết cho sự nảy mầm hạt và phát triển cây con [25]

Trên thế giới, mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu về lipase thực vật từ chiết tách, khảo sát đặc tính, tinh sạch lipase đến ứng dụng Nhưng cho đến nay chỉ mới 29 loại lipase từ thực vật đã được xác định khối lượng phân tử cũng như trình

tự acid amin trong chuỗi protein [108] Việc nghiên cứu chiết tách và tinh sạch lipase từ thực vật còn gặp nhiều thách thức do hàm lượng lipid và phenolic trong mẫu cao dẫn đến lipase kém bền và dễ bị biến tính trong quá trình chiết tách Trong quy trình thu lipase từ hạt nảy mầm, thời gian nảy mầm kéo dài có thể cho hoạt độ lipase cao, nhưng cũng có thể chịu ảnh hưởng của sự nhiễm vi sinh vật [108] Ngoài

ra, quá trình sấy khô hạt cũng làm lipase mất hoạt tính

Tương tự, các nghiên cứu về cấu trúc của lipase thực vật cũng gặp những khó khăn vì khó thu được cấu trúc tinh thể và mẫu có độ đồng đều không cao [108] Điển hình là trường hợp lipase từ mủ đu đủ Một số tác giả ngoài nước đã nghiên cứu chiết tách, tinh sạch để xác định cấu trúc phân tử của lipase từ mủ đu đủ, nhưng gặp phải những khó khăn do lipase này có bản chất cố định tự nhiên trong mủ đu

đủ, rất khó giải phóng ra Tất cả các nỗ lực để chiết tách lipase này ra khỏi mủ đu

đủ đều không thành công [17]

Trong khi đó, những công trình nghiên cứu ở trong nước về lipase còn ít, chủ yếu là nghiên cứu về phân lập lipase từ vi sinh vật và thu lipase từ nội tạng các loài

cá, nghiên cứu về lipase từ thực vật là lĩnh vực hầu như không được quan tâm

Với những ưu điểm nổi bật được trình bày ở trên, việc nghiên cứu khai thác nguồn enzyme lipase từ thực vật được đánh giá có tiềm năng mang lại những lợi ích lớn về mặt kinh tế cho ngành công nghệ enzyme

Việt Nam có nguồn thực vật đa dạng và phong phú và lượng lớn phế phẩm từ thực vật có tiềm năng thu được lipase chất lượng tốt, tuy nhiên chúng chưa được

quan tâm nghiên cứu Do đó, đề tài được chọn cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận,

đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm" thực sự có ý nghĩa khoa học và thực tiễn

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của luận án là đánh giá khả năng khai thác lipase từ các nguồn thực vật sẵn có ở Việt Nam và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, thông qua đó có thể tạo ra sản phẩm có giá trị cao từ nguồn thực vật phổ biến ở Việt Nam

Mục tiêu cụ thể như sau:

1 - Đánh giá hoạt tính lipase thu nhận từ một số nguồn thực vật:

+ Hạt có dầu + Phụ phẩm nông nghiệp + Mủ các loại quả

2 - Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận lipase thô từ nguồn thực vật;

3 - Xác định các đặc tính hoá sinh của lipase thô và lipase tinh sạch;

4 - Đánh giá khả năng ứng dụng lipase thô trong công nghiệp thực phẩm

3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu như trên, đề tài xác định các nội

- Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu thực vật thích hợp để thu nhận lipase;

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase thu được;

- Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thô có hoạt độ cao từ nguyên liệu đã lựa chọn;

- Nghiên cứu khảo sát các đặc tính hoá sinh của lipase thô;

- Nghiên cứu tinh sạch lipase thô và xác định đặc tính hoá sinh của lipase tinh sạch;

- Nghiên cứu ứng dụng lipase thô trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA

và EPA

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo, các công trình đã nghiên cứu về enzyme lipase

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Các phương pháp xác định thành phần nguyên liệu thực vật gồm: phương pháp xác định độ ẩm, hàm lượng tro tổng, hàm lượng protein, hàm lượng chất béo

- Các phương pháp thu nhận lipase từ đậu phộng nảy mầm, đậu nành nảy mầm, cám gạo, phôi lúa mì, mủ đu đủ, mủ vả và mủ sung

- Các phương pháp xác định hoạt độ lipase: phương pháp chuẩn độ, phương pháp đo quang, phương pháp đĩa thạch

- Các phương pháp tinh sạch lipase: xác định điểm đẳng điện, phương pháp tủa bằng amoni sunfat, phương pháp sắc ký trao đổi ion, phương pháp điện di

- Các phương pháp hóa lý xác định chỉ tiêu chất lượng dầu cá hồi: chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số ester

- Các phương pháp toán học: phương pháp quy hoạch thực nghiệm, phương pháp tối ưu hoá

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Từ những nội dung nghiên cứu được định ra trong luận án sẽ toát lên ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn như sau:

* Ý nghĩa khoa học

- Đánh giá được khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn nguyên liệu thực vật, ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt độ của chế phẩm, từ đó xác định được nguồn nguyên liệu thực vật có tiềm năng để khai thác enzyme lipase

- Đề xuất được quy trình thu lipase thô từ nguồn thực vật có hiệu quả cao

- Xác định được tính đặc hiệu đối với cơ chất lipid của lipase thô thu nhận được từ nguồn thực vật

- Đề xuất phương pháp tinh sạch lipase thô từ mủ đu đủ và xác định khối lượng phân tử của lipase

6 Bố cục của luận án

MỞ ĐẦU

Chương 1: TỔNG QUAN

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về lipase

Lipase (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) thuộc lớp hydrolase, là enzyme hoạt động tốt tại bề mặt liên pha dầu – nước Tiềm năng xúc tác của lipase được biết đến từ năm 1930 theo công trình công bố của JBS Haldane và cộng sự [38]

Lipase có thể tham gia xúc tác cho rất nhiều phản ứng khác nhau như thủy phân, chuyển ester, tổng hợp ester Lipase xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride tạo glycerol và acid béo, đây là phản ứng đặc trưng của lipase Ngoài ra, trong điều kiện ít nước, lipase còn có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp ester, chuyển ester Các phản ứng xúc tác bởi lipase [106] được thể hiện như sau:

