CHƯƠNG VII: CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA TÍNH DI TRUYỀN

Quá trình khám phá DNA là vật chất di truyền 1865- Mendel công bố các quy luật di truyền 1868 - Fredrich Miescher phát hiện một hợp chất mang tính acid yếu trong nhân tê bào, sau này gọ

PHAN II: CƠ SỞ DI TRUYỀN HỌC

CHƯƠNG VII: CƠ SỞ PHÂN

TỬ CỦA TÍNH DI TRUYỀN

TS Nguyễn Hoài Hương

1928 - Thí nghiệm Griffith với Sirepfococcus pneumoniae

|

Two strains of Streptococcus pneumoniae

VII 1 Quá trình khám phá DNA là vật chất di truyền

1865- Mendel công bố các quy luật di truyền

1868 - Fredrich Miescher phát hiện một hợp chất mang tính acid yếu trong nhân tê bào, sau này gọi là DNA

1924- sử dụng phương pháp nhuộm màu soi kính hiển vi người ta phát hiện

ra nhân tê bào gôm acid nucleic và cả protein

1928 — thi nghiém Griffith phát hiện hiện tượng biến nạp (transformation) ở vi khuẩn

1944 — thí nghiệm của Avery, Mac Carty, Mc Leod xác định được tác nhân gây biến nạp

1949 - Erwin Chargaff phân tích thành phần cac base trong DNA: DNA mang tinh dac hiéu loai, dua ra quy tac Erwin Chargaff

1952 - thí nghiệm Hershey — Chase chteng minh DNA [a vat chat di truyền

1953 - Rosalind Franklin dùng phương pháp tán xạ tia X nghiên cứu cầu truc tinh thé DNA

1953 — Watson và Crick xây dựng mô hình cấu trúc không gian và kích thước của phân tử DNA

Thí nghiém Griffith voi Streptococcus

pneumoniae trén chudt

Té bao chét S’ chuyén tinh gay bénh cho té bao R

Biến nạp (transformation): thay d6i tinh trang khi truyén théng tin

di truyén

1944 - Thi nghiém cua Avery, Mac Carty, Mc

Leod chứng minh DNA là vật chất di truyền

A IS

PROTEIN - |RNA © IDNA

‘=

—- |No S cells

Transformation No transformation

Hiện tượng biến nạp không xuất hiện nếu không có DNA

= DNA là chất di truyền

T2 bang 32P và protein băng DNA chứa ?2P Vỏ protein chứa 32S 325 băng cách nuôi chúng

tụ? WW? hse

/

—>

=>

“` Cho phage T2 lây nhiễm E.coli

\

(icles Khuay trộn mạnh đê tách phage T2

Ly tam tach té bao E.coli va phage T2

E.coli: can lang Phage T2:

dich trong

KET LUAN: Vat chat ma phage

truyén cho E colila DNA

DNA là vật chất di truyền

1952 - Thí nghiệm của A Hershey và M Chase

Bacteriophage T2 Bacteriophage = phage = thực khuẩn

1953 - Phát hiện cấu trúc không gian và kích thước của phân tử DNA: hai chudi xoắn ơ

=

= = These spots

a » [J are caused

eS: by diffracted

bee see ew

Xá Sie wee |

ll

_—

| X-ray source Lead screen Photographic

plate

Những năm 50 thế kỷ 20:

Phương pháp tán xạ tia X được sử dụng đề phát hiện cấu trúc không gian của DNA

Mẫu DNA: DNA tỉnh khiết được kết tinh

1949- Thành phần hóa học của DNA

Những năm 50 thế kỷ 20:

Quy tắc Chargaff : trong DNA, lượng base purine (A+@) luôn bằng

lượng pyrimidine (T+€)

— .ÌS alWays

In DNA, the amount equal to the

of purines (A + G) amount of

pyrimidines

(ID (C) (T+)

Purines = Pyrimidines

VII 2 Cấu trúc khéng gian cua DNA theo Watson

- Crick

DNA double helix

+

La 5°

sugar-phosphate

backbone

base pairs

Watson & Crick, 1953

3.44 nm

Phương pháp tán xạ tia X dùng

để nghiên cứu cấu trúc không

gian của protein và nucleic acid

| 0.34 nm

Xây dựng mô hình cầu trúc không gian phân tử DNA dựa trên

kết quả tán xạ tia X

Liên kết hydro giữa các base của

hai mạch phân tử DNA - tính đặc hiệu

N—H ° CH,

/ \ /

H—N \

@O Ce purine:purine »x

too wide Adenine Thymine

2 H-bonds

Ị | pyrimidine:pyrimidine =w

I 1 too narrow ƒ \

) TH >

ì purine:pyrimidine \ /ý ` \

N—H °

_ fits X-ray data it

Guanine Cytosine

A lun lién két voi T, G voi C — quy tác bắt cap bé sung

Số lượng A = T, G =C (phù hợp quy tắc Chargaff)

