Luận văn thạc sĩ nghiên cứu khả năng tồn tại và nảy mầm của bào tử bacillus aquimaris sh6 trong ruột tôm thẻ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Nguyễn Thị Hương NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỒN TẠI VÀ NẢY MẦM CỦA BÀO TỬ Bacillus aquimaris SH6 TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA BÀO TỬ L

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Hương

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỒN TẠI VÀ NẢY MẦM CỦA

BÀO TỬ Bacillus aquimaris SH6 TRONG RUỘT TÔM THẺ

CHÂN TRẮNG VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA BÀO TỬ LÊN MỘT

SỐ CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH Ở TÔM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Hương

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỒN TẠI VÀ NẢY MẦM CỦA

BÀO TỬ Bacillus aquimaris SH6 TRONG RUỘT TÔM THẺ

CHÂN TRẮNG VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA BÀO TỬ LÊN MỘT

SỐ CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH Ở TÔM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Phạm Thị Thu Hường PSG.TS Nguyễn Thị Vân Anh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi luôn nhận được rất nhiều

sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình từ phía thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thu Hường và PGS TS Nguyễn Thị Vân Anh đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều

kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ, tập thể nhóm nghiên cứu và các bạn sinh viên tại phòng Sinh học Nano và Ứng dụng, phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym & Protein của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, những người đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ; các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học và các thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí của Quỹ TWAS (Viện Hàn lâm Khoa học Thế giới), đề tài mã số 16-549 RG/BIO/AS_G - FR3240293311 do PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh làm chủ nhiệm

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè

đã luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên Nguyễn Thị Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH 1

DANH MỤC CÁC BẢNG 3

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1.Tôm thẻ chân trắng 7

1.2.Probiotic và vai trò của chúng trong nuôi trồng thủy sản 8

1.2.1.Giới thiệu chung về probiotic 8

1.2.2.Các nghiên cứu về vai trò và ứng dụng của Bacillus probiotic trong nuôi tôm 9

1.3.Nghiên cứu về carotenoid và vi khuẩn sinh carotenoid 11

1.3.1.Carotenoid 11

1.3.2.Vi khuẩn sinh carotenoid 12

1.3.3.Astaxanthin 12

1.4.Hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng 13

1.5 Bào tử B aquimaris SH6 và tác dụng probiotic của chúng đối với tôm thẻ chân trắng 15

1.5.1.Thực trạng nghiên cứu vai trò probiotic của bào từ B aquimaris 15

1.5.2.Khả năng nảy mầm của bào tử B aquimaris 16

1.6.Đặt vấn đề nghiên cứu và thiét kế thí nghiệm 17

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1.Nguyên liệu 19

2.1.1.Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) 19

2.1.2.Bào tử B aquimaris SH6 19

2.1.3.Thức ăn cho tôm 20

2.1.4.Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 20

2.1.5.Hóa chất 21

2.1.6.Dụng cụ và thiết bị 23

2.2.Phương pháp 23

2.2.1.Chuẩn bị bào tử B aquimaris SH6 và tách chiết carotenoid 23

2.2.2.Chuẩn bị thức ăn cho tôm 26

2.2.3.Bố trí các nhóm thi ghiệm và quy trình nuôi tôm 26

2.2.4.Xác định số lượng B aquimaris SH6 và tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm 28

2.2.5 Đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm 29

2.2.6 Đánh giá các chỉ số miễn dịch của tôm 34

2.2.7 Xác định tốc độ tăng trưởng, nồng độ astaxanthin và màu sắc của tôm 38

2.2.8.Phân tích dữ liệu 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1.Khả năng lưu trú của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng 40

3.2.Thiết kế mồi và probe đặc hiệu cho Real-time PCR gen BaqA-SH6 43

3.3.Khả năng nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng 45

3.4.Vai trò của bào tử B aquimaris SH6 trong tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng 48

3.5.Tăng trưởng về trọng lượng của tôm khi ăn bào tử B aquimaris SH6 53

3.6.Nồng độ astaxanthin và màu sắc của tôm 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

Kết luận 58 Kiến nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Bào tử B aquimaris SH6 19

Hình 2.2: Thức ăn cho tôm thẻ chân trắng 20

Hình 2.3: Đường chuẩn nồng độ Astaxanthin 25

Hình 2.4 : Mô hình bể nuôi tôm trong quy mô phòng thí nghiệm 27

Hình 2.5: Bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm 28

Hình 2.6: Trình tự tương đồng đoạn gen BaqA giữa chủng B aquimaris MKSC 6.2 và một số chủng Anoxybacillus spp 31

Hình 2.7: Mô hình vector biến nạp pTOP TA V2 (3807 bp) [80] 32

Hình 3.1: Số lượng B aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng sau 28 ngày (CFU × 105/g ruột tôm) 40

Hình 3.2: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm thẻ chân trắng sau 28 ngày (CFU × 106/g ruột tôm) *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 41

Hình 3.3: Thành phần loài trong quần xã vi sinh vật ruột tôm ở ngày 28 ở các nhóm thí nghiệm 43

Hình 3.4: Điện di gel biến tính sản phẩm PCR mồi M13 để sàng lọc khuẩn lạc mang gen tái tổ hợp 44

Hình 3.5: Trình tự BaqA-SH6, mồi và probe đặc hiệu 44

Hình 3.6: Điện di gel electrophoresis sản phẩm PCR nhân đoạn gen BaqA-SH6 45

Hình 3.7: Đánh giá sự nảy mầm trong ruột tôm Đường tín hiệu huỳnh quang FAM của phản ứng Real-time PCR nhân đoạn gen đặc hiệu BaqA-SH6 trên một số mẫu đại diện: 0 h, 4 h, 24 h, 7 d và các điểm chuẩn 100%, 20% 47

Hình 3.8: Tỷ lệ nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng (%) 48

Hình 3.9: Số phận của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng 48

Hình 3.10: Chỉ số miễn dịch ở tôm tại ngày 0 và ngày 28 A - Mức độ biểu hiện mRNA Rho B - Mức độ biểu hiện mRNA Ran *P<0,05, **P<0,01 49

Hình 3.11: Chỉ số miễn dịch ở tôm tại ngày 0 và ngày 28 A - Hoạt tính enzyme PO B

- Hoạt tính enzyme SOD *P<0,05; **P<0,01 52

Hình 3.12: Tốc độ tăng trưởng (%/ngày) của tôm thẻ chân trắng ở các nhóm thí

nghiệm khác nhau Giá trị trung bình với cỡ mẫu n = 20 **P < 0,01 .54

Hình 3.13: Nồng độ astaxanthin của tôm tại thời điểm 28 D *P<0,05 55

Hình 3.14: Màu sắc của tôm sau khi luộc tại thời điểm 28 D 56

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Điều kiện của PCR nhân đoạn gen BaqA 31

Bảng 2.2: Chu trình phản ứng Real-time PCR, TaqMan probe 33 Bảng 2.3: Trình tự các cặp mồi và probe sử dụng trong nghiên cứu 35

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Forward (Mồi xuôi) Gram

Hecta Hour (giờ) Lit

Luria Bertani L-3-4-dyhydroxyphenylalanine Mililit

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp polymere) Phenoloxidase

Ribonucleic acid Reverve (Mồi ngược) Reverse Transcriptase Superoxidase dimutase Thể tích