1.1.1 Nguồn thu nhận lipase

Lipase được phân bố rộng rãi ở vi sinh vật, động vật và thực vật Lipase vi

sinh vật đã được một số tác giả thu nhận từ Pseudomonas [128], Bacillus sp LBN 4 [27], Staphylococcus epidermidis [63], Acinetobacter sp CR9 [68] Lipase chịu nhiệt từ nấm Rhizopus homothallicus cũng đã được chiết tách bởi Diaza và cộng sự

năm 2006 [41]

Ở động vật, lipase được thu nhận chủ yếu từ tụy tạng của trâu, bò, cừu, lợn,

và một số loại cá Lipase ở động vật đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa lipid Một số tác giả đã thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc, cá tra [11], [12] Trong các loại côn tr ng, lipase được tìm thấy trong cơ, huyết tương, ống tiêu hóa và các tuyến nước bọt

Thực vật có thể là nguồn cung cấp lipase quan trọng khi xét đến những ưu điểm như giá thành thấp, tính đặc hiệu, dễ dàng được chấp nhận và có thể ứng dụng

Nguồn lipase từ thực vật rất đa dạng và phong phú, có thể thu nhận từ các nguồn thực vật có sẵn trong tự nhiên mà không cần quy trình nuôi cấy nghiêm ngặt như lipase từ vi sinh vật Lipase chủ yếu hiện diện ở dạng dự trữ trong các mô của các hạt đang phát triển hoặc đặc biệt ở những nơi chứa lượng lớn triacylglycerol Hoạt động lipase của hạt tăng lên trong suốt quá trình nảy mầm vì triacylglycerol cần được chuyển hoá thành glycerol và các acid béo bằng phản ứng thủy phân bởi lipase, sau đó các chất này được chuyển hoá tiếp thành các phân tử đường hòa tan, vận chuyển đến các mô đang phát triển để cung cấp nguồn carbon và năng lượng hỗ trợ cho sự phát triển của cây non [91] Lipase từ một số loại hạt cũng đã được các

tác giả nghiên cứu chiết tách như phôi dừa (Cocos nucifera linn) [43], hạt của hoa

hướng dương [103], hạt lupin vàng nảy mầm [28], hạt nguyệt quế [59], hạt hạnh nhân [126] Lipase cũng được nghiên cứu ở một số loại ngũ cốc như các loại đậu nành [73], yến mạch [64], cám gạo [62] Ngoài ra lipase từ thực vật cũng có ở phần

mủ của một số loại quả như mủ đu đủ [17], mủ sung [53], mủ xương rồng [52]

1.1.2 Cấu trúc và cơ chế xúc tác của lipase

Ngày nay, hàng trăm loại lipase đã được xác định cấu trúc không gian 3

chiều trong cơ sở dữ liệu protein

Lipase từ các nguồn gốc khác nhau, thường khác nhau về kích thước phân tử

và có rất ít các trình tự tương đồng Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu các lipase đã được kết tinh cho thấy hầu hết chúng là những protein có cấu trúc α/β với một trung tâm là các cấu trúc gấp nếp β được bao quanh bởi một số dải xoắn α [106]

Theo Abdelmonaem và cộng sự (2011), mô hình enzyme Arabidopsis

thaliana lipase đã được xác định có dạng monomer dạng α/β bao gồm 8 chuỗi gấp β

xen lẫn với 22 chuỗi xoắn α Lipase này cũng có cấu trúc tương tự như cấu trúc lipase từ động vật và vi khuẩn, nhưng chỉ khác nhau về số lượng của chuỗi xoắn α

và gấp nếp β Hình 1.1 thể hiện cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase [76]

Trung tâm hoạt động của lipase được hình thành bởi bộ ba xúc tác bao gồm các acid amin: serine, histidine và acid aspartic/acid glutamic [72] Trung tâm hoạt

động của cả lipase và protease tương tự nhau về mặt hóa học nhưng có cấu trúc

khác nhau

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc 3D của Arabidopsis thaliana lipase [76]

Hình 1.2 Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết ester xúc tác bởi esterase và

lipase [101]

ester; (b) tứ diện trung gian; (c) acyl-enzyme trung gian và tấn công nucleophilic bằng nước; (d) tứ diện trung gian; (e) enzyme tự do

Do sự giống nhau của bộ ba xúc tác được tìm thấy trong lipase so với những

gì được quan sát trong serine protease, nên cơ chế xúc tác lipase được cho là tương

tự như xúc tác của serine protease [60]

Cơ chế phản ứng xúc tác thủy phân bởi lipase được thể hiện ở Hình 1.2 Phản ứng bắt đầu do nhóm -OH của serine thuộc trung tâm hoạt động enzyme tấn công nucleophin vào carbon của liên kết ester trong cơ chất tạo thành phức acyl - enzyme

và giải phóng ancol từ lipid Sau đó, phức acyl - enzyme bị thủy phân và lipase tự

do được giải phóng trở lại

1.1.3 Tính đặc hiệu của lipase

Mỗi loại lipase xúc tác chuyển hóa một loại cơ chất nhất định hay một kiểu

phản ứng hóa học nhất định, đó chính là tính đặc hiệu của lipase

Theo Villeneuve (2003) và cộng sự, tính đặc hiệu của lipase có thể chia thành 3 nhóm chính như sau:

