Luận án tiến sĩ phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi sinh vật gây bội nhiễm mụn trứng cá

Đề tài thực hiện với mục tiêu tìm kiếm những dòng vi khuẩn lactic LAB có khả ức chế vi khuẩn tham gia sinh mụn và vi sinh vật bội nhiễm ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid

TÓM LƯỢC

Việc sử dụng sản phẩm bôi da có chứa corticoid đã mang lại nhiều tác dụng phụ như: teo da, mụn trứng cá tái diễn nhiều lần, gia tăng bội nhiễm bởi nhiều vi sinh vật Đề tài thực hiện với mục tiêu tìm kiếm những dòng vi khuẩn lactic (LAB) có khả ức chế vi khuẩn tham gia sinh mụn và vi sinh vật bội nhiễm ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid, định hướng đưa

ra phương pháp chăm sóc da mụn trứng cá theo hướng cạnh tranh sinh học Qua khảo sát trên 148 bệnh nhân mụn trứng cá tình nguyện cho thấy tỷ lệ mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid chiếm 53,4% Trong đó, nữ chiếm tỷ lệ cao hơn nam (nữ: 58,8%; nam: 43,1%) Dạng lâm sàng phổ biến ở nhóm sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid là mụn trứng cá đỏ chiếm 44,3%

Tỷ lệ nhiễm P acnes trên mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid

là 56,8%, S epidermidis là 89,9%, S aureus là 60,8%, nhiễm ký sinh trùng Demodex là 8,9% và tỷ lệ nhóm vi khuẩn đồng nhiễm gồm P acnes, S epidermidis, S aureus là 45,6% Các dòng vi khuẩn phân lập từ mụn trứng cá

sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid đều kháng với các kháng sinh dùng trong điều trị mụn gồm: erythromycin, clindamycin, doxycyclin, tetracyclin, oxacillin và Trimethoprim/sulfamethoxazol với mức kháng từ 55,6% đến 95,4%

Bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch có cải tiến và chủng vào dịch nuôi vi khuẩn sinh mụn và vi khuẩn bội nhiễm ở mụn trứng cá sử dụng

sản phẩm bôi chứa corticoid gồm P acnes, S epidermidis, S aureus để đánh giá khả năng kháng khuẩn của LAB Kết quả đã chọn được dòng L plantarum

05SL3 có nguồn gốc từ da người không bị mụn trứng cá, có khả năng ức chế

vi khuẩn chỉ thị với khoảng vô khuẩn đối với P acnes là 18 mm, S epidermidis và S aureus là 8 mm Khả năng làm giảm mật số P acnes 46Pa sau 30 giờ là 60,2%, S epidermidis 09Se là 47,3% và S aureus 10Sa là 48,6%

so với đối chứng Qua kiểm tra đặc tính sinh học, vi khuẩn L plantarum

05SL3 thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que có kích thước 2,26x0,61 µm, sắp xếp đơn hoặc chuỗi ngắn, oxidase và catalase âm tính, có khả năng phát triển ở nhiệt độ 50 oC, sản xuất acid lactic đạt 14,23 g/L với hiệu suất sử dụng glucose là 84% ở nhiệt độ 37 oC, không sinh bacteriocin, khả năng chống oxy hóa với IC50 là 31,18% thấp hơn vitamin C 1,75 lần, khả năng giữ ẩm tương đương với glycerin 5% và kháng với các kháng sinh như: tetracyclin, oxacillin, erythromycin, climdamycin, doxycyclin, trimethoprim/ sulfamethoxazol

Lactobacillus plantarum 05SL3 có thể nuôi sinh khối trong môi trường

nước tàu hũ và đường saccarose với hiệu suất đạt 69,23% (2,7 g/L) so với môi trường MRS (3,9 g/L) (p<0,001) và lên men gel Nha đam với tỷ lệ thành phần:

gel Nha đam 30%; sữa đặc có đường 2% và 1% Lactobacillus plantarum

05SL3 tạo chế phẩm Lp Gel chăm sóc da có chứa mật số vi khuẩn 4,7x108CFU/mL sau 40 ngày trữ ở nhiệt độ 25 oC (p<0,001)

Từ khóa: chế phẩm Lp Gel, Lactobacillus plantarum 05SL3, mụn trứng

cá Propionibacterium acnes; Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,

ABSTRACT

The using topical corticosteroid on the skin has shown many side effects such as atrophy, recurring acne, infecting of many microorganisms The objectives of this research were to isolate and select lactic acid bacteria (LAB) with the capacity of inhibiting the growth of infectting acne microorganisms,

as well as to develop skin-care method by bio-competitive

The survey of 148 voluntary acne patients showed 53.4% of using topical corticosteroid Of which, the females ratio were 58.8% and males ratio were 43.1% The regular clinical of using topical corticosteroid was acne vulgaris

(44.3%) The infection ratio of P acnes was 56.8%, S epidermidis was 89.9%, S aureus was 60.8% and Demodex was 8.9% The regular of bacterial infections are P acnes, S epidermidis, S aureus with ratio was 45.6% The three kinds of acne-causing bacteria including P acnes, S epidermis, S aureus were highly resistant to erythromycin (Er), doxycycline (Dx)

andtrimethoprim / sulfamethoxazole (Bt) with resistance rate to73% from 95.4%

By using the diffusion method testing on agar plates and the inoculation

of LAB strain was tested on acne-causing bacteria grown in trypticase and

heart extract broth medium at 30h incubation time The results selected L plantarum 05SL3 from human skin without acne The L plantarum 05SL3

was capable of inhibiting with clear-area distances from 18mm, 8mm, 8mm depending on kind of acne-causing bacteria tested After 30h of incubation,

the population of S aureus was reduced to 48.6%, S epidermidis was reduced 47.3% , and P acens was reduced 60.2% in comparison to the control The L plantarum 05SL3 had rod-shaped, 2.26mx0.61m, single or short chain,

Gram-positive; oxidase and catalase negative, growing at 50 oC, using glucose, lactose, or saccharose for growth, producing lactic acid of 14.23 g / L with yield was 84% at 37 oC, not bacteriocin, antioxidant with an IC50 of 31

18% was lower than vitamin C 1.75 times The ability to moisten of L plantarum 05SL3 was the same to glycerin at 5% L plantarum 05SL3 was

antibiotic resistance such as: tetracycline, oxacillin, erythromycin, climdamycin, doxycyclin, trimethoprim / sulfamethoxazole

The Lactobacillus plantarum 05SL3 able to grow in the culture including

whey soybean and saccarose with biomass production was 2.7g/L, the yield

was 69.23% in comparison to yield in MRS broth The 05SL3 L plantarum was able to fermented in Aloe vera gel 30%, plus 2% of sweetened

condensed milk and 1% Lactobacillus plantarum 05SL3 The Lp aloe vera gel contains the Lp density of 4.7 x 108 CFU/mL after 40 days store at 25 oC

Keywords: Acne; Lp Aloe vera gel, Lactobacillus plantarum 05SL3, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcu sepidermidis;

LỜI CAM ĐOAN

Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và anh, chị đồng nghiệp của Trường Đại học Tây Đô đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tiến hành luận án

MỤC LỤC

Trang

TÓM LƯỢC i

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN v

LỜI CẢM ƠN vi

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH xi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT xiii

GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về mụn trứng cá 4

1.1.1 Phân loại mụn trứng cá 4

1.1.2 Cơ chế gây mụn trứng cá 5

1.2 Vi sinh vật bội nhiễm ở mụn trứng cá 6

1.2.1 Vi khuẩn Propionibacterium acnes 8

1.2.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 10

1.2.3 Vi khuẩn Staphylococcus epidermidis 12

1.2.4 Ký sinh trùng Demodex 13

1.3 Ảnh hưởng của corticoid bôi đối với mụn trứng cá 14

1.4 Sơ lược về vi khuẩn lactic và những ứng dụng trong chăm sóc da 15

1.4.1 Một số đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 15

1.4.2 Những ứng dụng của vi khuẩn lactic trong y học 18

1.4.3 Tiềm năng ứng dụng vi khuẩn lactic trong chăm sóc da 20

1.5 Sơ lược về Nha đam và những ứng dụng trong mỹ phẩm 23

1.5.1 Sơ lược về đặc điểm sinh học của Nha đam 23

1.5.2 Những ứng dụng của Nha đam trong mỹ phẩm 23

1.6 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn 24

1.6.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 24

1.6.2 Định danh vi khuẩn bằng các kỹ thuật truyền thống 26

1.6.3 Định danh vi khuẩn bằng giải trình tự gen 16S-rRNA 28

1.6.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen 16S-rRNA 30

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Phương tiện nghiên cứu 32

2.2 Vật liệu 32

2.3 Môi trường phân lập, nuôi cấy vi sinh vật và hóa chất 32

2.4 Địa điểm 33

2.5 Phương pháp nghiên cứu 33

2.5.1 Khảo sát tần suất xuất hiện của P acnes, S aureus, S epidermidis, Demodex trên da mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid 34

2.5.2 Khảo sát sự đề kháng kháng sinh của nhóm vi khuẩn bội nhiễm phổ biến

ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid và tuyển chọn vi khuẩn

làm chỉ thị 42

2.5.3 Phân lập và tuyển chọn những dòng LAB có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị 45

2.5.4 Khảo sát một số đặc tính sinh học ứng dụng trong chăm sóc da của dòng LAB đã chọn 48

2.5.5 Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm sóc da 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 Khảo sát tần suất xuất hiện của P acnes, S.aureus, S epidermidis, Demodex trên da mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid 60

3.1.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 60

3.1.2 Tình hình sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid ở mụn trứng cá 62

3.1.3 Tỷ lệ bội nhiễm vi sinh vật ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid 65

3.1.4 Kết luận 73

3.2 Khảo sát khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn bội nhiễm ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid 74

3.2.1 Kết quả kháng sinh đồ 74

3.2.2 Kết quả định danh vi khuẩn bội nhiễm ở mụn trứng cá bằng giải trình tự gen 16S-rRNA 77

3.2.3 Kết luận 78

3.3 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị 78 3.3.1 Phân lập vi khuẩn lactic 78

3.3.2 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị của các dòng LAB phân lập 80 3.3.3 Kết luận 86

3.4 Khảo sát một số đặc tính sinh học ứng dụng trong chăm sóc da của L plantarum 05SL3 86

3.4.1 Khả năng sinh bacteriocin bằng phương pháp nhỏ giọt 86

3.4.2 Khả năng sinh acid lactic 87

3.4.3 Khả năng sinh hoạt chất chống oxy hóa 88

3.4.4 Khả năng giữ ẩm 89

3.4.5 Khả năng kháng kháng sinh 90

3.4.6 Kết luận 91

3.5 Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm da 92

3.5.1 Thiết kế môi và điều kiện trường nuôi sinh khối L plantarum 05SL3 92

3.5.2 Lên men làm chế phẩm chăm sóc da 97

3.5.3 Kết luận 101

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 102

4.1 Kết luận 102

4.2 Đề nghị 103

TÀI LIỆU THAM KHẢO 104

DANH SÁCH BẢNG

Trang Bảng 2.1 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ ức chế vi khuẩn của kháng

sinh……… 43

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR……… 44

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ức chế vi khuẩn chỉ thị của LAB 48 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng thử nghiệm DPPH……… 50

