Khảo sát hoạt tính liên kết canxi và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein từ phụ phẩm cá hồi

+ Tách phân đoạn dịch thủy phân, xác định phân đoạn peptide có hoạt tính liên kết canxi cao nhất + Khảo sát các tính chất chức năng của dịch thủy phân protein từ phụ phẩm cá hồi... Đầu t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Võ Đình Lệ Tâm

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Hoàng Kim Anh

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

Luận văn tốt nghiệp được bảo vệ tại trường Đại học Bách Khoa –

Đại học Quốc gia TPHCM

Thời gian bảo vệ: 10/01/2020

Thành phần hội đồng đánh giá luận văn bao gồm:

1 Chủ tịch hội đồng: GS.TS Lê Văn Việt Mẫn

2 Phản biện 1: PGS.TS Hoàng Kim Anh

3 Phản biện 2: PGS.TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

4 Ủy viên: TS Lê Minh Hùng

5 Ủy viên, thư ký: PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phi

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN VY TRÚC LINH MSHV: 1870267

I TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát hoạt tính liên kết Canxi và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein từ phụ phẩm cá hồi

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

+ Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến hoạt tính liên kết canxi của dịch thủy phân protein

+ Tối ưu hóa điều kiện thủy phân để thu dịch thủy phân có hoạt tính liên kết canxi cao nhất + Tách phân đoạn dịch thủy phân, xác định phân đoạn peptide có hoạt tính liên kết canxi cao nhất

+ Khảo sát các tính chất chức năng của dịch thủy phân protein từ phụ phẩm cá hồi

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 19/08/2019

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 08/12/2019

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt công trình nghiên cứu khoa học này, lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn các quý thầy cô của Bộ môn Công nghệ thực phẩm đã truyền đạt những kiến thức bổ ích và giải đáp những thắc mắc trong suốt thời gian học

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn và tri ân sâu sắc đến cô TS Võ Đình Lệ Tâm đã giao cho tôi đề tài này, chỉ dẫn tận tình, định hướng rõ ràng để tìm ra phương pháp giải quyết vấn đề một cách khoa học và hiệu quả nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong ban quản lý phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị để tôi có thể tiến hành thí nghiệm luận văn

Bên cạnh đó, tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, các bạn học viên cao học, các em sinh viên đã gắn bó và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, cùng bạn bè đã hỗ trợ, khích lệ tinh thần và bên cạnh tôi những lúc khó khăn nhất

Kính chúc sức khỏe đến các quý thầy cô, gia đình và bạn bè

Trân trọng cảm ơn!

TÓM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát hoạt tính liên kết canxi (CaBC) và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein từ phụ phẩm cá hồi Đầu tiên thành phần hóa học của phụ phẩm cá hồi và ảnh hưởng của điều kiện thủy phân gồm loại enzyme, nhiệt

độ, pH, tỷ lệ enzyme:cơ chất (E:S), thời gian thủy phân đến CaBC của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi được đánh giá Sau đó phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được

sử dụng để thu nhận dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi có CaBC cao nhất Tiếp theo, bốn phân đoạn peptide 10–30 kDa, 3–10 kDa, 1–3 kDa và <1 kDa thu nhận từ dịch thủy phân được đánh giá CaBC Cuối cùng, dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi được khảo sát các tính chất chức năng gồm độ tan, độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, khả năng giữ nước (WHC) và khả năng giữ dầu (OHC)

Kết quả cho thấy thành phần hóa học của phụ phẩm cá hồi có hàm ẩm là 61,9±0,2%, hàm lượng protein 44,3±0,7%, hàm lượng béo 45,4±1,1%, hàm lượng tro 10,2 ± 0,2%, hàm lượng canxi 3,7±0,1% (theo hàm lượng chất khô) Dịch thủy phân protein của phụ phẩm cá hồi có CaBC cao nhất đạt 221,02 mgCa2+/g protein với điều kiện thủy phân tối ưu gồm Neutrase enzyme, nhiệt độ 450C, pH 7, tỷ lệ E:S 72,24 U/g protein và thời gian thủy phân 8,02 giờ Phân đoạn peptide <1kDa có CaBC cao nhất 520,4±25,8 mgCa2+/g protein (1,1 lần cao hơn CaBC của casein phosphopeptide) Xác định được các tính chất chức năng của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi ở khoảng pH từ

3 đến 8, độ tan đạt trên 85%, độ bền nhiệt đạt trên 80% sau khi xử lý nhiệt ở 630C trong 30 phút và đạt trên 65% sau khi xử lý nhiệt ở 930C trong 30 giây; tại pH 3 khả năng tạo bọt (FC) và độ bền bọt (FS) đạt giá trị cao nhất lần lượt là 36,3±1,7% và 18,9±0,9%; khả năng tạo nhũ (EAI) đạt cao nhất 52,5±0,1 m2/g và độ bền nhũ (ESI) đạt cực đại 136,9±3,9 phút tại pH 8; WHC đạt 2,0±0,1 ml nước/g bột dịch thủy phân và OHC đạt 6,5±0,3 ml dầu/g bột dịch thủy phân

Nghiên cứu này đã đề xuất hướng tận dụng phụ phẩm chế biến cá hồi mới Dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi có thể được sử dụng như chất mang canxi tự nhiên hoặc phụ gia

In this study, calcium-binding capacity (CaBC) and functional properties of proteolysate from salmon processing by-product were investigated Firstly, chemical composition of salmon by-products and effect of hydrolysis conditions including enzyme type, temperature, pH, enzyme:substrate ratio (E:S), hydrolysis time on CaBC were evaluated Then, response surface methodology (RSM) was applied to optimize the hydrolysis for obtaining proteolysate possessing maximal CaBC Next stage, four peptide fractions of 10–30 kDa, 3–10 kDa, 1–3 kDa and <1 kDa separated from the proteolysate were evaluated their CaBC And the last stage, the functional properties comprising of solubility, heat stability, foaming property, emulsifying property, water holding capacity (WHC) and oil holding capacity (OHC) of the proteolysate were tested

The result showed that chemical composition of the by-product included 61.9±0.2%

of moisture, 44.3±0.7% of protein, 45.4±1.1% of lipid, 10.2±0.2% of ash, 3.7±0.1% of calcium (on dry weight basis) The proteolysate displayed the maximal CaBC of 221.02 mgCa2+/g protein under the optimal hydrolysis condition including enzyme Neutrase, hydrolysis temperature of 450C, pH 7, E:S ratio of 72.24 U/g protein and hydrolysis time

of 8.02 hours The <1 kDa fraction owned the maximal CaBC of 520.4±25.8 mgCa2+/g protein (1.1 folds higher than that of casein phosphopeptide) The proteolysate exerted solubility over 85% in pH range 3-8; heat stability achieved above 80% after heat treatment

at 630C for 30 min and 65% after thermal handling at 930C for 30s in the pH range 3-8; the highest foaming capacity (FC) of 36.3±1.7% and foaming stability (FS) of 18.9±0.9% at

pH 3; the maximal emulsifying activity index (EAI) of 52.5±0.1 m2/g and emulsifying stability index (ESI) of 136.9±3.9 min at pH 8; WHC of 2.0±0.1 ml water/g proteolysate powder and OHC of 6.5±0.3 ml oil/g proteolysate powder