- Đặc hiệu cơ chất: cơ chất tự nhiên của lipase là glycerol ester Lipase không những xúc tác thủy phân triacylglycerol (TAG), mà còn thủy phân di- và monoacylglycerol và thậm chí là phospholipid [25] Điều này thể hiện lipase xúc tác trên các cơ chất glycerol ester có các chuỗi acid béo dài hoặc ngắn khác nhau Tính đặc hiệu cơ chất được xác định bằng cách ủ enzyme với cơ chất và xác định hoạt độ

enzyme Cơ chất được sử dụng là các ester của p–nitrophenyl có chiều dài chuỗi

carbon khác nhau Trong một số nghiên cứu, cơ chất triglyceride với các chuỗi acid béo bão hòa, chưa bão hòa khác nhau cũng được sử dụng để xác định tính đặc hiệu

cơ chất của lipase Theo nghiên cứu của S Abdekafi và cộng sự cho thấy enzyme chiết tách từ mủ đu đủ có tính đặc hiệu cơ chất trên tributyrin với hoạt độ cao nhất (168 ± 9,8 U/mg) so với cơ chất trioctanoin (14 ± 3,0 U/mg) và dầu oliu (8 ± 1,3 U/mg) [17]

- Đặc hiệu vị trí (Regioselective): lipase chỉ thủy phân triacylglycerol ở vị trí liên kết C1 và C3 của glycerol, tạo ra acid béo, 2-monoacylglycerol và 1,2 hoặc 2,3 -

diacylglycerol, hai chất này không bền, chuyển nhóm acyl tạo sản phẩm 1,3 - diacylglycerol và 1- hoặc 3–monoacylglycerol Đối với lipase không có tính đặc hiệu vị trí, chúng xúc tác thủy phân hoàn toàn triacylglycerol thành các acid béo và glycerol một cách ngẫu nhiên, tạo mono- và diacylglycerol là sản phẩm trung gian (Hình 1.3) [25]

Hình 1.3 Phản ứng xúc tác bởi lipase không đặc hiệu và đặc hiệu vị trí sn 1,

- Hệ nhũ tương: là hỗn hợp của hai chất lỏng không tan lẫn nhau Một chất (pha phân tán) được phân tán trong chất kia Chất nhũ hóa thường là chất ổn định làm bền hệ nhũ tương, thường là chất hoạt động bề mặt Hạn chế chính của hệ này đối với quá trình thủy phân lipid là cần năng lượng lớn cho quá trình đồng hóa để

trình ly tâm tách sản phẩm, cơ chất sau phản ứng [58] Hai loại chất lỏng khác nhau

có thể tạo nên hai loại hệ nhũ tương, ví dụ như nước và dầu có thể tạo thành các nhũ tương như nước trong dầu và dầu trong nước [71]

- Hệ 2 pha: là hệ trong đó tồn tại hai pha lỏng riêng biệt và các pha không trộn lẫn với nhau, chỉ các chất phản ứng hoặc sản phẩm có thể di chuyển từ pha này sang pha khác Quá trình thủy phân dầu được tiến hành trong hệ 2 pha iso -octan/nước để khắc phục một số hạn chế của hệ nhũ tương Trong hệ này, các enzyme thủy phân dễ dàng hơn và cần ít chi phí hơn Vì cơ chất dầu được hòa tan trong iso - octan và trộn với enzyme trong pha nước bằng cách khuấy trộn mà không cần năng lượng lớn để tạo hệ nhũ tương Ưu điểm của hệ này là dễ dàng phân tách chất xúc tác và sản phẩm, giảm sự ức chế của cơ chất hoặc sản phẩm Tuy nhiên, dung môi hữu cơ có thể làm biến tính enzyme khi xúc tác [29]

1.2 Lipase thực vật

1.2.1 Khả năng xúc tác của lipase thực vật

Lipase thực vật được tìm thấy ở hầu hết các hạt có dầu Lipase có khả năng xúc tác cho các phản ứng thủy phân hoặc tổng hợp nhiều loại cơ chất khác nhau Lipase từ thực vật có một số ưu điểm vượt trội hơn so với lipase từ động vật, vi sinh vật bao gồm: có tính đặc hiệu cao, giá thành thấp và được thu nhận từ những nguồn thực vật có sẵn trong tự nhiên mà không cần đến công nghệ biến đổi gen để tạo ra [25] Lipase thực vật được chiết tách thô từ các nguồn sẵn có như các loại hạt, mủ các loại quả, phụ phẩm nông nghiệp có thể được ứng dụng trực tiếp ngay trong thực phẩm mà không độc hại đối với con người Do đó, việc khai thác nguồn enzyme lipase từ thực vật được đánh giá có tiềm năng đem lại những lợi ích lớn về mặt kinh

tế cho ngành công nghệ enzyme

Lipase thực vật bao gồm các lipid acylhydrolase không đặc hiệu, phospholipase A1, A2, B, C, D, monoacylglycerol và triacylglycerol lipase Triacylglycerol acylhydrolase (TAG) lipase được tìm thấy chủ yếu trong các loại hạt có nhiều năng lượng như hạt có chứa nhiều chất béo Enzyme bền trong khoảng

pH từ 4 đến 9; nhiệt độ từ 25 oC đến 60 oC và có khối lượng phân tử khoảng 19 -

270 kDa Lipase chiết tách từ các nguồn thực vật khác nhau có đặc tính khác nhau Đặc tính của một vài loại lipase đã được xác định sau nhiều bước tinh sạch Cho đến gần đây chỉ có 29 loại lipase thực vật có khối lượng phân tử và trình tự acid amin trong chuỗi protein được công bố [108]

Điều này chứng tỏ nghiên cứu về lipase thực vật cho đến nay vẫn chưa nhiều, chúng chỉ được khảo sát ứng dụng trong một vài lĩnh vực cụ thể [108]

1.2.2 Một số nguồn lipase từ thực vật

1.2.2.1 Lipase từ hạt có dầu

Ngoài các đặc điểm chung của nhóm lipase, lipase từ hạt còn có một số đặc điểm riêng biệt Một số đặc tính của lipase thu nhận từ các loại hạt có dầu đã được một số tác giả ngoài nước nghiên cứu thu nhận thể hiện ở Bảng 1.1

Từ Bảng 1.1 cho thấy đa số lipase thực vật có nhiều ở các hạt có dầu, chứa nhiều triacylglycerol Nhìn chung lipase thu nhận từ các loại đậu hoạt động tốt ở pH gần trung tính, nhiệt độ tối ưu 30 oC và đặc hiệu với các acid béo chuỗi ngắn và

chuỗi trung bình Lipase từ hạt đậu Africa hoạt động tốt trên cơ chất dầu dừa Hầu

hết, lipase từ các loại đậu đều tăng hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân dầu oliu khi có mặt của Ca2+ Đối với các hạt hạnh nhân, hạt nguyệt quế thì lipase hoạt động tốt ở pH kiềm và nhiệt độ cao khoảng 50 oC – 65 oC [128], [59]

Bảng 1.1 Tính chất của một số lipase có nguồn gốc từ hạt [72]

Nguồn pH opt T o opt Chất hoạt hóa Chất ức chế Cơ chất Đặc hiệu vị trí Ứng dụng

(Oryza sativa)

Hạt lúa mì

Thủy phân Ester hóa.