MỞ ĐẦU

Với đặc thù là một quốc gia có bờ biển dài, thủy sản đã và đang được chú trọng đẩy mạnh phát triển và được xem là một trong các thành phần kinh tế mũi nhọn của Việt Nam Trong đó, tôm thẻ chân trắng là một đối tượng được quan tâm hàng đầu bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế phục vụ xuất khẩu của nó Theo Báo cáo thực hiện

kế hoạch năm 2017, nhiệm vụ, giải pháp chủ yếu thực hiện kế hoạch năm 2018 của Tổng cục Thủy sản - Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, sản lượng nuôi trồng thủy hải sản của nước ta trong năm 2017 đạt con số 3.858 nghìn tấn, trong đó, tôm thẻ chân trắng đạt tới 427 nghìn tấn, chiếm 11.1% tổng sản lượng, tăng 108.5% so với cùng kỳ năm 2016 Tương ứng với kim ngạch xuất khẩu đạt 2.535 triệu USD, tăng 129.5% so với cùng kỳ năm 2016 và chiếm 30.4% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy hải sản của Việt Nam năm 2017 Năm 2018 ghi nhận báo cáo về tổng sản lượng nuôi trồng tôm nước lợ 6 tháng đầu năm đạt 494 nghìn tấn, tăng 10,6% so với cùng kỳ nàm 2017 [1] Những con số kể trên phần nào cho thấy giá trị thương phẩm to lớn và vai trò quan trọng của tôm thẻ chân trắng trong tổng thể nền kinh tế - nông nghiệp nuôi trồng thủy hải sản của Việt Nam Đây cũng chính là lý do khiến tôm thẻ chân trắng đang ngày càng trở thành mối quan tâm hàng đầu trong chiến lược phát triển kinh tế của Nhà nước cũng như từ các nhà khoa học trong những nghiên cứu những biện pháp giúp cải thiện năng suất và chất lượng cũng như hạn chế các tác nhân gây bệnh ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng tôm thẻ chân trắng Trong đó, có hai hướng nghiên cứu liên quan tới sức khoẻ của tôm được nhiều nhà khoa học quan tâm là: (i) tìm ra các vắc xin và các phương pháp phòng bệnh cho tôm thẻ chân trắng như bệnh đốm trắng, gan tuỵ, phân trắng… (ii) phát triển các chế phẩm sinh học, ví dụ như probiotic, để tăng cường sức khoẻ cho tôm thông qua các chỉ số về cân nặng, miễn dịch, dinh dưỡng…

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò của một số chủng vi khuẩn như

Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus plantarum, đối với tôm thẻ

chân trắng, liên quan đến tác dụng tăng trọng lượng, tăng khả năng sống sót và tăng

cường miễn dịch [16, 28] Tuy nhiên, những năm gần đây, khi nhắc đến tôm thẻ chân trắng thì cả nông dân lẫn doanh nghiệp và người tiêu dùng không chỉ quan tâm đến cân nặng và sản lượng mà còn về giá trị dinh dưỡng của tôm Giá trị dinh dưỡng và chất lượng đó của tôm thẻ chân trắng phụ thuộc chủ yếu vào màu sắc và nồng độ các chất chống oxy hóa có trong mô cơ tôm, như: astaxanthin, cantaxanthin, β-carotene, Trong đó, astaxanthin được biết đến là một trong những chỉ thị quan trọng để đánh giá giá trị và chất lượng của tôm [76], astaxanthin cũng giúp tích lũy lượng lớn carotenoid

và phòng ngừa “Hội chứng màu xanh” ở tôm Vì thế, sự tăng trưởng về nồng độ astaxanthin của tôm đang trở thành mối quan tâm rất lớn của các nhà khoa học Trong các công bố gần đây của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano và Ứng dụng,

Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein (PTNTĐCNEP), Bacillus

aquimaris SH6 được biết đến có khả năng tăng hàm lượng astaxanthin, cân nặng và

hoạt tính enzyme PO [48] Do vậy, SH6 hứa hẹn là chủng probiotic đem lại hiệu quả cao khi sử dụng làm thức ăn cho tôm thẻ chân trắng Tuy nhiên, nghiên cứu này chưa

đề cập tới số phận và cơ chế tác dụng của bào tử SH6 trong ruột tôm để phần nào giải thích được các tác dụng có lợi mà SH6 mạng lại cho tôm Ngoài ra, các số lượng chỉ tiêu miễn dịch của tôm trong nghiên cứu này còn hạn chế Vì vậy, chúng tôi tiến hành

“Nghiên cứu khả năng tồn tại và nảy mầm của bào tử Bacillus aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng và ảnh hưởng của bào tử lên một số chỉ tiêu miễn dịch của tôm” với các mục tiêu sau:

 Chứng minh khả năng lưu trú và nẩy mầm của bào tử B aquimaris SH6 trong

ruột tôm thẻ chân trắng, và ảnh hưởng của nó tới sự đa dạng quần xã vi sinh vật trong ruột tôm

 Đánh giá mức độ tăng trưởng của các chỉ số miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng

khi cho ăn bào tử B aquimaris SH6, kèm theo các chỉ số tăng trọng và tăng hàm

lượng astaxanthin ở tôm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tôm thẻ chân trắng

Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) là loài bản địa ở phía đông Thái

Bình Dương, được khai thác chủ yếu làm thực phẩm Nhiều năm gần gây, nuôi tôm thẻ chân trắng trong điều kiện nước lợ phát triển rất mạnh mẽ ở một số quốc gia như Trung Quốc, Đài Loan, Việt Nam,… không chỉ phục vụ nhu cầu thực phẩm trong nước mà còn nhằm phát triển xuất khẩu ra một số nước Châu Âu, Châu Mỹ, … đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người nuôi trồng thủy sản và đóng góp một phần đáng kể cho kinh tế quốc gia

Trên thế giới, trong giai đoạn năm 1980, các nước như Trung Quốc, Equado là các nước nuôi trồng và sản xuất tôm lớn nhất trên thế giới Tuy nhiên, đến nay thì vị trí

đó đã thuộc về bốn nước Đông Á là Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan và Indonesia, chiếm 75% sản lượng tôm toàn cầu Trong đó, đối tượng nuôi chủ lực là tôm thẻ chân trắng

Tại Việt Nam, tôm thẻ chân trắng bắt đầu phát triển mạnh mẽ từ sau năm 2000,

do trước đó nông dân lo ngại việc du nhập tôm thẻ chân trắng sẽ làm lây lan mầm bệnh ảnh hưởng đến đối tượng chủ lực ở giai đoạn đó là tôm sú Các đơn vị đầu tiên nhập tôm thẻ vào nuôi thử nghiệm ở Việt Nam là 3 công ty: Công ty Duyên Hải (Bạc Liêu), Công ty Việt Mỹ (Quảng Ninh) và Công ty Asia Hawai (Phú Yên) Đến nay, tôm thẻ chân trắng đã phát triển nuôi khắp cả nước trong đó chủ yếu là vùng Đồng bằng sông Cửu Long hướng tới mục tiêu đạt diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng là 150.000 ha, sản lượng đạt trên 750.000 tấn và tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu tôm nước lợ là 12 tỷ USD ở năm 2030

Tuy nhiên, sự phát triển nuôi trồng tôm thẻ chân trắng một cách mạnh mẽ như vậy gây ra áp lực lớn đối với môi trường, cung ứng con giống, dịch bệnh, … Thêm vào

đó, khi nuôi trồng tôm thẻ chân trắng hướng chới xuất khẩu đến các thị trường khó tính

như Châu Âu, Châu Mỹ, đòi hỏi sản lượng và chất lượng tôm rất cao Do vậy, đã có nhiều nghiên cứu, sách báo của các nhà khoa học trong nước về việc phát triển kỹ thuật

- công nghệ nuôi tôm thương phẩm, nghiên cứu nâng cao chất lượng tôm giống, sản xuất tôm thẻ chân trắng bố mẹ sạch bệnh,… [3, 5]

Do vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học (probiotic) trong nuôi tôm là điều thiết yếu, hướng tới giải pháp nuôi trồng tôm thẻ chân trắng theo hướng hạn chế sử dụng kháng sinh, an toàn cho môi trường và con người, đồng thời vẫn đảm bảo tốc độ tăng trưởng, khả năng chống chịu bệnh tật, sản lượng và chất lượng tôm