This study suggested a new approach to utilize salmon product Salmon product proteolysate can be used as a natural calcium carrier or food texture enhancer in

by-food technology or pharmaceutical technology

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập riêng của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác Trong quá trình viết bài, các tài liệu tham khảo liên quan đã được trích dẫn nguồn cụ thể và rõ ràng theo đúng yêu cầu Nếu không đúng như đã nêu, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

về đề tài của mình

Học viên thực hiện luận văn

Nguyễn Vy Trúc Linh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

ĐẶT VẤN ĐỀ xii

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu về cá hồi 1

1.1.1 Cá hồi 1

1.1.2 Phân loại 1

1.1.3 Đặc điểm sinh học của cá hồi 2

1.1.4 Tình hình nuôi, chế biến và thị trường cá hồi trên thế giới 2

1.1.5 Phụ phẩm chế biến cá hồi 3

1.2 Dịch thủy phân protein 4

1.2.1 Các phương pháp thủy phân protein 4

1.2.1.1 Thủy phân bằng tác nhân hóa học 4

1.2.1.2 Thủy phân bằng tác nhân hóa sinh 5

1.2.2 Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein 5

1.2.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 5

1.2.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn 7

1.2.2.3 Hoạt tính liên kết kim loại 8

1.2.3 Tính chất chức năng của dịch thủy phân protein 9

1.2.3.1 Độ tan 9

1.2.3.2 Độ bền nhiệt 9

1.2.3.3 Khả năng tạo bọt 10

1.2.3.4 Khả năng tạo nhũ 10

1.2.3.5 Độ thẩm thấu 10

1.2.2.6 Tính chất cảm quan 10

1.3 Ứng dụng dịch thuỷ phân protein từ thủy hải sản 11

1.4 Thu nhận phân đoạn peptide từ dịch thủy phân 12

1.5 Tổng quan quá trình nghiên cứu về CaBC và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein thủy hải sản 13

1.5.1 Nghiên cứu về CaBC 13

1.5.2 Nghiên cứu về tính chất chức năng 14

1.6 Khả năng hấp thu 15

1.7 Tính an toàn 16

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Nguyên liệu 17

2.1.1 Phụ phẩm cá hồi 17

2.1.2 Chế phẩm enzyme và hóa chất 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp xác định thành phần hóa học của phụ phẩm 18

2.2.1.1 Xác định protein tổng bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC, 2000) 18

2.2.1.2 Xác định hàm lượng béo bằng phương pháp Folch

(Folch và cộng sự, 1957) 19

2.2.1.3 Xác định hàm ẩm (AOAC, 2000) 19

2.2.1.4 Xác định hàm lượng tro (AOAC, 2000) 19

2.2.1.5 Phương pháp xác định hàm lượng canxi (TCVN 1526-1:2007) 19

2.2.2 Khảo sát điều kiện thủy phân 19

2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ chế phẩm enzyme (Anson, 1938) 19

2.2.2.2 Phương pháp thủy phân 20

2.2.2.3 Phương pháp xác định mức độ thủy phân (Nielsen và cộng sự, 2001) 22

2.2.2.5 Phương pháp lọc khử khoáng dịch thủy phân 23

2.2.2.6 Phương pháp xác định CaBC (Jung và cộng sự, 2006) 23

2.2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan

(Lowry và cộng sự, 1951) 23

2.2.3 Phương pháp tối ưu hóa điều kiện thủy phân 23

2.2.3.1 Phương pháp sàng lọc yếu tố thủy phân 23

2.2.3.2 Phương pháp tối ưu hóa điều kiện thủy phân 24

2.2.4 Phương pháp thu nhận phân đoạn peptide từ dịch thủy phân 25

2.2.5 Phương pháp xác định tính chất chức năng của dịch thủy phân

(Li và cộng sự, 2012 và Putra và cộng sự, 2018) 25

2.3.6 Phân tích thống kê 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Kết quả khảo sát thành phần hóa học của phụ phẩm cá hồi 26

3.2 Ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến CaBC và DH của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 26

3.2.1 Ảnh hưởng của loại enzyme thủy phân 26

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân 27

3.2.3 Ảnh hưởng của pH 28

3.2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ E:S 29

3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 30

3.3 Tối ưu hóa quá trình thủy phân để thu nhận dịch thủy phân protein có

CaBC cao nhất 31

3.3.1 Thí nghiệm sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến CaBC của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 31

3.3.1 Thí nghiệm tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến CaBC của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 33

3.4 Xác định CaBC của các phân đoạn peptide 35

3.5 Tính chất chức năng của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 36

3.5.1 Độ tan 36

3.5.2 Độ bền nhiệt 37

3.5.3 Khả năng tạo bọt 38

3.5.4 Khả năng tạo nhũ 39

3.5.5 WHC và OHC 41

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

4.1 Kết luận 42

4.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC A: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 52

PHỤ LỤC B: CÁC GIÁ TRỊ PHÂN TÍCH THỰC NGHIỆM 71

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA Analysis of variance (phân tích phương sai)

AOAC Association of Official Analytical Chemists

CaBC Calcium-binding capacity (hoạt tính liên kết Canxi)

DH Degree of hydrolysis (mức độ thủy phân)

EAI Emulsifying activity index (khả năng tạo nhũ)

E:S Enzyme:Substrate (Enzyme:cơ chất)

ESI Emulsifying stability index (độ bền nhũ)

FC Foaming capacity (khả năng tạo bọt)

FS Foaming stability (độ bền bọt)

OHC Oil holding capacity (khả năng giữ dầu)

RSM Response surface methodology (Phương pháp bề mặt đáp ứng) v/v volume/volume (thể tích/thể tích)

w/v weight/volume (khối lượng/thể tích)

w/w weight/weight (khối lượng/khối lượng)

WHC Water holding capacity (khả năng giữ nước)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại tên khoa học cá Hồi 2

Bảng 1.2 Peptide kháng oxy hóa từ thủy hải sản 7

Bảng 1.3 Một số peptide kháng vi sinh vật 8

Bảng 1.4 Ứng dụng của một số sản phẩm có nguồn gốc từ dịch thủy phân protein thủy hải sản 11

Bảng 1.5 Một số phương pháp sử dụng để tách phân đoạn peptide 12

Bảng 2.1 Nhiệt độ và pH tối ưu của các loại enzyme 17

Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến CaBC của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 22

Bảng 2.3 Các mức yếu tố trong tâm ma trận thiết kế sàng lọc 24

Bảng 2.4 Ma trận thiết kế thí nghiệm sàng lọc 24

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của phụ phẩm chế biến cá hồi 26

Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm sàng lọc các yếu tố thủy phân ảnh hưởng đến CaBC của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 32

Bảng 3.3 Mức độ ảnh hưởng của các thông số quá trình thủy phân 32

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cá hồi 1

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 18

Hình 2.2 Quy trình thu nhận dịch thủy phân từ phụ phẩm chế biến cá hồi 21

Hình 2.3 Công thức hóa học của hạt nhựa Amberlite IRC-748I, dạng muối natri 23

Hình 2.4 Cột lọc phân đoạn peptide 25

Hình 3.1 Ảnh hưởng của loại enzyme thủy phân đến CaBC và DH của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 27

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến CaBC và DH của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 28

Hình 3.3 Ảnh hưởng của pH đến CaBC và DH của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 29

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ E:S đến CaBC và DH của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 30

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến CaBC và DH của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 31

Hình 3.6 Đồ thị bề mặt đáp ứng cho CaBC của dịch thuỷ phân phụ phẩm cá hồi 34

Hình 3.7 CaBC của các phân đoạn peptide từ dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 35

Hình 3.8 Độ tan của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 36

Hình 3.9 Độ bền nhiệt của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi 37