Hoạt tính thủy phân của lipase từ mủ babaco (Vasconcellea x Heilbornii cv.)

và Plumeria trên cơ chất dầu hướng dương được nghiên cứu bởi Cambon và cộng

sự vào năm 2006 [31] Nhiệt độ tối ưu cho phản ứng thủy phân trên cơ chất dầu

hướng dương của babaco và Plumeria là 50 °C đến 55 °C Giá trị pH tối ưu của lipase từ mủ babaco là 7, trong khi lipase từ Plumeria có hai giá trị pH tối ưu 4 và 7

[31] Theo nghiên cứu của S Abdefafi và cộng sự, hoạt độ của lipase từ mủ đu đủ khi thủy phân tributyrin, dầu oliu, trioctanoin đã được xác định tương ứng là 2000 ±

185 U/g, 256 ± 8 U/g và 983 ± 29 U/g ở nhiệt độ tối ưu 37 °C và pH 9 [17] Kết quả cho thấy với cơ chất tributyrin thì hoạt tính enzyme cao chứng tỏ enzyme từ mủ đu

đủ là esterase hơn là lipase Hoạt tính lipase được thể hiện trên cơ chất có chuỗi acid béo mạch dài trên 10 carbon như dầu oliu [106] Tuy nhiên, đặc điểm thuận lợi nhất của CPL là khả năng hoạt động hiệu quả trong phạm vi rộng của pH và nhiệt độ Lipase từ mủ đu đủ có khả năng chịu nhiệt tốt bởi nó là enzyme cố định trong mủ CPL hoạt động tối ưu ở pH 9, nhiệt độ 370C trên cơ chất dầu oliu Với cơ chất tributyrin và trioctanoin, hoạt tính của CPL đạt cực đại tương ứng ở pH 8 và 9 [17] Giá trị pH tối ưu cho hoạt động của CPL tương tự như các lipase thực vật khác như lipase từ quả cọ [82] và babaco [31]

Mặc dù, mủ đu đủ chứa lipase có hoạt tính mạnh, những nỗ lực nghiên cứu

để tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ đến nay cũng chưa thành công vì chưa hòa tan được enzyme Lượng protein của phân đoạn không tan của mủ đã được phân tích bằng phương pháp điện di, kết hợp với khối phổ và đã xác định được 28 loại protein [40] CPL sẽ bị mất hoạt tính trong môi trường có Triton X100, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) và Tetradecyl Trimethylammonium Bromide (TTAB) và nó vẫn có hoạt tính cao khi có mặt của Sodium Taurodeoxycholate (NaTCD) và chất tẩy rửa ion lưỡng cực Chaps Ảnh hưởng của nhiều loại protease lên hoạt tính thủy phân của lipase cũng đã được nghiên cứu và CPL có khả năng chống lại nhiều loại enzyme, ngoại trừ trypsin Tất cả những đặc tính này đã dự đoán rằng CPL có tiềm năng ứng dụng tốt trong nhiều lĩnh vực [17]

Lipase từ mủ sung và mủ xương rồng cũng đã được thu nhận và xác định đặc

tính bởi bởi Houda Lazreg và cộng sự Lipase mủ sung có nhiệt độ tối ưu 45 oC, pH tối ưu 5,5 trên cơ chất dầu oliu [52] Lipase mủ xương rồng hoạt động tối ưu ở

40oC, pH 8 trên cơ chất tributyrin và dầu oliu và có khối lượng phân tử 40kDa

1.2.3 Phương pháp chiết tách lipase từ thực vật

Lipase thực vật thường được ứng dụng dưới dạng chiết xuất thô hoặc tinh sạch một phần, hoặc ở dạng lipase tinh khiết thu được bằng các phương pháp chiết tách

Một số phương pháp chiết tách lipase từ thực vật được mô tả dưới đây Mỗi phương pháp thường liên quan đến nhiều bước khác nhau tùy thuộc vào bộ phận của thực vật được sử dụng hoặc mức độ tinh sạch mong muốn Các bước xử lý sinh khối thường được sử dụng để chiết xuất lipase bao gồm: chuẩn bị thực vật chiết thô

và tinh sạch lipase

1.2.3.1 Chuẩn bị thực vật chiết thô

Quá trình chuẩn bị thực vật chiết thô thường bao gồm 2 bước là nghiền sinh khối và tách loại lipid sinh khối nghiền

Ngoại trừ mủ, quá trình chiết enzyme thực vật thường bắt đầu bằng cách nghiền các phần khác nhau của nguyên liệu Quá trình nghiền giúp phá vỡ sinh khối thực vật thành các hạt nhỏ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc với môi trường bên ngoài, dẫn đến tăng khả năng để enzyme tiếp xúc với dung môi chiết [73]

Tách loại bỏ lipid có trong thực vật chiết thô bằng dung môi hữu cơ là công đoạn cần thiết Lipid hiện diện trong sinh khối chủ yếu là acid béo và triacylglycerol, có thể tác động đến quá trình chiết và ảnh hưởng đến hoạt độ của lipase Quá trình tách loại lipid tạo điều kiện thuận lợi để chiết lipase trong pha nước, làm tăng năng suất chiết và tăng hoạt độ của lipase Nghiên cứu của Kapranchikov và cộng sự cho rằng loại bỏ lipid trước khi chiết enzyme giúp cải

thiện hoạt động của lipase từ mầm lúa mì (Triticum aestivum L.) gấp 1,8 lần Kazim