1.2 Probiotic và vai trò của chúng trong nuôi trồng thủy sản

1.2.1 Giới thiệu chung về probiotic

Nghiên cứu về probiotic từ lâu đã và đang nhận được rất nhiều sự quan tâm từ các nhà khoa học trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, với mục đích ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: tăng cường sức khỏe, hỗ trợ quá trình hấp thụ dinh dưỡng ở con người và chăn nuôi gia súc, gia cầm, nuôi trồng thủy sản Probiotic là lựa chọn thay thế cho thuốc kháng sinh để hạn chế tối đa các tác dụng phụ và đem lại nhiều tác dụng có lợi cho vật chủ Ngày nay, probiotic không chỉ dừng lại ở phạm vi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm mà còn được thương mại hóa và phát triển mạnh

mẽ dưới nhiều hình thức khác nhau, trong đó, các sản phẩm được phát triển nhiều nhất

là thực phẩm chức năng cho người và thức ăn chăn nuôi cho gia súc, gia cầm và thủy sản

Probiotic là các chủng vi khuẩn sống mang lại tác dụng có lợi cho vật chủ bởi khả năng cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật có lợi phát triển và ức chế các chủng vi sinh vật có hại cho vật chủ [26] Probiotic

là các chủng vi khuẩn sống, điển hình bởi những tác dụng sau đây :

- Ngăn ngừa nhiễm trùng đường tiêu hóa, ngăn ngừa sự xâm lấn và gây hại của các chủng vi sinh vật gây bệnh [74, 79]

- Tăng cường miễn dịch cho vật chủ [33]

- Tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng, tăng trọng lượng, tăng khả năng sống sót của vật chủ [52]

Đặc điểm nổi bật khi sử dụng probiotic là thân thiện với môi trường và an toàn cho người sử dụng Do đó, probiotic ngày càng được các nhà khoa học quan tâm, với mục đích nghiên cứu sâu hơn về vai trò, công dụng và cơ chế tương tác của chúng với vật chủ Dựa vào đó để đưa ra những kết luận mang tính khoa học, làm cơ sở cho các doanh nghiệp phát triển và thương mại hóa các sản phẩm thức ăn chăn nuôi chứa probiotic

1.2.2 Các nghiên cứu về vai trò và ứng dụng của Bacillus probiotic trong nuôi

tôm

Probiotic dùng trong lĩnh vực thuỷ sản thường được biết đến hầu hết là các

chủng thuộc chi Lactobacillus và Bacillus [18, 31] (ngoại trừ B cereus và B anthracis

là một số loài Bacillus gây bệnh [9, 22]) Một trong những lý do khiến Bacillus sp gần

đây được ứng dụng phổ biến làm probiotic là vì chúng có khả năng hình thành nội bào

tử, nhờ đó probiotic chứa Bacillus sp tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất

(sấy khô ở nhiệt độ cao), có thể bảo quản và sử dụng trong thời gian dài mà không ảnh hưởng đến chất lượng và mật độ vi sinh vật trong sản phẩm, đồng thời chúng có khả năng tồn tại trong điều kiện môi trường khắc nghiệt Khi được cung cấp đủ chất dinh dưỡng và môi trường sống thuận lợi, chúng có thể nảy mầm và trở thành dạng tế bào

sinh dưỡng [49] Bên cạnh đó, Bacillus sp còn đáp ứng được các tiêu chí của probiotic

như: có khả năng tồn tại và nảy mầm trong ruột, hình thành màng sinh học và khả năng

kháng vi sinh vật gây bệnh [32], Bacillus sp có khả năng sản sinh một số enzyme tiêu

hóa, kích thích tiêu hóa thức ăn trong ruột dẫn đến kích thích tăng trọng lượng của vật chủ, ví dụ cụ thể đối với đối tượng là tôm thẻ chân trắng [28, 79],

Nghiên cứu về vai trò probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng có thể kể đến một

số lĩnh vực, bao gồm: (1) Thức ăn chứa probiotic giúp tăng cường miễn dịch, tăng sức khỏe, khả năng tiêu hóa, hấp thụ chất dinh dưỡng, ở tôm thẻ chân trắng, giúp tăng năng suất và sản lượng nuôi tôm; (2) Thức ăn nuôi tôm chứa probiotic giúp tôm chống chịu một số tác nhân gây bệnh, nghiêm trọng như vi rút đốm trắng (3) Một hướng nghiên cứu mới là thức ăn chứa probiotic là các chủng có khả năng sinh carotenoid, giúp làm tăng hàm lượng astaxanthin ở tôm thẻ chân trắng, qua đó cải thiện chất lượng

tôm nuôi Đã có nhiều công bố về vai trò probiotic của một số chủng Bacillus sp., cụ thể: B amyloliquefaciens [2, 4] B subtilis và B indicus [32, 52], B licheniformis, B

megaterium [19, 33, 35] Cụ thể như nghiên cứu phân lập các chủng có hoạt tính

probiotic của tác giả Khuất Hữu Thanh và cộng sự (2009) [3], nghiên cứu về chủng B

amyloliquefaciens không chỉ làm thức ăn mà có tác dụng tích cực trong việc cải thiện

chất lượng nước hồ nuôi tôm của các tác giả thuộc trường Đại học Cần Thơ [2, 4]

nghiên cứu về các chủng B subtilis, B megaterium liên quan đến sự tăng khả năng sản sinh enzyme tiêu hóa cho tôm [54], nghiên cứu về B licheniformis có tác dụng tăng

cường miễn dịch và cân bằng hệ vi sinh ruột tôm trước các tác nhân gây bệnh [16, 35, 40] Có thể thấy rằng các nghiên cứu đánh giá tác dụng của probiotic dạng vi khuẩn

thuộc chi Bacillus rất phổ biến và đa dạng cả ở trong nước và trên phạm vi quốc tế

Bên cạnh đó, tôm thẻ chân trắng là loài động vật có tốc độ tăng trưởng khá nhanh trong điều kiện môi trường và dinh dưỡng thuận lợi Song chúng lại rất nhạy cảm với sự thay đổi các yếu tố môi trường như nhiệt độ và độ mặn của nước Không chỉ vậy, các tác nhân như vi rút như vi rút gây bệnh đốm trắng (WSSV – White Spot

Syndrome Virus) và các chủng vi sinh vật gây bệnh (Vibrio sp., .) [3], đây luôn là

những mối lo ngại đáng kể đối với người nuôi tôm thẻ chân trắng vì những thiệt hại to lớn mà chúng gây ra Để khắc phục phần nào tình trạng vi rút hoặc vi khuẩn gây bệnh cho tôm, sử dụng kháng sinh bằng cách cho tôm ăn hoặc bổ sung vào nước nuôi tôm là biện pháp đã được sử dụng rất phổ biến Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh để phòng ngừa

bệnh trong nuôi tôm để lại vấn đề tồn đọng chưa thể giải quyết đó là: vi khuẩn, vi rút

có khả năng tích lũy đột biến kháng thuốc, khiến thuốc kháng sinh không thể sử dụng lâu dài [0, 74] Hơn thế nữa, việc sử dụng kháng sinh còn dẫn đến ảnh hưởng xấu cho sức khỏe con người khi sử dụng tôm và tác động tiêu cực đến môi trường do dư lượng lớn kháng sinh tích lũy trong tôm và môi trường nước [71] Những năm gần đây, probiotic được cho là có tiềm năng và được sử dụng khá phổ biến nhằm mục đích khắc phục những mặt hạn chế kể trên của việc sử dụng kháng sinh Một số nghiên cứu của

các tác giả trong và ngoài nước đã chứng minh vai trò của các chủng Bacillus sp trong

việc hỗ trợ tăng cường miễn dịch giúp tôm phòng ngừa các tác nhân gây bệnh như vi rút đốm trắng [61]

1.3 Nghiên cứu về carotenoid và vi khuẩn sinh carotenoid

1.3.1 Carotenoid

Carotenoid là các phân tử hữu cơ tự nhiên có trong một số thực vật và sinh vật

quang hợp như tảo, nấm và một số vi khuẩn, điển hình là Bacillus sp [34] Carotenoid

là tên chung của một nhóm các hợp chất có công thức phân tử và chức năng tương tự nhau, mỗi loại carotenoid đặc trưng cho một loại sắc tố khác nhau như vàng, vàng cam,