Hình 3.10 Khả năng tạo bọt và độ bền bọt của dịch thủy phân protein 38

Hình 3.11 Khả năng tạo nhũ và độ bền nhũ của dịch thủy phân protein 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cá hồi có tên khoa học là Salmonidae chứa rất nhiều chất dinh dưỡng có lợi cho sức

khỏe như: vitamin D, vitamin B12, vitamin B, vitamin A, vitamin B6; các nguyên tố vi chất như canxi, kali, sắt, photpho, kẽm, đồng, magie và nhóm acid amin như: thiamin, niacin, riboflavin, pantothenic Theo “Quy hoạch phát triển cá nước lạnh đến năm 2020, tầm nhìn 2030” của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ước tính tổng sản lượng nuôi

cá nước lạnh đến năm 2015 đạt 3460 tấn (cá hồi là 1448 tấn), đến năm 2020, sản lượng nuôi đạt 10000 tấn (cá hồi là 2713 tấn) [1] Trong quá trình chế biến, một lượng lớn các phụ phẩm (xương, da, vụn thịt, ) thường được tận dụng làm thức ăn cho gia súc hoặc sử dụng cho các sản phẩm có giá trị kinh tế thấp như chế biến thành bột cá, dầu cá hay làm dầu diezel sinh học Trong phụ phẩm cá hồi chứa một lượng lớn protein, vì vậy việc xử lý các phụ phẩm cá hồi nhằm thu được protein có giá trị thương mại cao hơn đồng thời tránh các vấn đề về môi trường đang được quan tâm nghiên cứu Trong đó, việc thủy phân bằng enzyme để thu hồi protein từ phụ phẩm cá là một cách tiếp cận hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi [2],[3]

Canxi là một chất khoáng cần thiết cho những chức năng sinh học trong cơ thể như dẫn truyền thần kinh, co bóp cơ, đông máu và hỗ trợ cấu trúc của khung xương [4] Thiếu canxi có thể dẫn đến bệnh loãng xương ở người lớn, còi xương ở trẻ em, ngoài ra khi thiếu canxi lâu dài trong khẩu phần ăn sẽ liên quan đến việc phát sinh các bệnh cao huyết áp và ung thư ruột [5] Trong nhiều điều kiện, bổ sung canxi vô cơ như canxi cacbonat hoặc canxi clorua, có thể tạo ra kết tủa canxi photphat trong quá trình tiêu hóa, giảm sự hấp thu và khả dụng sinh học của canxi, gây ra tác dụng phụ cho đường ruột như đầy hơi, khó tiêu [6] Mặt khác, canxi hữu cơ, canxi lactate và canxi gluconate, cho thấy hiệu quả điều trị thấp trong thử nghiệm lâm sàng do khả dụng sinh học và tỷ lệ canxi thấp [6] Ngoài ra, bổ sung canxi dưới dạng vô cơ hoặc dùng thuốc canxi liều cao trong thời gian dài có thể dẫn đến sỏi thận, canxi trong máu cao, giảm hiệu quả làm việc của thậnvà giảm hấp thu các khoáng chất cần thiết khác [5] Một số nghiên cứu cho thấy khi peptide liên kết với ion canxi, được

trình tiêu hóa, giúp tăng cường khả dụng sinh học của canxi [9] Thêm vào đó, việc sử dụng các peptide nhỏ sẽ có nhiều lợi ích như: tiêu thụ ít năng lượng và tốc độ chuyển hóa nhanh [10] Chính vì vậy, peptide liên kết canxi được xem như nguồn thay thế tuyệt vời cho các nguồn cung cấp canxi kể trên, việc phát triển các phương pháp tăng cường tính hòa tan của canxi nhằm giúp cải thiện đáng kể sự hấp thu và phát huy đặc tính sinh học của chúng đang

là vấn đề được quan tâm hiện nay

Bên cạnh đặc tính sinh học các tính chất chức năng của dịch thủy phân protein như khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, WHC và OHC rất cần thiết để có thể mở rộng ứng dụng của dịch thủy phân trong sản xuất thực phẩm [11]

Vì vậy, nghiên cứu “Khảo sát hoạt tính liên kết canxi và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein từ phụ phẩm cá hồi” được thực hiện nhằm tìm ra chất có khả năng liên kết canxi có nguồn gốc tự nhiên và các tính chất chức năng để ứng dụng trong sản xuất thực phẩm hoặc dược phẩm từ phụ phẩm chế biến thủy hải sản

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cá hồi

1.1.1 Cá hồi

Cá hồi có tên khoa học là Salmonidae là một họ cá vây tia, thuộc bộ Salmoniformes

(bộ cá hồi) Trong thiên nhiên, cá hồi là một loài thủy sản xứ lạnh, được sinh đẻ trong môi trường nước ngọt nhưng hầu hết quãng đời còn lại chúng lại sống trong môi trường nước mặn, sau khi đã trưởng thành chúng trở về môi trường nước ngọt để duy trì nòi giống

Cá hồi sống dọc các bờ biển tại cả Bắc Đại Tây Dương (các họ di cư Salmo salar)

và Thái Bình Dương, và cũng đã từng được đưa tới Hồ lớn ở Bắc Mỹ, chúng phân bố rộng

ở Đại Tây Dương, Bắc Mỹ, Bắc Âu Cá hồi được sản xuất nhiều trong ngành nuôi trồng thủy sản ở nhiều nơi trên thế giới [12]

Hình 1 1 Cá hồi 1.1.2 Phân loại

Cá hồi có tên tiếng Anh là Salmon, tên khoa học là Salmo salar, thuộc họ

Salmonidea trong bộ Salmoniformes

Phân loại cá Hồi (Salmo salar) được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại tên khoa học cá Hồi [12]

Phân ngành (subphylum) Vertebrata

Phân lớp (subclass) Teleostei

Liên bộ (superordo) Protacanthopterygii

1.1.3 Đặc điểm sinh học của cá hồi

Cá hồi (Salmo salar) phân bố chủ yếu ở các vùng biển ôn đới gần 2 cực thuộc Đại

Tây Dương Cá Hồi sống hoang dã hoặc được nuôi tại các vùng biển ven bờ ở các nước Bắc Âu hoặc Nam Mỹ Loài cá này có 3-4 vây lưng với 5-7 tia vây và 1-2 gai; vây hậu môn hơi dài với 7-11 tia; vây đuôi có khoảng 19 tia Cá trưởng thành da màu bạc với đốm đen nằm trên lưng, kích thước tối đa 150 cm, cân nặng tối đa 47 kg, tuổi thọ 8-13 năm

Cá hồi cũng được nuôi ở các thủy vực tự nhiên và trong các hệ thống nước chảy Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cá hồi tốt nhất trong nhiệt độ nước từ 10 – 200C Chúng cũng có khả năng chịu nhiệt độ cao hơn tới 240C trong một thời gian ngắn Hàm lượng oxy hòa tan trong nước cần đạt tới > 7mg/l, pH thích hợp cho cá hồi là từ 6,7 đến 8,6 [13]

1.1.4 Tình hình nuôi, chế biến và thị trường cá hồi trên thế giới

Tại thị trường Mỹ có ba nguồn cung cấp cá hồi lớn là Canada, Na Uy và Chile Tuy nhiên, mỗi nhà cung cấp lại phân phối theo các nhánh khác nhau Cá hồi được cung cấp từ Canada vào thị trường Mỹ chủ yếu là dạng tươi sống nguyên con (chiếm 91% tổng doanh thu sang thị trường Mỹ) Na Uy đứng thứ hai chủ yếu phân phối mặt hàng cá hồi fillet, trong đó 66% kim ngạch xuất khẩu cá hồi fillet đông lạnh và 33% kim ngạch xuất khẩu cá hồi tươi của Na Uy sang thị trường Mỹ Đối với nhà cung cấp Chile, sự phát triển thị trường

có xu hướng tương đồng với Na Uy, nhưng khác với Na Uy là 78% tổng kim ngạch xuất

khẩu cá hồi fillet tươi của Chile đến thị trường Mỹ, trong khi tỷ trọng cá hồi fillet đông lạnh chiếm 16% [14],[15]