Bảng 2.5 Thành phần dinh dưỡng của nước tàu hũ……… 53

Bảng 2.6 Thành phần môi trường nuôi LAB……… 54

Bảng 2.7 Tỷ lệ thành phần môi trường nuôi LAB……… 54

Bảng 2.8 Điều kiện nuôi LAB……… 55

Bảng 2.9 Tỷ lệ các thành phần trong chế phẩm……… 55

Bảng 2.10 Mật số vi khuẩn trong chế phẩm……… 58

Bảng 3.1 Phân bố bệnh theo lứa tuổi và giới tính……… 60

Bảng 3.2 Tỷ lệ biểu hiện các dạng lâm sàng……… 61

Bảng 3.3 Tỷ lệ mụn trứng cá có sử dụng corticoid……… 62

Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra corticoid trong 18 sản phẩm bôi………… 62

Bảng 3.5 Phân bố bệnh theo biểu hiện lâm sàng và sử dụng mỹ phẩm……… 64

Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm Demodex trên bệnh nhân mụn trứng cá……… 66

Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm P acnes trên mụn trứng cá……… 67

Bảng 3.8 Tỷ lệ nhiễm S.aureus trên mụn trứng cá……… 69

Bảng 3.9 Tỷ lệ nhiễm S epidermidis trên mụn trứng cá……… 71

Bảng 3.10 Tỷ lệ đồng nhiễm các nhóm vi khuẩn trên mụn trứng cá… 72 Bảng 3.11 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn S aureus……… 75

Bảng 3.12 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn S epidermidis……… 75

Bảng 3.13 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn P acnes……… 76

Bảng 3.14 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn lactic……… 78

Bảng 3.15 Đặc điểm của 82 dòng LAB phân lập……… 80

Bảng 3.16 Khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị của LAB……… 81

Bảng 3.17 Tỷ lệ các dòng LAB phân lập ức chế vi khuẩn chỉ thị…… 82

Bảng 3.18 Sự ức chế S aureus 10Sa của LAB 05SL3 83

Bảng 3.19 Sự ức chế S epidermidis 09Se của LAB 05SL3 ………… 83

Bảng 3.20 Sự ức chế P acnes 46Pa của LAB 05SL3……….… 84

Bảng 3.21 Khảo sát khả năng sinh acid lactic……… 87

Bảng 3.22 Kết quả khảo sát chống oxy hóa bằng DPPH của DN-Lp… 88 Bảng 3.23 Kết quả giữ ẩm của DN-Lp……… 90

Bảng 3.24 Kết quả kháng sinh đồ của L plantarum 05SL3………… 91

Bảng 3.25 Sự tăng trưởng của L plantarum 05SL3 theo móc thời gian 92

Bảng 3.26 Ảnh hưởng nguồn cung cấp carbohydrat đến sinh khối của L plantarum 05SL3……… 93

Bảng 3.27 Tỷ lệ các thành phần môi trường nuôi sinh khối

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1 Mô hình các dạng mụn trứng cá ……… 5

Hình 1.2 Mô hình hệ vi sinh vật da ……… 7

Hình 1.3 Sự đa dạng của hệ vi sinh vật da trên mỗi vị trí cơ thể … 7

Hình 1.4 Tế bào vi khuẩn P acnes ……… 8

Hình 1.5 Cây phát sinh loài của vi khuẩn P acnes……… 9

Hình 1.6 Tế bào Vi khuẩn S aureus ……… 11

Hình 1.7 Tế bào Vi khuẩn S epidermidis ……… 12

Hình 1.8 Ký sinh trùng Demodex……… 14

Hình 1.9 Vi khuẩn Lactobacillus salivarius……… 17

Hình 1.10 Cây phát sinh loài của LAB ……… 17

Hình 1.11 Sơ đồ kích thích miễn dịch của LAB ……… 21

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình nghiên cứu……… 33

Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng mẫu……… 36

Hình 2.3 Vi khuẩn phát triển môi trường phân lập……… 37

Hình 2.4 Vi khuẩn Gram +……… 38

Hình 2.5 Phản ứng dương tính catalase……… 38

Hình 2.6 Phản ứng indol……… 39

Hình 2.7 Phản ứng nitrat hóa……… 39

Hình 2.8 Phản ứng dịch hóa gelatin……… 40

Hình 2.9 Phản ứng coagulase……… 40

Hình 2.10 Triển khai sắc ký bản mỏng các mẫu mỹ phẩm ………… 41

Hình 2.11 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR……… 45

Hình 2.12 Khuẩn lạc phân giải CaCO3……… 46

Hình 2.13 Đĩa thạch đục lổ làm giếng thử kháng khuẩn……… 47

Hình 2.14 Thí nghiệm khảo sát khả năng giữ ẩm của dịch nuôi LAB 51

Hình 2.15 Khả năng kháng kháng sinh của LAB……… 52

Hình 2.16 Khả năng lên men đường của LAB……… 53

Hình 2.17 Thí nghiệm khảo sát tỷ lệ các thành phần trong chế phẩm 55

Hình 3.1 Tỷ lệ phân bố bệnh theo tuổi và giới tính……… 61

Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng các sản phẩm bôi chứa corticoid……… 63

Hình 3.3 Dạng lâm sàng ở mụn trứng cá sử dụng corticoid… …… 64

Hình 3.4 Tỷ lệ phân bố bệnh theo biểu hiện lâm sàng và sử dụng mỹ phẩm……… 64

Hình 3.5 Demodex quan sát vật kính 40x ……… 65

Hình 3.6 Tỷ lệ nhiễm Demodex trên mụn trứng cá….……… 66

Hình 3.7 Kết quả xét nghiệm sinh hóa nhận diện P.acenes ……… 67

Hình 3.8 Tỷ lệ nhiễm P.acnes trên mụn trứng cá……… 68

Hình 3.9 Kết quả xét nghiệm sinh hóa nhận diện S aureus ……… 69

Hình 3.10 Tỷ lệ nhiễm S aureus trên mụn trứng cá……… 70

Hình 3.11 Kết quả xét nghiệm sinh hóa nhận diện S epidermidis … 70 Hình 3.12 Tỷ lệ nhiễm S epidermidis……… 71 Hình 3.13 Tỷ lệ đồng nhiễm các nhóm vi khuẩn trên mụn trứng cá… 73 Hình 3.14 Kết quả kháng sinh đồ……… 74 Hình 3.15 Phổ điện di DNA của 14 dòng vi khuẩn bội nhiễm mụn

trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid….………… 77 Hình 3.16 Hình dạng khuẩn lạc các dòng LAB phân lập……… 79 Hình 3.17 Các dạng tế bào và Gram của dòng LAB phân lập……… 79 Hình 3.18 Phân giải CaCO3 của LAB……… 79 Hình 3.19 Kết quả ức chế vi khuẩn chỉ thị của LAB……… 81 Hình 3.20 Khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị của dòng LAB 05SL3… 82 Hình 3.21 Biểu đồ ức chế S aureus 10Sa của LAB 05SL3………… 83 Hình 3.22 Biểu độ ức chế S epidermidis 09Se của LAB 05SL3…… 84 Hình 3.23 Biểu đồ ức chế P acnes 46Pa của LAB 05SL3………… 84

Hình 3.24 Hình tế bào vi khuẩn L plantarum 05SL3……… 85 Hình 3.25 Kết quả kiểm tra khả năng sinh baceriocin của

Hình 3.31 Kết quả kháng sinh đồ của L plantarum 05SL3………… 91 Hình 3.32 Biểu đồ tăng trưởng của L plantarum 05SL3……… 92 Hình 3.33 Kết quả khả năng sử dụng đường của L plantarum 05SL3 93 Hình 3.34 Sinh khối vi khuẩn L plantarum 05SL3 sau 24 giờ……… 95 Hình 3.35 Mật số L plantarum 05SL3 sau 48 giờ……… 98

Hình 3.36 Mật số L plantarum 05SL3 theo thời gian và nhiệt độ bảo

Hình 3.37 Chế phẩm trữ ở 15 oC sau 75 ngày……… 100 Hình 3.38 Chế phẩm trữ ở nhiệt độ 25 oC sau 60 ngày……… 100

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Các ký hiệu, chữ viết tắt ý nghĩa

HPLC High-Performance Liquid Chromatography (Sắc ký

lỏng hiệu năng cao)

LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic)

Lp Gel Gel Nha đam lên men bởi L plantarum 05SL3

Lr-SCS L rhamnosus culture supernatanl (Dịch ly tâm từ

môi trường nuôi vi khuẩn L rhamnosus)

MDCs Macrophage Dendritic cell (Đại thực bào đuôi gai)

PIA Poly-saccharide Intercellular Adhesin

ROS Reactive Oxygen Species (gốc tự do oxy hóa)

TYEG Trypticase-Yeast-Extract-Glucose

GIỚI THIỆU Tính cấp thiết của đề tài

Mụn trứng cá là bệnh viêm nang lông tuyến bã phổ biến ở da, đặc trưng bởi các vùng da tăng tiết bã nhờn như mặt, lưng và ngực Mụn trứng cá thường hay gặp ở lứa tuổi thiếu niên và thanh niên Khoảng 73,6% nam và

69,9% nữ bị mụn trứng cá ở tuổi dậy thì (Kaciauskiene et al., 2013) Nguyên

nhân là do sự tăng sản xuất chất nhờn của tuyến bã nhờn, tắc nghẽn lỗ chân

lông, sự phát triển quá mức của vi khuẩn Propionibacterium acnes (P acnes)

và sự hiện diện các yếu tố viêm (Tahir, 2010) Nếu không bị nhiễm trùng, mụn chỉ ở cấp độ nhẹ, gồm các mụn đầu trắng, đầu đen kèm theo nốt sẩn, nhưng vì

lý do nào đó như: nặn mụn, vệ sinh kém, chế độ ăn uống, sử dụng thuốc bôi da

và mỹ phẩm không phù hợp sẽ gây ra nhiễm trùng, làm mụn trở nên trầm

trọng, mụn mủ nhiều và to hơn, có thể gây ra những sẹo lớn (Kaciauskiene et al., 2015) làm mất vẻ thẩm mỹ của da

Tuy không ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, nhưng hậu quả của mụn trứng

cá lại tác động mạnh mẽ về mặt thẩm mỹ và tâm lý Khoảng 40,8% người mụn

trứng cá rơi vào tình trạng trầm cảm (Al-Huzali et al., 2014) và mức độ trầm cảm gia tăng từ hai đến ba lần so với người bình thường (Uhlenhake et al.,

2010), sự thiếu tự tin, lo lắng, buồn bực cũng cao hơn người không bị mụn

(Do et al., 2009) Do mụn trứng cá chỉ tác động đến tâm lý và thẩm mỹ nên

vấn đề điều trị càng ít được chú ý, có đến 74% người bị mụn trứng cá để kéo

dài cả năm hoặc trở nặng mới đến cơ sở y tế điều trị (Tan et al., 2001)

Trong các trường hợp trên, người bị mụn trứng cá thường sử dụng phương pháp điều trị “truyền miệng” từ người thân hoặc bạn bè và sử dụng các mỹ phẩm chứa corticoid Những mỹ phẩm này được sử dụng với nhiều mục đích như: trị mụn, trị nám, tàn nhang, làm trắng da, (Huỳnh Văn Bá,

