Ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein con ruốc khô

Sau đó, ảnh hưởng của DH đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân protein theo phương pháp trung hòa gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DPPH, phương pháp năng lực kháng oxy hó

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Võ Đình Lệ Tâm

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Hoàng Kim Anh

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

Luận văn tốt nghiệp được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TPHCM

Thời gian bảo vệ: 10/01/2020

Thành phần hội đồng đánh giá luận văn bao gồm:

1 Chủ tịch hội đồng: GS.TS Lê Văn Việt Mẫn

2 Phản biện 1: PGS.TS Hoàng Kim Anh

3 Phản biện 2: PGS.TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

4 Ủy viên: TS Lê Minh Hùng

5 Ủy viên, thư ký: PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phi

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

GS TS Lê Văn Việt Mẫn

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Võ Chí Bảo MSHV: 1870358

Ngày, tháng, năm sinh: 05/06/1996 Nơi sinh: Rạch Kiến

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số : 8540101

chất chức năng của dịch thủy phân protein con ruốc khô

1) Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân của dịch thủy

phân protein con ruốc khô

2) Khảo sát ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy

phân protein con ruốc khô

3) Khảo sát ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến tính chất chức năng của dịch phân protein con ruốc khô

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 19/08/2019

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

Thầy Cô, cũng như sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Cô TS Võ Đình Lệ Tâm người đã hết lòng

giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô phòng thí nghiệm, đặc biệt là cô Nguyễn Thị Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện về trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất… trong suốt thời

gian thực hiện luận văn thạc sĩ

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể quý thầy cô trong khoa Kỹ Thuật Hóa Học – Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm – Trường Đại học Bách Khoa TP HCM

đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, quý thầy cô và bạn bè đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ

TP Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2020

Sinh viên thực hiện

Võ Chí Bảo

tính kháng oxy hóa và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein con ruốc khô Đầu tiên, ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến DH của dịch thủy phân protein con ruốc khô được đánh giá Sau đó, ảnh hưởng của DH đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân protein theo phương pháp trung hòa gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), phương pháp năng lực kháng oxy hóa khử ion sắt (III) (FRAP), phương pháp trung hòa gốc tự do cation 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS●+), phương pháp trung hòa gốc tự do anion superoxide (O2●-) và phương pháp liên kết ion Fe2+ được khảo sát Cuối cùng, ảnh hưởng của DH đến tính chất chức năng của dịch thủy phân protein gồm độ tan, độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, khả năng giữ nước (WHC) và khả năng giữ dầu (OHC) được nghiên cứu Kết quả cho thấy giá trị DH của dịch thủy phân protein con ruốc khô tăng từ 0 đến 75,8% khi thời gian thủy phân kéo dài từ 0 đến 180 phút Dịch thủy phân protein con ruốc khô thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa cao với hoạt tính trung hòa gốc DPPH và giá trị FRAP cao nhất lần lượt là 22,5 ± 0,3% (thấp hơn 1,8 lần so với hoạt tính trung hòa gốc DPPH của vitamin C) và 74,6 ± 1,9 µM đương lượng Trolox (µM TE) (thấp hơn 24,2 lần so với giá trị FRAP của vitamin C) tại giá trị DH 66,7%; hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS●+ và hoạt tính trung hòa gốc tự do O2●- cao nhất với giá trị lần lượt 33,5 ± 0,1% (2,4 lần thấp hơn so với của hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS●+ của vitamin C) và 90,8 ± 0,8% (1,1 lần thấp hơn so với hoạt tính trung hòa gốc O2●- của vitamin C) tại giá trị DH 75,8%; hoạt tính liên kết ion Fe2+

cao nhất là 54,5 ± 0,3% (1,7 lần thấp hơn so với hoạt tính liên kết ion Fe2+ của dinatri ethylenediaminetetraacetate (Na2EDTA)) tại giá trị DH 72,1% Bột dịch thủy phân protein con ruốc khô ở các giá trị DH khảo sát đều có độ hòa tan trên 55%, kể cả khi đã qua xử lý nhiệt ở 63oC trong 30 phút hoặc 93o

C trong 30 giây, trong khoảng pH từ 3 đến 8 Khả năng tạo bọt (FC) và độ bền bọt (FS) của dịch thủy phân protein con ruốc khô với các giá trị DH khác nhau trong khoảng 5,7 – 80,0% và 2,9 – 77,0%, tương ứng thấp hơn 1,1 – 14,5 lần và 1,1 – 40,3 lần so với FC và FS của albumin trong khoảng pH 3-8 Khả năng tạo nhũ (EAI) của dịch thủy phân thấp hơn 1,1 – 3,9 lần

so với natri caseinate, nhưng độ bền nhũ (ESI) của dịch thủy phân lại cao hơn 1,4 – 9,3 lần so với natri caseinate trong khoảng pH 3-8 Bột dịch thủy phân thể hiện WHC cao nhất là 9,5 ± 0,3 ml nước/g bột dịch thủy phân tại giá trị DH 66,7% và OHC cao nhất là 3,4 ± 0,1 ml dầu/g bột dịch thủy phân tại giá trị DH 50,6% Qua đó, giá trị con ruốc khô được nâng cao nhờ tận dụng để sản xuất dịch thủy phân protein, có thể ứng dụng như chất kháng oxy hóa hoặc phụ gia cải thiện cấu trúc và cảm quan của thực phẩm

antioxidant activity and functional properties of proteolysate from dried Acetes japonicus Firstly, effect of hydrolysis time on DH of Acetes proteolysate was investigated Subsequently, effect of DH on antioxidant activity of the Acetes proteolysate based on

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) scavenging assay, ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) cation radical (ABTS●+) scavenging activity, superoxide anion radical (O2●-) scavenging activity and ferrous chelating rate was tested Finally, effect of DH on functional properties of the proteolysate including solubility, heat stability, foaming and emulsifying property, water holding capacity (WHC) and oil holding capacity (OHC) were evaluated The result indicated that DH value of the proteolysate increased from 0 to 75.8% as prolonging

hydrolysis time in range of 0 - 180 minutes The Acetes proteolysate exerted great

antioxidant activity with the highest DPPH scavenging activity and FRAP value of 22.5 ± 0.3% (1.8 times lower than that of vitamin C) and 74.6 ± 1.9 µM Trolox equipvalent (µM TE) (24.2 folds lower comparing to that of vitamin C), respectively, at DH of 66.7%; the greatest ABTS●+ và O2●- scavenging activity of 33.5 ± 0.1% (2.4 folds lower than that of vitamin C) and 90.8 ± 0.8% (1.1 times lower in comparison to that of vitamin C), in order, at DH value of 75.8%; the highest ferrous chelating rate of 54.5 ± 0.3% (1.7 folds lower than that of disodium ethylenediaminetetraacetate (Na2EDTA)) at DH value of

72.1% The Acetes proteoysate powder at all tested DH range displayed solubility over

55%, even after treating at 63oC for 30 minutes or 93oC for 30 seconds, in pH range from

3 to 8 Foaming capacity (FC) and foaming stability (FS) of the Acetes proteolysate with

various DH were in range 5.7 – 80.0% and 2.9 – 77.0%, 1.1 – 14.5 folds and 1.1 – 40.3 times lower than those of albumin, respectively, in the pH range of 3 – 8 Emulsifying activity indexs (EAI) of the proteolysate were 1.3 – 3.9 folds lower in comparison to that

of sodium caseinate while their emulsifying stability indexs (ESI) were 1.4 – 9.3 times higher than that of sodium caseinate at all DH value in the pH range of 3 – 8 The proteolysate powder showed the highest WHC of 9.5 ± 0.3 ml water/g proteolysate powder at DH 66.7% and the greatest OHC of 3.4 ± 0.1 ml oil/g proteolysate powder at

DH 50.6% This study contributed to enhanced value of the Acetes, being protein source

to produce proteolysate which could be served as an antioxidant compound or a food additive improving food texture and sensory

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên thực hiện luận văn

Võ Chí Bảo

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH viii

ĐẶT VẤN ĐỀ ix

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Con ruốc 1

1.2 Dịch thủy phân 2

1.2.1 Giới thiệu 2

1.2.2 Các phương pháp thuỷ phân protein 2

1.2.3 Hoạt tính sinh học 3

1.2.4 Tính chất chức năng 9

1.3 Mức độ thủy phân 13

1.4 Ứng dụng dịch thuỷ phân protein từ thủy sản 14

1.5 Tổng quan quá trình nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein thủy hải sản trong và ngoài nước 15

1.5.1 Nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa 15

1.5.2 Nghiên cứu về tính chất chức năng 16

1.6 Khả năng hấp thu 17

1.7 Tính an toàn 18

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Nguyên liệu 19

2.1.1 Con ruốc khô 19

2.1.2 Chế phẩm enzyme và hóa chất 19

2.2 Phương pháp 19

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân 20

2.2.5 Phương pháp lọc khử khoáng dịch thủy phân 21

2.2.6 Xác định mức độ thủy phân 22

2.2.7 Xác định tính chất chức năng của dịch thủy phân (Li và cộng sự, 2012 và Putra và cộng sự, 2018) 22

2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến DH 23

3.2 Ảnh hưởng của DH đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân protein con ruốc khô 24

