khảo sát đặc tính của thực khuẩn thể aeromonas hydrophila phân lập từ ao nuôi cá tra tại tỉnh đồng tháp và an giang

Lúc này, liệu pháp thực khuẩn thể xuất hiện như một liệu pháp đầy tiềm năng và an toàn trong việc thay thế kháng sinh được sử dụng để phòng và trị bệnh cho cá tra.. Trong luận văn này, c

Trang 1

[Date]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA THỰC KHUẨN THỂ

Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ AO NUÔI CÁ TRA

Trang 2

[Date]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập-Tự do-Hạnh Phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Dương Hồ Diễm Trâm MSHV: 1570774

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201

1 Tên đề tài

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA THỰC KHUẨN THỂ

Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ AO NUÔI CÁ TRA

TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ AN GIANG

2 Nhiệm vụ và nội dung

- Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm (chu kì xâm nhiễm và hệ số nhân) và xác định phổ xâm nhiễm của các thực khuẩn thể đã phân lập sẵn

- Khảo sát, đánh giá khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh sử dụng thực khuẩn thể đơn

lẻ

- Khảo sát, đánh giá việc phối trộn các thực khuẩn thể (phage cooktail) với nhau để

kiểm soát vi khuẩn

- Khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh sử dụng thực khuẩn thể trong môi trường nước ao tiệt trùng

Trang 3

[Date]

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, em

đã được học tập và nhận được sự chỉ dẫn tận tình của các thầy cô, điều đó đã giúp em trang bị được nhiều kiến thức để có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, các thầy cô khoa Kỹ thuật Hóa học và đặc biệt là các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học đã cung cấp cho em những kiến thức cần thiết, đã nhiệt tình chỉ dạy và tạo mọi điều kiện để em có thể tiến hành luận văn thuận lợi

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy hướng dẫn - TS Hoàng Anh Hoàng

đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn Xin cảm ơn đến chị Yến, chị Xuân, bạn Tâm , và các thành viên phòng 107B2 đã cùng đồng hành và chia sẻ khó khăn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (Nafosted) đã hỗ trợ kinh phí thực hiện thông qua đề tài mã số 10/2019/TN

Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn!

Trang 4

[Date]

TÓM TẮT

Trong những năm gần đây, ngành nuôi trồng thủy sản ở Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) đang là ngành rất phát triển và có đóng góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu Cá tra là một trong những đối tượng cá nuôi nước ngọt chủ lực của ĐBSCL nói chung và Đồng Tháp, An Giang-là 2 tỉnh có sản lượng nuôi cá tra lớn nhất ở ĐBSCL nói riêng

Theo thống kê của chi cục Thủy sản Đồng Tháp và An Giang, diện tích cá tra toàn tỉnh Đồng Tháp là khoảng 2.450 ha và diện tích thả nuôi cá tra toàn tỉnh An Giang hơn 1200 ha Bên cạnh đó, theo thống kê thì sản lượng cá tra tăng đều qua mỗi năm do nhu cầu sử dụng số lượng cá tra tăng mạnh dẫn đến tình hình dịch bệnh trên cá tra đang ngày càng gia tăng và gây ra nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho người dân Trong khi việc sử dụng kháng sinh không còn mang lại hiệu quả cao, bên cạnh đó còn mang lại nhiều tác hại nghiêm trọng Lúc này, liệu pháp thực khuẩn thể xuất hiện như một liệu pháp đầy tiềm năng và an toàn trong việc thay thế kháng sinh được sử dụng để phòng

và trị bệnh cho cá tra

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính các phage xâm nhiễm

đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra đã được phân

lập sẵn trong nghiên cứu trước Sau khi khảo sát, chúng tôi thấy chu kỳ xâm nhiễm nằm trong khoảng 40-65 phút Hệ số nhân thuộc khoảng 44-190 Tiếp theo, các phage được khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn đích trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn, khả năng ức chế được khảo sát riêng rẽ hoặc kết hợp các phage với nhau Bằng việc đo

OD600, khả năng ức chế được thể hiện trong khoảng 7-7,5 giờ Ngoài ra khả năng ức chế vi khuẩn của thực khuẩn thể cũng được thực nghiệm trong môi trường nước ao tiệt trùng Khả năng ức chế của thực khuẩn thể được thể hiện tốt trong 48 giờ khảo sát Đây được xem là những kết quả ban đầu quan trọng nhằm đưa liệu pháp thực khuần thể vào trong phòng và điều trị bệnh xuất huyết trên cá tra

Trang 5

[Date]

ABSTRACT

In recent years, the aquaculture industry in the Mekong Delta (Mekong DELTA)

is a very developed industry and has contributed significantly in export turnover Catfish

is one of the major freshwater fish objects of the Mekong DELTA in general and Dong Thap, An Giang-is the two provinces with the largest aquaculture production in the Mekong DELTA in particular