2009; Ambika et al., 2014; Chohan et al., 2014; Dey, 2014) Việc sử dụng sản

phẩm bôi chứa corticoid ở những người mụn trứng cá sẽ làm suy yếu collagen, teo da, mỏng da, ửng đỏ hoặc rạn da, viêm da quanh miệng, mất sắc tố, phát

ban dạng mụn trứng cá đỏ, đặc biệt làm gia tăng sự hiện diện của vi khuẩn P acnes và Staphylococcus aureus (S aureus) (Klein et al., 2001; Ambika et al., 2014; Coondoo et al., 2014; Dey, 2014) Ngoài ra, sự tác động của corticoid

trên tế bào sừng sẽ làm tăng biểu hiện gen Toll-like receptor 2 (TLR2 ), đây là

yếu tố nhận biết vi khuẩn P acnes ở da, kích thích mạnh mẽ phản ứng viêm (Shibata et al., 2009)

Hiện nay, vấn đề điều trị mụn trứng cá được áp dụng nhiều phương pháp bao gồm điều trị toàn thân và tại chỗ với các nhóm thuốc được sử dụng là

kháng sinh, nội tiết và retinoid (Haider and Shaw, 2004; Huot và Nguyễn Tất Thắng, 2009) Bên cạnh đó, liệu pháp ánh sáng xanh cũng đang được áp dụng

(Hörfelt, 2009; Gold et al., 2009) Tuy nhiên, biện pháp này cần phải có thời

gian dài và chi phí cao nên người bệnh thường không thực hiện đầy đủ qui trình dễ dàng dẫn đến thất bại trong điều trị

Đối với việc sử dụng kháng sinh, từ năm 1979 đã phát hiện có sự kháng

erythromycin và clindamycin của vi khuẩn P acnes (Crawford et al., 1979)

Đến năm 2011, sự kháng thuốc trở nên phổ biến hơn, có 31% vi khuẩn

P acnes phân lập từ người mụn trứng cá kháng ít nhất một loại kháng sinh

được dùng trong điều trị, khoảng 93,1% kháng với tetracyclin, 84,5% kháng

với erythromycin và 69% kháng với cotrimoxazol (Zandi et al., 2011) Hiện

tượng kháng thuốc đã gây không ít khó khăn trong việc khống chế vi khuẩn bội nhiễm, mụn tái diễn nhiều lần tạo điều kiện cho sự bội nhiễm bởi nhiều vi sinh vật khác làm cho mụn trở nên nặng hơn

Phương pháp điều trị bằng nội tiết hoặc retinoid cũng mang lại nhiều tác dụng phụ như: đối với thuốc nội tiết có thể gây đau ngực, buồn nôn, tăng cân,

nám da, thay đổi tâm trạng, nặng hơn gây đột quỵ, đau tim (Ebede et al., 2009; Ghosh et al., 2014), đối với retinoid xuất hiện mẫn đỏ, rát hoặc ngứa nhẹ gây cảm giác khó chịu trên da (Mukherjee et al., 2006)

Các phương pháp trên không hoàn toàn điều trị dứt điểm mụn trứng cá

mà chỉ mang tính chất khống chế nhằm làm giảm tác hại của mụn Vì thế mụn

có thể tái phát sau thời gian điều trị Từ đó, đòi hỏi cần phải có những biện pháp mới có thể ức chế sự bùng phát của vi khuẩn bội nhiễm là rất cần thiết

trong quản lý và điều trị mụn trứng cá Với những lý do trên nên đề tài “Phân

lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi sinh vật bội nhiễm mụn trứng cá do sử dụng sản phẩm chứa corticoid” được thực hiện nhằm

đưa ra một phương pháp chăm sóc da ngăn chặn sự bội nhiễm của một số vi sinh vật, góp phần hạn chế sự tái phát bệnh, giảm chi phí và thời gian điều trị

Mục tiêu của đề tài

(1) Xác định vi sinh vật bội nhiễm phổ biến ở mụn trứng cá có sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid (vi sinh vật bội nhiễm mụn trứng cá gọi chung gồm vi khuẩn tham gia sinh mụn và vi sinh vật bội nhiễm)

(2) Tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic (LAB) có khả năng ức chế vi sinh vật bội nhiễm phổ biến ở mụn trứng cá có sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid và ứng dụng trong sản xuất chế phẩm chăm sóc da

Nội dung nghiên cứu

(1) Khảo sát tần suất xuất hiện của vi sinh vật bội nhiễm phổ biến

(P acnes, S aureus, S epidermidis, Demodex) trên da mụn trứng cá có sử

dụng sản phẩm bôi chứa corticoid

(2) Khảo sát sự đề kháng kháng sinh của nhóm vi khuẩn bội nhiễm phổ biến ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid và tuyển chọn vi khuẩn chỉ thị

(3) Phân lập và tuyển chọn những dòng LAB có khả năng ức chế vi khuẩn chỉ thị

(4) Khảo sát một số hoạt tính sinh học có khả năng ứng dụng trong chăm sóc da của dòng LAB đã chọn

(5) Lên men gel Nha đam làm chế phẩm chăm sóc da

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là những dòng vi khuẩn LAB có khả năng kháng

vi sinh vật bội nhiễm phổ biến ở mụn trứng cá

Phạm vi nghiên cứu là khả năng ức chế nhóm vi sinh vật bội nhiễm phổ biến ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid

Những đóng góp mới của đề tài

- Xác định nhóm vi sinh vật bội nhiễm phổ biến ở mụn trứng cá sử dụng corticoid bôi và đánh giá thực trạng kháng thuốc kháng sinh

- Tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nhóm vi khuẩn sinh mụn và vi khuẩn bội nhiễm phổ biến ở mụn trứng cá sử dụng sản phẩm bôi chứa corticoid, đồng thời có khả năng chăm sóc da bằng cách sản sinh hợp chất chống oxy hóa và giữ ẩm

- Bước đầu xây dựng được công thức lên men chế phẩm LAB chăm sóc

da mụn trứng cá từ gel Nha đam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 1 Tổng quan về mụn trứng cá

Mụn trứng cá được mô tả sớm nhất trong các văn bản Hy Lạp cổ đại thời Byzantine của thầy thuốc Aetius Amidenus Từ “acne” xuất phát từ từ acme trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là “điểm” hoặc “tại chỗ”, acme viết sai thành

acne và được sử dụng đến ngày nay (Tabasum et al., 2013) Mụn trứng cá là

bệnh viêm da mãn tính, phổ biến nhất ở lứa tuổi thanh thiếu niên với các biểu hiện lâm sàng: có nhiều bã nhờn, mụn trứng cá đỏ, mụn mủ, nốt, nang (Kataria and Chillar, 2015)

- Các thể lâm sàng khác: Mụn trứng cá trẻ sơ sinh, mụn trứng cá do thuốc, mụn trứng cá muộn ở phụ nữ, mụn trứng cá do hóa chất

Dựa vào hình ảnh và số lượng tổn thương ở nửa khuôn mặt có thể chia

Hình 1.1: Mô hình các dạng mụn trứng cá (Shear, 2011)

1.1.2 Cơ chế gây mụn trứng cá

Sinh bệnh học của mụn trứng cá thường liên quan đến các yếu tố nội sinh, ngoại sinh nhưng rõ nhất là liên quan đến bốn yếu tố (Tahir, 2010; Chandersekar, 2013):

Đến tuổi dậy thì, với sự hoạt động của hormon androgen, đặc biệt là testosteron kích thích tuyến bã nhờn và tế bào sừng (keratinocyte) sản xuất nhiều chất nhờn Vì lý do nào đó, chất nhờn phóng thích ra ngoài bị hạn chế sẽ tích tụ và hình thành nhân mụn trứng cá có thể nhìn thấy dưới da gọi là mụn

đầu trắng (whitehead) hoặc lộ ra ngoài là mụn đầu đen (blackhead) (Preston et al., 2001; Makrantonaki and Cranceviciene, 2011)

1.1.2.2 Tắc nghẽn lỗ chân lông

Sự tắc nghẽn lỗ chân lông xảy ra do rối loạn sự bong tróc của tế bào biểu

mô ở nang lông Các tế bào này trở nên to và kết chặt lại hình thành những lớp dày, mỏng một cách bất thường ở cổ nang lông gây cản trở sự phóng thích của chất nhờn (Thiboutot, 2009)

1.1.2.3 Phát triển quá mức của vi khuẩn P acnes

Vi khuẩn P acnes là một cư dân bình thường trên da, cư trú chủ yếu ở

các vùng có nhiều tuyến bã Khi cơ thể đến tuổi trưởng thành, tuyến nội tiết hoạt động kích thích sự tăng hoạt động của tuyến bã, tiết nhiều chất nhờn, đây

là điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn này phát triển P acnes phát triển làm thay

đổi cân bằng của hệ vi sinh vật tại các vị trí này, đồng thời tiết ra các enzym như lipase, protease, hyaluronidase, làm tổn thương các mô của tuyến và nang lông Khi các mô bị tổn thương sẽ kích thích các yếu tố miễn dịch, sản sinh các cytokin và phản ứng viêm xảy ra dẫn đến sự hình thành mụn trứng cá

(Bru¨ggemann, 2010; Jahns et al., 2012; Kasimatis et al., 2013)

1.1.2.4 Phản ứng viêm

Sự hiện diện của P acnes và các sản phẩm do vi khuẩn tiết ra đã kích

thích sự hoạt động của hệ thống miễn dịch Các bạch cầu, đặc biệt là tế bào Langerhan ở dưới da có khả năng bắt giữ và tiêu diệt kháng nguyên theo cơ chế thực bào Quá trình tiêu diệt kháng nguyên của đại thực bào đã gây ra hiện tượng viêm như: sưng, đỏ, đau ở xung quanh lỗ chân lông Phản ứng viêm xảy

ra tiếp tục thu hút bạch cầu đến và vùng viêm lan rộng hơn, các mụn, sẩn đỏ

đau, nốt sần, mụn mủ xuất hiện gọi là mụn trứng cá (Preston et al., 2001; Jeremy et al.,2003)

1.2 Vi sinh vật bội nhiễm ở mụn trứng cá

Trên bề mặt da bình thường luôn tồn tại một hệ vi sinh vật ở trạng thái cân bằng bao gồm vi khuẩn, virus, nấm và ký sinh trùng chân đốt không gây hại đến ký chủ (Schommer and Crallo, 2013) Sự đa dạng về chủng loại của hệ sinh thái này phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: vị trí ký sinh trên cơ thể, yếu tố nội sinh của từng người và yếu tố môi trường ngoài (Schommer and Crallo, 2013) Qua phân tích tính đa dạng hệ vi sinh vật da, đặc biệt là vi khuẩn, cho thấy có ít nhất 19 ngành và bộ vi khuẩn khác nhau, các ngành và bộ chính gồm Actinobacteria (51,8%), Firmicutes (24,4%), Proteobacteria (16,5%) và

Bacteroidetes (6,3%) (Grice et al., 2009) Phần lớn các chi được xác định là Corynebacterium, Propionibacterium và Staphylococcus (Grice et al., 2009)