Tính đến hết năm 2016, sản lượng cá hồi trên toàn thế giới đạt 3,6 triệu tấn, chiếm khoảng 4,4% tổng sản lượng thủy sản trên toàn thế giới Trong vòng 20 năm, từ năm 1995 đến 2016, sản lượng đánh bắt và nuôi trồng cá hồi đã tăng gần 384% Tính riêng trong nửa đầu năm 2017, sản lượng cá Hồi thu hoạch được là 2,2 triệu tấn [16]

Tại Việt Nam, cá hồi được ươm nuôi ở Sapa (Lào Cai), Đà Lạt (Lâm Đồng), Lạng Sơn, Bắc Giang và một số địa phương khác Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn ước tính tổng sản lượng nuôi cá nước lạnh đến năm 2015 đạt 3460 tấn (cá hồi 1448 tấn), đến năm 2020 sản lượng nuôi đạt 10000 tấn (cá hồi là 2713 tấn) [17]

1.1.5 Phụ phẩm chế biến cá hồi

Hiện nay trên thị trường các sản phẩm chế biến từ cá hồi chủ yếu là sản phẩm đông lạnh chiếm trên 92% (fillet, nguyên con, cắt khúc), và phần còn lại là các sản phẩm khác Ngoài ra, một số sản phẩm giá trị gia tăng như sản phẩm cao cấp, thực phẩm đóng hộp, phối chế làm sẵn, ăn liền tuy có bước đầu sản xuất nhưng số lượng còn rất hạn chế

Trong phụ phẩm của cá hồi khung xương chiếm 8,6% khối lượng cá, và trong khung xương chứa 60-70% khoáng chủ yếu là canxi và phospho, có thể được xem là một nguồn cung cấp khoáng tiềm năng Theo báo cáo của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) số 1027, hàm lượng protein của khung xương khoảng 40% khối lượng chất khô, cần được nghiên cứu tận dụng [14],[3]

Một số sản phẩm từ phụ phẩm cá hồi trên thị trường hiện nay gồm có dầu đặc, dầu lỏng, acid béo tự do FFA (công ty cổ phần Đầu tư và phát triển đa quốc gia – IDI corp), bột cá (công ty cổ phần Gò Đàng – Godaco) Các phụ phẩm trong chế biến cá hồi tuy đã được tận dụng để sản xuất ra sản phẩm mới nhưng những sản phẩm có giá trị cao có áp dụng khoa học công nghệ và được ứng dụng trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng,

mỹ phẩm vẫn chưa nhiều [18]

1.2 Dịch thủy phân protein

Dịch thủy phân protein là sản phẩm tạo ra từ quá trình thủy phân protein sử dụng tác nhân hóa học như acid, base hoặc tác nhân hóa sinh (chế phẩm enzyme) Mỗi dịch thủy phân protein là một hỗn hợp các peptide có độ dài và trình tự acid amin khác nhau cùng với các acid amin tự do [19]

Một số dịch thủy phân protein là hỗn hợp của các oligopeptide phân tử lượng cao, hỗn hợp của các oligopeptide phân tử lượng trung bình, peptone, hỗn hộp các peptide mạch ngắn, hỗn hợp các acid amin và các peptide phân tử lượng thấp hoặc hỗn hợp các acid amin

tự do [20]

1.2.1 Các phương pháp thủy phân protein

Quá trình thuỷ phân là quá trình phá vỡ các liên kết peptide trong protein có sự tham gia của nước khi sự có mặt của chất xúc tác như tác nhân hoá học (acid hoặc base) hoặc tác nhân hóa sinh (chế phẩm enzyme)

1.2.1.1 Thủy phân bằng tác nhân hóa học

Đây là một trong những phương pháp phổ biến và thường được sử dụng trong sản xuất công nghiệp, vì giá thành thấp và dễ tiến hành Trong ngành công nghệ thực phẩm, phương pháp này thường được áp dụng trong sản xuất nước tương, các sản phẩm lên men Phương pháp này thường được tiến hành nhờ xúc tác của acid mạnh (HCl, H2SO4) hoặc base mạnh (NaOH) ở nhiệt độ cao để cắt đứt liên kết peptide Nhưng bên cạnh ưu điểm nêu trên phương pháp này cũng có những nhược điểm như sau:

Khi thuỷ phân bằng acid, một số acid amin như tryptophan, asparagine, glutamine

và hầu hết các vitamin sẽ bị mất đi do quá trình thuỷ phân bằng acid thường diễn ra ở nồng

độ acid cao (10N) và nhiệt độ cao (1180C) Dịch thủy phân thu được thường có giá trị dinh dưỡng thấp và tính chất chức năng kém Ngoài ra, quá trình trung hòa sau khi, thủy phân dẫn đến dịch chứa hàm lượng muối cao, ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm [17]

Khi thuỷ phân bằng base, serine, cysteine và threonine bị biến đổi thành các chất độc như lysinoalanine, ornithinoalanine, lanthionine, và β-amino alanine thông qua phản

ứng tách β và phản ứng cộng; các acid amin chuyển từ đồng phân L thành đồng phân D do phản ứng racemic hóa, giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm [17]

1.2.1.2 Thủy phân bằng tác nhân hóa sinh

Hiện nay phương pháp thủy phân protein bằng tác nhân hóa sinh thường sử dụng enzyme protease (hay còn gọi là proteinase hoặc peptidase) là một nhóm enzyme có chức năng xúc tác cho quá trình thủy phân protein thành các peptide và acid amin Protease được phân loại dựa trên tính đặc hiệu và cơ chế hoạt động và được chia thành 4 nhóm chính dựa vào nhóm chức chức năng ở trung tâm hoạt động bao gồm serine, thiol, carboxyl và metallo Dựa vào cơ chế hoạt động, protease được chia làm 2 nhóm gồm endoprotease (thủy phân liên kết peptide trong protein, sinh ra những peptide lớn) và exoprotease (aminopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N và carboxypeptidase thủy phân liên kết peptide đầu C của protein) [17]

So với thủy phân bằng phương pháp hóa học, phương pháp này sẽ bảo vệ giá trị dinh dưỡng của các acid amin sinh ra trong quá trình thủy phân tốt hơn so với phương pháp hóa học do hạn chế dung hóa chất Ngoài ra còn có thể kiểm soát thành phần peptide, acid amin của dịch thủy phân do tính đặc hiệu của việc sử dụng chế phẩm enzyme [21]

1.2.2 Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein

Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân có liên quan đến sự cộng hưởng hoạt tính của các protein tan, peptide và acid amin, trong đó peptide đóng vai trò quan trọng nhất, vì peptide chiếm phần lớn trong dịch thủy phân [22] Peptide có hoạt tính sinh học thường bị

vô hoạt khi nằm trong trình tự protein [21] Tuy nhiên, các peptide này khi giải phóng khỏi protein sẽ thể hiện các hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật, liên kết khoáng,…[23]