Kose cũng d ng acetone để loại lipid trong cám gạo trước khi chiết lipase [92]

Các dung môi hiệu quả nhất để loại lipid từ thực vật là diethyl ether, acetone

một số dung môi hữu cơ có thể ức chế hoạt động xúc tác của enzyme Trong nhiều

trường hợp, n-hexane thường cho kết quả tốt nhất, với lượng lipase tổn thất không đáng kể và n-hexan có tính dễ bay hơi Theo Hassanien, acetone lạnh (20 oC) cũng

có thể là một dung môi tốt d ng để loại lipid Vì acetone có thể bảo tồn được hoạt tính của lipase [92]

1.2.3.2 Tinh sạch lipase thực vật

Quá trình tinh sạch lipase thực vật nhằm thu được lipase tinh khiết, tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu về đặc tính và cấu trúc của chúng Thông thường, kỹ thuật tinh sạch lipase gồm các quá trình: chiết enzyme với dung dịch đệm, kết tủa, sắc ký cột Quá trình này áp dụng đối với các loại lipase tan được trong nước Còn đối với lipase không tan trong nước như lipase từ mủ đu đủ thì cần có bước tiền chiết tách ban đầu là sử dụng dung dịch chứa các chất hoạt động bề mặt để lôi kéo lipase ra khỏi cấu trúc mủ đu đủ Một vài nổ lực nghiên cứu tách lipase ra khỏi mủ

đu đủ nhưng chưa thành công Điều này có thể được giải thích là do lipase có liên kết cộng hóa trị với các polymer isopren có trong mủ Do đó Abdelkafi và cộng sự

đã sử dụng dung dịch đệm Tris – HCl pH 8 chứa chất hoạt động bề mặt CHAPS 20mM để hòa tan mủ đu đủ tách một phần enzyme Tuy nhiên, kết quả xác định đặc tính cho thấy enzyme này thể hiện hoạt tính esterase hơn là hoạt tính lipase [17]

CHAPS có tên hóa học là propanesulfonate hydrate, là chất hoạt động bề mặt lưỡng cực d ng để hòa tan protein SLS có tên gọi là Sodium N–Lauroyl Methyl Glycinate được cấu tạo bởi muối natri của acid béo và amino acid là Sarcosine (Methyl Glycinate), là chất hoạt động bề mặt anion Chất hoạt động bề mặt này có thể lôi kéo protein ra khỏi cấu trúc polymer của mủ đu đủ

3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-Dựa trên cơ sở này, dung dịch Tris – HCl pH 8 chứa chất hoạt động bề mặt SLS được lựa chọn trong nghiên cứu này để tách lipase ra khỏi cấu trúc mủ đu đủ

Bước tiếp theo của quá trình chiết lipase là kết tủa Kỹ thuật phổ biến nhất được áp dụng để kết tủa protein lipase là phương pháp kết tủa phân đoạn bằng amoni sunfat (AS) Lipase từ hạt và vỏ quả đu đủ cũng đã được chiết tách và tủa

bằng AS [90], lipase từ hạt yến mạch tủa bằng AS bão hòa 50% có hoạt độ cao gấp 1,97 lần so với lipase thô ban đầu [64]

Qua nghiên cứu của một số tác giả cho thấy hoạt độ lipase cao nhất thường đạt được ở các phân đoạn tủa với dung dịch AS bão hòa nồng độ dao động từ 60% đến 90% Để quá trình thu hồi lipase hiệu quả sau bước kết tủa, cần có bước loại bỏ muối AS bằng phương pháp thẩm tách

Ngoài kết tủa bằng AS, còn có thể kết tủa acetone theo tỷ lệ thích hợp Dung môi hữu cơ thường ít được sử dụng hơn vì dễ gây biến tính không thuận nghịch đối với các protein lipase [80]

Sắc ký là phương pháp được áp dụng phần lớn trong quá trình tinh sạch các lipase thực vật sau bước kết tủa (tiền tinh sạch) Sắc ký tách các protein khác nhau chứa trong kết tủa dựa trên ái lực của chúng với pha tĩnh Các kỹ thuật được áp dụng nhiều nhất là sắc ký trao đổi ion và sắc ký tương tác kỵ nước Lipase từ đậu castor đã được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion với pha tĩnh là Diethylaminoethyl (DEAE) [115] Lipase (EpLL) từ mủ xương rồng cũng được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-Cellulose có độ tinh sạch gấp 12,57 lần [52]

Trong nghiên cứu này, sắc ký trao đổi anion trên cột Hi Trap Q Sepharose Fast flow (5,0ml, 1,6cm×2,5cm) được dùng để tinh sạch lipase từ mủ đu đủ

Ngoài ra kỹ thuật lọc bằng màng lọc dựa theo trọng lượng phân tử, kỹ thuật chiết tách 2 pha cũng được sử dụng để tinh sạch lipase

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của lipase thực vật

Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ và cấu trúc ổn định của lipase trong quá trình thủy phân như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, chất hoạt hóa, chất kìm hãm

- Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của lipase thực vật

Nhiệt độ có tác động rõ rệt đến hoạt động xúc tác của lipase thực vật Nhiệt

độ tối ưu được xác định cho các loại lipase thực vật khác nhau trong khoảng từ

30 oC đến 55 oC Khi nhiệt độ phản ứng cao hơn nhiệt độ hoạt động tối ưu của lipase

lipase bị bất hoạt ở nhiệt độ cao [81] Lipase giảm hoạt tính liên quan đến sự cắt đứt các liên kết hydro trong cấu trúc phân tử protein, dẫn đến các cấu trúc bậc 2, 3 và 4 của lipase bị biến đổi Việc duy trì nhiệt độ trong quá trình phản ứng có ảnh hưởng mạnh đến hoạt động xúc tác của enzyme Nhiệt độ tối ưu của một số lipase thực vật

đã được xác định cụ thể như sau: lipase từ hạt đậu Africa hoạt động tối ưu ở 30 o

C [45], lipase hạt dừa hoạt động tối ưu ở 40 oC [63], lipase từ mủ sung hoạt động tối