Sự phong phú của mỗi nhóm vi khuẩn phụ thuộc nhiều vào vị trí ký sinh trên

cơ thể Ví dụ, các vị trí có nhiều tuyến bã nhờn như mặt, lưng thì chủ yếu là

Propionibacterium sp và Staphylococcus sp, ở những nơi ẩm như nách, bẹn, mũi thì chi Corynebacterium chiếm ưu thế Ngược lại, ở những vị trí như gót

chân hay vùng khô ráo khác thì phổ biến là β-Proteobacteria và

Flavobacteriales (Hình 1.2; Hình 1.3) (Grice et al., 2009; Grice and Segre,

2011)

Hình 1.2: Mô hình hệ vi sinh vật da (Grice and Segre, 2011)

Hình 1.3: Sự đa dạng của hệ vi sinh vật da trên mỗi vị trí cơ thể (Grice and

Segre, 2011) Trên da bình thường, hệ vi sinh vật có khả năng hỗ trợ da chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh từ ngoài thông qua hành vi kích thích miễn dịch bẩm sinh của da (Grice and Segre, 2011) Tuy nhiên, khi có sự thay đổi

về mặt sinh thái như sự tăng sản xuất chất nhờn đã tạo điều kiện thuận lợi cho

vi khuẩn Propionibacterium sp đặc biệt là P acnes phát triển mạnh, làm thay

đổi sự cân bằng của hệ vi sinh vật tại những vùng có nhiều tuyến nhờn, đồng

thời sản xuất các yếu tố gây tổn thương các mô và kích thích phản ứng viêm Khi tổn thương mô quanh nang lông xảy ra, hàng rào bảo vệ của da suy giảm chính là cơ hội tốt cho nhiều vi khuẩn khác tấn công như nhóm

Staphylococcus sp (Bru¨ggemann, 2010; Lo et al., 2011; Jahns et al., 2012)

1.2.1 Vi khuẩn Propionibacterium acnes

1.2.1.1 Đặc tính sinh học và khả năng gây bệnh

Vi khuẩn P acnes thuộc họ Propionibateriaceae, Bộ Actinomycetales,

Ngành Actinobacteria là vi khuẩn Gram dương, hình que, tế bào có đường kính 0,5-0,8 m và dài 3-4 m (Hình 1.4), không sinh bào tử, kỵ khí, có khả năng sản xuất acid propionic, khử nitrat, dịch hoá gelatin, catalase và indol dương tính Khuẩn lạc phát triển chậm khoảng 4 ngày sau khi cấy, trên môi trường phân lập TYEG (Trypticase-Yeast Extract-Glucose) có bổ sung bromocresol purple khuẩn lạc màu vàng đục, mô cao, đường kính 0,5-2,5 mm

(Stackebrandt et al., 2006)

Hình 1.4: Tế bào vi khuẩn P acnes (Bru¨ggemann, 2010)

Dựa vào phản ứng ngưng kết huyết thanh, đặc điểm sinh hóa và phân

tích di truyền, P acnes được chia thành các type I (IA và IB), II, III (Hình 1.5) (McDowell et al., 2008)

- Type I: Nhóm vi khuẩn có khả năng tán huyết dạng , sản xuất lipase, lecithinase, proteinase và hyaluronidase

- Type II: Nhóm vi khuẩn không gây tán huyết dạng , sản xuất lipase, lecithinase, proteinase và hyaluronidase

- Type III: Nhóm vi khuẩn không sản xuất acid từ lactose, xylose, maltose, arabinose, cellobiose, melezitose, âm tính với urease và -glucosidase, dương tính với catalase, arginine dihydrolase, tiết ra lipase, gây tán huyết dạng 

Hình 1.5: Cây phát sinh loài của vi khuẩn P acnes (McDowell et al., 2008)

Trước đây, P acnes được xem là cư dân của hệ vi sinh vật da không gây

bệnh, nhưng trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu về đặc tính di

truyền cho thấy P acnes có liên quan đến một số bệnh nhiễm trùng như: viêm

nội tâm mạc, viêm tuyến tiền liệt, viêm phổi, viêm tủy xương; và đặc biệt là

mụn trứng cá (Bru¨ggemann, 2010) Cơ chế gây bệnh của P acnes được

chứng minh là do khả năng sản xuất các enzym liên quan đến sự phá hủy tế bào ký chủ như: sialidase và neuraminidase tạo độ kết dính và sinh độc tố, lipase tiêu hóa chất nhờn, hyaluronan có khả năng thu hút đại thực bào và tế bào đuôi gai kích thích mạnh mẽ phản ứng viêm, CAMP (Christie-Atkins-Munch-Peterson) là yếu tố quyết định gây bệnh Ngoài việc tiết ra các sản phẩm phá hoại tế bào ký chủ, cấu trúc màng tế bào của vi khuẩn gần một nửa

là lipoglycan và protein màng có hình móc câu giúp cho vi khuẩn thích nghi với khả năng bám dính vào ký chủ hoặc dụng cụ y tế và chống lại sự miễn

dịch (Bru¨ggemann, 2010)

1.2.1.2 Khả năng đề kháng kháng sinh của P acnes

Hiện tượng đề kháng kháng sinh của P acnes đã được nghiên cứu rất lâu

và khả năng kháng thuốc đã và đang phát triển đến mức báo động Năm 1976

chưa phát hiện sự kháng thuốc của P acnes, nhưng chỉ ba năm sau, năm 1979

bắt đầu phát hiện kháng erythromycin và clindamycin dạng bôi và tiếp theo là

tetracyclin (Crawford et al., 1979) Từ kết quả nghiên cứu của Ross và cs (2003) cho thấy P acnes có khả năng đề kháng cao với erythromycin và

clindamycin ở các nước Địa Trung Hải như: Tây Ban Nha tỷ lệ kháng erythromycin và clindamycin lần lượt là 91% và 92,4%; Hy Lạp là 75,3% và

Italia là 59,5% (Ross et al., 2003) Các loại kháng sinh điều trị mụn trứng cá

phổ biến như ampicilin, erythromycin, roxithromycin, clindamycin được

khuyến cáo không sử dụng điều trị kéo dài quá 3 tháng (Nishijima et al.,

2000) Đến năm 2011, khoảng 93,1% kháng với tetracyclin, 84,5% kháng với

erythromycin và 69% kháng với cotrimoxazol, 31% vi khuẩn P acnes phân

lập từ các bệnh nhân mụn trứng cá kháng ít nhất một loại kháng sinh được

dùng trong điều trị (Zandi et al., 2011) Tại Việt Nam, qua khảo sát khả năng

đề kháng kháng sinh của P acnes trên bệnh nhân mụn trứng cá tại phòng

khám bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh như sau: clindamycin 88,1%; azithromycin 16,7%; tetracyclin 0%, doxycylin 0%; minocyclin 0%; trimethroprim/sulfamethoxazol 95,2% (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013) Bên cạnh sự gia tăng khả năng đề kháng sinh của vi khuẩn, việc sử dụng kháng sinh điều trị mụn trứng

cá còn mang đến một số tác dụng không mong muốn như kích ứng da, mẫn ngứa, khô da, da mẫn cảm với ánh sáng (Nguyễn Hữu Sáu, 2010) Điều này cho thấy việc sử dụng kháng sinh điều trị mụn trứng cá đang trở nên khó khăn

Vì vậy việc lựa chọn thuốc phải phù hợp với từng bệnh nhân, từng thể bệnh và

bệnh nhân phải tuân thủ theo điều trị của bác sĩ mới đạt kết quả mong muốn

1.2.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

1.2.2.1 Đặc tính sinh học và khả năng gây bệnh

Vi khuẩn Staphylococcus aureus được Ogston phát hiện đầu tiên vào

năm 1881 trong mẫu bệnh phẩm thu từ bệnh nhân bị nhiễm trùng sinh mủ sau phẫu thuật và đặc tên là Staphyloccoci vào năm 1882 có nghĩa là chùm nho trong tiếng Hy Lạp Vào năm 1884, Rosenbach phân lập hai cầu khuẩn Staphyloccoci, một loại có khuẩn lạc xuất hiện sắc tố được đặt tên là

Staphylococcus pyogenes aureus (nay gọi là S aureus) có nghĩa là tụ cầu vàng

và một loại khuẩn lạc màu trắng đặt là Staphylococcus pyogenes albus có nghĩa là tụ cầu trắng (Gotz et al., 2006) Vi khuẩn S aureus thuộc Giống Staphylococcus, Họ Staphylococcaceae, Bộ Bacillales, tế bào hình cầu đường

kính từ 1,8-1 µm, xếp chùm, đơn, đôi, chuỗi ngắn, hiếu khí tùy tiện, Gram dương, catalase dương tính, có khả năng lên men đường mannitol, làm đông đặc huyết tương (dương tính với coagulase) (Hình 1.6) Trên môi trường thạch Baird-Parker khuẩn lạc xuất hiện sau 42 giờ ủ nhiệt độ 37 oC, có màu đen hoặc xám đen, đường kính 1,5 mm, trơn, lồi, trên môi trường Mannitol salt agar (MSA) khuẩn lạc có màu vàng sau 24 giờ ở nhiệt độ 37 oC (Gotz et al., 2006)

Hình 1.6: Tế bào Vi khuẩn S aureus (Hamed et al., 2017)

S aureus thuộc nhóm vi khuẩn da và niêm mạc, phát triển nhiều ở tay, ngực, bụng và mũi Khoảng 10,2% người khỏe mạnh mang S aureus thường xuyên, 10,6% nhiễm thoáng qua (Fard-Mousavi et al., 2015) và được xem là

tác nhân quan trọng của nhiễm trùng bệnh viện và các bệnh nhiễm trùng da cộng đồng (Otto, 2010) với tỷ lệ tử vong từ 6-40% (Onanuga and Tenedie,

2011) S aureus trở nên nguy hiểm do có khả năng sản xuất nhiều loại độc

lực, các yếu tố này cho phép tụ cầu vàng né tránh được hệ miễn dịch của vật chủ (Foster, 2005) Enzym staphylokinase có khả năng vô hiệu hóa vị trí hoạt

động C3b của IgG (Rooijakkers et al., 2005), protein A có khả năng làm vô hiệu hóa C1q của IgG (Falugi et al., 2013) và nhiều protein khác có khả năng bất hoạt một số bổ thể và tránh sự truy bắt của bạch cầu (Haggar et al., 2004; DeLeo et al., 2009).