3.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa theo cơ chế cho electron 24

3.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa theo cơ chế cho hydro 27

3.2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa theo cơ chế liên kết ion kim loại 30

3.3 Ảnh hưởng của DH đến tính chất chức năng của dịch thủy phân protein con ruốc khô 32

3.3.1 Độ tan 32

3.3.2 Độ bền nhiệt 33

3.3.3 Khả năng tạo bọt 36

3.3.4 Khả năng tạo nhũ 38

3.3.5 WHC 40

3.3.6 OHC 41

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

4.1 Kết luận 43

4.2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 55

PHỤ LỤC B: PHƯƠNG PHÁP 61

ANOVA Phân tích phương sai

AOAC Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

FRAP Năng lực kháng oxy hóa khử ion sắt (III)

Na2EDTA Dinatri ethylenediaminetetraacetate

SDS sodium dodecyl sulfate

TCA tricloroacetic acid

TNBS trinitrobenzene sulfonic acid

TPTZ 2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine

Trolox 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid

μM TE Đương lượng Trolox

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Con ruốc khô 1

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng của phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS●+ 5

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng của phương pháp FRAP 7

Hình 2.1 Công thức hóa học của hạt nhựa Amberlite IRC-748I, dạng muối natri 21

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến DH của dịch thủy phân protein con ruốc khô 23

Hình 3.2 Ảnh hưởng của DH đến hoạt tính trung hòa gốc DPPH (a) và giá trị FRAP (b) của dịch thủy phân protein con ruốc khô 26

Hình 3.3 Ảnh hưởng của DH đến hoạt tính trung hòa gốc O2●- của dịch thủy phân protein con ruốc khô 28

Hình 3.4 Ảnh hưởng của DH đến hoạt tính trung hòa gốc ABTS●+ của dịch thủy phân protein con ruốc khô 29

Hình 3.5 Ảnh hưởng của DH đến hoạt tính liên kết sắt của dịch thủy phân protein con ruốc khô 30

Hình 3.6 Ảnh hưởng của DH đến độ hòa tan của bột dịch thủy phân protein con ruốc khô 33

Hình 3.7 Ảnh hưởng của DH đến độ bền nhiệt của bột dịch thủy phân protein con ruốc khô 35

Hình 3.8 Ảnh hưởng của DH đến khả năng tạo bọt của bột dịch thủy phân protein con ruốc khô 37

Hình 3.9 Ảnh hưởng của DH đến khả năng tạo nhũ của bột dịch thủy phân protein con ruốc khô 39 Hình 3.10 Ảnh hưởng của DH đến WHC của bột dịch thủy phân protein con ruốc khô 41 Hình 3.11 Ảnh hưởng của DH đến OHC của bột dịch thủy phân protein con ruốc khô 42

của tế bào và được trung hòa bởi rào chắn kháng oxy hóa sinh học gồm chất kháng oxy hóa enzyme (superoxide dismutase, glutathione peroxidase,…) và chất kháng oxy hóa phi enzyme (vitamin, nguyên tố vết, coenzyme và cofactor) [1] Tuy nhiên, trong một số trường hợp, rào chắn hoạt động không hiệu quả, không thể bảo vệ cơ thể chống lại gốc tự

do, dẫn đến nhiều bệnh khác nhau như ung thư, xơ vữa động mạch, tiểu đường, viêm khớp, bệnh mạch vành và bệnh Alzheimer [2] Trong thực phẩm, gốc tự do oxy hóa lipid, sinh ra sản phẩm peroxide hóa lipid thứ cấp không mong muốn, giảm thời gian bảo quản, chất lượng cũng như mức độ an toàn của thực phẩm [3] Các tác hại trên có thể được ngăn ngừa bằng cách sử dụng hợp chất kháng oxy hóa Mặc dù hợp chất kháng oxy hóa tổng hợp như butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), t-butylhydroquinone (TBHQ) và propyl gallate có hiệu quả kinh tế và hoạt tính kháng oxy hóa cao nhưng cũng tiềm tàng độc tính Do đó, việc sử dụng những chất kháng oxy hóa tổng hợp trên bị cấm ở một số quốc gia [4] Điều đó thúc đẩy các nhà khoa học tìm ra những chất kháng oxy hóa tự nhiên tiềm năng thay thế cho các chất tổng hợp Kim và Wijesekara (2010) [5] đã công bố rằng peptide và dịch thủy phân protein từ sinh vật biển hoặc phụ phẩm thủy hải sản có khả năng trung hòa gốc tự do, ngăn ngừa các tác động bất lợi của chúng Nghiên cứu của Sarmadi và Ismail (2010) [1] cho thấy dịch thủy phân protein/peptide kháng oxy hóa an toàn, lành mạnh và dễ dàng hấp thu đối với con người Ngoài ra, dịch thủy phân protein có những tính chất quan trọng có thể kể đến như độ tan, độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt và tạo nhũ, khả năng giữ dầu và giữ nước Độ tan là một trong những tính chất chức năng quan trọng của protein và dịch thủy phân protein, ảnh hưởng đến các tính chất khác như khả năng tạo bọt và khả năng tạo nhũ [6] Xử lý nhiệt là một trong những quá trình công nghệ phổ biến trong chế biến thực phẩm, có thể ảnh hưởng đến các tính chất chức năng của protein và dịch thủy phân [6] Khả năng tạo bọt và tạo nhũ của dịch thủy phân protein là những tính chất chức năng ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc của sản phẩm thực phẩm Với khả năng giữ nước, bột dịch thủy phân

mayonnaise, nước chấm salad nhằm hạn chế tách pha, cải thiện vị của sản phẩm [7] Mỗi dịch thủy phân protein là một hỗn hợp các acid amin và peptide có kích thước và trình tự acid amin khác nhau [8] Mức độ thủy phân thể hiện tỷ lệ liên kết peptide bị cắt đứt trong dịch thủy phân, là một trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến thành phần, kích thước và trình tự acid amin của peptide, ảnh hưởng đến cả hoạt tính kháng oxy hóa

và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein [1, 9] Mức độ thủy phân phụ thuộc vào điều kiện thủy phân bao gồm các yếu tố như tỷ lệ nguyên liệu:dung môi, loại enzyme, pH, nhiệt độ, tỷ lệ enzyme:cơ chất, thời gian thủy phân,… [10]

Con ruốc là một trong những loài sinh vật biển có giá trị thấp và được đánh bắt với số lượng lớn Chúng thường được dùng làm nguyên liệu sản xuất các sản phẩm có giá trị kinh tế không cao như mắm ruốc, ruốc khô hoặc thức ăn cho gia súc Tuy nhiên, nghiên cứu của Vo (2018) [11] chứng minh con ruốc khô có hàm lượng protein cao (72,8% khối lượng chất khô), xứng đáng được xem là một nguồn tiềm năng để thu nhận dịch thủy phân protein/peptide có hoạt tính sinh học, bao gồm cả hoạt tính kháng oxy hóa Mặt khác, trên thế giới và ở Việt Nam hiện chưa có công bố khoa học nào về ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein từ con ruốc khô

Mục tiêu của nghiên cứu này gồm: (i) khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến DH của dịch thủy phân protein con ruốc khô; (ii) đánh giá ảnh hưởng của DH đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân protein con ruốc khô theo ba cơ chế: cho electron, cho hidro và liên kết ion Fe2+; (iii) khảo sát ảnh hưởng của DH đến tính chất chức năng của dịch thủy phân protein con ruốc khô gồm độ tan, độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, WHC và OHC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Con ruốc

Con ruốc là loài giáp xác 10 chân, dạng như con tôm nhỏ Người trong Nam gọi

“tép” nhỏ, người Hà Tĩnh gọi “moi”, người miền Trung gọi “khuyết”

Hình 1.1 Con ruốc khô

Ruốc có hình dạng như tôm nhỏ, chỉ lớn khoảng 10-40 mm tùy thuộc vào ruốc cái

hay đực Hai loài chính đánh bắt được ở Đông Nam Á là A indicus và A japonicus Bản

hải của con ruốc trải dài từ bờ tây Ấn Độ sang Thái Lan, Nam Dương, biển Đông và ngược lên Đài Loan, Nhật Bản Ở vùng biển Quảng Bình, mùa ruốc kéo dài từ tháng Tư đến tháng Tám Âm lịch hàng năm Nhưng ruốc đánh bắt được vào tháng Sáu lại là ruốc ngon nhất Ở Quảng Bình có câu ngạn ngữ rằng: "ruốc tháng sáu là máu rồng" Có nghĩa

là ruốc tháng sáu vừa có màu đỏ au như huyết vừa chứa đầy đủ dưỡng chất nhất của loài ruốc biển nên con ruốc bắt được vào lúc này là ngon nhất, bổ nhất Tùy theo luồng ruốc

đi trên biển, người ngư dân sử dụng loại lưới nào để đánh bắt mà gọi tên loại đó Ví dụ: Ruốc bắt từ mành dã ở nước 5 - 7 sải, gọi là ruốc dã (hay giạ), ruốc đánh được từ việc kéo lưới bằng đi bộ ven bờ gọi là ruốc kéo, từ việc lặn xuống đáy biển dùng lưới nhỏ mà vớt gọi là ruốc lặn, từ loại vó ở ngoài khơi gọi là ruốc ''te''