1.2.2.1 Hoạt tính kháng oxy hóa

Chất kháng oxy hóa là chất có tác dụng ức chế hoặc làm chậm quá trình oxy hóa của một cơ chất, đóng vai trò quan trọng trong sản xuất thực phẩm, là một tác nhân quan trọng bảo vệ sức khỏe hạn chế sự mất cân bằng oxy hóa Đối ngành công nghiệp sản xuất

trình oxy hóa gây ra cho quá trình sản xuất và bảo quản thực phẩm, đảm bảo chất lượng và

tăng thời gian bảo quản cho sản phẩm [24]

Những peptide kháng oxy hóa từ thực phẩm được xem là an toàn và tốt cho sức

khỏe, kèm theo đó là khối lượng phân tử thấp, hoạt tính cao và dễ hấp thu [25] Peptide

kháng oxy hóa ưu việt hơn enzyme kháng oxy hóa do có cấu trúc đơn giản, ổn định trong

các điều kiện khác nhau và không gây hại cho hệ miễn dịch [26]

Peptide có hoạt tính kháng oxy hóa ngoài giá trị dinh dưỡng còn có tác động tích

cực cho sức khỏe người nhờ tác dụng bảo vệ cơ thể người chống lại những tổn thương gây

ra bởi gốc tự do và các dạng oxy hoạt động (oxy đơn bội, hydroperoxide, superoxide anion,

gốc hydroxyl) [27]

Cơ chế kháng oxy hóa chính xác của các peptide vẫn đang còn được nghiên cứu

Tuy nhiên, rất nhiều nghiên cứu cho thấy peptide là tác nhân trung hòa gốc tự do, khả năng

khử và ngăn cản quá trình peroxide hóa enzyme hoặc phi enzyme Các peptide kháng oxy

hóa sở hữu khả năng tương tác với gốc tự do hoặc các ion có tính oxy hóa để chấm dứt

chuỗi phản ứng và tạo thành các hợp chất bền hơn hoặc các ion có tính khử [28]

Một trong những vấn đề vẫn chưa được làm rõ là mối quan hệ giữa tính chất cấu

trúc của peptide như khối lượng phân tử, tính kị nước, thành phần và trình tự acid amin với

từng cơ chế kháng oxy hoá Các acid amin kị nước như histidine, proline, methionine,

cysteine, tyrosine, tryptophan và phenylalanine có thể nâng cao hoạt tính kháng oxy hóa

[26]

Các peptide kháng oxy hóa từ thủy hải sản được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Peptide kháng oxy hóa từ một số loài thủy hải sản[29 ] , [ 24]

Da cá vượt Gly-Leu-Phe-Gly-Pro-Arg,

Gly-Ala-Thr-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg, Val-Leu-Gly-Pro-Phe,

vi khuẩn gram âm, gram dương và kể cả nấm [30]

Một số peptide kháng khuẩn đã được tìm thấy từ nhiều loài thủy hải sản khác nhau như trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số peptide kháng vi sinh vật [22]

Hàu Cys, Leu, Glu, Asp, Phe, Tyr, Ile, Gly

Tôm Hùm Mĩ Gln-Tyr-Gly-Asn-Leu-Leu-Ser-Leu-Leu-Asn-Gly-Tyr-Arg

1.2.2.3 Hoạt tính liên kết kim loại

Canxi, sắt và đồng hoạt động như những cofactor, tham gia quá trình trao đổi chất hay là thành phần của một số hợp chất quan trọng trong cơ thể con người [31] Canxi đóng vai trò quan trọng trong việc tạo độ cứng cho xương, chất dẫn truyền xung thần kinh, một cofactor cho nhiều loại enzyme giúp cho các hóa lý và hóa sinh trong cơ thể diễn ra bình thường Sự thiếu hụt canxi sẽ dẫn đến hiện tượng loãng xương nên việc bổ sung canxi trong khẩu phần ăn là điều cần thiết [32] Đồng được biết như là cofactor của nhiều loại enzyme trong cơ thể, tham gia vào nhiều quá trình hóa sinh khác nhau như hô hấp tế bào, sinh tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh, tổng hợp sắc tố và mô liên kết, phát triển hệ thần kinh trung ương …[33] Đối với sắt nếu không cung cấp đủ cho cơ thể có thể gây ra thiếu máu, nhận thức kém, tăng tỷ lệ tử vong của phụ nữ mang thai [34]

Việc bổ sung muối vô cơ, muối hữu cơ hay nguyên tố kim loại vào thực phẩm được xem là phương pháp hiệu quả để bổ sung khoáng cho cơ thể Tuy nhiên, chất lượng cảm quan của thực phẩm có thể bị ảnh hưởng khi bổ sung các dạng khoáng trên [35] Hơn thế nữa, phương pháp này có thể dẫn đến tình trạng ion kim loại chuyển tiếp tồn tại dạng tự do trong cơ thể, gây ra ảnh hưởng xấu Ví dụ, ion đồng hay sắt tự do có thể tham gia phản ứng Fenton sinh ra các dạng oxy hoạt động, điển hình là OH•, gây tổn thương DNA [36] Ngược lại, peptide liên kết khoáng đã được chứng minh có khả năng tạo thành phức chất bền, dễ tan, cải thiện sự hấp thu khoáng của cơ thể [37],[38]

Peptide liên kết kim loại giúp tăng khả năng hấp thu các ion kim loại nhờ vào việc tạo thành phức hòa tan bền với ion kim loại thông qua hình thành liên kết cho nhận giữa cặp điện tử tự do của các acid amin như Asp, Glu, His…và orbital trống của ion kim loại [39] Lấy một ví dụ thực tế, sữa và các sản phẩm từ sữa là nguồn cung cấp canxi phổ biến

Casein phosphopeptide từ quá trình tiêu hóa trong ruột non của casein có khả năng bắt canxi, tăng cường lượng canxi hòa tan có thể hấp thu vào cơ thể [32] Tuy nhiên, một số người không thể sử dụng sữa và các sản phẩm từ sữa do không thể hấp thu hoặc dị ứng [31] Vì thế cần phải tìm nguồn canxi thay thế, một số nghiên cứu đã chứng minh các dipeptide hoặc tripeptide có khả năng liên kết canxi và dễ hấp thu vào trong tế bào nhờ vào

và sự hiện diện của các chất phụ gia dung môi khác nhau Dịch thủy phân với mức độ thủy phân thấp vẫn có thể tan ở pH 4-5 vì nó không chỉ chứa các peptide có phân tử lượng nhỏ

mà còn có sự ion hóa mạnh hơn của các nhóm acid và carboxyl làm tăng tính ưa nước Thay đổi các yếu tố bên ngoài này có thể dẫn đến tăng độ hòa tan, tuy nhiên việc thay đổi các điều kiện dung dịch không phải lúc nào cũng phù hợp để tăng độ hòa tan của dịch thủy phân protein đến mức cần thiết Độ hòa tan của dịch thủy phân sẽ là một trong những tính chất phải xem xét đầu tiên nếu sử dụng dịch thủy phân vào sản xuất thực phẩm như nước giải khát và thức uống cho trẻ em [20]

1.2.3.2 Độ bền nhiệt

Tính chất bền nhiệt của dịch thủy phân protein là một trong những tính chất được quan tâm Vì dựa vào độ bền nhiệt có thể biết được mức độ ứng dụng của dịch thủy phân vào quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là các quá trình xử lý nhiệt Dịch thủy phân bền nhiệt hơn protein trong nguyên liệu, nếu dịch thủy phân ở mức độ thủy phân thấp (3 – 10%) với sự có mặt của ion kim loại hóa trị II như CaCl2 bền nhiệt ở 100 – 1300C trong khoảng

pH 3 – 11 Tính chất hòa tan và tính chất bền nhiệt có thể được gia tăng bằng việc tạo thành phức chất với polysaccharide như acid galacturonic [2]