base

ea = - > Vật chất di truyền chứa thông tin di truyền : trình tự base

$-4nm > \ eee ^ j ˆ Ấ x 2+ z > ~ ˆ "Kk AR: x

%

> Vật chất di truyền phải được sao chép chính xác dé chuẩn bị cho

tê bào phân chia: nhờ quy luật bắt cặp bô sung giữa các base A — T

và C—G

> Vật chất di truyền được biểu hiện ra kiểu hình (tương quan kiểu

ig gene — kiéu hình) nhờ quá trình phién ma — dich ma

(a) Key features of (b) Partial chemical structure (c) Space-filling model

DNA structure

Tổng quan cấu trúc DNA

VII.3 DNA trong tế bào 2 DNA Eukaryote

(chiều dài bộ gene gấp 1000 chiều dài sàng phiên mã

tế bào)

1 DNA Prokaryote

b) Chất dị nhiễm sắc (Heterochromatin): DNA được nén chặt, bị kìm hãm phiên mã

Nuclear envelope

Inner membrane

Nucleolus Nucleoplasm

Chromatin Heterochromatin Euchromatin

Ribosomes

Nuclear pore

1 phan tu DNA

Chuỗi xoắn kép

DNA

Chất nhiễm sắc

dạng sâu chuỗi (hạt

là nucleosome)

Sadi chromatin, các

nucleosome dudgc

quấn cuộn

Vùng NST ở thể

lỏng lẻo (đồng

nhiễm sac)

NST nén chặt

(dị nhiễm sắc)

NST ở trung kỳ

(metaphase) của

nguyên phân

VII 4 Sao chép DNA (DNA replication)

LA Bs ae SE nÀ ‹n F seis? lin

JOUSOUOUEN

9S 2G

LOW

E

=

—

c

w

=

Vv

=

©

U

<

z

a

—

°

ø

>

9)

~

HIGH Nhiễm sắc chất và nhiễm sắc thể (NST)

1 Mô hình chuỗi xoắn kép của DNA cho phép dự đoán phương

pháp sao chép của DNA

DNA mẹ

Tách rời hai mạch Mỗi mạch DNA mẹ

làm khuôn mẫu tổng

hợp một mạch DNA con

Lengths of various genomes

Organism or organelle Type Approximate Length TMV 1 single-stranded RNA 2um 6.4 kb Adenovirus 1 double-stranded DNA ll um 35 kb Bacteriophage T4 1 double-stranded DNA 55 um 170 kb

E coli 1 double-stranded DNA 1.3mm 4.2 X 103 kb Human mitochondria about 10 identical double- 5 um each 16 kb each

stranded DNAs

46 chromosomes of double- 1.8m 6X 10° kb

stranded DNA

from Genes IV Benjamin Lewin pg 390

Thi nghiém Meselson & Stahl

Generation 0 Generation 1 Generation 2 c=

DNA sample DONA sample DNA sample Fe >>

OS ii: 5 Gi 3

Nuôi cấy E colí trong môi trường chứa 15N là nguồn nitơ duy nhất trong nhiều thế hệ (generation) Lấy mẫu và chiết tách

DNA

Chuyển tế bào E coli sang môi trường chứa 1N Sau khi tế bào phân chia một lần, lấy mẫu và chiết tách DNA

3 Lập lại bước hai

4 Ly tâm cả ba mẫu DNA nói trên dùng thang nồng độ CsCI, so sánh vị trí của các vệt DNA

Sao chép bán bảo tồn (semiconservative replication)

Aa Sg me BE

Generation 0 15N ể 1 vệt DNA nặng

86-15 2 Generation

1 vệt DNA trung gian giữa nặng và nhẹ

Generation 2 12 DNA nhẹ; 1⁄2 DNA trung gian

giữa nặng và nhẹ Hybrid '4N Hybrid 14N

Kết quả thí nghiệm khẳng định cơ chế sao chép bán bảo tồn

DNA template cof,

5° —— 3

>dNTP tạo lién két phosphodiester voi doan mdi, dong thời theo

nguyên tắc bắt cặp bô sung base với mạch khuôn

dNTP 3 Quá trình sao

a) Tạo liên kêt

DNA template strand ,

Enzyme sao chép (DNA polymerase) cần đoạn mồi (RNA primer) đề hoạt động

DNA polymerase

>Hướng sao chép: 5’ - 3’

>Một mạch DNA đóng vai trò mạch khuôn

>Cần tổng hợp đọan mồi theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung base với

mạch khuôn

b) Cơ chế sao chép DNA

>Sao chép tiến hành tại một điểm gọi là origine (ori)