ưu ở 45 oC [53], lipase từ mủ xương rồng hoạt động tối ưu ở 40 oC [52] Bên cạnh

đó, lipase từ một số loại hạt có nhiệt độ tối ưu cao như lipase từ hạt hạnh nhân hoạt động tối ưu ở 65 oC [126], hay lipase hạt óc chó hoạt động tối ưu ở 70 oC [125]

- Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của lipase thực vật

pH là một yếu tố có tác động rõ rệt đến hoạt động của lipase trong dung dịch nước hoặc hữu cơ Giá trị pH của môi trường tác động đến trạng thái ion hóa của lipase, sự tích điện của các nhóm phân cực trong phân tử lipase ảnh hưởng đến trung tâm hoạt động của lipase [81] Khi thay đổi pH sẽ làm thay đổi liên kết hydro,

do đó hình dạng trung tâm hoạt động của enzyme thay đổi, ảnh hưởng đến sự liên kết của cơ chất và trung tâm hoạt động Giá trị pH mà tại đó lipase có hoạt động tốt nhất gọi là pH tối ưu Trong khoảng pH tối ưu, lipase có hoạt độ cao nhất, ở giá trị

pH cao hay thấp hơn giá trị pH tối ưu thì hoạt độ của lipase giảm Điều này là vì chuỗi bên acid amin trong trung tâm hoạt động của enzyme có thể hoạt động như acid và bazơ yếu với các chức năng quan trọng phụ thuộc vào trạng thái ion hóa nhất định của chúng Sự ion hóa của hầu hết các lipase phụ thuộc vào pH, để lipase

ở trạng thái hoạt động thì nhất định các nhóm chức tại trung tâm hoạt động của lipase phải được ion hóa Do đó, pH tối ưu cho phản ứng sẽ là pH mà tại đó trạng thái ion hóa của cơ chất và lipase là thuận lợi nhất cho các phản ứng Nhìn chung, khoảng pH tối ưu của lipase từ một số loại hạt nằm trong khoảng 7 đến 9 [25] Lipase thu được từ các nguồn thực vật khác nhau thì có pH tối thích khác nhau

- Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính của lipase thực vật

Một số ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+, Zn2+, Pb2+, Fe2+ là những chất ức chế hoạt động thủy phân của lipase [25] Ngoài ra EDTA cũng ức chế hoạt động

xúc tác của lipase Vài ion kim loại như Na+, Ca2+, K+, NH4+ và Ba2+ ở nồng độ thấp 0,01M cũng làm tăng hoạt tính lipase Vượt quá nồng độ này, chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme [6]

Mức độ nhũ tương hóa của cơ chất cũng là yếu tố quan trọng làm tăng hoạt tính lipase Nhũ tương hóa làm cho cơ chất có kích thước micell, tạo hệ dầu/ nước giúp cho lipase dễ dàng hoạt động hơn Một số chất nhũ hóa dầu như: muối mật, acid cholic, acid deoxycholic, gum arabic, Triton – X100 [72]

1.2.5 Ứng dụng của lipase thực vật

Lipase là loại enzyme ngày càng được ứng dụng phổ biến bởi chúng có khả năng xúc tác nhiều loại phản ứng khác nhau như thủy phân, tổng hợp chất béo cũng như phản ứng chuyển ester [25] Lipase có vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp do nó ổn định trong các dung môi hữu cơ, hoạt động trên các cơ chất khác nhau, có tính đặc hiệu cao Do đó, lipase được ứng dụng rộng rãi trong các quá trình

có liên quan đến chất béo và dầu, như chất tẩy rửa, công nghệ thực phẩm, tổng hợp các chất hóa học, trong công nghiệp dược phẩm, sản xuất biodiesel, sản xuất nước hoa, v.v

1.2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Trong các sản phẩm thực phẩm, lipase được ứng dụng để tạo ra các acid béo bằng cách thủy phân chọn lọc chất béo và dầu có trong nhiều loại thực phẩm [25] Phụ thuộc vào độ dài của chuỗi carbon và độ bất bão hòa, các acid béo thu được tạo cho thực phẩm có hương thơm, màu sắc và mùi vị đặc trưng với những tính chất lý hóa và thành phần dinh dưỡng của nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau [51], [53], [113]

Ưu điểm của việc sử dụng lipase thực vật trong các ngành công nghiệp thực phẩm so với các nguồn lipase khác là lipase thực vật dễ dàng được chấp nhận so với lipase vi sinh vật Lipase thực vật bền hơn trong các phản ứng xúc tác có dung môi hữu cơ như phản ứng chuyển ester Hơn nữa, lipase thực vật còn có chi phí sản xuất thấp [75] Mangos và cộng sự đã ứng dụng CPL trong quá trình tổng hợp các

sơ sinh [74] CPL cũng được sử dụng để tổng hợp triacylglycerol cấu trúc bằng

phản ứng chuyển ester của ethyl ester với tripalmitin [84] Chất thay thế chất béo sữa người đã được tổng hợp bằng cách sử dụng CPL cố định trong mủ đu đủ như một chất sinh học và được sử dụng thay thế cho lipase thương mại với chi phí thấp [32] CPL được dùng xúc tác cho phản ứng chuyển ester của dầu cọ, tạo ra chất béo

có giá thành thấp dùng cho tổng hợp bơ ca cao nhân tạo, sản xuất chocolate có giá thành thấp hơn Việc sản xuất này tạo ra ít sản phẩm phụ hơn so với tổng hợp bằng phương pháp hóa học [95] Từ những ứng dụng trên cho thấy lipase từ mủ đu đủ có

tiềm năng ứng dụng thương mại lớn trong ngành công nghệ thực phẩm

Lipase từ lúa mì, đại mạch, bắp và hạt cải đã được d ng để sản xuất ester có khối lượng phân tử nhỏ trong môi trường hữu cơ [25] Những ester này có vai trò tạo hương cho các sản phẩm thực phẩm