According to the statistics of Dong Thap and An Giang Fisheries Department, the area of fish of Dong Tower is about 2,450 hectares and fish breeding area of An Giang province more than 1200 ha.In addition, according to statistics, the production of fish is increased through each year due to the need to use a strong increase in the number

of individuals resulting in the disease situation on the catfish is increasing and causing serious damage to people While the use of antibiotics no longer delivers high efficiency, it also provides serious harm At this, bacteriological therapy may appear as

a potential and safe therapy in the replacement of antibiotics used for prevention and treatment of fish

In this study, we conduct an active survey of infectious phages for the bacteria Aeromonas Hydrophila-causing hemorrhagic disease on the already isolated catfish in the previous study Latent period of three phages were about 40 to 65 minutes Burst size of these phages were about 44-190 Secondly, inactivation of host bacteria by single phage or cocktail of phages were evaluated By measuring OD600, inactivation was shown for 7-7,5 hours In addition, the challenge was conduted in sterilize pond water and inactivation was well shown for 48 hours These are considered important advances

in prevention and treatment of hemorrhagic disease on fish

Trang 6

[Date]

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học, thực nghiệm của thầy hướng dẫn bộ môn và các số liệu, kết quả

mà tôi đưa ra trong luận văn này là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây

Tác giả

DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

Trang 7

[Date]

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 3

TÓM TẮT 4

ABSTRACT 5

LỜI CAM ĐOAN 6

MỤC LỤC 7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC HÌNH 3

DANH MỤC BẢNG 4

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam 6

1.2 Cá tra 7

1.3 Bệnh xuất huyết trên cá tra 9

1.4 Các phương pháp phòng và trị bệnh xuất huyết trên cá tra 10

1.4.1 Sử dụng thuốc kháng sinh 10

Cơ chế tác động của kháng sinh 11

Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn A.hydrophila 11

Thực khuẩn thể 13

1.4.2 Phân loại thực khuẩn thể 14

1.4.3 Cấu tạo của phage 15

1.4.4 Cơ chế xâm nhiễm của thực khuẩn thể lên vi khuẩn: 16

1.4.5 Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh trên thủy sản 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

Vật liệu 19

Trang 8

[Date]

Phương pháp nghiên cứu 20

Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn A.hydrophila trong môi trường nước ao 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 27

Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm vi khuẩn A hydrophila của các thực khuẩn thể đã phân lập 27

Khảo sát phổ xâm nhiễm của thực khuẩn thể đối với một số vi khuẩn khác 29

Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn sử dụng thực khuẩn thể riêng lẻ 31

Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn sử dụng hỗn hợp thực khuẩn thể 35

Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn sử dụng hỗn hợp thực khuẩn thể 37

Khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh sử dụng thực khuẩn thể trong môi trường nước ao tiệt trùng 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 43

Trang 9

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM 1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐBSCL : Đồng bằng Sông Cửu Long

LB : Môi trường Luria-Bertani TSB : Môi trường Tryptic Soy Broth MOI : Multiplicity of infection - Tỷ lệ giữa số

lượng thực khuẩn thể và số lượng vi khuẩn

CFU : Colony-Forming Unit PFU : Plaque-Forming Unit VTS : Viện thủy sản

Trang 10

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Diện tích – sản lượng cá tra qua các năm

Hình 1.2 Hình thái cá tra

Hình 1.3 Vi khuẩn A hydrophila

Hình 1.4 Dấu hiệu cá bị xuất huyết

Hình 1.5 Thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn

Hình 1.6 Ảnh hiển vi điện tử các phage bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn (trái); hình

mặt cắt (giữa) và hình dạng ngoài phage T2

Hình 1.7 Sự nhân lên của phage T4

Hình 2.1 Tỉ lệ thực khuẩn thể tương đối theo thời gian

Hình 3.1 Sơ đồ biều thị hệ số nhân của các phage được khảo sát

Hình 3.2 Phổ xâm nhiễm trên Aeromonas hydrophila A1

Hình 3.3 Phổ xâm nhiễm trên Aeromonas hydrophila VTS, Edwardsiella ictaluri E1,

Edwardsiella ictaluri E2, Edwardsiella ictaluri E3, Edwardsiella ictaluri E4, Edwardsiella ictaluri VTS, Aeromonas sorbia VTS, Aeromonas veronii VTS