>Mot replicon la mét don vi sao chép (chứa một ørj

>DNA vòng của Prokaryote là một replicon

>Mỗi sợi DNA Eukaryote có nhiều replicon

>Quá trình sao chép diễn ra theo hai hướng

Organism # of replicons Average Velocity of

length of fork replicon movement Escherichia coli (bacteria) 1 4200 kb 50,000

bp/min Saccharomyces cerevisiae 500 40 kb 3,600 bp/min (yeast)

Drosophila melanogaster 3.500 40 kb 2.600 bp (fruit fly) “min Xenopus laevis (frog) 15,000 200 kb 500 bp/min Mus musculus (mouse) 25,000 150 kb 2,200 bp

/min Homo sapiens 10,000 to 300 kb

100.000

Cơ chế sao chép DNA

i) Khoi sw

Thao xoan — Helicase

Cang mach — Protein cang mach (single strand binding protein SSBP)

Tổng hợp đoạn mồi — Primase

ii) Néi dai — DNA polymerase III

Mạch tới tổng hợp liên tục

Mạch chậm tổng hợp gián đoạn thành nhiều đoạn Okazaki

iii) Kết thúc

Mạch chậm:

Cắt bỏ đoạn môi (RNA), tổng hợp DNA thay thế —- DNA

Polymerase |

Nối các đoạn Okazaki — DNA ligase

Enzyme primase tổng hợp đoạn môi (RNA primer) cỡ 5 nucleotide

Cơ chế sao chép DNA ở E.coli

i) Khoi sw

DNA ori ý

Khởi sự sao

>Helicase tháo xoắn

>Protein căng mạch ngăn cản hai mạch tạo xoắn trở lại

ii) N6i dai Tai mét chia ba sao chep (replication fork):

Enzyme DNA polymerase IIl tao lién két phosphodiester gitra cac nucleotide vào đoạn môi và nôi dài mạch DNA

Mạch tới và mạch chậm tổng hợp khác nhau nhưng luôn theo chiêu 5ˆ-3'

Mạch tới

© © © Mach cham

Mạch tới tổng hợp liên tục

ề Mạch tới

Mạch chậm

\\ Okazaki fragments /

Mạch chậm tông hợp gián đoạn thành các đoạn Okazaki

DNA ligase nối các đoạn Okazaki

XXXVXXYXXXXXXXVXXXXXXXSXXSXxXSXXxXXxXx

Tạo xoắn kép

xXNXXXVXVXXVXXXXXxXXxXXXxXxXXxXXxXXxx

iii) Kết thúc

DNA polymerase l cắt bỏ đoạn mùi

——

DNA polymerase |

va DNA polymerase | t6éng hop DNA thay thé

4 Sao chép DNA ở vi cò Origin

khuân

chép theo hai hướng

Z\

©

A =”

-sao chép DNA khi giao

|

// Oisplaced strand is > 1 unit length

\\¢ Complementary strand synthesis 3

“ —=EE==—=”—=—————p, ”

Tính chất của DNA polymerase

DNA polymerase 6G E coli

Polymer héa: 5’ - 3’

Proofreading exonuclease: 3’ - 5’

Exonuclease : 5’ - 3’

DNA polymerase III la enzyme chinh trong qua trinh sao chép DNA

DNA polymerase | trong sao chép DNA loại bỏ đoạn mổi và lấp

đầy chỗ trống trên mạch chậm, và đó cũng là enzyme sửa lỗi DNA

và được sử dụng để tạo DNA tái tổ hợp

v Tatca DNA polymerase can primer vdi dau 3’ OH tu do

v Tat ca DNA polymerase xuc tac phản ứng tổng hợp DNA (nối dài

mach DNA) theo hướng 5” - 8”

v Mét s6 DNA polymerases cé hoat tinh đọc và sửa lỗi (proofreading

activity) tlic hoat tinh exonuclease 3’-5’

5 Sao chép DNA ở tế bào Eukaryote

Điểm xuất phát sao chép DNA (orj)

| Ì |

—_— — SO

a

`"S=cC

Sao chép hai hướng

—_— ——- —==^"

Đơn vị sao chép

Hợp nhất các đơn vị sao chép

DNA con

6 Ứng dụng sao chép DNA

a) PCR = polymerase chain reaction Quá trình sao chép tự động một đoạn DNA ngắn nhiều lần in vitro Sao chép mang tính chu kỳ: một số bước lặp lại nhiều lần

Các bước chính:

>Mạch kép DNA tách rời nhau do bị đun nóng (biến tinh) (t> 90°C)

>Primer nhân tạo được cho vào hỗn hợp phản ứng cùng với 4 loại dNTP

và Tag polymerase

> Tag polymerase xúc tác phản ứng nối dài và bắt cặp bổ sung mạch mới tông hợp

Tag polymerase = DNA polymerase chịu nhiệt (959C) từ vi khuẩn chịu nhiét Thermus aquaticus phan lập từ suôi nước nóng