đỏ, đỏ cam, Một số carotenoid quen thuộc với con người như: β-carotene (tiền chất của vitamin A), lycopene, lutein, zeaxanthin và astaxanthin Carotenoid được biết đến với tác dụng quan trọng nhất là khả năng chống oxy hóa, giúp tế bào chống lại sự phá hủy bởi tia UV Chúng hoạt động như các oxy phân tử độc lập hoặc tương tác hiệp đồng với các chất chống oxy hóa khác để bảo vệ tế bào [70] Đối với vi khuẩn, carotenoid giúp bảo vệ vi khuẩn tồn tại trong môi trường nội bào [34] Đối với sức khỏe con người, carotenoid đã được chứng minh có khả năng phòng ngừa và ức chế tế

bào ung thư ở mô hình in-vivo [44] Carotenoid còn được biết đến với vai trò là chất

dinh dưỡng quan trọng tác động đến khả năng sinh sản của tôm [41], đồng thời, carotenoid phổ biến trong tôm là astaxanthin - là sắc tố tạo nên màu đỏ cam của tôm khi luộc [76]

1.3.2 Vi khuẩn sinh carotenoid

Carotenoid có rất nhiều tác dụng hữu ích đối với các sinh vật sống Tuy nhiên, con người hay các động vật khác, bao gồm cả tôm đều không có khả năng tự tổng hợp carotenoid mà chỉ có các loài vi khuẩn, một số thực vật và tảo [64] mới có khả năng này Trong nhiều năm gần đây, có nhiều công bố về sàng lọc các chủng vi khuẩn sản

sinh carotenoid từ đất, nước hay phân người, như: B marisflavi, B aquimaris sinh carotenoid sắc tố đỏ-cam [77], B firmus sinh carotenoid sắc tố hồng [55], B indicus, B

cibi, B jeogadi sinh sắc tố vàng [34] Tuy nhiên, cho đến nay mới chỉ có nghiên cứu

của Ngo và cộng sự năm 2016, tiến hành sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh sắc tố trong ruột tôm thẻ chân trắng [48] Trong nghiên cứu này, Ngo và cộng sự đã phân lập được

một số chủng như B aquimaris, B marisflavi, B firmus đều là các chủng vi khuẩn có lợi, có khả năng sinh sắc tố carotenoid màu vàng cam, trong đó, B aquimaris SH6 là

chủng được xác định có khả năng sinh sắc tố tốt nhất và khả năng tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng thông qua tăng cường hoạt tính enzyme PO ở tôm, cũng như tiềm năng phát triển thành chế phẩm sinh học trong thức ăn nuôi tôm nói riêng và nuôi trồng thủy sản nói chung

1.3.3 Astaxanthin

Astaxanthin là một loại carotenoid có công thức hóa học là diketo-β-carotene, là sắc tố chính được tìm thấy trong hầu hết các loại giáp xác như tôm, cua, và một số loài cá, chiếm tới 90% tổng số carotenoid trong các loài này Astaxanthin được biết đến là một loại chất chống oxy hóa tuyệt vời nhờ các gốc tự do trong cấu trúc phân tử và tác dụng chống ung thư, tốt cho da, tốt cho tim mạch, bảo vệ não bộ và giảm đau khớp, Đối với tôm, astaxanthin là sắc tố quyết định màu sắc đỏ cam của tôm khi luộc – là chỉ số cảm quan đánh giá giá trị dinh dưỡng và giá trị thương phẩm của tôm, tăng cường đáp ứng miễn dịch và sức chịu đựng của tôm trong điều kiện môi trường thiếu hụt oxy, đồng thời nồng độ astaxanthin cũng là chỉ số đánh giá giá trị kinh tế của tôm Từ năm 1990, Yamada và cộng sự đã chỉ ra rằng, tôm được cho

3,3-dihydroxy-4,4-ăn với thức 3,3-dihydroxy-4,4-ăn bổ sung astaxanthin cho thấy tỷ lệ tử vong giảm đáng kể so với tôm không được ăn với thức ăn bổ sung astaxanthin [76]

Với những công dụng quan trọng như thế, astaxanthin đang dần trở thành một chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá chất lượng và giá trị của tôm nuôi Trên thị trường hiện nay cũng có nhiều sản phẩm đã được thương mại hóa có tác dụng cung cấp astaxanthin tổng hợp phục vụ nuôi trồng thủy sản, tiêu biểu là Carophyll Pink® 10% CWS (hãng DSM, Thụy Sỹ) chứa 10% astaxanthin Bên cạnh đó, cũng có nhiều loại thực phẩm chức năng bổ sung astaxanthin cho người Tuy nhiên, những sản phẩm như Carophyll Pink® là những chất tổng hợp hoá học nên khả năng hấp thu và chuyển hoá ở tôm sẽ không hiệu quả bằng những hợp chất carotenoid có nguồn gốc tự nhiên Bên cạnh đó, dư lượng khi sử dụng trong nuôi trồng thủy sản có thể để lại ảnh hưởng tiêu cực cho người sử dụng và môi trường nuôi Do đó, những nghiên cứu phát triển probiotic dạng vi khuẩn sống có khả năng sinh tổng hợp carotenoid tự nhiên đem lại ý nghĩa về mặt khoa học và thực tiễn to lớn trong nuôi trồng tôm

1.4 Hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng

Tôm là loài động vật giáp xác không có khả năng sản sinh immunoglobulins mà

cơ chế bảo vệ phụ thuộc chính vào hệ miễn dịch tự nhiên hay còn gọi là hệ miễn dịch không đặc hiệu [23] Hệ thống miễn dịch này bao gồm các phản ứng trực tiếp của tế bào máu với tác nhân gây bệnh như cơ chế thực bào, các yếu tố hoạt hóa huyết tương

từ hệ thống prophenoloxidase (proPO), hoạt độ enzyme superoxidase (SOD), chúng cũng tạo ra các yếu tố kết dính, hệ thống đông máu (hemolymph coagulation system), melanin hóa, peptide kháng khuẩn - AMP (Anti-Microbial Peptide) [27, 42, 75]

Hệ thống miễn dịch của tôm khởi động bằng việc nhận diện tác nhân xâm nhập thông qua sự gắn kết protein bề mặt, các lipopolysaccharide trên thành tế bào vi khuẩn hoặc các β-1,3-glucan trên thành tế bào nấm, kích hoạt các yếu tố zymogen, dẫn đến các quá trình bao gói, thực bào, melanin hóa, encapsunin hóa nhằm tấn công và tiêu

diệt tác nhân xâm nhập [38, 65] Đối với hệ miễn dịch ở tôm, liên quan đến quá trình tiêu thụ các gốc tự do gây độc, các tế bào hyaline tiếp nhận tín hiệu và kích hoạt cơ chế

tự vệ tế bào sản sinh ra lượng lớn các gốc oxy tự do Các gốc oxy tự do này nếu tồn tại với số lượng lớn sẽ gây độc cho tế bào Khi đó, cơ chế miễn dịch không đặc hiệu của tôm sẽ cho phép tế bào sản sinh SOD - là một enzyme có khả năng xúc tác các phản ứng nội bào, chuyển hóa các gốc oxy tự do thành oxy phân tử và H2O2 Nhờ có enzyme SOD, mà các oxy tự do hoặc các gốc oxy hóa trong tế bào được kiểm soát ở mức tối thiểu, không xảy ra hiện tượng gây độc hay gây chết tế bào [11, 25] Bên cạnh cơ chế hoạt động của enzyme SOD, hoạt tính proPO/PO cũng đóng một vai trò thiết yếu trong

hệ miễn dịch không đặc hiệu của tôm thẻ chân trắng, cụ thể Cơ chế hoạt hóa enzyme