Hình 3.4 Phổ xâm nhiễm trên Aeromonas dhakensis

Hình 3.5 Biến thiên giá trị OD600 của pĐT 1.4

Hình 3.8 Biến thiên giá trị OD600 của pAG 10.1

Hình 3.9 Hình điện di chạy chủng kháng thực khuẩn thể của 4 phage được khảo sát

Hình 3.10 Kết quả “Spot test” của mẫu đối chứng A hydrophila

Hình 3.11 Kết quả “Spot test” của mẫu chủng kháng pĐT 1.4 (pĐT 1.4R)

Hình 3.14 Kết quả “Spot test” của mẫu chủng kháng pAG 10.1 (pAG 10.1R)

Hình 3.15 Biến thiên giá trị OD600 của pĐT 1.4 và pĐT 2.3

Hình 3.16 Biến thiên giá trị OD600 của pĐT 1.4 và pĐT 4.6

Hình 3.17 Biến thiên OD600 của các nghiệm thức theo thời gian khảo sát

Trang 11

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của cá tra

Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng một số loài cá

Bảng 1.3 Một số bệnh thường gặp ở cá tra (Từ Thanh Dung, 2008)

Bảng 1.4 Tỷ lệ phần trăm (%) kháng, nhạy của dòng A hydrophila trên 15 loại kháng

sinh

Bảng 1.5 Bảng phân loại thực khuẩn thể

Bảng 1.6 Các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trên bệnh thủy sản

(Richards GP, 2014)

Bảng 2.1 Các phage đã được phân lập sẵn của 2 tỉnh Đồng Tháp và An Giang

Bảng 2.2 Ví dụ bảng tính số lượng thực khuẩn sinh ra theo thời gian

Bảng 2.3 Danh sách các chủng vi khuẩn dùng để khảo sát

Bảng 3.1 Chu kỳ xâmnhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size) các phage

Bảng 3.2 Khảo sát chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size) các

phage

Trang 12

MỞ ĐẦU

Cá tra là một trong những đối tượng cá nuôi nước ngọt chủ lực của ĐBSCL nói chung và Đồng Tháp, An Giang là 2 tỉnh có sản lượng nuôi cá tra lớn nhất ở ĐBSCL nói riêng

Theo thống kê của hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sàn Việt Nam (Vasep), tổng diện tích canh tác 5.400 ha (năm 2018) tăng 3,3% so với năm 2017, sản lượng đạt 1,42 triệu tấn, tăng 8,4% so với năm 2017

Chính vì thế, do nhu cầu sử dụng số lượng cá tra tăng mạnh qua mỗi năm dẫn đến tình hình dịch bệnh trên cá tra đang ngày càng gia tăng và gây ra nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho người dân Trong quá trình nuôi, người dân đã sử dụng kháng sinh để điều trị các hầu hết các bệnh nhiễm khuẩn trên thủy sản.Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh lâu dài với liều lượng cao không những gây tồn dư lượng kháng sinh trong thủy sản và môi trường mà còn tạo điều kiện cho các vi khuẩn gây bệnh kháng kháng sinh phát triển

Vào thập niên đầu thế kỉ XIX, thực khuẩn thể (phage) trong điều trị bệnh nhiễm trùng đã được quan tâm đến nhưng thời điểm kháng sinh đầu tiên được tìm thấy vào

1940, nghiên cứu về phage chậm lại, nhường chỗ cho nghiên cứu kháng sinh Nhưng đến thời điểm con người nhận ra rằng kháng sinh không phải là phương pháp tốt nhất

để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh thì khuynh hướng sử dụng phage trong phòng trị bệnh lại được nghiên cứu trở lại với tên gọi là liệu pháp phage Điểm đặc biệt của liệu pháp

này là phage có tính đặc hiệu kí chủ, tác động chọn lọc vào vi khuẩn đích Aeromonas

hydrophila là tác nhân gây bệnh xuất huyết chính trên cá tra, do đó việc phân lập và xác

định được một số đặc tính liên quan đến thực khuẩn thể xâm nhiễm đối với vi khuẩn

Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra chính là bước đầu tiên trong việc ứng dụng

liệu pháp thực khuẩn thể trong thực tế

Bệnh xuất huyết hay còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu do

vi khuẩn Aeromonas hydrophila ở cá Tại Việt Nam, bệnh được ghi nhận trước năm

1993 Hiện nay, bệnh xuất hiện ở khắp các vùng nuôi cá nước ngọt và gây thiệt hại lớn

về kinh tế cho người nuôi ở các tỉnh ĐBSCL Hiện nay việc điều trị bệnh xuất huyết trên cá tra ở Đồng bằng Sông Cửu Long vẫn chủ yếu dựa vào kháng sinh Tuy nhiên,

Trang 13

việc sử dụng kháng sinh vẫn còn thiếu những quy định chặt chẽ dẫn đến xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn kháng một hoặc thậm chí nhiều loại kháng sinh, gây nhiều khó khăn trong quá trình điều trị Vì vậy việc tìm một liệu pháp điều trị an toàn và hiệu quả lâu dài thay thế kháng sinh đang ngày càng trở nên cấp bách hiện nay