Nguyên liệu:

>DNA can sao chép (DNA dich)

>Doan moi (10-20 nucleotide)

> Tag polymerase

Target DNA

Taq polymerase

> Tag polymerase néi dai đoạn môi, tông hợp mạch DNA con

Primer

Các bước của PCR cho mỗi chu kỳ:

>Đoạn mùi bắt cặp bổ sung với mỗi mạch của DNA dich (khuôn)

Target DNA

phút

Số lượng phân tử DNA

tăng theo cap sô nhân

10

b) DNA sequencing (xac dinh trinh tw base trong DNA)

Base (A, U, G, or C)

Ribonucleoside H

triphosphate (NTP)

Base (A, T, G, or C)

1 | 4

“OF —O—P—O— PO CH

Oo Oo oOo

Deoxyribonucleoside H

triphosphate (dNTP)

Base

Dideoxyribonucleoside H \

triphosphate (ddNTP)

Template

strand

; rimer z[jjMd£, (sequence known)

TET6GGCTATTCGG6CGT 5

Trong hỗn hợp có nhiều

mạch DNA mới được

tông hợp với độ dài khác

nhau, nucleotide cudi F[B

cùng luôn là ddNTP

Laser

Mỗi mạch phát huỳnh quang với

màu khác nhau Màu huỳnh

quang được xác định nhờ

chùm laser

Electrophoresis

ATET6GGCTATTCGGGC6T m—N Ï °

Nguyên tắc:

Tổng hợp mạch DNA bắt

cặp bổ sung với mạch cần xác định với các

dNTP va ddNTP

(dideoxiribonucleoside triphosphate) duoc gan nhóm chức phát huỳnh quang cũng

Ứng dụng: genomics —

giải mã bộ gene sinh vật

Nhóm OH ở C 3 bị mat OXY, dNTP tiếp theo không thể tạo liên kêt phosphodiester

Khi ddNTP gắn vào mach DNA dang téng hop, qua trinh téng

hợp ngừng lại

Điện di DNA

z Longest fragment

0 Detector

Shortest fragment

5

C

T

G

G

G

C

T

A

=

T

&

G

G

“IIIII[IIIHIIINHI Màu huỳnh quang ứng

với ddNTP cuôi cùng

DNA cần xác định

trình tự base được đun nóng đề có mạch đơn

>DNA mạch đơn

>» Primer

>» DNA polymerase

> dNTP

>ddNTP

nNc “a 1 ddATP

Ni

mach bat

cặp bỏ

sung bắt dau

Dién di (electrophoresis) cac mach DNA moi tổng hợp:

Phương pháp sắp xêp DNA theo độ dài Vệt dưới = mạch ngắn

Vét trên = mạch dài

3“ AATCT GGGCTATTCGG 5’

Sổ TIỊAGACCCGATAAGCCCGCA 3 Trình tự base được xác định nhờ máy tính

dul

11

VỊI 5 Các cơ chế sửa sai và bảo vé DNA

1 Các đột biến có thể xảy ra trên phân tử DNA

a) Các dạng biến đổi cặp base

Đoạn DNA bình thường

CATTCACCTGTACCA

GTAAGTGGACATGGT

Đồng hoán (từ T-A sang C-G) Dị hoán (từ T-A sang G-C)

CATCCACCTGTACCA CATGCACCTGTACCA

GTAGGTGGACATGGT GTACGTGGACATGGT

có Thay thé cap base — đột biến thay thế (substitution mutation)

Đồng hoán: pyrimidine này thành pyrimidine khác

Dị hoán: pyrimidine thành purine

xóa chèn

CATCACCTGTACCA CATGTCACCTGTACCA

GTAGTGGACATGGT GTACAGTGGACATGGT

Có thể mất hoặc thêm nhiều cặp base tại một vị trí

Đột biến ngẫu nhiên do đồng phân hỗ biến của cytosine

gây ra "

“hi bong

(Đột biến ngẫu

nhiên =không _ ¬

do tác nhân Lộ

amino

H

|

ONO A

Dạng đồng phân hỗ biến imino

Cytosine bắt cặp nhầm với adenine gây đột biến đổi đồng hoán

b) Đột biến ngẫu nhiên gây ra do đồng phân hỗ biến (tautomer)

Các dạng đồng phân hỗ biến của các base trong DNA

Ộ N

Adenine | ad Z

pm

TA H

N

R

R

AMINO] [===> _ -IMINO

Hau qua:

thay déi base bat

cap do

thay déi cach Ik hydro

Các dạng đồng phân hỗ biến của các base trong DNA

ON

Guanine móé | Ho

a“ nn 2

base bat

cap do

thay đổi cách Ik

HạC _ HạC hydro

Thymine | - |

KETO ——}» ENOL

12