Mùa ruốc ở vùng biển Quảng Ngãi thường kéo dài từ đầu tháng 2 đến tháng 4 hằng năm Theo Tổng cục Thủy sản, đầu năm 2019, bình quân mỗi ngày ngư dân Quảng Ngãi khai thác hơn 100 tấn ruốc Con ruốc vì quá nhỏ thường chỉ dùng để làm mắm hay phơi khô rồi xay vụn thành bột ruốc Nghiên cứu của Võ và cộng sự (2018) [12] công bố

hàm lượng protein của con ruốc khô đạt 72,8% hàm lượng chất khô, cho thấy con ruốc khô là một nguồn protein tiềm năng để thu nhận dịch thủy phân protein/peptide có những tính chất công nghệ quan trọng

1.2 Dịch thủy phân

1.2.1 Giới thiệu

Dịch thủy phân protein là sản phẩm tạo ra từ quá trình thủy phân protein sử dụng tác nhân hóa học như acid, base hoặc chế phẩm enzyme Mỗi dịch thủy phân protein là một hỗn hợp các peptide có độ dài và trình tự acid amin khác nhau cùng với các acid amin tự

do [8] Dịch thủy phân có thể được dùng như thực phẩm tốt cho sức khỏe, thực phẩm chức năng, chất bổ sung dưỡng chất và dược phẩm dinh dưỡng, có tiềm năng ngăn ngừa

và trị một số bệnh

1.2.2 Các phương pháp thuỷ phân protein

Quá trình thuỷ phân là quá trình cắt đứt các liên kết peptide trong protein có sự tham gia của phân tử nước khi sự có mặt của chất xúc tác như tác nhân hoá học (acid hoặc base) hoặc tác nhân hóa sinh (enzyme)

Thuỷ phân bằng tác nhân hoá học

Phương pháp này thuỷ phân protein nhờ xúc tác của acid mạnh (HCl, H2SO4) hoặc base mạnh (NaOH) ở nhiệt độ cao để cắt đứt liên kết peptide Phương pháp này có một số hạn chế như sau:

 Khi thuỷ phân bằng acid, một số acid amin như tryptophan, asparagine, glutamine và hầu hết các vitamin sẽ bị mất đi do quá trình thuỷ phân bằng acid thường diễn ra ở nồng độ acid cao (10N) và nhiệt độ cao (1180C) Dịch thủy phân thu được thường có giá trị dinh dưỡng thấp và tính chất chức năng kém Ngoài ra, quá trình trung hòa sau khi thủy phân dẫn đến dịch chứa hàm lượng muối cao, ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm [13]

 Khi thuỷ phân bằng base, serine, cysteine và threonine bị biến đổi thành các chất độc như lysinoalanine, ornithinoalanine, lanthionine, và β-amino alanine thông qua

phản ứng tách β và phản ứng cộng; các acid amin chuyển từ đồng phân L thành đồng phân D do phản ứng racemic hóa, giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm [13]

Tác nhân hóa sinh

Protease (hay còn gọi là proteinase hoặc peptidase) là một nhóm enzyme có chức năng xúc tác cho quá trình thủy phân protein thành các peptide và acid amin Protease được phân loại dựa trên tính đặc hiệu và cơ chế hoạt động Hiện nay, protease được chia thành 4 nhóm chính dựa vào nhóm chức chức năng ở trung tâm hoạt động bao gồm serine, thiol, carboxyl và metallo Dựa vào cơ chế hoạt động, protease được chia làm 2 nhóm gồm endoprotease (thủy phân liên kết peptide trong protein, sinh ra những peptide lớn) và exoprotease (aminopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N và carboxypeptidase thủy phân liên kết peptide đầu C của protein) [13]

Acid amin sinh ra trong quá trình thuỷ phân bằng enzyme được bảo toàn do phương pháp này hạn chế việc dùng hoá chất, không xảy ra các phản ứng hóa học không mong muốn khác như recamic hóa nên sản phẩm thu được có giá trị dinh dưỡng và mức độ an toàn cao Không những vậy, việc sử dụng chế phẩm enzyme để thủy phân còn có tính đặc hiệu, dễ dàng trong việc kiểm soát thành phần peptide, acid amin của dịch thủy phân [14]

1.2.3 Hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân có liên quan đến sự cộng hưởng hoạt tính của các protein tan, peptide và acid amin, trong đó peptide đóng vai trò quan trọng nhất Peptide có hoạt tính sinh học thường không thể hiện hoạt tính khi nằm trong trình tự protein Tuy nhiên, các peptide này khi giải phóng khỏi protein sẽ thể hiện các hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật, liên kết khoáng,…[14]

i) Hoạt tính kháng oxy hóa

Chất kháng oxy hoá là những hợp chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hoá, chúng có nhiều vai trò trong sản xuất thực phẩm và sức khoẻ con người

Trong lĩnh vực thực phẩm, quá trình oxy hoá chất béo không bão hoà không những làm giảm giá trị cảm quan mà còn giảm giá trị dinh dưỡng, giảm sự an toàn của sản phẩm

trong quá trình bảo quản và tạo ra các sản phẩm thứ cấp trong quá trình chế biến Trong quá trình sản xuất thực phẩm, việc bổ sung chất kháng oxy hoá sẽ ngăn chặn hoặc làm giảm những biến đổi xấu do quá trình oxy hoá trong thực phẩm gây ra và tăng thời gian bảo quản cho sản phẩm [15]

Việc tạo thành gốc tự do như gốc anion superoxide (O2●-), hydroperoxide (H2O2) và gốc hydroxyl (●OH) là hệ quả không thể tránh khỏi ở sinh vật trong quá trình trao đổi chất Gốc tự do không ổn định và nhanh chóng phản ứng với các chất khác trong cơ thể, dẫn tới tổn thương tế bào và các mô Trong cơ thể con người, có nhiều hệ thống kháng oxy hoá khác nhau như enzyme kháng oxy hoá nội tại (superoxide dismutase, catalase và glutathione peroxidase), vitamin C, vitamin E, glutathione Chúng có vai trò quan trọng trong việc trung hòa gốc tự do, giúp tế bào không bị tổn thương Tuy nhiên, khi cơ thể bị bệnh hoặc gặp một vấn đề nào đó khiến các gốc tự do và các dạng oxy hoạt động hình thành quá nhiều, chúng sẽ bắt đầu tấn công vào tế bào Màng tế bào, DNA, RNA sẽ bị oxy hóa và kết quả là hàng loạt các rối loạn và bệnh tật xuất hiện như tiểu đường, ung thư, bệnh Alzheimer, viêm, sơ vữa động mạch, lão hóa, [15] Do đó, cần bổ sung chất kháng oxy hóa để hạn chế và ngăn ngừa các tác động xấu trên

Để ngăn ngừa và làm chậm quá trình peroxide trong thực phẩm, nhiều chất kháng oxy hóa có bản chất hóa học như butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), tert-butylhydroquinone (TBHQ) và propyl gallate (PG) đã và đang được sử dụng Tuy nhiên việc sử dụng các chất kháng oxy hóa này cần được kiểm soát nghiêm ngặt do những nguy cơ ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Vì vậy, việc tìm kiếm những chất kháng oxy hóa tự nhiên thay thế cho những chất kháng oxy hóa tổng hợp đã và đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Peptide có hoạt tính kháng oxy hóa là peptide ngoài giá trị dinh dưỡng còn có tác động tích cực cho sức khỏe người nhờ tác dụng bảo vệ cơ thể người chống lại những tổn thương gây ra bởi gốc

tự do và các dạng oxy hoạt động (oxy đơn bội, hydroperoxide, superoxide anion, gốc hydroxyl) [16]

Sae-Leaw và cộng sự (2017) [17] đã xác định được 4 peptide có hoạt tính kháng oxy hóa với trình tự là Gly-Leu-Phe-Gly-Pro-Arg (646Da), Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (1107Da), Val-Leu-Gly-Pro-Phe (532Da), và Gln-Leu-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Val (780Da) từ dịch thủy phân da cá vược sử dụng chế phẩm Alcalase Trong nghiên cứu của Halim và cộng sự (2018) [18] về hoạt tính kháng oxy hóa của các

phân đoạn peptide tách từ dịch thủy phân protein từ con lươn (monopterus sp.) sử dụng

chế phẩm Alcalase, phân đoạn 3kDa có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất với hoạt tính trung hòa gốc DPPH, năng lực khử và hoạt tính liên kết ion sắt (II) đạt lần lượt 73,17%, 0,39% và 99,74% Ngoài ra, các peptide kháng oxy hóa còn được thu nhận từ dịch thủy

phân protein từ da cá Raja clavata, cá lù đù, hàu…[16]

 Một số phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá

o Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH●

Gốc tự do DPPH● là một gốc tự do bền, màu tím và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm Khi có mặt chất kháng oxy hóa, nó sẽ bị trung hòa thành DPPH●●H, có màu vàng [19]

o Phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS●+

Gốc tự do cation ABTS●+ là một gốc tự do bền, phát quang màu xanh, có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 734 nm Khi có mặt chất kháng oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS●+, các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa ion này thành ABTS Độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734 nm được dùng để xác định hoạt tính của chất kháng oxy hóa (hình 1.2) [19]