1.2.3.3 Khả năng tạo bọt

Khả năng tạo bọt là một trong những tính chất ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc của sản phẩm Khả năng tạo bọt của dịch thủy phân sẽ bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố, để tăng khả năng tạo bọt cần điều chỉnh tốc độ quay khác nhau và thời gian khuấy cũng như các giá trị pH điển hình cho từng sản phẩm [20]

1.2.3.5 Độ thẩm thấu

Độ thẩm thấu là một trong những tính chất hóa lý quan trọng của dịch thủy phân cũng như của tính chất thực phẩm Mức độ thủy phân tăng dẫn đến việc tạo thành hỗn hợp peptide và các acid amin sẽ làm tăng sự thẩm thấu của dịch thủy phân protein Một trong những phương pháp được sử dụng để làm điều chỉnh độ thẩm thấu của dịch thủy phân là

bổ sung tinh bột, phương pháp này không chỉ làm giảm mức độ thẩm thấu mà còn đảm bảo

sự ổn định khi chế biến [20]

1.2.2.6 Tính chất cảm quan

Các sản phẩm dịch thủy phẩn thường có mùi vị đặc biệt và có thể ứng dụng để tạo hương vị cho sản phẩm Nhưng đa số dịch thủy phân protein có vị đắng và không thể bổ

sung trực tiếp vào sản phẩm thực phẩm Qua một số nghiên cứu thì vị đắng của dịch thủy protein là do sự xuất hiện của các peptide Tuy nhiên, vị đắng giảm ở mức độ thủy phân cao khi các peptide gây vị đắng thành acid amin tự do [22]

1.3 Ứng dụng dịch thuỷ phân protein từ thủy hải sản.

Bảng 1.4 Ứng dụng của một số sản phẩm có nguồn gốc từ dịch thủy phân protein

Thực phẩm bổ sung giúp hỗ trợ các tế bào trong đường tiêu hóa

và điều tiết chức năng đường ruột

Mỹ và Canada

Amizate® Dịch thủy phân

Hỗ trợ phản ứng của cơ thể với căng thẳng và hỗ trợ chức năng thần kinh

protein cá tuyết

Ổn định hàm lượng glucose trong máu và kiểm soát cân nặng

Anh và

Mỹ

LIQUAMEN® Dịch thuỷ phân

protein cá Molva molva

Giảm căng thẳng, giảm chỉ số glycemic

Anh

MOLVAL® Dịch thủy phân

protein cá Molva molva Bắc Đại Tây Dương

Thực phẩm bổ sung giúp cân bằng cholesterol, kiểm soát căng thẳng và thúc đẩy tốt cho sức khỏe tim mạch

Anh

SEAGEST® Dịch thủy phân

protein cá trắng biển sâu

Hỗ trợ cấu trúc của niêm mạc ruột và tăng cường sức khỏe đường ruột

Mỹ

1.4 Thu nhận phân đoạn peptide từ dịch thủy phân

Nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để thu nhận phân đoạn peptide từ dịch thủy phân protein, mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm riêng như trình bày ở bảng 1.5

Hiệu suất thấp Chi phí cao

Kết tủa

Tách phân đoạn peptide dựa trên

sự khác biệt về điểm đẳng điện (pI)

Tính chọn lọc cao

Có thể phân hủy peptide hoặc thay đổi hoạt tính sinh học của chúng

Siêu lọc

Tách phân đoạn peptide dựa trên

sự khác biệt về kích thước phân

tử peptide

Không sử dụng hóa chất khác

Chi phí thấp

Khó tách các peptide có kích thước gần giống nhau

1.5 Tổng quan quá trình nghiên cứu về CaBC và tính chất chức năng của dịch thủy phân protein thủy hải sản

1.5.1 Nghiên cứu về CaBC

Một số nghiên cứu khoa học đã chứng minh dịch thủy phân protein có nguồn gốc

từ thủy hải sản là những nguồn nguyên liệu đầy tiềm năng để thu các peptide có CaBC

Từ phụ phẩm chế biến tôm, Guangrong- Huang và cộng sự (2011), đã thu nhận dịch thủy phân protein có CaBC, sử dụng các enzyme protease khác nhau (Flavourzyme, Alcalase, Pepsin, Trypsin) Trong số các enzyme dùng trong nghiên cứu, Trypsin cho dịch thủy phân có CaBC (0,294 mmol/ g protein) và DH (18,4%) cao nhất Dịch thủy phân sau

đó được lọc tách phân đoạn và phân đoạn peptide <1 kDa cho CaBC cao nhất Các peptide tinh chế cho thấy lượng canxi cao nhất kết hợp với peptide là 2,70 mmol / g protein Đồng thời cấu trúc peptide được xác định là Thr-Cys-His bằng ESI/ MS/ MS [45]

Narin Charoenphun và cộng sự (2012) đã tiến hành khảo sát dịch thủy phân protein

cá rô phi ở nồng độ protein 2% (w/v) được thủy phân bằng nhiều enzyme protease khác nhau, bao gồm Alcalase 2,4 L, Flavourzyme 1000L, Protease GN, và Papain ở 500C, pH 8 trong 6 giờ CaBC cao nhất là 65 mg/ g protein ở DH 27,7% khi sử dụng chế phẩm enzyme Alcalase 2,4 L Phân tử lượng của các peptide liên kết canxi là 1,2 kDa Trình tự của peptide được xác định là một peptide ngắn, Trp-Glu-Trp-Leu-His-Tyr-Trp [46]

Trong nghiên cứu của Xixi Cai và cộng sự (2016), đã chỉ ra một peptide được tách

từ dịch thủy phân protein của vi tảo biển qua sắc ký lọc gel và sắc ký pha đảo (HPLC) là Phe-Tyr (FY) có CaBC đạt 128,77±2,57 μg/ mg Thông qua khảo sát cho thấy, FY-canxi

có độ hòa tan và độ bền nhiệt cao, có lợi cho việc hấp thụ và vận chuyển cơ bản trong đường ruột của cơ thể người Thêm vào đó, FY-canxi tăng hiệu suất hấp thu canxi cao hơn

3 lần so với CaCl2 và bảo vệ ion canxi chống lại các chất ức chế như acid tannic, oxalate, phytate, và Zn2+ [47]

Trong nghiên cứu của Hu Hou, Shikai Wang và các cộng sự (2017), protein của moi

phân có CaBC Các peptide có CaBC trong dịch thủy phân được thu nhận và tinh sạch bằng sắc ký Hydroxyapatite (HAC), và sắc ký hiệu năng cao đảo ngược (RP-HPLC) Trình tự peptide được xác định là Val-Leu-Gly-Tyr-Ile-Gln-Ile-Arg (N- đến C-, khối lượng phân tử 960,58 Da) Theo kết quả của FTIR và quang phổ khối, vị trí liên kết ion canxi có thể liên quan đến nhóm amino của Gln, Ile và Arg [48]

Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hương Thảo (2016), đã công

bố kết quả của nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện thủy phân thu nhận peptide có hoạt tính liên kết canxi từ phụ phẩm cá tra Điều kiện thủy phân được tối ưu bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) với CaBC là hàm mục tiêu Enzyme trypsin, pH 8,0, nhiệt độ 41,8oC, tỷ lệ E:S 11,8U/g protein, thời gian thủy phân 108,26 phút ở được xác định là điều kiện thủy phân tối ưu cho dịch thủy phân có CaBC cao nhất 18,69 mg/g protein [49]