Ngoài ra lipase được sử dụng để cải biến triacylglycerol, tạo ra những sản phẩm dầu có chứa hàm lượng các acid béo không no cao nhằm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng và tăng giá trị cảm quan Trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, lipase được

d ng để thủy phân chất béo trong sữa để tạo những sản phẩm, chất béo đặc biệt với

hương thơm mong muốn như việc tạo ra các acid béo có các chuỗi carbon khác nhau

Bên cạnh đó, lipase còn thủy phân các chất béo từ sữa, tạo hương thơm cho các sản phẩm pho mát

1.2.5.2 Trong công nghiệp dược

Lipase thực vật được ứng dụng trong dược phẩm thuận lợi hơn so với lipase

vi sinh vật vì chúng an toàn thậm chí đối với cả lipase chỉ được tinh sạch một phần Lipase thực vật ổn định trong môi trường acid nên không bị phá vỡ bởi acid

dạ dày Tursi và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng lipase từ lúa mạch, ổn định trong acid để điều trị bệnh bị thiếu dịch tụy do u xơ [119] Villeneuve và cộng sự cũng đã nghiên cứu ứng dụng lipase từ mủ đu đủ trong quá trình tổng hợp ester canol phytosterol oleate, chất này hoạt động như các chất làm giảm cholesterol, làm giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành Lipase này cũng đã được sử dụng để ức chế sự phát triển khối u [121]

Hơn nữa, do có tính đặc hiệu cao nên lipase có thể được d ng để tạo nên các hợp chất có tính chất dược lý Lipase là một trong những enzyme được sử dụng nhiều nhất trong quá trình tổng hợp đồng phân quang học trung gian tinh khiết Việc sử dụng lipase chủ yếu là do các đặc tính chọn lọc vị trí, nhóm chức và đồng phân quang học trong quá trình phân giải các hỗn hợp đồng phân quang học Hơn nữa, lipase nhìn chung ổn định tốt trong dung môi hữu cơ, tạo điều kiện cho sự hòa tan các cơ chất hữu cơ Một số cải tiến và các ứng dụng mới cũng đã đạt được trong quá trình tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học được xúc tác bởi lipase [34] Nhìn chung, các enzyme này bền trong dung môi hữu cơ, nơi mà cơ chất được hòa tan [49], [61]

1.2.5.3 Trong các lĩnh vực khác

Ngoài các ứng dụng trên, lipase còn được ứng dụng trong công nghiệp chất tẩy rửa, sản xuất biodiesel sinh học, sản xuất vật liệu sinh học, tổng hợp hữu cơ, công nghiệp giấy và bột giấy, tổng hợp chất hoạt động bề mặt và triglyceride cấu trúc, công nghiệp hóa dầu, sản xuất hóa chất nông nghiệp, công nghiệp thuốc trừ sâu và quản lý môi trường

Lipase được sử dụng như chất phụ gia trong chất giặt rửa và chất tẩy Các tính chất chính của lipase được khai thác trong chất tẩy rửa là do chúng ổn định trong điều kiện pH từ 10 đến 11 và nhiệt độ từ 30 oC đến 60 oC, khả năng chống lại các thành phần khác như protease và tính đặc hiệu cơ chất thấp Lipase từ gạo

(Oryza sativa) và yến mạch (Avena fatua) có các tính năng ph hợp để sử dụng

trong bột giặt vì chúng ổn định ở pH kiềm và nhiệt độ khoảng 60 oC [25]

Lipase được ứng dụng nhiều trong công nghiệp mỹ phẩm để sản xuất các chất hoạt động bề mặt như monoacylglycerol và diacylglycerol thông qua phản ứng ester hóa của glycerol [56]

Ngoài ra, ứng dụng lipase thực vật trong sản xuất biodiesel đã cho thấy kết

quả đầy hứa hẹn trong những năm gần đây Khi sử dụng enzyme xúc tác, sản phẩm phụ glycerol có thể dễ dàng được loại bỏ mà không cần một quá trình tách phức tạp

được chuyển hóa hoàn toàn thành các alkyl ester [52] Lipase từ thực vật được dùng trong sản xuất acid béo từ triacylglycerol thu được từ nhiều nguồn khác nhau, các chất béo có thể được ester hóa bằng methanol hoặc ethanol để sản xuất biodiesel [25] Sản xuất biodiesel thông qua ester hóa nhờ lipase thực vật thuận lợi hơn các phản ứng hóa học vì nó giảm độ nhớt của dầu bằng cách thay thế glycerol với methyl hoặc ethyl ancol trong phản ứng ester hóa

Mounguengui và cộng sự cho rằng lipase từ thực vật có thể dễ dàng được chiết tách từ các loại hạt, cám gạo và nhựa cây để ứng dụng trong sản xuất biodiesel

có giá trị không đắt hơn so với lipase từ vi sinh vật Hơn nữa, chế phẩm lipase thực vật có thể d ng được ở dạng chế phẩm thô sau quá trình tinh sạch sơ bộ [80]

Donato và cộng sự (2008) đã đề xuất việc sản xuất methyl và ethyl ester sử dụng một số các quá trình ester hóa sau khi thủy phân của các loại dầu khác nhau bằng lipase thực vật Theo các nhà nghiên cứu, các acid béo có thể thu được từ quá trình thủy phân dầu cọ, dầu hạt cây thông bằng lipase hạt thầu dầu; thủy phân dầu

cọ bằng lipase có trong chính nó và ester hóa với methanol hoặc ethanol để sản xuất biodiesel [42]

1.3 Dầu cá và ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá

1.3.1 Dầu cá

Dầu cá theo IFFO (International fishmeal and fish oil organisation) được xác định là một chất lỏng có màu vàng hoặc nâu được ép từ thịt cá và sau đó thường được tinh chế Dầu cá được sản xuất từ phần phụ phẩm của các loại cá sau quá trình chế biến Phụ phẩm của cá được lựa chọn chủ yếu là phần thịt vụn, xương, lườn và phần đầu của các loài cá giàu chất béo như cá hồi, cá trích, cá mòi, cá ngừ Các phụ phẩm này cũng được dùng để chế biến dầu cá/bột cá, chiếm 10-15% thị phần trên

toàn cầu [30]