PO được kiểm soát bằng tế bào máu granular và semi-granular dẫn đến hiện tượng encapsunin và melanin hóa Khi các tế bào granular và semi-granular tiếp nhận các tín hiệu từ thụ thể màng tế bào về các tác nhân xâm nhập, chúng được hoạt hóa và xảy ra hiện tượng degranulation, sau đó kích hoạt hệ thống enzyme ProPO, hình thành phân

tử enzyme có hoạt tính - PO nhờ sự xúc tác của enzyme nội bào trypsine proteinase

PO hay còn gọi là trysinase, enzyme xúc tác cho các phản ứng: (1) hydroxyl hóa hợp chất monophenol thành o-diphenol và (2) oxi hóa o-diphenol thành o-quinone O-quinone chính là các nội độc tố tham gia quá trình melanin hóa, encapsunin hóa nội bào và tiêu diệt các tác nhân xâm nhập vào tế bào [65]

Bên cạnh đó, một số nghiên cứu khác về hệ miễn dịch và quá trình thực bào của tôm, các nhà khoa học đã phát hiện ra sự tham gia của các protein họ GTPase, trong

đó, điển hình là protein Rho (Ras like GTPase) tham gia vào cơ chế opsonin hóa, nội

tiết và quá trình hình thành superoxide trong cơ chế thực bào của tôm [36]; protein Ran (ras-related nuclear protein) là nhân tổ chủ đạo tham gia các quá trình vận chuyển các chất qua nhân [17, 28] Những công bố này đã đưa ra bằng chứng về việc khi có các

tác nhân xâm nhập như vi khuẩn, vi rút (WSSV) thì mức độ biểu hiện các gen Rho và

Ran này tăng lên một cách đáng kể Điều này là minh chứng cho sự gia tăng mức độ

biểu hiện các gen này tương ứng với sự tăng cường miễn dịch bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân xâm nhập đối với tôm Do đó, bên cạnh mức độ hoạt động của các enzyme

SOD hay PO như được mô tả ở trên thì mức độ biểu hiện các gen Rho, Ran này cũng

được xem là các chỉ thị sinh học phân tử phục vụ nghiên cứu đánh giá mức độ tăng cường hệ miễn dịch ở tôm nói chung và tôm thẻ chân trắng nói riêng

1.5 Bào tử B aquimaris SH6 và tác dụng probiotic của chúng đối với tôm thẻ

chân trắng

1.5.1 Thực trạng nghiên cứu vai trò probiotic của bào từ B aquimaris

Cũng giống như như nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus, B aquimaris có khả

năng hình thành bào tử bền nhiệt và tồn tại lâu dài trong điều kiện môi trường khác nhau Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng nảy mầm và thể hiện vai trò probiotic của

mình Do đó, B aquimaris được đánh giá là có tiềm năng phát triển thành chế phẩm sinh học với ưu điểm độ sống được đảm bảo trong quá trình bảo quản và sử dụng B

aquimaris là chủng vi sinh vật được tìm thấy phổ biến trong trầm tích biển, sinh trưởng

tốt trong điều kiện pH 7.5-9.5, tế bào hình que, có khả năng hình thành nội bào tử, ưa

mặn [77] Đã có một số nghiên cứu chứng minh rằng B aquimaris phân lập từ phân

của người có khả năng sinh tổng hợp các loại glycolycopens (một dạng carotenoid) và

nghiên cứu đánh giá khả năng hấp thu carotenoid của B aquimaris ở mô hình chuột [34, 77] Năm 2016, với mục đích sàng lọc các chủng vi khuẩn Bacillus trực tiếp từ

tôm để phát triển probiotic thân thiện với hệ vi sinh vật của tôm, nhóm nghiên cứu của tác giả Ngo và cộng sự đã tiến hành sàng lọc các vi khuẩn tạo bào tử và có sắc tố từ hệ

vi sinh vật trong ruột tôm thẻ chân trắng Từ các chủng phân lập được, nhóm nghiên

cứu đã thực hiện các thử nghiệm sâu hơn để xác định các chủng Bacillus sp có khả

năng sản sinh carotenoid ở mức độ cao nhất, có hoạt tính chống oxy hoá tốt nhất, và

bào tử bền nhiệt Qua đó, Ngo và cộng sự đã chứng minh được rằng bào tử B

aquimaris SH6 là chủng ưu việt nhất có khả năng sản sinh tổng hợp hơn 10 loại

glycolycopen khác nhau Chủng vi khuẩn này đã được chọn làm giống để sản xuất

probiotic cho thử nghiệm tăng hàm lượng astaxanthin, cân nặng và hoạt tính enzyme

PO (phenoloxidase) ở tôm thẻ chân trắng so với các chủng đối chứng như B subtilis PY79 và B indicus HU36 [48]

Tuy nhiên, báo cáo này chỉ giới hạn ở việc đánh giá một chỉ tiêu miễn dịch (hoạt

tính enxyme PO), cân nặng, nồng độ astaxanthin của tôm dưới tác dụng của B

aquimaris SH6 mà chưa làm sáng tỏ số phận của bào tử khi đi vào ruột tôm, cũng như

ảnh hưởng của nó đối với hệ vi sinh vật trong ruột và một số chỉ tiêu miễn dịch khác ở

tôm như Rho, Ran và SOD (Superoxidase dimustase)

1.5.2 Khả năng nảy mầm của bào tử B aquimaris

Nảy mầm là quá trình mà vi khuẩn gặp điều kiện môi trường và dinh dưỡng thuận lợi sẽ tái tạo trạng thái tế bào sinh dưỡng thay vì trạng thái nội bào tử Chất dinh dưỡng liên kết với thụ thể màng trong của bào tử, kích hoạt sự giải phóng axit dipicolinic, các cation và sự thủy phân lớp vỏ peptidoglycan của bào tử cho phép bào

tử chuyển thành trạng thái tế bào sinh dưỡng [60]

Liên quan đến vai trò probiotic của các chủng Bacillus sp., câu hỏi đặt ra là:

Nếu bào tử không nảy mầm, mà chỉ tồn tại ở trạng thái bào tử, đi ngang qua ruột và sau

đó bị thải ra ngoài qua phân của vật chủ, thì làm sao chúng có thể thực hiện chức năng probiotic của mình? Đây cũng là nguyên nhân khiến nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu về số phận của bào tử trong hệ tiêu hóa của vật chủ bao gồm cả hai quá trình nảy mầm và tái tạo bào tử trong ruột [12, 49, 60] Tuy nhiên, các nghiên cứu này

chỉ mới thực hiện trên đối tượng là B subtilis spp., nảy mầm trong ruột một số động

vật có xương sống Cụ thể, nghiên cứu của Nguyen và cộng sự (2006) về vòng đời của

B subtilis trong ruột chuột [53], nghiên cứu sự nảy mầm của chủng tái tổ hợp B subtilis SC2288 ở ruột chuột [12] hoặc sự nảy mầm của bào tử B subtilis SC2362

trong ruột gà [68] Sử dụng nhiều phương pháp và các chỉ thị sinh học khác nhau, những nghiên cứu này đã chứng minh được rằng bào tử không chỉ được tiêu thụ và thải

ra khỏi ruột vật chủ một cách đơn thuần, mà phần nào bám lại trong thành ruột và sau

đó nảy mầm Qua đó, chúng thể hiện vai trò của mình trong việc kích thích hệ miễn dịch của vật chủ sản sinh IgA và cytokin tiền viêm (TNF-α) [33], kích thích sự phát triển của hệ thống mô bạch huyết đường ruột (gut-asociated lymphoid tissue – GALT) [62], Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào đánh giá khả năng nảy mầm

của bào tử B aquimaris trong ruột tôm

Phương pháp truyền thống sử dụng các kỹ thuật vi sinh vật học được dùng để đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử vi khuẩn có thể kể đến là đếm khuẩn lạc hình thành trên đĩa môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, phương pháp này có độ chính xác không cao Do đó, để đánh giá khả năng nảy mầm của vi khuẩn trong ruột động vật,