Nhóm nghiên cứu của tác giả Võ Đình Lệ Tâm (2018) đã công bố kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện thủy phân (loại enzyme, tỷ lệ E:S, thời gian thủy phân) CaBC của dịch thủy phân protein con ruốc khô CaBC trong dịch thủy phân protein đạt được cao nhất 261,61±3,89 mg Ca2+/g protein (thấp hơn 1,77 lần so với casein phosphopeptide) với điều kiện thủy phân sử dụng chế phẩm enzyme Flavourzyme,

pH 6,5, nhiệt độ thủy phân 500C, tỷ lệ E:S 60 U/g protein và thời gian thủy phân 5 giờ [50]

1.5.2 Nghiên cứu về tính chất chức năng

Trong nghiên cứu của Kumar và cộng sự (2011), tiến hành thủy phân protein bốn

bộ phận của cá sòng và cá lù đù gồm da, cơ, xương, nội tạng sử dụng protease thương mại (pepsin, trypsin) Dịch thủy phân protein thu được đánh giá các tính chất chức năng gồm

độ hòa tan, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ ở pH từ 2 đến 10, thời gian thủy phân là 6 giờ Kết quả cho thấy dịch thủy phân protein từ các bộ phận cơ thể khác nhau của cá sòng

và cá lù đù cho có tính chức năng tốt trong phạm vi rộng của pH và dịch thủy phân thu được từ nội tạng thể hiện tính chất chức năng tốt hơn các bộ phận khác [51]

Taheri và cộng sự (2011) đã thủy phân protein từ phụ phẩm gia cầm và cá hồi vân bằng chế phẩm enzyme Alcalase 2.4L Dịch thủy phân protein của hai loại phụ phẩm sẽ được đánh giá và so sánh các tính chất chức năng gồm có độ hòa tan, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, WHC, OHC Dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi vân có khả năng nhũ

hóa và khả năng tạo bọt cao hơn dịch thủy phân protein phụ phẩm gia cầm, trong khi OHC của hai loại khác biệt không có khác biệt nhiều [52]

Latorres và cộng sự (2017) đã tiến hành khảo sát dịch thủy phân protein từ tôm thẻ chân trắng với DH khác nhau (10% và 20%) sử dụng chế phẩm enzyme Alcalase 2.4 L and Protamex Các tính chất chức năng của dịch thủy phân protein được đánh giá gồm có độ hòa tan, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ Qua kết quả khảo sát cho thấy độ hòa tan tăng, ngược lại khả năng tạo bọt và tạo nhũ giảm khi DH tăng [53]

Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của tác giả Võ Đình Lệ Tâm (2018) đã tiến hành khảo sát các tính chất chức năng của dịch thủy phân protein con ruốc khô gồm độ hòa tan,

độ bền nhiệt, khả năng tạo bọt, khả năng tạo nhũ, WHC và OHC Kết quả cho thấy, trong khoảng pH từ 5 đến 8 độ hòa tan và độ bền nhiệt của dịch thủy phân đạt được trên 75% và trên 70% Tại giá trị pH 8, các giá trị FC, FS, EAI và ESI đạt được các mức cao nhất lần lượt là 46,33±0,57%, 40,22±0,38%, 15,9±0,07 m2/g và 48,06±1,59 phút WHC và OHC của bột dịch thủy phân protein lần lượt là 2,81 ± 0,08 ml nước/g bột dịch thủy phân và 4,76 ± 0,41 ml dầu/g bột dịch thủy phân [50]

và tính tan trong lipid của peptide, tính chất cấu trúc phân tử (tính ưa nước, tính kỵ nước), kích thước Các yếu tố này sẽ quyết định tính nguyên vẹn của peptide sau khi đi qua hệ tiêu hóa Sau đó, peptide được hấp thu qua khoảng không gian giữa các tế bào niêm mạc ruột để đi vào hệ bạch huyết và thể hiện hoạt tính sinh học Peptide nhỏ thì tính nguyên vẹn sau khi đi qua thành ruột sẽ cao hơn, giúp bảo toàn hoạt tính của peptide Khi so sánh

thấp Ngoài ra, peptide có chứa proline hoặc hydroxyl proline, đặc biệt là các tripeptide với Pro-Pro ở đầu carboxyl sẽ tăng khả năng kháng lại enzyme tiêu hóa của peptide đó, tăng khả năng hấp thụ của peptide Liều lượng sử dụng cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hấp thu của peptide có hoạt tính sinh học Nguyên nhân là do sự bão hòa các chất mang peptide, ảnh hưởng đến lượng peptide đi vào máu, ảnh hưởng đến sinh khả dụng cũng như khả năng thể hiện hoạt tính của peptide Nhưng ngoài hấp thu bằng chất mang, peptide còn được hấp thu theo 4 còn đường khác gồm khuếch tán thụ động, thực bào, con đường paracellular và nhờ hệ bạch huyết, giúp khả năng được hấp thu của peptide tăng lên [54]

1.7 Tính an toàn

Để có thể ứng dụng peptide vào thực phẩm, đòi hỏi peptide phải có tính an toàn Nhưng đến hiện nay không có nhiều nghiên cứu đánh giá về tác dụng phụ của peptide đối với sức khỏe con người Trong đó, khả năng gây dị ứng của peptide một trong những yếu

tố được quan tâm hàng đầu của tính an toàn Peptide là sản phẩm khi protein bị cắt thành mạch ngắn hơn Trong quá trình cắt mạch protein, thành phần dị ứng trong protein được giảm xuống Tuy nhiên, trong một vài trường hợp peptide có thể vẫn còn giữ đoạn mạch gây dị ứng, và đây là một trong những mối nguy cần được xem xét khi ứng dụng peptide vào sản xuất thực phẩm Ví dụ Ara h1 là protein gây dị ứng có mặt trong đậu phộng, protein này dù bị thủy phân bằng enzyme tiêu hóa tạo thành peptide, và một trong số những peptide tạo thành vẫn còn giữ trình tự gây dị ứng [26]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Phụ phẩm cá hồi

Phụ phẩm cá hồi được cung cấp bởi Công ty TNHH Quốc Tế ANNA S.E.A, bao gồm các phần: xương, vây, đuôi và thịt bám trên xương được vận chuyển lạnh về phòng thí nghiệm Tại phòng thí nghiệm, phụ phẩm được xay nhuyễn và bảo quản ở -200C đến khi thí nghiệm

2.1.2 Chế phẩm enzyme và hóa chất

Chế phẩm enzyme gồm Flavourzyme® 500MG, Alcalase® 2.5L, Neutrase® 0.8L, Protamex® được mua từ Novozymes (Đan Mạch) Nhiệt độ và pH tối ưu của các loại enzyme được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Nhiệt độ và pH tối ưu của các loại enzyme

Flavourzyme® 500MG 7 50oC Các hóa chất sử dụng được mua từ Sigma-Aldrich và Merck Tất cả các chất trên đều đạt chuẩn phân tích Nước cất 2 lần được dùng trong nghiên cứu này

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát điều kiện

thủy phân

Loại enzyme Nhiệt độ pH

Tỷ lệ E:S Thời gian

Hàm mục tiêu

CaBC của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi

Tối ưu hóa điều

kiện thủy phân Hàm mục tiêu

Dịch thủy phân protein phụ phẩm

cá hồi có CaBC cao nhất

Khảo sát tính chất

chức năng

Độ tan

Độ bền nhiệt Khả năng tạo bọt Khả năng tạo nhũ OHC, WHC

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp xác định thành phần hóa học của phụ phẩm