Dầu cá như cá ngừ, cá hồi, cá trích, cá mòi, …là nguồn chứa nhiều acid béo bất bão hoà đa (PUFA) ω-3, trong đó DHA (Docosahexaenoic acid) và EPA (Eicosapentaenoic acid) có vai trò rất quan trọng đối với cơ thể người [37] Cả hai loại acid béo DHA (C22:6, ω-3) và EPA (C20:5, ω-3) đều thuộc nhóm ω-3, rất cần

cho cơ thể và cơ thể người không tự tổng hợp được [44] Cấu trúc phân tử DHA, EPA được thể hiện ở Hình 1.4

DHA là một trong những PUFA hữu ích nhất đối với ngành dược vì nó có vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn và kiểm soát một số loại bệnh như bệnh tim mạch, viêm, dị ứng, ung thư, đáp ứng miễn dịch, tiểu đường, tăng huyết áp và rối loạn thận DHA còn được gọi là thức ăn tốt cho não người vì nó tập trung nhiều ở màng tế bào não và tế bào võng mạc của mắt [37]

Bên cạnh đó, EPA (C20:5, ω -3) cũng được xem là acid béo thiết yếu sẽ

chuyển hoá thành các chất sinh học quan trọng như prostaglandin, leucotrien…

Prostaglandin có tác dụng ức chế sự đông vón tiểu cầu, giảm và phòng ngừa hình thành huyết khối, đồng thời có thể giảm bớt lượng cholesterol, giảm bớt triglyceride trong máu làm giảm độ nhớt dính của máu EPA còn tác dụng làm giảm tình trạng

xơ vữa động mạch Vì vậy EPA có tác dụng tốt đối với việc phòng ngừa và chữa trị các bệnh tim mạch do xơ vữa động mạch

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử DHA, EPA

Cá hồi là tên gọi chung cho nhiều loại cá thuộc họ Salmonidae, là nguồn lợi

thủy sản quý chứa nhiều chất có lợi cho sức khỏe như vitamin, DHA, EPA, các nguyên tố vi chất và nhiều acid amin Cá hồi sống dọc các bờ biển tại cả Bắc Đại Tây Dương và Thái Bình Dương Ở Việt Nam, cá hồi được ươm, nuôi ở Sa Pa, Đà Lạt, Lạng Sơn, Bắc Giang và một số địa phương khác…Dầu cá hồi chứa hàm lượng cao các acid béo không no đa nối đôi ω -3 PUFA (khoảng 11% EPA, 12,9% DHA) [32], cao hơn các dầu cá khác Tuy nhiên, hàm lượng DHA, EPA khi chiết tách từ dầu cá hồi thì chỉ thu được với hàm lượng nhỏ, chưa đến 30% Đối với sản phẩm thực phẩm chức năng đòi hỏi lượng DHA, EPA trong sản phẩm phải đạt trên 30%

Do đó, việc nghiên cứu sản xuất triglyceride giàu DHA, EPA từ dầu cá hồi là cần thiết

1.3.2 Ứng dụng lipase trong làm giàu DHA, EPA trong dầu cá

DHA có thể được chiết tách từ dầu cá và các sản phẩm triglyceride có hàm lượng DHA, EPA cao được tạo ra bằng các phương pháp hóa học hay phương pháp enzyme Phương pháp enzyme chiếm ưu thế hơn phương pháp hóa học vì giảm chi phí dung môi, phản ứng trong điều kiện êm dịu của pH, nhiệt độ, tính đặc hiệu enzyme cao, dễ dàng phản ứng [37]

Lipase (EC 3.1.1.3) có thể xúc tác cả phản ứng thủy phân dầu và phản ứng ester hóa với tốc độ ph hợp, t y vào các loại lipase khác nhau T y thuộc vào các điều kiện cụ thể của phản ứng sẽ quyết định phản ứng nào xảy ra Phản ứng thủy phân là thuận nghịch và có thể thay đổi chiều phản ứng khi một yếu tố thay đổi, ví

dụ như hàm lượng nước trong phản ứng:

C3H5(OOCR)3 + 3H2O ↔ C3H5(OH)3 + 3RCOOH Quá trình tổng hợp triglyceride giàu DHA và EPA hay còn gọi là quá trình làm giàu DHA, EPA dựa vào tính đặc hiệu xúc tác của lipase Tính đặc hiệu thể hiện mỗi enzyme chỉ ưu tiên xúc tác thủy phân một kiểu acid béo nhất định trong phân tử glyceride Dựa trên đặc tính này, những acid béo không mong muốn có thể bị loại bỏ, làm biến đổi cấu trúc phân tử chất béo thông qua các phản ứng đặc trưng của enzyme, nhờ đó thu được các sản phẩm có hàm lượng DHA, EPA cao hơn ban đầu

Một trong những phương pháp enzyme sử dụng để tổng hợp triglyceride giàu DHA đó là thủy phân và ester hóa chọn lọc Phương pháp này được thể hiện

trong khoảng pH và nhiệt độ rộng, có tính đặc hiệu hơn, có hoạt tính cao và đặc biệt

là có thể tái sử dụng Hơn nữa lipase cố định dễ dàng được thu hồi và do đó giảm được giá thành của enzyme [37]

Do đó hướng ứng dụng của đề tài là sử dụng lipase để thủy phân dầu cá hồi làm tiền đề cho quá trình làm giàu DHA, EPA trong dầu cá

Hình 1.5 Quy trình tổng hợp glyceride giàu DHA, EPA [37]

Pha hữu

cơ chứa glyceride

Ester của các acid béo khác DHA, EPA

Glyceride giàu DHA, EPA

Dầu cá, iso-octan/nước

Thủy phân bởi lipase không đặc hiệu

Chiết với hexan và KOH trong cồn

Chiết FFA trong pha nước

Ester hóa với butanol bởi lipase không đặc hiệu với DHA, EPA

Tách phân đoạn acid béo giàu DHA, EPA

Ester hóa với glycerol bởi lipase đặc

hiệu với DHA, EPA