Với nhiều ưu điểm và an toàn cho đối tượng sử dụng cũng như là đối tượng được

sử dụng, liệu pháp thực khuẩn thể đã và đang được nghiên cứu ứng dụng trong phòng

và điều trị bệnh trên thủy sản do nhiều loại vi khuẩn gây ra (Richards GP, 2014) Thực khuẩn thể là những virus chỉ xâm nhiễm đặc hiệu vi khuẩn Tuy nhiên, liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và điều trị bệnh xuất huyết trên cá tra còn chưa được nghiên cứu

nhiều Do đó, đây chính là động lực cho tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát đặc tính của

thực khuẩn thể Aeromonas hydrophila phân lập từ ao nuôi cá tra tại tỉnh Đồng

Tháp và An Giang.”

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

Khảo sát đặc tính thực khuẩn thể và một số yếu tố liên quan nhằm hướng tới phát triển liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh xuất huyết trên cá tra do vi khuẩn

Aeromonas hydrophila gây ra tại An Giang và Đồng Tháp

Nội dung nghiên cứu:

- Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm (chu kì xâm nhiễm và hệ số nhân) và xác định phổ xâm nhiễm của các thực khuẩn thể đã phân lập sẵn

-Khảo sát, đánh giá khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh sử dụng thực khuẩn thể đơn lẻ

- Khảo sát, đánh giá việc phối trộn các thực khuẩn thể (phage cooktail) với nhau

để kiểm soát vi khuẩn

- Khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh sử dụng thực khuẩn thể trong môi trường nước ao tiệt trùng

Trang 14

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam

Nghề nuôi cá tra thương phẩm ở ĐBSCL bắt đầu xuất hiện từ những năm của thập niên 1950 với quy mô nhỏ và cá nuôi chủ yếu là dựa vào nguồn cá giống sẵn có trong tự nhiên Tuy nhiên, từ cuối thập niên 1990 nghề nuôi cá tra đã phát triển vượt bậc do sự thành công trong việc sản xuất giống nhân tạo loài cá này cùng với các hệ thống và phương pháp nuôi đa dạng như từ nuôi bè cho đến nuôi trong ao đất

Theo ước tính của Tổng cục Thủy sản, năm 2018, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đạt 5.400 ha (tăng 3,3% so với năm 2017), sản lượng đạt 1,42 triệu tấn, tăng 8,4% so với 2017 An Giang và Đồng Tháp là những vùng nuôi lớn nhất cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long, chiếm hơn 75% tổng sản lượng cá tra cả nước

Trang 15

Hình 1.1 Tình hình xuất khẩu cá tra qua các năm

Đáng chú ý , hai tỉnh Đồng Tháp và An Giang được xem là nơi nuôi và xuất khẩu

cá tra lớn của ĐBSCL Mặt khác, Đồng Tháp còn là tỉnh có diện tích nuôi cá tra lớn nhất cả nước (chiếm trên 40% tổng diện tích cả nước) Sản lượng cá tra quý I/2019 tại Đồng Tháp ước đạt 80.298 tấn, tăng 2,4%, diện tích sử dụng 1,377 ha và An Giang ước đạt 81.583 tấn, tăng 11,3%, diện tích sử dụng 284 ha

1.2 Cá tra

Cá tra là loài cá kinh tế phổ biến nhất khu vực châu Á, là một trong 30 loài cá

thuộc họ Pangasiidae Tên loài Pangasianodon hypopthalmus được Rainboth W.J sử

dụng lần đầu tiên vào năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được nhiều tác giả sử dụng phổ biến đến nay (Nguyễn Văn Thường, 2008)

Đặc điểm hình thái:

- Cơ thể dẹp theo chiều hông

- Vi lưng ngắn với 1-2 gai cứng

- Vi mỡ khá phát triển

- Vi hậu môn dài

- Có hai đôi râu hàm Hình 1.2 Hình thái cá tra

Trang 16

- Lược mang phát triển

- Có cấu tạo miệng trước

Bảng 1.1 Một số bệnh thường gặp ở cá tra (Từ Thanh Dung, 2008)