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng của phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS ●+

o Phương pháp trung hòa gốc peroxyl (ORAC)

Hợp chất sinh gốc tự do như hợp chất azo được thêm vào chất phát huỳnh quang như β-phicoerythrin hoặc fluorescein và được gia nhiệt, hợp chất azo sinh ra gốc tự do peroxyl, oxy hóa hợp chất phát huỳnh quang, giảm cường độ phát huỳnh quang Hoạt tính kháng oxy hóa được đánh giá qua đồ thị thể hiện quan hệ giữa cường độ và thời gian phát quang trong trường hợp có và không có mặt chất kháng oxy hóa [20]

o Phương pháp trung hòa gốc tự do anion superoxide (O2●-)

Pyrogallol sẽ phát quang khi phản ứng với gốc tự do anion superoxide Khi có mặt chất kháng oxy hóa sẽ làm giảm cường độ phát quang của pyrogallol vì chất kháng oxy hóa tương tác với gốc tự do anion superoxide Hoạt tính kháng oxy hóa được định lượng thông qua mức độ giảm cường độ phát quang của pyrogallol (đánh giá độ hấp thu của hỗn hợp ở 320nm) [19]

o Phương pháp trung hòa gốc tự do hydroxyl (OH●)

α-Deoxyribose bị tấn công của gốc OH● sinh ra bởi phản ứng giữa FeSO4-EDTA và

H2O2 trong môi trường đệm phosphate pH 7,4 Sản phẩm sinh ra được cho phản ứng với thiobarbituric acid trong môi trường pH thấp khi có gia nhiệt tạo thành hợp chất màu hồng có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 532nm Khi có mặt chất kháng oxy hóa, OH● bị trung hòa, α-deoxyribose được bảo vệ, độ hấp thu của hỗn hợp ở bước sóng 532nm giảm [21]

o Hoạt lực khử RP (Reducing Power)

Phương pháp này đánh giá khả năng cho electron của chất kháng oxy hóa cho chất oxy hóa Sự hình thành các ion kim loại có số oxy hóa thấp hơn được đánh giá qua độ hấp thu của phức có màu ở một bước sóng thích hợp Chất oxy hóa thường chọn trong phương pháp này gồm Fe3+, Cu2+, Ag+, Au3+ và Ce4+ [19]

o Phương pháp FRAP

Ở pH thấp, khi có mặt chất kháng oxy hóa, phức chất ferric tripyridyltriazine (Fe3+TPTZ) bị khử thành dạng ferrous (Fe2+-TPTZ), có màu xanh đậm với độ hấp thu cực đại

-ở bước sóng 595 nm (hình 1.3) [19]

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng của phương pháp FRAP

o Phương pháp ức chế quá trình peroxide hoá lipid

Phương pháp này đánh giá khả năng bảo vệ màng tế bào khỏi sự tấn công bởi gốc tự

do nhờ chất kháng oxy hóa Hoạt tính kháng oxy hóa được thể hiện thông qua độ ưa béo của chất kháng oxy hóa [22]

o Phương pháp tẩy màu β-carotene

Phương pháp này dựa trên sự mất màu vàng của dung dịch β-carotene do sự tấn công của gốc tự do peroxyl (sinh ra bởi phản ứng tự oxy hóa linoleic acid khi gia nhiệt trong không khí) làm gãy hệ liên kết Π liên hợp của β-carotene Khi có mặt chất kháng oxy hóa, gốc tự do sẽ bị trung hòa, làm giảm sự mất màu của β-carotene [23]

o Phương pháp liên kết ion kim loại

Ion kim loại, đặc biệt ion kim loại đa hóa trị như sắt (II, III), đồng (I, II)…khi tồn tại dạng tự do trong cơ thể có thể sinh ra gốc tự do thông qua phản ứng oxy hóa khử, điển hình là phản ứng Fenton và Haber-Weiss Do đó, phối tử có khả năng tạo phức với các ion kim loại trên thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa nhờ vào ngăn chặn các ion này tham gia phản ứng sinh gốc tự do [24]

ii) Hoạt tính kháng khuẩn

Peptide kháng khuẩn là các peptide thể hiện hoạt tính ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn có hại Trong tự nhiên, chúng giữ vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch ở động vật, chúng tham gia vào việc trung hòa và tiêu diệt các vi sinh vật xâm nhập [25] Trong những năm gần đây, sự gia tăng về tính kháng kháng sinh và việc hạn chế sử dụng các loại hóa chất bảo quản trong thực phẩm đã thúc đẩy việc tìm kiếm các chất kháng khuẩn tự nhiên mới có khả năng thay thế các chất kháng khuẩn hóa học Nhiều peptide

kháng khuẩn đã được tìm thấy từ nhiều loài thủy hải sản khác nhau Jiang và cộng sự (2014) [26] đã tìm ra 5 peptide kháng khuẩn, YEESQAELEGSLK, GKKTAEIEK, EDLAKALAKK, QAVEAQK, và KELEEK từ dịch thủy phân protein của cá mè trắng Hoa Nam sử dụng enzyme Flavourzyme Năm peptide này thể hiện khả năng ức chế sự

phát triển của S aureus và E coli với nồng độ ức chế tối thiểu trong khoảng 0,3125 và 5

mg/ml Ennaas và cộng sự (2015) [27] đã sử dụng 4 loại protease gồm Protamex, Neutrase, papain, and Flavourzyme để thu dịch thủy phân protein từ phụ phẩm cá thu Kết quả cho thấy cả bốn dịch thủy phân đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cả Gram + và Gram -, trong đó dịch thủy phân Protamex có hoạt tính cao nhất Bốn peptide kháng khuẩn, AKPGDGAGSGPR, GLPGPLGPAGPK, SIFIQRFTT và RKSGDPLGR, đã được xác định từ dịch thủy phân protein từ phụ phẩm cá thu sử dụng chế phẩm Protamex

iii) Hoạt tính liên kết kim loại

Các khoáng chất gồm canxi, sắt và đồng đóng vai trò quan trọng đối với cơ thể con người thông qua hoạt động như những cofactor, tham gia quá trình trao đổi chất hay là thành phần của hợp chất chức năng quan trọng [28] Sự thiếu hụt các khoáng này dẫn đến nhiều bệnh khác nhau Ví dụ, còi xương, loãng xương, cao huyết áp và béo phì được xem

là hậu quả của việc thiếu hụt canxi [12] Không cung cấp đủ sắt cho cơ thể gây ra thiếu máu, nhận thức kém, tăng tỷ lệ tử vong của phụ nữ mang thai [29] Đồng, được biết như

là cofactor của nhiều loại enzyme trong cơ thể, tham gia vào nhiều quá trình hóa sinh khác nhau như hô hấp tế bào, sinh tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh, tổng hợp sắc tố và

mô liên kết, phát triển hệ thần kinh trung ương …[30] Việc bổ sung muối vô cơ, muối hữu cơ hay nguyên tố kim loại vào thực phẩm được xem là phương pháp hiệu quả để bổ sung khoáng cho cơ thể Tuy nhiên, chất lượng cảm quan của thực phẩm có thể bị ảnh hưởng khi bổ sung các dạng khoáng trên [31] Hơn thế nữa, phương pháp này có thể dẫn đến tình trạng ion kim loại chuyển tiếp tồn tại dạng tự do trong cơ thể, gây ra ảnh hưởng xấu Ví dụ, ion đồng hay sắt tự do có thể tham gia phản ứng Fenton sinh ra các dạng oxy hoạt động, điển hình là OH●, gây tổn thương DNA [24] Ngược lại, peptide liên kết khoáng đã được chứng minh có khả năng tạo thành phức chất bền, dễ tan, cải thiện sự

hấp thu khoáng của cơ thể [32, 33] Peptide liên kết kim loại giúp tăng khả năng hấp thu các ion kim loại nhờ vào việc tạo thành phức hòa tan bền với ion kim loại thông qua hình thành liên kết cho nhận giữa cặp điện tử tự do của các acid amin như Asp, Glu, His…và orbital trống của ion kim loại [34] Peptide liên kết kim loại đã được tìm thấy từ các nguồn protein thủy hải sản khác nhau

Từ dịch thủy phân protein cá rô phi, một peptide liên kết Canxi với trình tự acid amin Trp-Glu-Trp-Leu-His-Tyr-Trp đã được xác định với CaBC là 65 mg/g [28] Trong nghiên cứu của Chen và cộng sự (2013) [35], peptide liên kết kẽm với trình tự acid amin HLRQEEKEEVTVGSLK và hoạt tính liên kết kẽm đạt 6,56 µg/mg đã được thu nhận từ dịch thủy phân protein hàu Sun và cộng sự (2017) [36] chỉ ra rằng hải sâm là một nguồn protein tiềm năng để thu nhận dịch thủy phân có hoạt tính liên kết sắt Trong nghiên cứu của Guo và cộng sự (2015) [24] về hoạt tính liên kết đồng từ của peptide thu nhận từ dịch thủy phân protein cá minh thái Alaska, một peptide với trình tự GPAGPHGPPG và hoạt tính liên kết đồng đạt 0,43±0,02 mol Cu/mol peptide đã được xác định