điển hình là bào tử B subtilis spp., các nhà khoa học lựa chọn các một số các chỉ thị sinh học phân tử đặc trưng cho sự nảy mầm của bào tử B subtilis như một số gen:

gerA/B/K, Cwl, [12, 53] Tuy nhiên, trong trường hợp của B aquimaris SH6, do

những nghiên cứu về khả năng nảy mầm của chủng vi khuẩn này hoàn toàn chưa có

Nên nghiên cứu này lựa chọn gen BaqA-mã hóa cho enzyme α-amylase để làm chỉ thị sinh học phân tử, giúp đánh giá khả năng và hiệu suất nảy mầm của bào tử B

aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng Enzyme α-amylase được biết đến là

enzyme thủy phân tích bột, giúp phân giải liên kết α1-4 của phân tử amylose thành amylopectin Quá trình nảy mầm của bào tử vi khuẩn liên quan mật thiết với nồng độ

Ca2+ và nồng độ DPA (Dipicolinic acid) và tăng tiết enzyme α-amylase [55] Do đó,

đánh giá mức độ biểu hiện gen BaqA có thể giúp đánh giá khả năng và hiệu suất nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm

1.6 Đặt vấn đề nghiên cứu và thiét kế thí nghiệm

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích đánh giá khả năng lưu trú và

nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng và các tác dụng probiotic của chúng Để đánh giá được khả năng lưu trú, nảy mầm của bào tử B

aquimaris SH6 cũng như ảnh hưởng của bào tử lên các chỉ tiêu miễn dịch, tăng trưởng

trọng lượng và nồng độ astaxanthin, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên đối tượng tôm

thẻ chân trắng 25 ngày tuổi (Litopenaeus vannamei) với thiết kế thí nghiệm cho tôm ăn bào tử B aquimaris SH6 và dịch chiết carotenoid từ vi khuẩn B aquimaris SH6 có so

sánh với các nhóm đối chứng liên tục trong 28 ngày, ở quy mô phòng thí nghiệm Các nhóm thí nghiệm bao gồm: nhóm đối chứng âm “ĐC”: tôm được nuôi với thức ăn thông thường; nhóm “Carophyll”: tôm được cho ăn với thức ăn trộn Carophyll Pink®

10% CWS để đạt nồng độ astaxanthin cuối cùng trong thức ăn là 0,5 mg/g thức ăn;

nhóm “SH6 spore”: tôm được cho ăn với thức ăn trộn bào tử B aquimaris SH6, nồng

độ 5 × 106 CFU/g thức ăn và nhóm “SH6 carotenoid”: tôm được cho ăn với thức ăn trộn dịch chiết carotenoid từ tế bào sinh dưỡng SH6, nồng độ 5 µg/g thức ăn Với mục

tiêu ban đầu là đánh giá khả năng lưu trú và nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6, và

ảnh hưởng của nó tới hệ vi sinh vật của tôm, chúng tôi thiết kế thí nghiệm đếm độ sống của vi khuẩn từ mẫu ruột tôm ở các lô thí nghiệm và kết hợp với kỹ thuật giải trình tự gen 16sRNA để xác định đa dạng vi sinh vật cũng như độ sống của các loài vi sinh vật

có lợi trong ruột tôm Việc đánh giá sự nảy mầm của bào tử SH6 được thực hiện thông

qua mức độ biểu hiện của gen quy định khả năng nảy mầm của bào tử Bacillus

aquimaris – BaqA, gen mã hóa cho enzyme α-amylase được tế bào vi sinh vật tiết ra

khi chúng tồn tại ở tế bào sinh dưỡng Với mục tiêu thứ hai đánh giá các chỉ số miễn dịch và các hoạt tính probiotic khác trên tôm, chúng tôi thực hiện theo các phương pháp tham khảo nghiên cứu của các nhóm tác giả Huang và cộng sự (2008), McCord

và cộng sự (1969), … [33, 46] và của chính nhóm nghiên cứu đã công bố trước đây – Ngo và cộng sự (2016) [48]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) sử dụng trong nghiên cứu này được

cung cấp bởi cơ sở nuôi tôm tại Từ Sơn - Bắc Ninh tại thời điểm 30 ngày tuổi, trọng

lượng đạt 1,2 - 1,5 g Tôm thẻ chân trắng được đảm bảo đồng đều về kích thước và

trọng lượng Trước khi tiến hành thí nghiệm, tôm được nuôi thuần trong phòng thí

nghiệm với các điều kiện: nhiệt độ 26-28°C, pH 7,5-8,5, độ mặn 16‰ trong khoảng

2-3 ngày

2.1.2 Bào tử B aquimaris SH6

Chủng vi khuẩn B aquimaris SH6 sử dụng trong nghiên cứu này được phân lập

từ ruột tôm thẻ chân trắng theo nghiên cứu của Ngo và cộng sự, năm 2016 [48] Bào tử

SH6 có màu sắc vàng cam đặc trưng do khả năng sản sinh carotenoid (Hình 2.1)

Hình 2.1: Bào tử B aquimaris SH6

A - Bột bào tử B aquimaris SH6 (3 × 10 11 CFU/g) màu đỏ cam B - Hình ảnh

hiển vi quang học bào tử B aquimaris SH6 [48].

2.1.3 Thức ăn cho tôm

Thức ăn cho tôm thẻ chân trắng sử dụng trong nghiên cứu này được sản xuất bởi hãng Tomboy – Sketting - Việt Nam, kích thước thức ăn phù hợp với độ tuổi và kích thước của tôm (Hình 2.2)

Hình 2.2: Thức ăn cho tôm thẻ chân trắng

A - Thức ăn chưa trộn bào tử B - Thức ăn đã trộn bào tử và bao dầu

2.1.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm:

 Môi trường dinh dưỡng:

- LB (Luria Bertani) dạng lỏng, pH 7,5-8,5: Peptone (15 g/l), cao nấm men (5 g/l), NaCl (5 g/l) (Trung Quốc)

- LB (Luria Bertani) dạng rắn, pH 7,5-8.5: Peptone (15 g/l), cao nấm men (5 g/l), NaCl (5 g/l), thạch (16-18 g/l) (Trung Quốc)

- MRS dạng rắn, pH 5,6 ± 0,2 (Oxoid, Anh): 56 g/l

 Môi trường sinh bào tử:

- DSM (Difco Sporulation medium), pH 7,5-8,5: Nutrien Broth (8 g/l) (Merck, Đức); KCl (1 g/l); MgSO4.7H2O (0,25 g/l); Ca(NO3)2 1M (1 ml/l); MnCl2

0,01M (1 ml/l); FeSO4 1 mM (1 ml/l) (Trung Quốc)

2.1.5 Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là các hoá chất đạt chuẩn trong nuôi cấy vi sinh vật và các thử nghiệm hoá sinh học, được mua từ các hãng có uy tín Các hoá chất dùng cho xác định hoạt tính enzyme của hãng Merck - Đức, BioBasic - Canada; các hoá chất dùng trong các thí nghiệm sinh học phân tử của hãng Enzynomics - Hàn Quốc, Quiagen - Đức,… Tên của một số hoá chất chính được liệt kê dưới đây:

 Hóa chất, thành phần phản ứng tạo cDNA, PCR và Real-time PCR:

- Phản ứng tạo cDNA sử dụng enzyme phiên mã ngược M-MLV, V = 20 µl

TOPrealTM One-step 4X RT qPCR Kit (TaqMan Probe): 5 µl

 Hóa chất cho đánh giá hoạt tính enzyme PO (Phenoloxydase) [30]:

- Đệm cacodylate: 0,01M Natri cacodylate; 0,45M NaCl; 0,01M CaCl2; 0,26M MgCl2, pH 7,0

- Trypsin: 100 µg/ml trong đệm cacodylate

- L-DOPA (L-3-4-dyhydroxyphenylalanine): 3 mg/ml trong đệm cacodylate

 Hóa chất cho đánh giá hoạt tính enzyme SOD (Superoxidase dimutase) [46]:

- Đệm phosphate: Dung dịch đệm K2HPO4 216 mM, pH 7,8

- Pha hỗn hợp dung dịch phản ứng đo hoạt tính enzyme SOD: Đệm phosphate (K2HPO4 216 mM, pH 7,8); EDTA 10,7 mM pH 8,5; Cytochrome C 1,1 mM;

xanthin 0,108 mM; xanthin oxidase (XOD)

 Hóa chất tách chiết carotenoid: Methanol và chloroform [34]

2.1.6 Dụng cụ và thiết bị

- Dụng cụ: Bình tam giác (dung tích 50 ml, 200 ml, 1l), đĩa petri, que cấy,

pipet, cuvet, đĩa 96 giếng, ống falcon (15 ml, 50 ml), ống eppendoft (1,5 ml, 2 ml), ống PCR,…

- Thiết bị: Tủ nuôi cấy vi sinh vật, tủ an toàn sinh học, nồi hấp khử trùng, lò vi

sóng, bể ổn nhiệt, máy lắc, máy ly tâm, máy PCR, máy Real-time PCR, máy quang phổ UV-Vis, máy quang phổ Nano DropOne Microvolume UV-Vis, tủ lạnh (4°C, -20°C, -80°C), …

2.2 Phương pháp

2.2.1 Chuẩn bị bào tử B aquimaris SH6 và tách chiết carotenoid

Bào tử B aquimaris SH6: Chủng vi khuẩn sinh sắc tố B aquimaris SH6 phân

lập từ ruột tôm thẻ chân trắng trong nghiên cứu trước của Ngo và cộng sự [48] được sử dụng để tạo bào tử phục vụ cho nghiên cứu này Quy trình tạo bào tử được thực hiện

như sau: Tế bào sinh dưỡng B aquimaris SH6 được hoạt hóa bằng cách cấy ziczac trên

đĩa thạch LB, ủ 16 h ở 35°C, 2-3 khuẩn lạc màu vàng cam riêng rẽ trên đĩa được cấy vào 5 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc ở tốc độ 200 vòng/phút trong khoảng 16-18 h

để tạo chủng giống cấp 1 Cấy chuyển 1 ml giống SH6 cấp 1 vào 10 ml LB lỏng, nuôi lắc ở tốc độ 200 vòng/phút trong 16-18 h để rạo chủng giống cấp 2 Cấy chuyển 10 ml giống SH6 cấp 2 vào 500 ml (tỷ lệ 1:50) môi trường DSM lỏng, nuôi lắc ở tốc độ 200 vòng/phút trong 48-72 h để tạo bào tử Nhiệt độ nuôi lắc đối với SH6 là 33-35°C Trong khoảng thời gian sau 48 h nuôi lắc trong môi trường DSM, dịch nuôi sẽ được kiểm tra hiệu suất hình thành bào tử bằng kính hiển vi quang học cho tới khi đạt hiệu suất > 95% tạo bào tử Khi đạt hiệu suất tạo bào tử > 95%, ly tâm dịch nuôi bào tử

bằng máy ly tâm SIGMA 3K - Đức ở tốc độ 7000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ dịch nuôi, thu sinh khối bào tử SH6 màu vàng cam Sau đó, rửa bằng dung dịch muối NaCl 0,9%, vontex, sau đó ly tâm 7000 vòng/phút trong 10 phút để loại dịch rửa (lặp lại 2-3 lần) Cuối cùng, bào tử SH6 được trộn với dung dịch NaCl 0,9%, chia nhỏ và bảo quản ở -20°C phục vụ các nghiên cứu tiếp theo

Để xác định nồng độ bào tử (CFU/ml), chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu bào

tử SH6 bảo quản trong NaCl 0,9% ở trên đến nồng độ pha loãng 10-7 và cấy trải dịch pha loãng ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp (10-5, 10-6, 10-7) trên đĩa thạch LB hoặc DSM để đếm số khuẩn lạc hình thành (CFU), từ đó xác định nồng độ bào tử bằng công thức:

𝑛1𝑣1𝑑1 + … + 𝑛𝑖𝑣𝑖𝑑𝑖Trong đó:

- CFU/ml: số tế bào vi khuẩn trong 1ml mẫu

- C: Tổng số tế bào vi khuẩn đếm được trên mỗi đĩa ở độ pha loãng tương ứng (25-250 khuẩn lạc)

- ni: Số đĩa petri cấy tại độ pha loãng tương ứng

- di: Hệ số pha loãng tương ứng

- vi: Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa tại độ pha loãng tương ứng

Môi trường nuôi cấy và các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong quá trình nuôi cấy được đều được khử trùng ở 121°C trong 15 phút để loại bỏ hoàn toàn vi sinh vật nhiễm

từ môi trường bên ngoài

Tách chiết carotenoid:

Để thu dịch chiết carotenoid từ tế bào SH6, tế bào sinh dưỡng B aquimaris SH6

được kích hoạt bằng cách cấy ziczac trên đĩa thạch LB, ủ 16 h ở 35°C, 2-3 khuẩn lạc màu vàng cam riêng rẽ trên đĩa được cấy vào 5 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc ở tốc

độ 200 vòng/phút trong khoảng 16-18 h để tạo chủng giống cấp 1 Cấy chuyển 1 ml giống SH6 cấp 1 vào 10 ml LB lỏng, nuôi lắc ở tốc độ 200 vòng/phút trong 16-18 h để rạo chủng giống cấp 2 Cấy chuyển 10 ml giống SH6 cấp 2 vào 500 ml (tỷ lệ 1:50) môi trường LB lỏng, nuôi lắc ở tốc độ 200 vòng/phút trong 24 h để thu tế bào sinh dưỡng Nhiệt độ nuôi lắc đối với SH6 là 33-35°C Sau 24 h, tiến hành ly tâm thu sinh khối Phương pháp tách chiết carotenoid được tham khảo từ các nghiên cứu trước đây [34] Tuy nhiên, sử dụng dung môi tách chiết là hỗn hợp methanol:chloroform có thể dẫn đến hiện tượng gây độc với tôm khi cho ăn với thức ăn trộn dịch chiết carotenoid có chứa methanol hoặc chloroform Vì vậy, chúng tôi sử dụng dung môi tách chiết là dầu gan cá Sinh khối tế bào SH6 được làm đông ở -80°C trong 4 h, sau đó giã nhuyễn trên

đá và phá tế bào bằng máy phá tế bào (Sonicator – Q500, USA) Dịch chiết carotenoid được đo quang phổ vạch hấp phụ ở bước sóng 480 nm (A480) và dựa vào phương trình đường chuẩn nồng độ astaxanthin (Hình 2.3) để xác định nồng độ astaxanthin trong dịch chiết Dịch chiết carotenoid được bảo quản ở -20°C để phục vụ thí nghiệm tiếp theo

Hình 2.3: Đường chuẩn nồng độ Astaxanthin

2.2.2 Chuẩn bị thức ăn cho tôm

Đầu tiên, thức ăn của tôm được khử trùng ở 121°C, 15 phút để diệt toàn bộ các

probiotic dạng Bacillus sp có sẵn và các vi sinh vật nhiễm trong quá trình vận chuyển

và bảo quản thức ăn Sau đó, tiến hành trộn thức ăn theo các nhóm thí nghiệm (theo phần Kế hoạch thí nghiệm) Nhóm “ĐC” là thức ăn tôm đã khử trùng, không bổ sung bất kỳ thành phần Carophyll hay bào tử Nhóm “Carophyll”: hòa tan 0,5 g bột Carophyll pink vào 10 ml DW (70°C), phun đều lên bề mặt 100 g thức ăn đã khử trùng

để đạt nồng độ astaxanthin cuối cùng là 0,5 mg/g thức ăn Nhóm “SH6 carotenoid”: dựa vào nồng độ carotenoid đã xác định (xem phần 2.2.1) pha dịch chiết carotenoid trong 10ml dầu gan cá và phun đều lên bề mặt 100 g thức ăn đã khử trùng để đạt nồng