Xuất huyết VK Aeromonas

hydrophila

Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, chung quanh miệng và nắp mang, phía mặt

bụng

Gan thận mủ VK Edw ictaluri

Da bị mất màu, bụng căn to và mắt hơi lồi, khi mổ ra thì gan, thận, tỳ tạng có

Phù đầu Môi trường Phần đầu bị phù, mắt thường lồi ra, da

nhợt nhạt

Trắng mang,

trắng gan Môi trường

Cá thường nổi đầu bơi lờ đờ trên mặt nước, bỏ ăn, xuất huyết nhẹ ngoài da,

mang nhợt nhạt

Vàng da Môi trường Cá bỏ ăn, bơi lảo đảo, da cá có màu vàng

tái nhạt hoặc vàng nghệ

Trang 17

1.3 Bệnh xuất huyết trên cá tra

Tại Việt Nam bệnh xuất huyết hay còn được gọi là bệnh đốm đỏ (Huizinga và

cs., 1979), bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ hoặc bệnh nhiễm trùng máu được ghi nhận trước năm

1993, là một trong những bệnh có tần số xuất hiện cao nhất trên cá tra nuôi Bệnh lây

lan nhanh, tỷ lệ chết có thể lên đến 90% trong trường hợp bệnh nặng Ở ĐBSCL, bệnh

xuất hiện hầu như quanh năm, phổ biến nhất là mùa khô, lúc bị sốc do vận chuyển, ao

nuôi có hàm lượng nitrite và ammonia cao, oxy hoà tan thấp Bệnh có thể xuất hiện ở

tất cả giai đoạn phát triển của cá tra nuôi

Tác nhân gây bệnh: là do vi khuẩn Aeromonas hydrophila, loài vi khuẩn đặc

thù vùng nước ngọt Vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn đầu tròn, khuẩn lạc hình tròn

lồi, màu kem, đường kính 2-3 mm A hyrophila thuộc nhóm Aeromonas và là tác nhân

chủ yếu gây bệnh nhiễm trùng huyết (MAS) Trong điều kiện bình thường,

A hydrophila không gây bệnh đối với các sinh vật sống, nhưng khi môi trường ô nhiễm,

cá bị stress, thay đổi sinh lý đột ngột hay bị nhiễm những mầm bệnh khác thì

A hydrophila là tác nhân gây bệnh tiềm tàng (Plumb và cs., 1976; Fang và cs., 2000)

Phân loại vi khuẩn A hydrophila:

- Giới (regnum): Bacteria

- Ngành (phylum): Proteobacteria

- Lớp (class): Gamma Proteobacteria

- Bộ (ordo): Aeromonadales

- Họ (familia): Aeromonadaceae

- Chi (genus): Aeromonas

- Loài (species): A hydrophila

Vi khuẩn A hydrophila không sinh bào tử, thuộc nhóm vi khuẩn Gram (-), thân

trắng, dạng hình que ngắn, di động nhờ một tiên mao Vi khuẩn có kích thước

0,5x1-1,5 um Trên mỗi môi trường nuôi cấy khác nhau, thể hiện đặc tính khác nhau ( Boulanger và cs., 1977) Trên môi trường đặc hiệu, môi trường thạch máu có bổ sung

Hình 1.3 Vi khuẩn A hydrophila

Trang 18

kháng sinh ampicillin và máu cừu, khuẩn lạc mọc trên môi trường này có màu trắng

đục, có khả năng gây dung huyết trên thạch máu do cơ chế độc lực của nó Còn trên

môi trường LB, khuẩn lạc bóng, trong, có màu nâu nhạt (Baba và cs., 1988)

A hydrophila có thể tồn tại và tồn tại trong bất kì môi trường nào, điều kiện chịu nhiệt

rất cao, lên tới 42oC

Dấu hiệu bệnh lý bệnh xuất huyết và các biến đổi mô học:

Hình 1.4 Dấu hiệu cá bị xuất huyết

Bệnh xuất huyết là một trong những bệnh có tần số xuất hiện cao nhất trên cá tra

nuôi Cá bị nhiễm bệnh xuất huyết thường ăn kém hoặc bỏ ăn tùy theo bệnh nhẹ hay

nặng Bệnh xuất huyết trên cá tra thường có các biểu 4 hiện đặc trưng như xuất hiện các

đốm xuất huyết (petechial haemorrhage) ở da, tập trung nhiều ở gốc vây, xung quanh

miệng, hầu, hậu môn Bên cạnh đó, bụng cá phình to, bên trong chứa dịch màu vàng

hoặc màu hồng Các nội tạng như bóng hơi, ruột, tuyến sinh dục cũng xuất huyết Ngoài

ra, gan tái nhạt, thận và tỳ tạng xưng to, mềm nhũn, màu đỏ sậm (Ly và cs., 2009;

Crumlish và cs., 2010; Từ Thanh Dung và cs., 2015)