1.2.4 Tính chất chức năng

i) Độ tan

Độ tan của protein là tính chất chức năng đầu tiên thường được đánh giá trong quá trình phát triển và thử nghiệm nguyên liệu protein mới Độ tan cao chứng tỏ khả năng phân tán tốt các phân tử protein và sản phẩm thu được là hệ keo có độ đồng nhất cao Độ tan của protein bị tác động bởi thành phần và trình tự acid amin, phân tử khối, cấu hình

và hàm lượng các nhóm phân cực và không phân cực trong acid amin Ngoài ra, độ tan của protein còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như lực ion, loại dung môi, pH, nhiệt độ và điều kiện xử lý

pH môi trường là yếu tố quyết định độ tan của protein Mức độ hòa tan của protein trong dung dịch là kết quả của tương tác tĩnh điện và tương tác kỵ nước giữa các phân tử protein Độ tan tăng nếu lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử lớn hơn tương tác kỵ nước

Để có thể tan, Protein phải tương tác nhiều nhất có thể với dung môi Tại điểm đẳng điện (pI), tổng điện tích của protein bằng không, giữa các phân tử protein tồn tại lực hút là chủ

yếu, dẫn đến các phân tử liên kết với nhau và kết quả là protein không tan Tương tác giữa protein và nước tăng tại giá trị pH cao hơn hoặc thấp hơn pI bởi khi đó protein mang điện âm hoặc điện dương, tăng độ hòa tan của protein [37]

iii) Khả năng tạo bọt

Tính chất tạo bọt bền của protein rất quan trọng trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm khác nhau Bọt trong thực phẩm là một hệ phức tạp bao gồm khí, chất lỏng, chất rắn và chất hoạt động bề mặt Sự phân bố kích thước bong bóng khí trong bọt ảnh hưởng đến tính chất cảm quan và cấu trúc sản phẩm bọt như độ mịn, độ nhẹ và độ ngon miệng Chức năng của tác nhân tạo bọt hay protein trong quá trình tạo bọt là làm giảm sức căng

bề mặt, tăng độ nhớt của pha lỏng và hình thành màng bao chắc Tác nhân tạo bọt như protein cần phải có những tính chất như: (1) phải làm bền bọt nhanh và hiệu quả ở nồng

độ thấp; (2) phải hoạt động hiệu quả trên khoảng pH rộng để phù hợp với nhiều loại thực phẩm khác nhau; (3) phải hoạt động hiệu quả trong môi trường có những chất ức chế quá trình tạo bọt như chất béo, alcohol hoặc chất mùi

Có ba giai đoạn diễn ra trong quá trình hình thành bọt Đầu tiên, các protein tan khuếch tán đến bề mặt phân pha nước-khí và làm giảm sức căng bề mặt Sau đó, protein duỗi mạch và tái sắp xếp tại bề mặt phân pha Cuối cùng, protein tương tác với nhau thông qua tương tác tĩnh điện, tương tác kị nước và liên kết hidro tạo thành màng bao bọc bọt

Khả năng tạo bọt của protein bị ảnh hưởng bởi nguồn protein, phương pháp và các thông số quá trình như nhiệt độ, pH, nồng độ protein, thời gian khuấy đảo…Ngoài ra, khả năng tạo bọt của protein còn phụ thuộc vào khả năng hình thành màng bao mềm dẻo, đàn hồi và cố kết để bao bọc bọt và giúp bọt chống lại các tác động cơ học Độ tan, khả năng

di chuyển và khuếch tán đến bề mặt phân pha khí-nước của protein cao làm giảm độ nhớt

bề mặt, tăng khả năng di chuyển của bong bóng trong dung dịch và khả năng hidrat hóa của lớp màng protein, cải thiện khả năng tạo bọt Bên cạnh đó, kích thước phân tử, cấu hình protein, mức độ tương tác nội phân tử và mức độ hidrat hóa của lớp màng protein cũng là các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo bọt Tương tác nội phân tử protein ảnh hưởng đến độ cố kết của màng bao bọt, tác động đến khả năng tạo bọt của protein Cấu hình protein thay đổi làm lộ ra các gốc kỵ nước, tạo thành các vùng kỵ nước và tăng tương tác giữa các protein tại bề mặt phân pha, tạo thành màng protein liên tục cố kết bao quanh bong bóng khí [37]

iv) Khả năng tạo nhũ

Khả năng tạo nhũ của protein là khả năng protein tham gia vào hình thành và làm bền

hệ nhũ tương mới tạo thành Khả năng tạo nhũ là một tính năng công nghệ quan trọng trong việc phát triển một nguyên liệu protein mới sử dụng trong thực phẩm Khả năng tạo nhũ của protein được biểu thị qua EAI và ESI EAI thể hiện diện tích bề mặt dầu bị nhũ hóa dưới điều kiện nhất định bởi 1g protein EAI phụ thuộc vào khả năng hình hình màng bao quanh hạt cầu béo và khả năng giảm sức căng bề mặt tại bề mặt phân pha nước-dầu của protein ESI biểu thị khả năng duy trì hạt cầu béo trong hệ nhũ tương không bị tách ra

do kết hợp hoặc kết tụ

Nhiều yếu tố hóa học và vật lý có liên quan đến quá trình hình thành, độ bền và tính chất của hệ nhũ protein-béo-nước EAI của protein phụ thuộc vào nguồn protein, hàm lượng protein, pH, lực ion (loại muối và hàm lượng muối) và độ nhớt của hệ Độ tan, tính

kỵ nước bề mặt và tính linh hoạt phân tử của protein cũng được chứng minh có tác động đến EAI của protein Bên cạnh đó, EAI của protein còn bị ảnh hưởng bởi thiết bị, nhiệt

độ dầu và nhiệt độ dung dịch protein Hình dạng, điện tích và tính kỵ nước của phân tử

protein, mức độ phân cực và mức độ hydrat hóa của nhóm phân cực cũng có ảnh hưởng đến EAI của protein Hệ nhũ càng bền khi protein có độ tan cao, có khả năng di chuyển nhanh đến bề mặt phân pha nước-dầu, phân bố đều các nhóm mang điện và có khả năng hình thành màng bao bền

pH môi trường tác động đến EAI của protein thông qua thay đổi cấu hình, độ tan và tính chất bề mặt của protein Protein có độ tan càng cao, khả năng di chuyển đến và tạo thành lớp màng bao quanh hạt cầu béo càng cao, EAI cao Sự cân bằng ưa béo-ưa nước quyết định tính chất nhũ của protein Sự cân bằng thích hợp giữa nhóm ưa nước và ưa béo trong protein là cần thiết cho khả năng làm giảm sức căng bề mặt và bề mặt phân pha Sự cân bằng ưa béo-ưa nước thích hợp giúp cho protein dễ dàng định hướng tại bề mặt phân pha dầu-nước

ESI phụ thuộc vào bản chất và tính chất của màng bao quanh hạt cầu béo Protein làm bền hệ nhũ bằng cách tạo ra màng chắn ngăn chặn các hạt cầu béo kết hợp lại với nhau Màng bao dày, được hydrat hóa và tích điện làm bền nhũ Độ dày, độ kết dính và điện tích của màng được quyết định bởi bản chất protein và điều kiện quá trình nhũ hóa

Độ bền nhũ tăng lên khi hydrat hóa màng protein pH môi trường tác động đến độ bền nhũ thông qua ảnh hưởng đến tính lưu biến của màng do thay đổi độ tan, tổng điện tích

và cấu hình của phân tử protein [37]

WHC của protein là khả năng giữ nước chống lại lực hút vật lý và hóa lý của protein WHC có vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc thực phẩm, đặc biệt là sản phẩm thịt từ thịt vụn (comminuted meat product) và bột nhào WHC phụ thuộc vào thành phần và cấu hình của phân tử protein Nước tương tác protein thông qua nhiều con đường, phần lớn là liên kết hydro với các nhóm ưa nước như imino, amino, carboxyl, hydroxyl, carbonyl và sulfhydryl Bên cạnh đó, nghiên cứu về vị trí liên kết nước đặc hiệu của protein sử dụng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy các nhóm không phân cực như alanine và valine có thể liên kết với 1 phân tử nước, trong khi đó các nhóm phân cực có thể liên kết 2-3 phân tử nước và các nhóm ion (trong Asp, Glu, Lys) có thể

liên kết 4-7 phân tử nước [7] Protein/peptide có khả năng giữ nước cao có thể sử dụng như chất giữ ẩm trong sản xuất thực phẩm

vi) OHC

OHC của protein là một trong những dữ liệu quan trọng để chọn protein làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm OHC của protein bị tác động bởi tương tác protein-dầu và sự sắp xếp không gian của pha béo (quyết định bởi tương tác dầu-dầu) Protein tương tác với dầu thông qua liên kết kỵ nước, liên kết tĩnh điện, liên kết hidro và liên kết Van Der Waals Bên cạnh đó, OHC của protein còn bị ảnh hưởng bởi nguồn protein, điều kiện xử

lý, thành phần phụ gia và kích thước protein [37] Bột dịch thủy phân có OHC cao là một yếu tố cần thiết để ứng dụng trong sản xuất xúc xích, mayonnaise, nước chấm salad nhằm hạn chế tách pha, cải thiện vị của sản phẩm [7]