Ngoài gây nhiễm trùng bệnh viện và cộng đồng, S aureus được xem là tác nhân bội nhiễm trong mụn trứng cá Theo nghiên cứu của Fanelli et al (2011) thì có 43-45% bệnh nhân mụn trứng cá có sự bội nhiễm bởi S aureus (Fanelli et al., 2011) Sự nhiễm trùng của S aureus với các biểu hiện lâm sàng dạng mụn mủ, áp xe, bong vảy da (McCaig et al., 2006; Kobayashi et al., 2015; Dhillon and Varshney, 2013; Shamsi, 2015; Nakajima et al., 2016)

1.2.2.1 Khả năng kháng kháng sinh của S aureus

Ngoài khả năng trốn thoát khỏi hệ miễn dịch bẩm sinh của ký chủ,

S aureus còn có khả năng kháng kháng sinh rất cao Sự kháng thuốc của

S aureus đã tạo ra những đợt dịch bệnh lớn như: tụ cầu kháng penicillin vào

năm 1940 đến giữa năm 1950 không có kháng sinh nào hiệu quả đối với những dòng kháng này Trận dịch thứ 2 là tụ cầu kháng với methicillin

(MRSA) được báo cáo năm 1960 (Kobayashi et al., 2015) Ở Việt Nam, một

cuộc khảo sát trên 15 bệnh viện vào năm 2008-2009 cho thấy khoảng 30-64%

tụ cầu vàng kháng methicillin (Nguyễn Văn Kính, 2009), 98,3% kháng penicillin (Trần Thị Thủy Trinh và Nguyễn Thanh Bảo, 2014) Bên cạnh

kháng penicillin, methicillin S aureus còn kháng nhiều loại thuốc như:

doxicyclin, tetracyclin, clindamycin, erythromycin, vancomycin (Srinivasan

et al., 2002; Fanelli et al., 2011; Khorva et al., 2012; Dhillon and Varshney, 2013; Adhikari et al., 2017) Sự bội nhiễm và khả năng kháng kháng sinh của

S aureus đã góp phần tạo ra những khó khăn trong việc điều trị mụn trứng cá

1.2.3 Vi khuẩn Staphylococcus epidermidis

1.2.3.1 Đặc tính sinh học và khả năng gây bệnh

Năm 1882, Ogston sử dụng từ Micrococcus và Cocci để chỉ sự khác nhau giữa cách sắp xếp dạng chuỗi và chùm của cầu khuẩn Năm 1884, Rosenbach phân lập một loại tụ cầu khuẩn lạc không sinh sắc tố và đặt

là Staphylococcus pyogenes albus và sau này gọi là S epidermidis hay tụ cầu trắng (Gotz et al., 2006; Becker et al., 2014) S epidermidis thuộc Giống Staphylococcus, Họ Staphylococcaceae, Bộ Bacillales, tế bào hình cầu đường

kính từ 0,5-1,5 µm, xếp đơn, đôi, chuỗi ngắn và chùm (Hình 1.7), không di động, không sinh bào tử, hiếu khí, Gram dương, catalase dương tính, không làm đông đặc huyết tương (âm tính với coagulase), trên môi trường MSA khuẩn lạc có màu trắng sau 24 giờ ở nhiệt độ 37 oC (Gotz et al., 2006; Namvar

et al., 2014)

Hình 1.7: Tế bào Vi khuẩn S epidermidis (Bernatova et al., 2013)

Vi khuẩn S epidermidis là thành viên của hệ vi sinh vật da, nếu chỉ phát

triển trên lớp biểu bì mạnh khỏe thì tụ cầu này là một cư dân bình thường và

có khả năng ức chế phản ứng viêm thông qua hoạt động của acid lipoteichoic (LTA) Khi da bị chấn thương, tế bào sừng kích hoạt TLR3 để nhận diện các

tế bào bị hư hỏng và kích thích sản sinh cytokin gây viêm Dưới sự hiện của

LTA sẽ ức chế sự phát sinh cytokin và giảm phản ứng viêm (Lai et al., 2009; Lai et al., 2010) Trong trường hợp S epidermidis xâm nhập vào lớp hạ bì

được xem là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện, nhiễm trùng huyết, nội tâm mạc, nhiễm trùng mắt, nhiễm trùng sau phẫu thuật, nhiễm

trùng sau cấy ghép, nhiễm trùng trẻ sơ sinh (Cheung and Otto, 2010; Verdayes

et al., 2013) Trên mụn trứng cá S epidermidis được xem là nhân tố nhiễm trùng cơ hội, hiện diện với tỷ lệ từ 6,8-49% đứng sau P acnes là 52,7-91,6% (Dhillon and Varshney, 2013; Shamsi et al., 2015; Nakajima et al., 2016) Cơ chế gây bệnh của S epidermidis được thực hiện nhờ khả năng tạo

exopolysaccharid có vai trò trong việc hình thành màng sinh học ức chế sự tấn công của đại thực bào và các yếu tố chống nhiễm khuẩn của ký chủ, giảm tốc

độ tăng trưởng và đột biến gen kháng lại thuốc kháng sinh (McCann et al.,

2008), sản xuất chất ngoại bào acid poly-γ-glutamic (PGA), PNAG/PIA và PSMs bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi cơ chế miễn dịch bẩm sinh của ký chủ

(Kocianova et al., 2005; Cheung and Otto, 2010; Otte, 2012)

1.2.3.2 Khả năng đề kháng kháng sinh S epidermidis

Năm 1996, Yorkn et al., phát hiện 75% S epidermidis mang gen mecA kháng methicillin (York et al., 1996), đến 2002 Miragaia et al., đã phát hiện 87,4% chủng S epidermidis có mang gen kháng methicillin (MRSE) trở nên

đa kháng (Miragaia et al., 2002) Một cuộc khảo sát khả năng kháng kháng sinh của S epidermidis của Ma et al., (2011) từ năm 2004-2009 tại một bệnh

viện của một trường đại học ở Trung Quốc cho thấy tỷ lệ đề kháng cao (trên 70%) với penicillin, oxacillin và erythromycin, kháng trung bình (từ 30 - 70%) với tetracyclin, clindamycin, ciprofloxacin, trimethoprim /sulfamethoxazol, chloramphenicol và đề kháng thấp (khoảng 30%) với rifampicin, ceftizoxim

và gentamicin (Ma et al., 2011)

Hiện tượng kháng oxacillin, erythromycin, tetracyclin, clindamycin,

kanamycin, neomycin, amoxycillin của S epidemidis nói riêng và vi khuẩn S aureus và P acnes nói chung trên bệnh nhân mụn trứng cá cũng được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu (Adejuwon et al., 2010; Dhillon and Varshney, 2013; Namvar et al., 2014; Shamsi et al., 2015; Nakajima et al., 2016)

1.2.4 Ký sinh trùng Demodex

Demodex là một loại ve ký sinh thuộc lớp Arachnida, họ Demodicidae,

và loài Acarina, có kích thước nhỏ nhất trong nhóm động vật chân đốt, ký sinh chủ yếu ở nang lông Hai loài ký sinh ở người phổ biến là Demodex folliculorum và Demodex brevis (Rather et al., 2014) D folliculorum trưởng thành có chiều dài 0,3-0,4 mm, D brevis ngắn hơn khoảng 0,15-0,2 mm, cơ

thể bán trong suốt, hình thon dài, chia 2 phần, phần đầu mang 8 chân ngắn Cơ thể được bao bởi một lớp vẩy có dạng móc neo để bám vào nang lông, kiểu miệng bám hút (pin-like mouth-part) để ăn tế bào và chất nhờn trong nang

lông (Hình 1.8) (Rather and Hassan, 2014) D folliculorum tập trung phần lớn

phía trên của nang lông và tuyến bã nhờn, trong khi đó D brevis phát triển

nhiều ở sâu bên trong nang và tuyến nhờn Các vị trí gần mũi, lông mày, đầu,

mí mắt là những nơi tập trung nhiều tuyến nhờn cung cấp trường sinh sống tốt

cho Demodex nhưng cũng có thể rời nang lông di chuyển trên da với tốc độ

8-16 mm/giờ (Rather and Hassan, 2014)

Hình 1.8: Ký sinh trùng Demodex (Shih et al., 2009)

Vòng đời: Demodex cái có phần ngắn và tròn hơn con đực Cả hai con Demodex đực và cái đều có bộ phận sinh dục và thụ tinh trong Việc giao phối

xảy ra trong nang lông, trứng được sinh bên trong các nang lông hoặc tuyến bã nhờn Ấu trùng có sáu chân nở sau 3-4 ngày phát triển thành con trưởng thành

trong khoảng 7 ngày Demodex có chu kỳ sống là 14 ngày Tổng số tuổi thọ của Demodex là vài tuần khi chết, cơ thể chúng bị phân hủy bên trong các

nang lông hoặc các tuyến bã nhờn, đây có thể là một trong những nguyên nhân gây ra mụn trứng cá đỏ (rosacea) (Debora, 2012; MacKenzie, 2012)

Demodex thường ký sinh ở người có độ tuổi từ 20 trở lên khi da có nhiều

chất nhờn, con đường lây truyền chủ yếu là tiếp xúc qua lông mày, chất

nhờn, của người nhiễm (Kaur et al., 2012) Demodex có thể ký sinh trên da

khỏe mạnh và chỉ gây bệnh khi hiện diện với mật độ cao làm tổn thương nang lông, tắc nghẽn lỗ chân lông gây viêm và tạo cơ hội cho yếu tố gây bệnh khác

xâm nhập như P acnes và S aureus (Shih et al., 2009; Tchernev, 2011) Một

số biểu hiện lâm sàng do Demodex như khô nang lông, ngứa, đỏ, da sần sùi,

mụn mủ, (Chen and Plewig, 2014)

1.3 Ảnh hưởng của corticoid bôi đối với mụn trứng cá

Corticoid với tên đầy đủ corticosteroid là hợp chất có hoạt tính sinh học giống như hormon steroid tiết ra từ vỏ thượng thận, được phát hiện đầu tiên bởi Kendall và Reichstein vào năm 1930 Corticoid được sử dụng đầu tiên vào năm 1948 dùng điều trị bệnh thấp khớp Đến năm 1952, quá trình tổng hợp cortiocid thành công, sau đó từ năm 1954 đến 1958, corticoid tổng hợp có tác

dụng chống viêm được đưa vào sử dụng phổ biến Tuy nhiên đến năm 1960 các tác dụng phụ của corticoid được phát hiện và việc sử dụng bắt đầu hạn chế (Benedek, 2011)

Tác dụng điều trị của corticoid được biết đến như là một thuốc kháng viêm, chống dị ứng qua việc làm: giảm lympho bào, giảm bạch cầu ái toan, ái kiềm, làm mất sự thâm nhập bạch cầu đa nhân, ức chế phóng thích histamin,

bardykini giảm leucotrien C, giảm sản xuất prostaglandin (Klein et al., 2001;

Trần Thị Thu Hằng, 2011) Dược học lâm sàng của liệu pháp corticoid có ba dạng là liệu pháp toàn thân trực tiếp, gián tiếp và tại chỗ

Đối với tác dụng tại chỗ của corticoid có tác dụng chống viêm và giảm dị ứng nhưng mang lại rất nhiều tác dụng phụ Trong trường hợp lạm dụng corticoid để điều trị, ban đầu bệnh giảm nhưng sử dụng kéo dài gây ra những tai biến như: làm tăng nhãn áp, đục nhân mắt, teo da, mỏng da, ửng đỏ hoặc rạn da, có vết bầm và giãn mạch, mất sắc tố, làm trầm trọng mụn trứng cá đỏ,

che đậy nhiễm khuẩn và xuất hiện nấm da (Klein et al., 2001; Coondoo et al., 2014) Theo Klein et al (2001), việc dùng corticoid trên da kéo dài sẽ làm suy yếu collagen, teo da, dễ tổn thương và nhiễm trùng bởi S aureus và một số trực khuẩn Gram âm (Klein et al., 2001) Theo Coondoo et al.,(2014), lạm dụng

corticoid bôi gây tổn thương dạng mụn trứng cá như sẩn, mụn mủ, sẩn viêm

có kích thước nhỏ và đồng nhất, đồng thời làm gia tăng sử phát triển của P acnes và Demodex folliculorum (Coondoo et al.,2014)