1.4 Các phương pháp phòng và trị bệnh xuất huyết trên cá tra

1.4.1 Sử dụng thuốc kháng sinh

Kháng sinh là 1 hợp chất được sản xuất bởi sinh vật mà ở nồng độ thấp có thể

ức chế hoặc giết chết sinh vật khác Thuật ngữ kháng sinh đôi khi được sử dụng với tên

gọi khác là chất kháng khuẩn (antimicrobial agents) Kháng sinh có thể là các chất tự

nhiên, bán tổng hợp hoặc là các chất hoàn toàn tổng hợp nhưng chúng gây ít hoặc không

làm tổn thương tế bào chủ Các kháng sinh có tác dụng làm ngừng sự sinh trưởng của

vi khuẩn hoặc nấm được gọi là chất kiềm khuẩn (bacteriostatic agents) hoặc giết chết

chúng, gọi là chất diệt khuẩn (bactericidal agents) (Prescott và cs, 2000; Walsh, 2003)

Trang 19

Cơ chế tác động của kháng sinh

Theo Tenover (2006) và Levy, Marshall (2004) kháng sinh tác động lên tế bào

vi khuẩn theo 1 số cơ chế chủ yếu sau:

- Can thiệp vào quá trình tổng hợp vách tế bào (nhóm β-lactam: penicillin, ampicillin,amoxicillin, cephalosporin, monobactams; nhóm glycopeptide: vancomycin, teicoplanin)

- Ức chế sinh tổng hợp protein (nhóm macrolide, chloramphenicol, clindamycin, quinupristin-dalfoppristin, linezolid)

- Can thiệp vào quá trình tổng hợp acid nucleic (nhóm flouroquinolone và rifampin)

- Ức chế quá trình biến dưỡng acid folic (nhóm sulfonamide, trimethoprim và nhóm đồng phân của acid folic)

- Kháng sinh có thể phá hủy cấu trúc màng tế bào vi khuẩn Gram âm (các kháng sinh polymyxin và daptomycin)

Một số nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến hiện nay: Amoxicillin, Ampicillin, Cephalosporin, Tetracylin, Quinolon…(Vũ Tiến Dũng, 2013)

Cho đến nay, thuốc kháng sinh vẫn còn sử dụng một các phổ biến để phòng trị bệnh vi khuẩn trong nuôi thủy sản ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới

Trường hợp cá giống bị bệnh xuất huyết, trị bằng thuốc kháng sinh và đưa thuốc vào cơ thể cá bằng đường miệng (trôṇ thuốc vào thức ăn) chỉ có kết quả khi cá mới chớm bệnh Phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm là rất quan trọng trong điều trị; khi cá bệnh nặng, cá sẽ ăn ít hoăc̣ bỏ ăn nên việc điều trị thường sẽ không mang lại kết quả Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc kháng sinh còn thiếu những quy định chặt chẽ trong giấy phép sử dụng và cần có sự thống nhất về những quy định quốc tế trong nuôi trồng thủy sản Do đó việc điều trị bằng thuốc kháng sinh chưa mang lại hiệu quả tối ưu và tiết kiệm về mặt thời gian

Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn A hydrophila

Nghiên cứu gần đây của Quách Văn Cao Thi và cs (2014) về khả năng kháng thuốc của

30 chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập từ các ao nuôi ở ĐBSCL được thể hiện trong

bảng 1.2 dưới đây:

Trang 20

Bảng 1.2 Tỷ lệ phần trăm (%) kháng, nhạy của dòng A hydrophila trên 15 loại kháng

Vi khuẩn A hydrophila nhạy cao với kháng sinh doxycyclin, cefotaxim và

ciprofloxacin (>80%) và norfloxacin (66,7%) Tuy nhiên, vi khuẩn này kháng cao với các kháng sinh tetracyclin (93,3%), florfenicol (63,3%) và kháng hoàn toàn với kháng sinh trimethoprim/sunfamethoxazol, cefalexin và các kháng sinh thuộc nhóm penicillin

Đặc biệt hầu hết tất cả 15 loại thuốc kháng sinh, vi khuẩn A hydrophila đều thể hiện

sự đa kháng thuốc

Ngoài ra, sự kháng thuốc của vi khuẩn A hydrophila trên cá tra ở khu vực

ĐBSCL cũng được nhiều tác giả nghiên cứu Nghiên cứu của Từ Thanh Dung và cs,

(2004) cho thấy vi khuẩn A hydrophila phân lập từ cá tra bệnh tại An Giang, Cần Thơ,

Trang 21

Đồng Tháp và Vĩnh Long cũng kháng với oxytetracyline, oxolinic acid và sulfonamide Kết quả nghiên cứu của Phạm Thanh Hương (Phạm Thanh Hương và cs., 2010) cũng

cho thấy tỷ lệ kháng streptomycin cao của vi khuẩn A hydrophila là 55,7% Điểm đặc

biệt, nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Nam Kha (2012) cũng ghi nhận 92,4% vi khuẩn