đó, base được thêm vào trong quá trình thủy phân có thể đem lại những nhược điểm trong quá trình ứng dụng dịch thủy phân

Trong quá trình thủy phân, sự thay đổi nhiệt độ đông đặc của dịch thủy phân có thể

đo được bằng máy đo độ thẩm thấu Giá trị DH của dịch thủy phân có thể đánh giá thông qua sự thay đổi nhiệt độ đông đặc Tuy nhiên, phương pháp này không thể dùng cho dung dịch có độ nhớt cao hoặc dung dịch có nồng độ chất tan (như muối) cao Những cơ chất không phải protein bị thủy phân bởi những enzyme khác (như amylase) trong chế phẩm protease sẽ làm ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp này

Hàm lượng nitơ hòa tan trong TCA đã được chứng minh có tương quan cao đến giá trị DH đánh giá bằng phương pháp pH-stat Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng hiệu quả trong trường hợp thủy phân protein bằng endo-peptidase Trong trường hợp sử dụng chế phẩm protease chủ yếu chứa exo-peptidase thì mối tương quan này không còn chặt chẽ Điều này có thể được cho là hoạt động của exo-peptidase không làm tăng độ hòa tan như endo-peptidase mặc dù số lượng liên kết peptide bị cắt là như nhau

Phương pháp TNBS dựa trên phản ứng giữa nhóm amino bậc 1 với thuốc thử TNBS Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thời gian dài để có được kết quả Thêm vào đó, thuốc thử TNBS không bền, có độc tính và phải được sử dụng cẩn thận vì nó có nguy cơ gây nổ

Phương pháp OPA dựa trên phản ứng giữa nhóm amino và OPA trong môi trường có chứa beta-mercaptoethanol tạo thành chất màu có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 340nm Tuy nhiên, DTT đã được sử dụng thay thế cho b-mercaptoethanol do ít gây ô nhiễm môi trường [38]

1.4 Ứng dụng dịch thuỷ phân protein từ thủy sản

Bảng 1.1 trình bày ứng dụng của một số sản phẩm có nguồn gốc từ dịch thủy phân protein thủy hải sản

Bảng 1.1 Tên thương hiệu, các ứng dụng của dịch thuỷ phân protein cá [16]

gia Seacure® Dịch thuỷ phân cá

biển trắng vùng nước

sâu

Thực phẩm bổ sung giúp hỗ trợ các tế bào trong đường tiêu hóa

và điều tiết chức năng đường ruột

Mỹ và Canada

Amizate® Dịch thủy phân

Hỗ trợ phản ứng của cơ thể với căng thẳng và hỗ trợ chức năng

thần kinh

Anh

PROTIZEN® Dịch thuỷ phân Thực phẩm bổ sung giúp giảm Anh

protein cá trắng căng thẳng Vasotensin® Dịch thủy phân

protein cá ngừ sọc

Hỗ trợ chức năng mạch máu và

ổn định huyết áp

Mỹ và Nhật Bản PEPTACE® Dịch thuỷ phân

protein cá Molva molva

Giảm căng thẳng, giảm chỉ số glycemic và giảm căng thẳng

Anh

MOLVAL® Dịch thủy phân

protein cá Molva molva Bắc Đại Tây Dương

Thực phẩm bổ sung giúp cân bằng cholesterol, kiểm soát căng thẳng và thúc đẩy tốt cho sức

1.5 Tổng quan quá trình nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa và tính chất

chức năng của dịch thủy phân protein thủy hải sản trong và ngoài nước

1.5.1 Nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng dịch thủy phân protein có nguồn gốc

từ cá là những nguồn nguyên liệu đầy tiềm năng để thu các peptide kháng oxy hóa và một

số các peptide kháng oxy hóa từ dịch thủy phân protein đã được phân lập

Nhóm tác giả Vo và cộng sự (2019) [39] đã khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân gồm loại enzyme, nhiệt độ, pH, tỷ lệ E:S và thời gian thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân protein phụ phẩm chế biến tôm Kết quả cho thấy, dịch thủy phân protein phụ phẩm chế biến tôm thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất với hoạt tính trung hòa gốc DPPH và giá trị FRAP lần lượt là 76,27±2,04% và 422,00±13,15 µM

TE dưới điều kiện thủy phân tốt nhất

Tương tự, dịch thủy phân protein từ sợi cơ cá tráo vây lưng đen thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa cao với hoạt tính trung hòa gốc DPPH là 59,20%, hoạt tính trung hòa gốc

tự do hydroxyl đạt 96,12%, năng lực khử đạt 54,00% và hoạt tính liên kết ion sắt đạt 90,91% [40]

Sripokar và cộng sự (2019) [41] sử dụng enzyme Trypsin từ gan cá thu ngừ (Thunnus

alalunga) để thủy phân cơ cá bò đuôi dài (Abalistes stellaris) Ảnh hưởng của nồng độ

protein đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân đánh giá theo phương pháp trung hòa gốc DPPH, phương pháp FRAP, phương pháp trung hòa gốc ABTS●+ và phương pháp liên kết ion Fe2+

được khảo sát

Từ phụ phẩm cá hồi, Vo và cộng sự (2018) [42] cũng đã thu nhận được dịch thủy phân protein có hoạt tính kháng oxy hóa cao với hoạt tính trung hòa gốc DPPH là 35,4 ± 0,4% và giá trị FRAP là 105,6 ± 2,1 µM TE Từ dịch thủy phân này, nhóm tác giả tiến hành phân đoạn sử dụng phương pháp siêu lọc và đã xác định được phân đoạn <1 kDa thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất Từ phân đoạn này, hai peptide có hoạt tính kháng oxy hóa đã được xác định với trình tự là GAAEKGVPLF và GVDNPGHPF

Trong nghiên cứu của Jin và cộng sự (2018) [43], hai peptide kháng oxy hóa với trình

tự là MCLDSCLL và HPLDSLCL được xác định từ dịch thủy phân protein vỏ sò đỏ Hai peptide này thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa cao chống lại gốc tự do DPPH, gốc tự do ABTS●+, gốc tự do oxy đơn bội và khả năng liên kết ion đồng cao

1.5.2 Nghiên cứu về tính chất chức năng

Putra và cộng sự (2018) [44] đã thu nhận dịch thủy phân protein từ ốc bươu vàng bằng hai loại chế phẩm enzyme khác nhau (Alcalase và Papain) Các tính chất chức năng như độ tan, khả năng tạo bọt và tạo nhũ, khả năng giữ nước và giữ dầu của hai dịch thủy phân được đánh giá Kết quả cho thấy dịch thủy phân bằng Alcalase thể hiện hầu hết các tính chất chức năng tốt hơn so với dịch thu nhận bằng Papain Nhóm tác giả giải thích rằng Alcalase phù hợp với protein ốc bươu vàng, tạo ra nhiều peptide mạch ngắn trong dịch, cải thiện tính chất chức năng của dịch

Trong nghiên cứu của Noman và cộng sự (2018) [10], ảnh hưởng của pH đến tính chất chức năng gồm độ tan và khả năng tạo nhũ của dịch thủy phân protein cá tầm Trung Quốc được khảo sát Kết quả cho thấy pH ảnh hưởng tính chất chức năng thông qua tác động đến khả năng tích điện của peptide trong dịch thủy phân, thay đổi tương tác của peptide-peptide, peptide-dung môi và peptide-béo

Latorres và cộng sự (2018) [45] đã chọn ra dịch thủy phân protein tôm trắng với hai giá trị khác nhau và đánh giá tính chất chức năng (độ tan, khả năng tạo bọt và khả năng tạo nhũ) tại bốn giá trị pH khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy DH và pH tác động đồng thời đến tính chất chức năng của dịch thủy phân protein thông qua thay đổi đặc tính của peptide thành phần như kích thước, điện tích, mức độ kỵ nước…

Như vậy, trên thế giới và ở Việt Nam chưa có công bố khoa học nào về ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến hoạt tính kháng oxy hóa và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein con ruốc

quả thực nghiệm chỉ ra rằng, sự có mặt của proline hoặc hydroxyl proline trong mạch peptide làm tăng khả năng kháng lại enzyme tiêu hóa của peptide đó, đặc biệt là các tripeptide với Pro-Pro ở đầu carboxyl Hơn thế nữa, việc hấp thu peptide có hoạt tính sinh học còn được chứng minh phụ thuộc vào liều lượng sử dụng Điều này được giải thích là

do sự bão hòa các chất mang peptide, ảnh hưởng đến lượng peptide đi vào máu, ảnh hưởng đến sinh khả dụng cũng như khả năng thể hiện hoạt tính của peptide Tuy nhiên, những con đường hấp thu khác (ngoài hấp thu nhờ chất mang) tăng cơ hội peptide được hấp thu, giảm thiểu ảnh hưởng trên Ngoài hấp thu nhờ chất mang, peptide còn được hấp thu theo 4 con đường khác bao gồm khuếch tán thụ động, thực bào, con đường paracellular và nhờ hệ bạch huyết Sự vận chuyển của paracellular đề cập đến việc chuyển các chất qua biểu mô bằng cách đi qua khoảng không gian giữa các tế bào Nó trái ngược với vận chuyển qua tế bào, nơi các chất đi qua tế bào, đi qua cả màng đỉnh và màng đáy Đối với con đường qua hệ bạch huyết, peptide quá lớn để có thể đi theo mao quản vào máu nên chúng khuếch tán qua hệ bạch huyết và từ đó đi vào máu [46]