1.4 Sơ lược về vi khuẩn lactic và những ứng dụng trong chăm sóc da 1.4.1 Một số đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Thuật ngữ vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria – LAB) đã được đề nghị bởi Orla – Jensen vào năm 1919 để chỉ nhóm vi khuẩn có khả năng lên men chất bột đường tạo thành acid lactic LAB có các đặc điểm chung như: Gram dương; không sinh bào tử; kỵ khí tùy tiện hay vi hiếu khí; tế bào có hình que

hoặc cầu; âm tính với catalase, oxidase và gelatinase (Carr et al., 2002; König

et al., 2009)

LAB thường kết hợp với môi trường sống giàu chất dinh dưỡng, chẳng hạn như phát triển trên nhiều loại thực phẩm (sữa, thịt, rau) và một số là thành viên của hệ vi sinh vật trong miệng, ruột người và động vật có vú (Lee and

Salminen, 2009; Gupta et al., 2018) Ngoài tự nhiên, LAB sống hoại sinh, sử

dụng protein, cacbohydrat, acid amin từ xác động vật, thực vật Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển từ 10 oC đến 40 oC LAB phát triển trên môi trường giàu dinh dưỡng, khuẩn lạc nhỏ, lên men kỵ khí, sản phẩm lên men chủ yếu là

lactate Ngoài ra, LAB còn sản xuất các hợp chất hữu cơ cung cấp mùi thơm

và hương vị cho các sản phẩm lên men (Beasley et al., 2004)

Trong quá trình trao đổi chất, LAB có khả năng ức chế vi sinh vật khác bằng con đường cạnh tranh dinh dưỡng và sản sinh các sản phẩm ức chế như: acid lactic; acid acetic; peroxid hydrogen; carbon dioxid; bacteriocin; diacetyl; Hoạt động đối kháng của LAB được tóm tắt như sau (Aymerich, 2000):

- Bacteriocin: ảnh hưởng đến màng tế bào, quá trình sao chép DNA và tổng hợp protein

- Peroxid hydrogen: oxy hóa protein cơ bản

- Carbon dioxid: ức chế quá trình decarboxylation (giải phóng CO2), giảm tính thấm của màng tế bào

- Acid lactic: thẩm thấu qua màng tế bào, giảm độ pH trong tế bào

- Diacetyl: tương tác với những protein gắn với arginine

Phân loại LAB

Orla – Jensen đã đưa ra một số đặc điểm để phân loại LAB bao gồm: màu Gram, hình thái tế bào, hình thức lên men glucose (lên men đồng hình hay dị hình), nhiệt độ tăng trưởng; dạng acid lactic được tạo ra (dạng L, D hoặc cả hai) Dựa vào đặc điểm trên, đầu tiên LAB có bốn chi chủ yếu như:

Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus, sau đó bằng những kỹ thuật sinh học phân tử đã bổ sung thêm các chi Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus, Globicatella, Lactococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella Chi Lactobacillus, Carnobacterium và một số dòng của chi Weissella có tế bào hình que và các chi còn lại dạng cầu (Hình 1.9) (Jin et al., 2009) Ngoài ra, có

một số vi khuẩn Gram dương, có khả năng sản sinh acid lactic thuộc chi

Microbacterium, Propionibacterium (Sneath, 2001) và Bifidobacterium (Gibson and Fuller, 2000; Holzapfel et al., 2001), cũng được giới thiệu vào

nhóm LAB (Hình 1.10)

Hình 1.9: Vi khuẩn Lactobacillus salivarius (Sanhueza et al., 2015)

Hình 1.10: Cây phát sinh loài của LAB (Holzapfel et al., 2001)

Tuy nhiên, sự phân loại chỉ dựa vào đặc điểm hình thái, sinh hóa đã gây

ra nhiều tranh cãi: nếu phân loại LAB theo phương pháp truyền thống là dựa vào hình thái, quá trình lên men, dạng acid lactic tạo thành, nhiệt độ phát triển,… của một số đơn vị phân loại thì khi phân tích di truyền trên trình tự gen 16S rRNA phát hiện một số loại không thể hiện mối quan hệ phát sinh loài

(Holzapfel et al., 2001), nếu phân loại LAB dựa vào đặc tính sinh lý, sinh hóa,

hình thái và kết hợp với phân tích trình tự gen trên 16S rRNA giúp phát hiện

thêm nhiều loài LAB có từ các nguồn gốc khác nhau (Huili et al., 2011) Từ

đó, phân tích trình tự rRNA đang trở thành một công cụ trợ giúp quan trọng trong việc phân loại các LAB, cũng như việc minh chứng cho những mô tả về một chi mới (König and Fröhlich, 2009)

Dựa vào quá trình lên men, LAB được chia thành hai nhóm: lên men đồng hình và lên men dị hình

- LAB lên men đồng hình (homofermentation): lên men một phân tử

glucose trong điều kiện thiếu oxy bằng con đường Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) tạo ra sản phẩm cuối cùng là hai phân tử acid lactic Các giống LAB

đại diện như: Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, và Lactobacillus nhóm I)

- LAB lên men dị hình (heterofermentation): lên men một phân tử

glucose bằng con đường pentose phosphat tạo sản phẩm cuối cùng là một phân

tử acid lactic và một trong các sản phẩm khác như: CO2; ethanol; acid acetic

và một số sản phẩm khác Các giống đại diện cho nhóm LAB lên men dị

hình như: Leuconostoc; Oenococcus; Weissella và Lactobacillus nhóm III (L brevis, L buchneri, L fermentum, L reuteri).

1.4.2 Những ứng dụng của vi khuẩn lactic trong y học

Vi khuẩn lactic được xem là vi khuẩn có lợi và đã được ứng dụng phổ biến trong các lĩnh vực như chăn nuôi, thủy sản, bảo quản và chế biến thực phẩm qua nhiều thời kỳ của lịch sử Trong vài thế kỷ gần đây, LAB được ứng dụng rộng rãi trong y học Tác dụng có lợi của LAB đã được đề xuất bởi Metchnikoff, là một nhà khoa học Nga Ông cho rằng tuổi thọ của người dân ở bán đảo Balkan được kéo dài có thể là do họ ăn nhiều các sản phẩm sữa lên

men (Hoves et al., 1999) LAB mang lại lợi ích cho người ở nhiều khía cạnh

như: phòng chống tiêu chảy, cải thiện sự dung nạp lactose, kích thích miễn dịch, phòng chống dị ứng, giảm tỷ lệ mắc ung thư ruột kết, cải thiện những bệnh có liên quan đến tim mạch,…

1.4.2.1 Tác động trên hệ tiêu hóa và kích thích miễn dịch

Hệ tiêu hóa của người có khoảng 10 tỷ vi khuẩn thuộc 500 loài cùng tồn

tại, trong đó bao gồm cả LAB (Masood et al., 2011) Vì thế, việc giữ cân bằng

hệ vi sinh vật trong hệ thống tiêu hóa là rất quan trọng Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng hạn chế các bệnh có liên quan đến đường tiêu hóa của LAB như:

- Đối với bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ nhỏ do nhiễm rotavirus có thể sử dụng

Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus casei subsp casei strain GG giúp

trẻ phục hồi nhanh hơn, đồng thời kích thích hệ miễn dịch tạo ra kháng thể

như IgG, IgM ngưng kết rotavirus (Kaila et al., 1992; Shornikova et al., 1997; Bernaola et al., 2010)

- Bệnh ung thư ruột kết: việc sử dụng chế phẩm sinh học có chứa

Lactobacillus hoặc Bifidobacterium thường xuyên có thể ức chế nhóm vi

khuẩn có trong ruột sản xuất các enzym β-glucornidase, nitroreductase và azoreductase liên quan đến ung thư ruột kết và giảm sản sinh các yếu tố gây

viêm giúp giảm tỷ lệ ung thư ruột kết (Holzapfel et al., 2001; Liong et al., 2008; Shi et al., 2016) Tuy cơ chế hoạt động ức chế ung thư của chế phẩm

sinh học chưa được xác định chính xác nhưng có thể thực hiện theo các con

đường (Holzapfel et al., 2001; Huili et al., 2011):

- Ức chế hoặc loại bỏ chất gây ung thư

- Ức chế sự phát triển của nhóm vi khuẩn sinh enzym xúc tác phản ứng hình thành các chất gây ung thư

- Thay đổi pH đường ruột làm thay đổi hoạt động cũng nhưng mật số của

hệ vi sinh vật đường ruột

- Kích thích sự vận động của trực tràng để đào thải nhanh các chất thải

- Kích thích hệ miễn dịch

1.4.2.2 Giảm cholesterol

Nhiều loài LAB có khả năng làm giảm cholesterol như: Streptococcus HJS-1 làm giảm 57%; Lactobacillus HJL-37 làm giảm 64,4% và Bifidobacterium HJB -4 làm giảm 58,8% khi bổ sung cholesterol hòa tan vào trong môi trường nuôi MRS (Hyeong-Jun et al., 2004) L brevishas được

phân lập từ sữa lên men có khả năng làm giảm cholesterol đến 80% trong 24

giờ (Lavanya et al., 2011) hay các dòng vi khuẩn Lactobacillus được phân lập

từ phân của trẻ đang bú mẹ, có khả năng làm giảm cholesterol trong huyết thanh từ 10-33,34% (Hoàng Quốc Kháng và Phạm Thị Lan Thanh, 2012)

1.4.2.3 Phòng chống dị ứng

Dị ứng là một phản ứng quá mức của hệ thống miễn dịch khi cơ thể tiếp xúc với những chất lạ Dị ứng rất phổ biến trên toàn thế giới, để giảm bớt tỷ lệ người bị dị ứng có nhiều phương pháp điều trị đã đề cập và một trong những phương pháp là sử dụng chế phẩm sinh học hay probiotic Chế phẩm sinh học

là nhóm LAB sống có khả năng điều hòa miễn dịch và an toàn khi sử dụng,

đồng thời cũng có khả năng phòng ngừa và điều trị nhiều bệnh như dị ứng

(Sobczak et al., 2014; Wioletta et al., 2014)

Dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum phân lập từ kim chi, có khả năng

làm giảm hen suyễn trên mô hình chuột thí nghiệm khi bị kích thích bởi việc tiêm ovalbumin (OVA - là chất gây dị ứng), đồng thời trong máu những con

chuột có sử dụng L plantarum có nồng độ IL-4 và IL – 13 thấp hơn những chuột đối chứng (Hong et al., 2008) Một nghiên cứu chống dị ứng phấn hoa thông liễu của Yonekura et al (2009) với việc sử dụng L paracasei KW3110

hàng ngày trước 1 tháng khi mùa ra hoa của cây đến và kéo dài trong 3 tháng, cho thấy các triệu chứng về bệnh viêm mũi giảm, phân tích huyết thanh cho

thấy lượng bạch cầu ái toan tăng lên (Yonekura et al., 2009)