2.2.1.1 Xác định protein tổng bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC, 2000)

Nguyên tắc: khi đốt nóng mẫu đem phân tích với dung dịch H2SO4 đậm đặc, carbon

và hydro tạo thành CO2 và H2O, nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 sẽ kết hợp với dung dịch H2SO4 tạo thành muối (NH4)2SO4 Bay hơi NH3 khỏi hỗn hợp bằng dung dịch NaOH Hóa lỏng NH3 bay ra và thu nhận bằng một lượng xác định dung dịch

H2SO4 0,1N Định lượng lượng H2SO4 còn lại bằng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn, qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu [55]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục

2.2.1.2 Xác định hàm lượng béo bằng phương pháp Folch (Folch và cộng sự, 1957)

Nguyên tắc: Dùng dung môi kị nước (chloroform:methanol = 2:1) trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ Loại bỏ phần chất rắn bằng cách lọc hoặc ly tâm Một số thành phần tạp chất sau khi trích ly được loại bỏ bằng cách cho tiếp xúc với nước, khuấy, ly tâm, tách tạp Lipid trong nguyên liệu được tách khỏi dung môi kỵ nước bằng thiết bị bốc hơi chân không [56]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục

2.2.1.3 Xác định hàm ẩm (AOAC, 2000)

Nguyên tắc: sấy mẫu nguyên liệu đã biết khối lượng đến khối lượng không đổi, từ

đó xác định được hàm lượng ẩm của mẫu [55]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục

2.2.1.4 Xác định hàm lượng tro (AOAC, 2000)

Nguyên tắc: Mẫu được nung ở nhiệt độ 500-5500C để đốt cháy hết các hợp chất hữu

cơ, phần còn lại thu được là tro [55]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục

2.2.1.5 Phương pháp xác định hàm lượng canxi (TCVN 1526-1:2007)

Nguyên tắc: Tro hóa phần mẫu thử, xử lý tro bằng acid clohydric và cho kết tủa canxi về dạng canxi oxalat Hòa tan kết tủa trong acid sulfuric và chuẩn độ acid oxalic tạo thành bằng dung dịch kali permanganat thể tích chuẩn [57]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục

2.2.2 Khảo sát điều kiện thủy phân

2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ chế phẩm enzyme (Anson, 1938)

Nguyên tắc: cho enzyme thủy phân cơ chất casein, acid amin Tyrosine được giải phóng cùng với các peptide và các acid amin khác Xác định Tyrosine tạo thành bằng phản

pH = 7,5, T = 37°C , thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong tricloro acetic acid (TCA), phản ứng với thuốc thử Folin, cho độ hấp thu ở bước sóng 660nm bằng với độ hấp thu của dung dịch L-Tyrosine 1M trên đường chuẩn [58]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục

2.2.2.2 Phương pháp thủy phân

Phụ phẩm cá hồi được thủy phân sử dụng phương pháp của Bhaskar và Mahendrakar (2008) [59] với một vài thay đổi Đầu tiên, phụ phẩm được trộn với nước theo tỷ lệ 1:10 (w/v) (giá trì này được chọn từ kết quả nghiên cứu trước, số liệu không trình bày trong nghiên cứu này) trước khi gia nhiệt lên 900C trong 15 phút để vô hoạt enzyme nội tại Tiếp theo, pH của hỗn hợp được chỉnh đến giá trị mong muốn bằng dung dịch NaOH 1M hoặc dung dịch HCl 1M Sau đó, chế phẩm enzyme được cho vào theo tỷ lệ E:S xác định và tiến hành thuỷ phân tại nhiệt độ và thời gian phù hợp Sau quá trình thuỷ phân, dịch thuỷ phân được gia nhiệt ở 900C trong 15 phút để vô hoạt chế phẩm enzyme Dịch thuỷ phân được ly tâm trước khi lọc qua giấy lọc Whatman paper no 3 để tách loại bỏ phần rắn, thu lấy dịch thủy phân Phần dịch được tiến hành sấy đông khô và bảo quản ở -40C

Quy trình thu nhận dịch thủy phân từ phụ phẩm cá hồi được thể hiện trong hình 2.2

CThời gian 15 phút

Nhiệt độ 900

CThời gian 15 phút

2.2.2.3 Phương pháp xác định mức độ thủy phân (Nielsen và cộng sự, 2001)

Nguyên tắc: phản ứng giữa nhóm amino và o-phthaldialdehyde (OPA) với sự có mặt của dithiothretiol (DTT) tạo thành hợp chất màu (xanh dương nhạt) có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 340nm [60]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục

2.2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến CaBC của dịch thủy phân

Ảnh hưởng của điều kiện thủy phân gồm loại enzyme, pH, nhiệt độ, tỷ lệ E:S và thời gian thủy phân đến CaBC của dịch thủy phân được khảo sát sử dụng phương pháp thử đơn yếu tố thực hiện bằng cách thay đổi một yếu tố với nhiều mức độ khác nhau trong khi

cố định các yếu tố khác

Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến

CaBC của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi

Tỷ lệ E:S (U/g protein)

Thời gian (giờ)

enzymes

Chọn giá trị tối ưu

2.2.2.5 Phương pháp lọc khử khoáng dịch thủy phân

Dịch thuỷ phân sau quá trình lọc thô được đưa qua cột nhựa trao đổi ion (macroporous resin, Amberlite IRC-748I, dạng muối natri, Acros) để tiến hành lọc khử khoáng Hạt nhựa Amberlite IRC-748I, dạng muối natri (hình 2.3) sẽ trao đổi ion Na+ với các ion kim loại khác trong dịch thủy phân dựa trên sự khác biệt về ái lực của hạt nhựa đối với các ion này

Hình 2.3 Công thức hóa học của hạt nhựa Amberlite IRC-748I, dạng muối natri

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục

2.2.2.6 Phương pháp xác định CaBC (Jung và cộng sự, 2006)

Nguyên tắc: ion canxi phản ứng với o-cresolphthalein complexone (o-CPC) trong môi trường kiềm để tạo thành một phức chất màu tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 570nm [40]

Quy trình thực hiện được trình bày ở phần phụ lục

2.2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan (Lowry và cộng sự, 1951)

Nguyên tắc: dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng ở bước sóng 660 nm, protein khử hỗn hợp phosphomolipdate – phosphovonphramate (thuốc thử Folin – Ciocalteau) Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein [61]

2.2.3 Phương pháp tối ưu hóa điều kiện thủy phân

2.2.3.1 Phương pháp sàng lọc yếu tố thủy phân

Sử dụng phương pháp Plackett-Burman để sàng lọc các yếu tố của quá trình thủy phân ảnh hưởng đến CaBC của dịch thủy phân protein phụ phẩm cá hồi Thiết kế thí nghiệm cho 4 yếu tố của quá trình thủy phân gồm: nhiệt độ, pH, tỷ lệ E:S, thời gian thủy phân với hàm mục tiêu là CaBC Thí nghiệm được thiết kế với 2 mức độ (mức trên +1 và mức dưới -1)

Bảng 2.3 Các mức yếu tố trong tâm ma trận thiết kế sàng lọc

Mức trên +1, mức cơ sở 0, mức dưới -1

Bảng 2.4 Ma trận thiết kế thí nghiệm sàng lọc

Tỷ lệ E:S (U/g protein)

Thời gian thủy phân (giờ)

2.2.3.2 Phương pháp tối ưu hóa điều kiện thủy phân

Các yếu tố được lựa chọn từ thí nghiệm sàng lọc sẽ được chọn làm yếu tố cho tối

ưu Tiến hành thí nghiệm tối ưu với các thông số tại tâm của từng yếu tố với điều kiện thủy