1.7 Tính an toàn

Bên cạnh những lợi ích mà peptide đem lại cho sức khỏe con người như trên, việc đánh giá mức độ an toàn của peptide cũng rất cần thiết để có thể áp dụng rộng rãi chúng vào thực phẩm Có rất ít nghiên cứu đánh giá về tác dụng phụ của peptide đối với sức khỏe con người Phần lớn phần tử dị ứng từ thực phẩm có bản chất là protein Peptide có hoạt tính sinh học là sản phẩm thủy phân của protein và cắt protein thành mạch ngắn hơn

có khối lượng phân tử nhỏ hơn Đồng thời, quá trình thủy phân giảm thành phần có tính

dị ứng trong protein Tuy nhiên, có thể một vài peptide vẫn còn giữ đoạn mạch gây dị ứng, một trong những mối nguy cần đề phòng khi sử dụng peptide trong sản xuất thực phẩm Ví dụ, Ara h1 là protein gây dị ứng có mặt trong đậu phộng, việc thủy phân protein này bằng enzyme tiêu hóa ở dạ dày và tá tràng tạo thành các peptide và một trong

số những peptide tạo thành vẫn còn giữ trình tự gây dị ứng Mặc dù cho đến nay ảnh hưởng phụ của peptide chưa có nhiều nghiên cứu chứng minh được nhưng cần phải chú ý khi sử dụng chúng trong thực phẩm [1]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Con ruốc khô

Con ruốc khô được thu mua tại công ty ở tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam với độ ẩm khoảng 12,3 ± 0,1% Thành phần hóa học của con ruốc khô được phân tích theo phương pháp của AOAC (2000) [47] và kết quả cho thấy con ruốc chứa 72,8 ± 0,7% protein, 4,3 ± 0,2% béo và 16,8 ± 0,2% tro (tính theo căn bản khô)

2.1.2 Chế phẩm enzyme và hóa chất

Chế phẩm enzyme gồm Flavourzyme® 500MG được mua từ Novozymes (Đan Mạch) Các hóa chất sử dụng được mua từ Sigma-Aldrich và Merck Tất cả các chất trên đều đạt chuẩn phân tích Nước cất 2 lần được dùng trong nghiên cứu này

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp thủy phân

Con ruốc khô được thủy phân sử dụng phương pháp của Bhaskar và Mahendrakar (2008) [48] với một vài thay đổi Đầu tiên, con ruốc khô xay nhuyễn được trộn với nước với tỷ lệ 1:8 (w/v) trước khi gia nhiệt lên 90°C trong 15 phút để vô hoạt enzyme nội tại Tiếp theo, pH của hỗn hợp được chỉnh đến 7 bằng dung dịch NaOH 1M hoặc dung dịch HCl 1M Sau đó, chế phẩm Flavourzyme được thêm vào theo tỉ lệ E/S 60 U/g protein và tiến hành thuỷ phân tại 55oC và thời gian phù hợp Sau quá trình thuỷ phân, dịch thuỷ phân được gia nhiệt ở 90°C trong 15 phút để vô hoạt chế phẩm enzyme Dịch thuỷ phân được ly tâm trước khi lọc qua giấy lọc Whatman paper no 3 để thu nhận phần dịch trước khi sấy đông khô và bảo quản ở -4oC

2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ chế phẩm enzyme (Anson, 1938)

Nguyên tắc: Cho enzyme thủy phân cơ chất casein, acid amin Tyrosine được giải phóng cùng với các peptide và các acid amin khác Xác định Tyrosine tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt tính enzyme theo định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính enzyme là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm pH=7,5, T=37oC, thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong tricloro acetic

acid (TCA), phản ứng với thuốc thử Folin, cho độ hấp thu ở bước sóng 660nm bằng với

độ hấp thu của dung dịch L-Tyrosine 1 mM trên đường chuẩn [49]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục B

2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan (Lowry, 1951)

Nguyên tắc: Phương pháp này kết hợp phản ứng giữa ion đồng với liên kết peptide trong môi trường kiềm (phản ứng Biuret) và phản ứng oxy hóa vòng thơm trong protein (chủ yếu là mạch nhánh của Trp và Tyr) Phương pháp Lowry dựa trên phản ứng ion đồng (I), sinh ra bởi phản ứng oxy hóa của liên kết peptide, với thuốc thử Folin–Ciocalteu (hỗn hợp phosphotungstic acid và phosphomolybdic acid) Phản ứng sinh ra phân tử màu xanh là xanh heteropolymolybdenum có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 660

nm Do đó, tổng nồng độ protein trong mẫu có thể được suy ra từ nồng độ của mạch nhánh Trp và Tyr thông qua độ hấp thu ở bước sóng 660 nm [50]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục B

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân

i) Hoạt tính trung hòa gốc DPPH (Sharma và Bhat, 2009)

Nguyên tắc: gốc tự do DPPH là một gốc tự do bền, có màu tím và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm Khi có mặt chất kháng oxy hóa, nó sẽ bị trung hòa thành 2,2-diphenyl-1 picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của dịch thủy phân được đánh giá thông qua độ hấp thu ở bước sóng 517 nm [51] Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục B

ii) Phương pháp FRAP (Benzie và Strain, 1996)

Nguyên tắc: ở pH thấp, khi có mặt chất kháng oxy hóa, phức chất ferric tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ) bị khử thành dạng ferrous (Fe2+-TPTZ), màu xanh đậm với

độ hấp thu cực đại ở bước sóng 593 nm [52]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục B

iii) Phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS ●+

Nguyên tắc: Gốc tự do cation ABTS●+ là một gốc tự do bền, phát quang màu xanh có

độ hấp thu cực đại ở bước sóng 734 nm Khi cho chất kháng oxy hóa vào dung dịch chứa

ABTS●+, các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa ion này thành ABTS Độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734 nm được dùng để xác định hoạt tính của chất kháng oxy hóa [19]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục B

iv) Phương pháp trung hòa gốc tự do anion superoxide (O 2 ●- )

Nguyên tắc: Pyrogallol sẽ phát quang khi phản ứng với gốc tự do anion superoxide Khi có mặt chất kháng oxy hóa sẽ làm giảm cường độ phát quang của pyrogallol vì chất kháng oxy hóa tương tác với gốc tự do anion superoxide Hoạt tính kháng oxy hóa được định lượng thông qua mức độ giảm cường độ phát quang của pyrogallol (đánh giá độ hấp thu của hỗn hợp ở 320nm) [19]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục B

v) Phương pháp liên kết ion Fe 2+

Nguyên tắc: Ion Fe2+ sẽ tạo phức chất có màu bền với ferrozine, có độ hấp cực đại ở bước sóng 562 nm [53] Các peptide trong dịch thủy phân sẽ cạnh tranh với ferrozine tạo phức với ion Fe2+

làm giảm độ hấp thu ở bước sóng 562 nm

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục B

2.2.5 Phương pháp lọc khử khoáng dịch thủy phân

Hình 2.1 Công thức hóa học của hạt nhựa Amberlite IRC-748I, dạng muối natri

Nguyên tắc: Dịch thuỷ phân sau quá trình lọc thô được đưa qua cột nhựa trao đổi ion (macroporous resin, Amberlite IRC-748I, dạng muối natri, Acros) để tiến hành lọc khử khoáng Hạt nhựa Amberlite IRC-748I, dạng muối natri (hình 2.1) sẽ trao đổi ion Na+ với các ion kim loại khác trong dịch thủy phân dựa trên sự khác biệt về ái lực của hạt nhựa đối với các ion này

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục B

2.2.6 Xác định mức độ thủy phân

Nguyên tắc: Phản ứng giữa nhóm amino và OPA với sự có mặt của DTT tạo thành hợp chất màu xanh dương nhạt có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 340nm

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục B

2.2.7 Xác định tính chất chức năng của dịch thủy phân (Li và cộng sự,

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến DH

Hình 3.1 mô tả ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến DH của dịch thủy phân protein con ruốc khô DH được định nghĩa là tỷ lệ liên kết peptide bị cắt đứt, bị ảnh hưởng bởi nguồn protein, loại enzyme, điều kiện thủy phân bao gồm pH, nhiệt độ, tỷ lệ enzyme:cơ chất và thời gian thủy phân [18] Trong nghiên cứu này, giá trị DH của dịch thủy phân được khảo sát theo thông số thời gian thủy phân với các điều kiện khác của quá trình thủy phân như loại enzyme, pH, nhiệt độ và tỷ lệ E:S được cố định như trong nghiên cứu của Vo (2018) [11]

Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến DH của dịch thủy phân protein con

ruốc khô

Giá trị DH của dịch thủy phân protein con ruốc khô tăng nhanh từ 0 đến 65,9 ± 2,9% trong 40 phút đầu của quá trình thủy phân Điều này có thể giải thích do protein con ruốc khô có nhiều điểm phù hợp với trung tâm hoạt động của chế phẩm Flavourzyme Thêm

vào đó, Flavourzyme là chế phẩm enzyme chứa 7 loại protease (leucine aminopeptidase