1.4.3 Tiềm năng ứng dụng vi khuẩn lactic trong chăm sóc da

LAB đã được con người sử dụng từ rất lâu qua các sản phẩm lên men truyền thống như: rau, quả muối chua, các sản phẩm lên men từ thịt và sữa… Ngày nay vai trò của LAB càng trở nên quan trọng hơn trong việc mang lại lợi ích cho sức khỏe của con người Ngoài các ứng dụng trên, LAB có thể ứng dụng để chăm sóc và bảo vệ da thông qua các đặc tính được chứng minh sau

1.4.3.1 Kích thích tăng miễn dịch của ký chủ

Interleukin 10 (IL-10) được sinh ra từ tế bào mast có vai trò hạn chế sự xâm nhập của bạch cầu, các yếu tố viêm và tổn thương mô có liên quan đến phản ứng miễn dịch bẩm sinh hoặc có thể làm tổn thương da (Grimbaldeston

et al., 2007) Khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53.103 ) vào

chế độ ăn hàng ngày của trẻ ở độ tuổi trung bình 21 tháng tuổi bị viêm da dị ứng với liều 2x1010 CFU/g mỗi ngày và kéo dài 4 tuần thấy nồng độ IL-10

trong huyết thanh tăng lên đáng kể (Pessi et al., 2000) Sự hiện diện của IL-10

trong huyết thanh đã chứng minh được vai trò kích thích miễn dịch chống

viêm của Lactobacillus rhamnosus

Qua nghiên cứu về sự tương tác của 3 dòng vi khuẩn Lactobacillus với

tế bào gai (MDCs – Myeloid dendritic cell) của người, cho thấy Lactobacillus

được nhận diện bởi các vị trí HLA-DR, CD83, CD40, CD80 và CD86 của MDCs và kích thích MDCs tăng sản xuất IL-12 và IL-18 Sự hiện diện của IL-12 và IL-18 kích thích tế bào Th1 sản sinh IFN-γ (interferon gamma) nhưng không sản xuất IL-4 và IL-13 đây là những yếu tố gây viêm dị ứng

(Mohamadzadeh et al., 2005) Interleukin 4 (IL-4) giảm và tỷ lệ IFN-γ/IL-4

trong huyết thanh của chuột thí nghiệm tăng đáng kể, khi cho chuột được kích thích dị ứng bằng OVA với liều lượng từ 2-6 g/chuột uống chế phẩm sinh

học có nguồn gốc từ LAB sau 4 tuần (Tsai et al., 2012) Những kết quả này

nhấn mạnh vai trò quan trọng của LAB đối với việc điều chỉnh chức năng miễn dịch của đại thực bào (DCs - Macrophage Dendritic Cells) và cho thấy rằng một số chủng có thể là nguồn nguyên liệu điều chế vắc xin, bằng cách thúc đẩy sự phát triển của DCs hoặc điều chỉnh phản ứng của nhóm tế bào T

cụ thể là Th1 và Tc1

Một nghiên cứu chống viêm da dị ứng trên chuột thí nghiệm của Kim et

al (2012), khi cho chuột viêm da dị ứng sử dụng Platycodon grandiflorum lên men bởi Lactobacillus plantarum trong 10 tuần Kết quả cho thấy IL-4 và

IgG1 trong huyết thanh giảm, nồng độ IL-12p40, Immuno Globulin G 2a

(IgG2a) tăng (Kim et al., 2012) Khi cho trẻ từ 1 đến 3 tuổi viêm da dị ứng uống L plantarum CJLP133 với liều lượng 0,5x1010 CFU/mL trong 12 tuần,

cho thấy lượng IL-4 trong huyết thanh giảm đáng kể (Han et al., 2012) Cơ chế kích thích miễn dịch chống dị ứng được thể hiện như sau: LAB được đưa

vào hệ tiêu hóa khi đến ruột, các tế bào vi khuẩn LAB tiếp xúc với niêm mạc ruột và DCs hoặc bị tế bào đuôi gai bắt lấy, sau đó DCs sản sinh IL-12 là yếu

tố báo hiệu của viêm nội bào, IL-12 kích thích tế bào Th1 (tế bào T-help) sản xuất IFN-γ (Interferon gamma) đây là yếu tố miễn dịch bẩm sinh chống lại sự nhiễm khuẩn nội bào, đồng thời cũng là yếu tố kiểm soát khối u Sự sản sinh IFN-γ của Th1 đã ức chế sự sản sinh IL-4 của Th2 đây là yếu tố biểu hiện dị ứng (Hình 1.11) (Patrick, 2012)

Hình 1.11: Sơ đồ kích thích miễn dịch của LAB (Patrick, 2012)

1.4.3.2 Khả năng ức chế vi khuẩn khác

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có lợi, được ứng dụng nhiều trong ngành chế biến thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Trong quá trình trao đổi chất, LAB có khả năng ức chế vi sinh vật khác bằng con đường cạnh tranh dinh dưỡng và sản sinh các sản phẩm ức chế như: acid lactic, acid acetic,

peroxid hydrogen, carbon dioxid, bacteriocin, (Kholia et al., 2017)

Theo Chen et al (2006), acid lactic có khả năng ức chế P acnes ở nồng

độ 60 mg/mL (Chen et al., 2006) Ngoài ra chất kháng khuẩn bacteriocin được

ly trích từ dịch nuôi của LAB có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Gram âm và Gram dương như Enterococcus faecalis 103907 CIP, Bacillus cereus 13569 LMG, Staphylococcus aureus ATCC 25293, Escherichia coli

105182 CIP, K pneumoniae, P aeruginosa và Streptococcus sp (Savadogo et al., 2004; Mallesha et al., 2010; Shafighi, 2012) Bên cạnh đó, Kang et al (2012) cũng chứng minh mật số của P acnes giảm xuống còn 1.0×102

CFU/ml (đối chứng là 1,3x108 CFU/ml) và Staphylococus epidermidis còn

5x103 CFU/mL (đối chứng là 1,5x107 CFU/mL) sau 24 giờ khi nuôi chung với

Lactobacillus reuteri KCTC 3679 Sự ức chế này là do hoạt động của các hợp

chất được sinh ra trong quá trình phát triển của LAB như: H2O2, các acid hữu

cơ và bacteriocin (Kang et al., 2012)

khỏi tia cực tím (UV) bằng cách hấp thụ tia UV và loại bỏ các loài oxy hoạt

tính (ROS) (Brenner and Hearing 2008; Shen et al., 2012) Việc sản xuất

melanin là một hệ thống phòng thủ quan trọng của da nhưng tích tụ quá nhiều melanin gây ra tăng rối loạn sắc tố như tàn nhang, những đốm sắc tố sậm màu

(lentigo) và nám (Li et al., 2003; Ahn et al., 2006) Theo Chen và cs (2006)

acid lactic và các peptid trong nước sữa kefir (kefir whey) lên men có thể làm sáng da thông qua việc ức chế sự tổng hợp và ngăn cản hoạt động của

tyrosinase làm giảm melanin (Chen et al., 2006) Lr-SCS (Lactobacillus rhamnosus Spent Culture Supernatant) là dịch ly tâm từ dịch nuôi của Lactobacillus rhamnosus có khả năng chống oxy hóa thông qua thí nghiệm

khử gốc tự do của DPPH, ức chế tổng hợp tyrosinase và giữ ẩm Khả năng giữ

ẩm của Lr-SCS tương đương với glycerin ở nộng độ 10% (Tsai et al., 2013) Acid lipoteichoic được phân lập từ Lactobacillus plantarum có tác dụng ức chế hoạt động của enzym tyrosinase (Kim et al., 2015)

Ngoài việc ngăn cản sự hình thành melanin, Lactobacillus plantarum còn

có tác dụng chống lão hóa da và tăng tính đàn hồi Theo Chan et al (2013), sau khi sử dụng Lactobacillus plantarum HY7714 liên tục trong vòng 12 tuần

với liều 1×1010 CFU/ngày làm giảm quá trình lão hóa và tăng tính đàn hồi của

da (Chan et al., 2013; Lee et al., 2015) Miyazaki et al (2004) nghiên cứu dịch chiết từ sữa đậu nành lên men bởi nhóm vi khuẩn Bifidobacterium cho

thấy có chứa genistein, daidzein và acid hyaluronic (HA) có khả năng làm

hồi phục tính đàn hồi của da (Miyazaki et al., 2004)

Qua những kết quả nghiên cứu trên cho thấy LAB và các sản phẩm sinh

ra trong quá trình phát triển của LAB có thể ứng dụng trong việc bào chế mỹ phẩm có tác dụng chăm sóc da với các tác dụng như: ức chế vi khuẩn, kích thích hoạt động miễn dịch, khử gốc tự do, làm trắng da, tăng tính đàn hồi, chậm quá trình lão hóa và giữ ẩm cho da

1.5 Sơ lược về Nha đam và những ứng dụng trong mỹ phẩm

1.5.1 Sơ lược về đặc điểm sinh học của Nha đam

Nha đam hay Lô hội, Lông tu,… có tên khoa học là Aloe vera thuộc:

Giới: Plantae

Bộ: Asparagales

Họ: Asphodelaceae hay Xanthorrhoeaceae

Chi: Aloe Loài: A vera

Nha đam là cây lâu năm phát triển khắp các vùng ôn đới và nhiệt đới, có thể có nguồn gốc ở Bắc Phi hoặc vùng Nile ở Sudan Chi Aloe có hơn 400 loài

khác nhau và loài Aloe barbadensis Miller (Nha đam) được xem là có hoạt tính sinh học cao nhất (Yagi et al., 1998; Who, 1999) Gel từ thịt lá Nha đam

có chứa 99% là nước và các hợp chất hữu cơ khác gồm: phenolic như: emodin aloe, aloin, aloesin; các acid hữu cơ như: saponin và terpenoid; các polysaccharid như: arabinan, glactan, galactogalacturan, glucogalactomannan,

acid glucuronic và nhiều acid amin, khoáng, vitamin (Tungala et al., 2011;

Ahmeda and Roga, 2013; Sanghi, 2015) Với những thành phần này, gel Nha đam được dùng để điều tiết sự tiết chất nhờn, giữ ẩm, làm chậm quá trình lão hóa da, làm mát và kháng khuẩn, chống nấm nên có thể điều trị các bệnh nhiễm trùng da ở thể nhẹ như: mụn nhọt; u nang da lành tính; giảm viêm;

Vì thế, Nha đam được ứng dụng phổ biến trong ngành công nghiệp mỹ phẩm

(Tudose et al., 2009; Tungala et al., 2011; Nandal and Bhardway, 2012;

Sanghi, 2015)

1.5.2 Những ứng dụng của Nha đam trong mỹ phẩm

Năm 2012, Pounikar et al đã xây dựng thành công công thức bào chế

mỹ phẩm thảo dược từ gel Nha đam có tác dụng làm sạch, làm mềm da và cải thiện cấu trúc da gồm các thành phần: gel Nha đam; acacia, hydroxy propyl

methyl cellulose (HPMC), carbopol 934, glycerin, acid tartaric, potassium

sorbat và sodium benzoat (Pounikar et al., 2012)

Izawa and Sone (2014) đã chứng minh rằng dịch trích từ gel Nha đam

lên men bằng vi khuẩn Lactocbacilus plantarum có tác dụng dưỡng ẩm làn da

gấp 4 lần so với dịch trích Nha đam không lên men (Izawa and Sone, 2014)