Aeromonas phân lập từ cá tra ở ĐBSCL đa kháng thuốc Sự kháng thuốc và khả năng

kháng thuốc của vi khuẩn A hydrophila đang diễn biến rất phức tạp và ảnh hưởng đến

hiệu quả việc điều trị bệnh vi khuẩn trên cá tra nói riêng và trong nuôi trồng thủy sản nói chung Vì vậy việc tìm một liệu pháp điều trị thay thế kháng sinh đang ngày càng trở nên cấp bách hiện nay

1.4.2 Thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể (phage) là những thể phong phú nhất trên trái đất, thực khuẩn thể là một phần quan trọng góp phần ổn định quần thể vi sinh vật, chúng cũng rất linh hoạt và có khả năng thích nghi với rất nhiều ứng dụng Thực khuẩn thể là loại virus xâm nhiễm vi khuẩn, sự sao chép của chúng phụ thuộc vào việc sử dụng các vật liệu di truyền

từ tế bào vi khuẩn bị xâm nhiễm

Twort (1877-1950) đã quan sát thấy xuất hiện các khuẩn lạc trong suốt phát triển trên bề mặt nuôi cấy vi khuẩn Khi chuyển các khuẩn lạc trong suốt sang bề mặt vi khuẩn mới cũng tạo ra các khuẩn lạc trong suốt tương tự Sau khi kiểm tra vi khuẩn từ các khuẩn lạc trong suốt, Twort nhận thấy rằng vi khuẩn đã phân hủy thành những mảnh nhỏ và ông đã đưa ra giả thuyết rằng các virus truyền nhiễm nhỏ hơn vi khuẩn đã gây

ra sự phân hủy vi khuẩn (Summers, 2005) D'Herelle quan sát thấy những gì mà ông gọi là "bacteriophage" đã gây ra sự ly giải, hoặc vỡ vi khuẩn trong chất lỏng cũng như trong các đốm rõ ràng trên thạch, ông cho rằng bacteriophage là ký sinh trùng của vi khuẩn Các nghiên cứu của ông cũng cho thấy rằng các tế bào bacteriophage cần các tế bào chủ (vi khuẩn) để tăng sinh Sáng chế của kính hiển vi điện tử trong những năm

1940 cho phép các nhà khoa học quan sát các vi khuẩn và quan hệ giữa các thực khuẩn thể và vi khuẩn, chứng minh rằng các loài thực khuẩn thể có các hình thái khác nhau và các tế bào thực khuẩn thể chứa DNA Năm 1952, Hershey và Chase cho thấy rằng khi một tế bào chủ gắn vào một tế bào chủ, DNA của nó sẽ được tiêm vào tế bào và lớp protein của chúng không vào tế bào chủ (Summers, 2005)

Trang 22

Hình 1.5 Thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn

1.4.3 Phân loại thực khuẩn thể

Dựa vào kiểu gen và hình thái, Ủy ban quốc tế về phân loại virus (International Committee on Taxonomy of Viruses hay ICTV) đã xếp thực khuẩn thể vào 10 họ

Bảng 1.3 Bảng phân loại thực khuẩn thể

Họ Hình thái vỏ

Myoviridae Khối 20 mặt Có đuôi ( có thể co rút) dsDNA, thẳng T4 Siphoviridae Khối 20 mặt Có đuôi (dài không co

Trang 23

1.4.4 Cấu tạo của phage

 Cấu trúc: phage có 3 dạng cơ bản :

- Cấu trúc hình khối không đuôi

- Cấu trúc hình khối có đuôi

- Cấu trúc dạng sợi hay dạng que

Đối với dạng có đuôi (chẳng hạn phage T4) gồm đầu hình lục giác, cổ, đuôi có dạng hình trụ, cuối đuôi có các sợi lông như chân để bám vào vi khuẩn và đĩa gốc với

6 sợi lông đuôi

 Thành phần hóa học gồm:

- ADN: có hầu hết ở các phage, thường có 2 chuỗi xoắn vào nhau, một số có ADN một chuỗi, những phage không chứa ADN thì chứa ARN và thường ARN một chuỗi

- Protein: vỏ capsid được cấu tạo bằng những đơn phân gọi là capsome, chính là những hạt protein

- Enzyme: ở đuôi của phage có chứa một số loại enzyme

Hình 1.6 Ảnh hiển vi điện tử các phage bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn

(trái); hình mặt cắt (giữa) và hình dạng ngoài phage T4

Trang 24

1.4.5 Cơ chế xâm nhiễm của thực khuẩn thể lên vi khuẩn:

Hình 1.7 Sự nhân lên của phage T 4

Sự nhân lên của phage trong vi khuẩn thường diễn ra theo các giai đoạn sau:

Giai đoạn hấp phụ và xâm nhập: Muốn xâm nhập và nhân lên trong vi khuẩn,

trước hết phage phải tìm thấy chỗ tiếp nhận đặc hiệu trên bề mặt tế bào vi khuẩn Nhiều nghiên cứu cho thấy khi vi khuẩn biến dị, thay đổi tính chất bề mặt thì phage không có khả năng xâm nhập vào vi khuẩn Khi đã bám vào bề mặt tế bào vi khuẩn, enzyme ở đuôi của phage sẽ làm tan vách (thành) tế bào vi khuẩn, sau đó đuôi co bóp đẩy lõi của đuôi vào vi khuẩn, tiếp theo DNA của phage sẽ được bơm vào tế bào vi khuẩn Vỏ capsid sẽ ở lại ngoài vi khuẩn

Giai đoạn sinh tổng hợp các thành phần : Sau 2-3 phút, enzyme

deoxyribonuclease của phage xuất hiện phá hủy DNA của tế bào vi khuẩn, mRNA và kèm theo hàng loạt enzym cần thiết cho phage được tổng hợp DNA của phage được hình thành cùng với protein (tạo vỏ capsid) của phage được tổng hợp ở ribosome của tế bào chủ

Giai đoạn lắp ghép và giải phóng: Các thành phần DNA lắp ghép với protein

tạo thành phage Các phage mới được hình thành sau thời gian khoảng 12 phút và sự giải phóng phage mới thường xảy ra ở phút thứ 25 Trung bình mỗi vi khuẩn có thể giải phóng từ 100 đến vài trăm phage

1.4.6 Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh trên thủy sản

Liệu pháp thực khuẩn thể (liệu pháp phage) là việc sử phage để điều trị bệnh do

vi khuẩn Liệu pháp phage có nhiều ứng dụng tiềm năng trong y học con người cũng như trong thú y và nông nghiệp Chỉ số điều trị của phương pháp phage rất cao vì ít có

Trang 25

tác dụng phụ So với việc sử dụng liệu pháp kháng sinh, liệu pháp phage có nhiều ưu điểm (Richards GP, 2014):

(1) Tính đặc hiệu, phage tấn công một cách đặc hiệu cao với từng loài, thậm chí từng chủng vi khuẩn riêng biệt, giúp giảm ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong ruột cá cũng như các vi khuẩn tự nhiên không phải chủng đích

(2) Hạn chế sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

(3) Một ưu điểm khác của phage so với kháng sinh là chúng có thể tự nhân lên, cũng như tự hạn chế số lượng Chúng nhân lên nhanh chóng theo cấp số mũ như vi khuẩn và giảm dần khi lượng vi khuẩn giảm Tùy trường hợp điều trị đôi khi chỉ cần dùng 1 liều nhỏ ban đầu, chúng sẽ nhân lên thông qua các tế bào vi khuẩn mà không cần tiêm nhắc lại

(4) Bởi phage có nguồn gốc tự nhiên, rất đa dạng và phong phú nên hạn chế đáng

kể khó khăn trong việc phê chuẩn và cấp giấy phép sử dụng so với kháng sinh

(5) Khả năng chống chịu cao của phage với điều kiện môi trường khác nhau Phage được tìm thấy trong môi trường có sự hiện diện của vi khuẩn đích, kể cả những nơi có điều kiện khắc nhiệt như nhiệt độ cao, hay môi trường có tính acid cao Ngoài

ra, khả năng thích nghi của chúng còn cao hơn vi khuẩn

(6) Phage giảm dần sau khi tiêu diệt chủng vi khuẩn đích, và được thải ra ngoài môi trường mà không gây bất kì rủi ro nào

(7) Sản xuất nhanh, linh động và rẻ tiền Phage được sản xuất thông qua quá trình lây nhiễm vào các tế bào vi khuẩn đặc hiệu chỉ trong vài giờ, và không cần sử dụng hóa chất đắt tiền

Liệu pháp phage đã và đang được nghiên cứu ứng dụng trong phòng và điều trị bệnh trên thủy sản do nhiều loại vi khuẩn gây ra Bảng dưới đây là một số các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp phage:

Trang 26

Bảng 1.4 Các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp phage trên bệnh thủy sản (Richards

fin rot) Bệnh đỏ vảy (red-fin disease)

Cá chạch

(Misgurnus

anguillicaudatus)

Wu và cs (1981) Jun và cs (2013)

Edwardsiella

tarda

Bệnh đốm trắng (Edwardsiellosis)

Cá chạch

(Misgurnus

anguillicaudatus)

Wu và cs (1981)

Pseudomonas

aeruginosa

Bệnh tổn thương-loét da (Ulcerative lesions on skin)

Định dạng
Số trang	52
Dung lượng	2,2 MB