A, leucine aminopeptidase 2, dipeptidyl peptidase 4, dipeptidyl peptidase 5, neutral protease 1, neutral protease 2 và alkaline protease 1) bao gồm cả endo- và exo-peptidase [54], thủy phân được nhiều protein khác nhau Khi kéo dài thời gian thủy phân đến 180 phút, tốc độ và độ lớn sự thay đổi giá trị DH thấp (hình 3.1) Nguyên nhân được cho là do

số lượng liên kết phù hợp với trung tâm thủy phân của chế phẩm Flavourzyme đã giảm đáng kể trong 40 phút đầu Kết quả tương tự cũng được công bố bởi Noman và cộng sự (2018) [10] khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến DH của dịch thủy phân protein cá tầm Trung Quốc Từ đồ thị hình 3.1, các giá trị DH gồm 0%, 50,6%, 66,7%, 69,7%, 71,5%, 72,1% và 75,8% ứng với thời gian thủy phân tương ứng là 0, 30,

60, 90, 120, 150 và 180 phút được chọn để thực hiện các khảo sát tiếp theo

3.2 Ảnh hưởng của DH đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân protein con ruốc khô

3.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa theo cơ chế cho electron

Gốc tự do DPPH là một trong những gốc tự do bền, màu tím và có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 517nm Khi có mặt chất kháng oxy hóa, gốc tự do DPPH bị trung hòa do nhận một electron từ chất kháng oxy hóa Kết quả là độ hấp thu tại bước sóng 517nm giảm và màu của dung dịch chuyển từ tím sang vàng [55]

Phương pháp FRAP được dùng như phương pháp thứ hai để đánh giá ảnh hưởng của

DH đến khả năng cho electron của dịch thủy phân protein con ruốc khô Trong phương pháp FRAP, chất kháng oxy hóa hoạt động như một chất khử, khử phức sắt (III) tripyridyl triazine (Fe(III)-TPTZ) thành phức Fe(II)-TPTZ Mức độ khử được đánh giá thông qua sự thay đổi độ hấp thu ở bước sóng 593nm [56]

Hình 3.2 cho thấy hoạt tính trung hòa gốc DPPH và giá trị FRAP đều tăng khi giá trị

DH tăng từ 0 đến 66,7%, đạt giá trị cực đại lần lượt là 22,5 ± 0,3% (thấp hơn 1,78 lần so với hoạt tính trung hòa gốc DPPH của vitamin C) và 74,6 ± 1,9 µM TE (thấp hơn 24,2 lần so với giá trị FRAP của vitamin C) tại DH 66,7% Khi tiếp tăng giá trị DH đến 75,8%, hoạt tính trung hòa gốc DPPH và giá trị FRAP có xu hướng hoặc giảm hoặc thay

đổi không đáng kể Khuynh hướng ảnh hưởng tương tự đến hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp trung hòa gốc DPPH và phương pháp FRAP cũng được công bố bởi You và cộng sự (2009) [57] và Klompong và cộng sự (2007) [58] khi nghiên cứu trên dịch thủy phân protein cá chạch bùn và cá chỉ vàng Xu hướng ảnh hưởng của DH đến hoạt tính trung hòa gốc DPPH của dịch thủy phân protein con ruốc khô cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu trên dịch thủy phân cá tuyết của García-Moreno và cộng sự (2017) [59]

DH ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa của dịch thủy phân protein thông qua tác động đến kích thước và cấu trúc peptide cũng như thành phần acid amin Hoạt tính kháng oxy hóa thấp của các dịch thủy phân protein có giá trị DH thấp (DH<66,7%) có thể là do các dịch thủy phân này chứa nhiều peptide mạch dài hoặc protein chưa bị thủy phân Phần lớn các peptide mạch dài hoặc protein nguyên vẹn có cấu trúc không gian cồng kềnh và có các liên kết nội phân tử, cản trở hoặc khóa các nhóm có hoạt tính kháng oxy hóa [60] Khi DH tăng đến 66,7%, protein con ruốc khô hầu như bị thủy phân thành peptide có khối lượng phân tử thấp có khả năng di chuyển dễ dàng đến gốc tự do, ngăn chặn phản ứng dây chuyền cũng như tác hại của gốc tự do [61] Ngoài ra, Chi và cộng sự (2014) [62] cũng đã công bố rằng các peptide có khối lượng phân tử thấp dễ dàng di chuyển qua màng ruột và tương tác với các gốc tự do sinh ra từ quá trình oxy hóa trong

cơ thể Hoạt tính kháng oxy hóa giảm khi giá trị DH tăng cao hơn 66,7% được cho là do dịch thủy phân chứa phần lớn là các acid amin tự do So với peptide, acid amin tự do có hoạt tính kháng oxy hóa thấp hơn do thiếu sự cộng hưởng cấu trúc [63]

Sự có mặt của Glu và Asp làm tăng hoạt tính kháng oxy hóa theo cơ chế cho electron

do chúng có khả năng cho electron tự do trên nguyên tử oxy trong nhóm cacboxyl cho gốc tự do [64] Vòng phenyl của Phe được xem là nguồn electron dồi dào có thể chuyển cho gốc tự do DPPH hay ion Fe3+ [65] N-amine trong nhóm Ɛ-amine của Lys cũng có thể trung hòa gốc tự do hoặc chuyển ion ferric thành ion ferrous nhờ vào khả năng chuyển electron [66] Bên cạnh đó, Girgih và cộng sự (2014) [65] cũng đã công bố rằng Asn cải thiện hoạt tính kháng oxy hóa nhờ vào electron tự do của nó trên nguyên tử oxy và nguyên tử nitơ trong nhóm cacboxamide ở mạch nhánh có khả năng cho trong quá trình

tương tác với gốc tự do Ngoài ra, Acid amin ưa béo ở hai peptide như Ala, Val và Leu làm tăng sự có mặt của những peptide này tại bề mặt phân pha, ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong pha béo [67, 68] Sự có mặt của Pro ở hai peptide ngăn chặn sự hình thành cấu trúc bậc 2, phơi bày ra nhiều mạch nhánh của acid amin có khả năng kháng oxy hóa [69]

a

b

Các ký tự khác nhau trên các cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Hình 3.2 Ảnh hưởng của DH đến hoạt tính trung hòa gốc DPPH (a) và giá trị FRAP (b)

của dịch thủy phân protein con ruốc khô

3.2.2 Hoạt tính kháng oxy hóa theo cơ chế cho hydro

Gốc tự do O2●- có độc tính cao, hình thành từ nhiều phản ứng tự oxy hóa in vivo và

chuỗi truyền electron [70] Gốc tự do này có thể tham gia nhiều phản ứng hóa sinh khác nhau tạo thành các dạng oxy hoạt động khác như hydro peroxide, peroxynitrite,

hypochlorous acid và dạng oxy hoạt động mạnh nhất in vivo, gốc tự do hydroxyl (OH•) thông qua phản ứng Haber-Weiss [70] Các tế bào sống có một hệ thống enzyme kháng oxy hóa hoạt động như rào chắn sinh học tự nhiên chuyển hóa các dạng oxy hoạt động hoặc các dạng nitơ hoạt động thành các hợp chất vô hại [71] Dịch thủy phân protein có hoạt tính trung hòa gốc tự do superoxide cao hỗ trợ các tế bào chống lại ảnh hưởng có hại của gốc tự do này Hình 3.3 cho thấy hoạt tính trung hòa gốc tự do superoxide giảm khi giá trị DH tăng đến 66,7% Điều này có thể là do quá trình thủy phân đã chuyển các protein, peptide mạch dài thành các peptide mạch ngắn hoặc mạch trung bình, giảm tác động có lợi có sự cộng hưởng cấu trúc, giảm hoạt tính trung hòa gốc superoxide của dịch thủy phân protein Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng giá trị DH của dịch thủy phân protein con ruốc khô thì hoạt tính trung hòa gốc O2●- tăng và đạt cực đại 90,8 ± 0,8% (1,03 lần thấp hơn so với hoạt tính trung hòa gốc O2●- của vitamin C) tại giá trị DH 75,8% Nguyên nhân có thể là do giá trị DH cao chứng tỏ protein bị thủy phân sâu tạo thành nhiều peptide mạch ngắn, lộ ra nhiều nhóm có khả năng cho hydro để trung hòa gốc tự do superoxide [72] Kết quả tương tự cũng đã được công bố bởi Li và cộng sự (2014) [72] khi nghiên cứu ảnh hưởng của DH đến hoạt tính trung hòa gốc tự do O2 ●-

của dịch thủy phân protein hạt trà

Phương pháp xác định hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS●+ được dùng để đánh giá khả năng chuyển nguyên tử hydro của dịch thủy phân protein [73] Kết quả ảnh hưởng của DH đến hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS●+ của dịch thủy phân protein con ruốc khô được thể hiện ở hình 3.4 Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS●+ của dịch thủy phân protein con ruốc khô tăng khi giá trị DH của dịch thủy phân tăng và đạt giá trị cực đại là 33,5 ± 0,1% (2,4 lần thấp hơn so với của hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS●+ vitamin C) tại giá trị DH 75,8% Dịch thủy phân có giá trị DH cao thường chứa nhiều peptide