Tanaka et al (2015), bằng thử nghiệm sử dụng kem Nha đam trên những

phụ nữ Nhật Bản ở tuổi 40 thấy rằng, nếu sử dụng hàng ngày giúp làm giảm

nếp nhăn trên mặt, kích thích sản sinh collagen và acid hyaluronic (Tanaka et al., 2015)

Qua sự phân tích các đặc tính dược liệu và tổng hợp các công trình

nghiên cứu ứng dụng của Nha đam, Cuvas-Limón et al (2015) đã kết luận

rằng gel Nha đam có thể sử dụng làm chất nền (prebiotic) để sản xuất

probiotic (Cuvas-Limón et al., 2016) Một sản phẩm Nha đam được lên men bởi Lactocbacilus plantarum HM218749.1 có tác dụng chống oxy hóa, làm

chậm quá trình lão hóa, giảm sản xuất IL-1β, TNF-α và IL-6, ức chế sự phát

triển của vi khuẩn S aureus và P acnes đã được Jiang et al (2016) chứng minh (Jiang et al., 2016)

1.6 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn

1.6.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Khi nghiên cứu về một loại vi khuẩn nào đó, thường phải quan tâm đến các đặc điểm khuẩn lạc, hình thái tế bào, đặc điểm sinh hóa và điều kiện sinh thái Tuy nhiên, vi khuẩn tồn tại trong môi trường rất hiếm khi chỉ có một loài duy nhất mà tồn tại theo một hệ vi sinh vật Vì thế, cần phải có phương pháp

để tách chúng ra khỏi các loài khác có trong môi trường sống đó (Benson, 2001)

1.6.1.1 Một số phương pháp phân lập vi khuẩn

Phân lập là kỹ thuật tách rời vi khuẩn ra khỏi quần thể ban đầu để có vi khuẩn thuần khiết Các phương pháp phổ biến để phân lập vi khuẩn gồm phương pháp hộp ria (streak plate), hộp trải (spread plate) hoặc hộp đổ (pour plate), phương pháp loạt ống agar mềm (Trần Linh Thước, 2005)

+ Phương pháp hộp ria: là phương pháp pha loãng mẫu, trong đó hỗn hợp vi sinh vật được trải và ria trên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri sao cho các tế bào tách biệt nhau Sau khi ủ mỗi tế bào sẽ tăng trưởng thành khuẩn lạc đơn riêng biệt Khuẩn lạc đơn này là sinh khối từ các tế bào hậu thế của một tế bào ban đầu (Trần Linh Thước, 2005)

+ Phương pháp hộp trải hoặc hộp đổ: là phương pháp pha loãng liên tiếp bậc 10 dịch chứa vi sinh vật thành các bậc pha loãng khác nhau và chuyển 0,1

mL dịch mẫu ở các bậc phía sau lên bề mặt đĩa môi trường rắn (hộp trải) hoặc

1 mL dịch mẫu vào môi trường rắn đung chảy (hộp đổ) Mỗi tế bào riêng biệt

sẽ tăng trưởng thành khuẩn lạc đơn sau thời ủ (Trần Linh Thước, 2005)

+ Phương pháp loạt ống agar mềm: là phương pháp pha loãng liên tiếp một dung tích dịch chứa chủng trong các ống môi trường agar mềm và sau đó chuyển lên bề mặt môi trường nền trên đĩa petri Mỗi tế bào riêng biệt ở những ống pha loãng phía sau phát triển thành khuẩn lạc đơn (Trần Linh Thước, 2005)

Các phương pháp trên thường chọn môi trường phân lập phù hợp với nhóm vi khuẩn nghiên cứu Sau khi có được khuẩn lạc đơn, tùy từng nhóm vi khuẩn nghiên cứu sẽ có điểm đặc trưng riêng để tuyển chọn và tiếp tục phân lập để tạo thành dòng vi khuẩn thuần khiết bằng các kỹ thuật như cấy ria chữ

T, cấy ria bốn gốc, cấy ria tia hoặc cấy ria liên tục (Trần Linh Thước, 2005)

1.6.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm vi khuẩn có các đặc tính như: Gram dương; tế bào có hình cầu hoặc que; không hình thành bào tử; phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí; có khả năng chuyển hóa carbohydrate thành acid lactic Ngoài acid lactic là sản phẩm chính của quá trình lên men, LAB còn có khả năng sinh các hợp chất khác như: acid acetic, acid propionic, rượu, bacteriocin,….có khả năng chống lại các nhóm vi sinh vật gây hại khác như vi khuẩn, nấm ((Listeria monocytogens, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Candida albicans, ) LAB thường có nguồn gốc từ xác bã thực vật, phân người và động vật, hệ thống tiêu hóa (miệng, ruột) của người và động vật, các sản phẩm

lên men truyền thống từ thực vật hay sữa (Gupta et al., 2018)

Quá trình phân lập LAB sử dụng các phương pháp hộp đỗ, hộp trải, hộp ria và các kỹ thuật cấy ria Môi trường nuôi cấy LAB thường được sử dụng là MRS cho các nhóm Lactobacilli và Bifidobactaria, môi trường Strep base cho nhóm Streptococci và Brain-heart cho nhóm Enterococci Các môi trường này

có thể bổ sung thêm một số hoạt chất tùy thuộc vào việc tuyển chọn chủng nghiên cứu như cycloheximide, cystein, Điều kiện nuôi cấy thường có nhiệt

độ từ 37-40 oC, khí trường gồm CO2 khoảng 3-10%, N2 và H2 khoảng 90% (Lee and Salminen, 2009)

Bên cạnh những hoạt chất bổ sung vào môi trường phân lập LAB, thì CaCO3 cũng được bổ sung vào khoảng 1% với mục đích phát hiện vi khuẩn có

khả năng sinh acid lactic Trên môi trường MRS rắn bổ sung CaCO3 có màu vàng đục, khi LAB phát triển sinh acid lactic sẽ làm trong môi trường xung

quanh khuẩn lạc (Monika et al., 2017) Từ đó việc tuyển chọn khuẩn lạc của

LAB sẽ dễ dàng hơn

1.6.2 Định danh vi khuẩn bằng các kỹ thuật truyền thống

Nhận diện vi khuẩn theo phương pháp truyền thống là dựa vào các đặc tính như hình thái, sinh lý, sinh hóa Các đặc tính này được khảo sát qua các xét nghiệm nhuộm Gram, nhuộm bào tử, khảo sát khả năng di động, nhu cầu

dinh dưỡng, khả năng sinh các sản phẩm phụ, (Nguyễn Lân Dũng và cs,

2012)

1.6.2.1 Khảo sát hình thái vi khuẩn qua nhuộm Gram

Nhuộm Gram là một phương pháp giúp phân chia vi khuẩn thành hai nhóm Gram dương và Gram âm, được phát hiện bởi nhà khoa học người Đan

Mạch Hans Christian Joachim Gram vào năm 1884 (Yunuasa et al., 2014)

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi khi định loài vi sinh vật (Nguyễn

Lân Dũng và cs, 2012)

Vi khuẩn Gram âm có cấu trúc vách gồm peptidolycan chiếm 5-20%, lipid khoảng 20% và hàm lượng protein cao Lớp màng lipid kép sẽ bị hòa tan bởi cồn, để lộ lớp peptidolycan mỏng bắt giữ thuốc nhuộm màu tìm sẽ bị trôi

và sẽ bắt thuốc nhuộm màu đỏ safranin sau khi nhuộm bổ sung Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidolycan dày chiếm 50-90% không bị khử màu tím bởi cồn, do cồn làm mất nước và lớp này co cụm lại không làm trôi màu tím

(Yunuasa et al., 2014) Sau các bước nhuộm vi khuẩn được quan sát dưới

kính hiển vi để diện màu Gram và hình thái

1.6.2.2 Khảo sát đặc tính sinh hóa

Xét nghiệm sinh hóa là dựa vào những đặc tính sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn Tùy từng loại vi khuẩn mà có những xét nghiệm sinh hóa riêng Theo

Nguyễn Lân Dũng và cs (2012) các phản ứng sinh hóa thường sử dụng gồm:

thử nghiệm catalase, oxydase, indol, coagulase, nitrate hóa, gelatin hóa, hiếu

khí và kỵ khí, lên men đường (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2012)

a Xét nghiệm catalase

Catalase là enzym có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện Catalase thủy phân H2O2 thành oxy và nước, ngăn cản sự tích tụ phân

tử có độc tính trong tế bào (Trần Linh Thước, 2005) Để phát hiện vi khuẩn có enzym catalase bằng cách cấy chuyển vài khuẩn lạc vào giọt H2O2 và quan

sát Nếu thấy giọt H2O2 có bong bóng xuất hiện điều đó có nghĩa là vi khuẩn

có enzyme catalase, gọi phản ứng dương tính (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2012)

b Xét nghiệm oxydase

Xét nghiệm oxydase là phương pháp dùng để xác định sự hiện diện của cytochrom C oxydase Cytochrom C oxydase là chất nhận điện tử sau cùng của chuỗi truyền điện tử trong hô hấp hiếu khí Cytochrom C oxydase có trong những vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện Để nhận diện cytochrom C oxydase phải nhờ vào thuốc thử p-phenylenediamin Nếu trong tế bào vi khuẩn có cytochrom C khi tiếp xúc với thuốc thử cytochrom C oxy hóa thuốc thử thành indolphenol có màu xanh dương (Trần Linh Thước, 2005)

c Xét nghiệm indol

Enzym tryptophanase có vai trò xúc tác phản ứng loại nhóm amin tạo thành indol Khi trong môi trường nuôi vi khuẩn có tryptophan, vi khuẩn có enzym trypyophanase sẽ oxy hóa tryptophan tạo thành indol, indol được nhận biện bằng thuốc thử có chứa p-dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) Nhân pyrrol của indol có chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMABA tạo nên một phức hợp quion có màu đỏ (Trần Linh Thước, 2005)

d Xét nghiệm nitrate hóa

Xét nghiệm này giúp nhận diện enzym nitratase có trong vi khuẩn kỵ khí, biến dưỡng năng lượng trong điều kiện thiếu oxy Enzym nitratase có thể khử nitrat thành NO2-, NH3, NO hay N2 Để nhận biết vi khuẩn có nitratase bằng cách cấy vi khuẩn vào trong môi trường có chứa NO3- và ủ trong điều kiện kỵ khí Nếu môi trường chuyển đục sau thời gian ủ, vi khuẩn dương tính (Nguyễn

Lân Dũng và cs, 2012)

e Xét nghiệm gelatin hóa

Enzym gelatinase là một enzym ngoại bào hiện diện ở một số vi khuẩn,

có khả năng thủy phân gelatin thành polypeptid và các acid amin Để nhận biết

vi khuẩn có gelatinase bằng cấy bổ sung gelatin vào trong môi trường nuôi Gelatin sẽ làm đông đặc môi trường khi vi khuẩn có gelatinase sẽ làm môi trường hóa lỏng (Trần Linh Thước, 2005)

d Xét nghiệm coagulase

Enzym coagulase do một số nhóm vi khuẩn đặc biệt là nhóm

Staphylococcus tiết ra làm đông đặc các thành phần của huyết tương Để nhận

biết vi khuẩn có enzym này không bằng cách cấy chuyển vài khuẩn lạc vào