độ carotenoid cuối cùng là 5 µg/g thức ăn Nhóm “SH6 spore”: hòa tan dịch lưu bào tử SH6 trong 10 ml DW, phun đều lên bề mặt 100 g thức ăn đã khử trùng Đối với các nhóm: “ĐC”, “Carophyll” và “SH6 spore”, thức ăn sau khi trộn với các thành phần trên

sẽ được bao phủ bằng 10 ml dầu gan cá để giảm thiểu tối đa hiện tượng viên thức ăn bị tan ra trong nước nuôi tôm Riêng nhóm “SH6 carotenoid” không cần tiến hành bao dầu do đã sử dụng dầu gan cá làm dung môi chiết và pha loãng carotenoid Thức ăn đã bao dầu sẽ được mã hóa, chia nhỏ và bảo quản ở -20°C

2.2.3 Bố trí các nhóm thi ghiệm và quy trình nuôi tôm

Để đánh giá khả năng lưu trú của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm và hoạt tính probiotic của chúng đối với tôm thẻ chân trắng (L vannamei) với các chỉ số

cụ thể như: tăng trọng lượng, tăng hàm lượng astaxanthin, màu sắc và các chỉ tiêu miễn dịch, chúng tôi thiết kế và thực hiện thí nghiệm với 4 nhóm thí nghiệm gồm: “ĐC”,

“Carophyll”, “SH6 spore”, “SH6 carotenoid” trong thời gian 28 ngày, các thời điểm thu mẫu và số lượng mẫu được trình bày chi tiết trong các phần thiết kế thí nghiệm Mỗi nhóm thí nghiệm gồm 70 tôm được nuôi trong 2 bể Tôm được nuôi tại phòng Sinh học Nano và Ứng dụng - Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ enzyme và protein - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, nhiệt độ trong phòng được kiểm soát và

giữ liên tục ở khoảng 26-28°C, pH 7,5-8,5 Bể nuôi tôm được sục khí liên tục để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho tôm, nước nuôi tôm được lọc liên tục và thay định kỳ 5 ngày (tối đa 30 % nước) Quy trình kỹ thuật nuôi tôm đươc tham khảo trong một số nguồn tài liệu, sách “Kỹ thuật nuôi tôm thẻ chân trắng” của tác giả Thái Bá Hồ, và một số nghiên cứu đã có về tôm thẻ chân trắng và tối ưu hóa theo điều kiện sẵn có ở phòng thí nghiệm [3, 48] Mô hình bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm được thể hiện trong Hình 2.4

Hình 2.4 : Mô hình bể nuôi tôm trong quy mô phòng thí nghiệm

Cụ thể, mỗi bể tôm có dung tích 45 l, chứa 25 l nước với độ mặn 16‰ được vận hành bằng hệ thống sục khí liên tục đảm bảo lượng oxy hòa tan trong nước đủ cung cấp cho tôm trong suốt quá trình nuôi; bơm tuần hoàn được lắp đặt (nối với thiết bị chứa bông lọc) để lọc nước bể nuôi tôm một cách tuần hoàn và liên tục, loại bỏ các chất cặn

bã trong bể nuôi tôm như: phân tôm, thức ăn thừa, lưu ý tắt bơm trong khoảng 1 h đầu cho tôm ăn để tránh hiện tượng lọc bỏ thức ăn của tôm Hệ thống các bể nuôi tôm được

bố trí trong phòng thí nghiệm như Hình 2.5 Tôm được cho ăn trong 28 ngày với thức

ăn đã mã hóa (xem mục 2.2.2) 3 lần/ngày, mỗi ngày 2-3 g Quan sát, theo dõi tình trạng

sức khỏe, vận động và khả năng ăn của tôm hàng ngày để đảm bảo phát hiện kịp thời những thay đổi về sức khỏe của tôm để có những điều chỉnh phù hợp

Hình 2.5: Bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm

A - Đại diện hệ thống các bể nuôi tôm quy mô phòng thí nghiệm B - Đại diện

một bể nuôi tôm có hệ thống sục khí và bơm

Phương pháp và nguyên tắc thu mẫu:

Tiến hành thu mẫu tôm một cách ngẫu nhiên tại các thời điểm xác định, phụ thuộc vào tính chất mỗi thí nghiệm, 03 mẫu tôm trên một nhóm thí nghiệm Sử dụng bộ dụng cụ (dao, kéo, kẹp, …) đã khử trùng để giải phẫu tôm, các bộ phận cần thiết được giải phẫu cẩn thận, cho vào ống eppendoft 2 ml vô trùng, sử lý ngay lập tức hoặc bảo quản lạnh ở -80°C để đảm bảo duy trì tính chất mẫu

2.2.4 Xác định số lượng B aquimaris SH6 và tổng số vi sinh vật hiếu khí trong

ruột tôm

Tiến hành thu mẫu tôm (n = 3) tại mỗi thời điểm ngày 0, 1, 3, 7, 14 và 28 trong

quá trình nuôi tôm, ký hiệu tương ứng là 0 D, 1 D, 3 D, 7 D, 14 D, và 28 D Sau đó giải phẫu, thu toàn bộ ruột tôm vào ống eppendoft 2 ml vô trùng, giã nhuyễn bằng que giã

vô trùng, bổ sung 1 ml NaCl 0,9%, để 15 phút rồi vontex 1 phút để hòa tan vi sinh vật trong ruột tôm vào NaCl 0,9% Pha loãng dịch đồng nhất chứa vi sinh vật ruột tôm đến

độ pha loãng 104 Cấy trải 100 µl dịch pha loãng trên đĩa thạch LB, mỗi nồng độ lặp lại

2 lần Số khuẩn lạc thu được trên đĩa là cơ sở để tính toán xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm Trong đó, khuẩn lạc mang màu sắc và hình thái đặc trưng

(khuẩn lạc tròn, hơi lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng cam), nghi ngờ B aquimaris SH6 được

kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA

Để đánh giá thành phần các chủng vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm, quá trình phân lập được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch, sau đó lựa chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch, thực hiện tách chiết DNA tổng số bằng bộ Kit tách chiết Anapure Bacterial DNA Mini Kit (ANABIO R&D, Việt Nam) Sản phẩm tách DNA tổng số được kiểm tra chất lượng tách chiết bằng phương pháp điện di gel elctrophoresis xác nhận băng DNA tổng số và định lượng bằng đo quang phổ với máy quang phổ Nano DropOne microvolume UV-VIS (Thermo Scientific - Hoa Kỳ) Cuối cùng, sản phẩm tách chiết DNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16s rRNA (cặp mồi F27: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ và R1527: 5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’ [48]) (thành phần phản ứng PCR được trình bày như Mục 2.1.5) cho sản phẩm có kích thước 1500 bp Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kit Anapure PCR Product & Gel Purification Mini Kit (ANABIO R&D, Việt Nam), giải trình tự 16S rRNA (1st BASE DNA Sequencing Division, Singapore) và so sánh với trình tự có sẵn trên ngân hàng gen NCBI, độ tương đồng > 98% được lựa chọn để xác định loài tương ứng với khuẩn lạc phân lập được Từ kết quả giải trình tự, kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch (CFU/g ruột) có thể phân tích và xác định tỷ lệ phần trăm mỗi chủng

2.2.5 Đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm

Để đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B aquimaris SH6 trong ruột tôm, thí nghiệm được thiết kế với 1 bể nuôi tôm (30 tôm), nồng độ bào tử B aquimaris SH6 1 ×

108 CFU/g thức ăn, cách tạo thức ăn chứa bào tử B aquimaris SH6 và các điều kiện

nuôi tôm tương tự như trình bày ở Mục 2.2.2, 2.2.3 và mô hình Hình 2.4 Thu ruột tôm

và tách chiết RNA tổng số phục vụ đánh giá tỷ lệ % nảy mầm ở những thời điểm ngay sau khi cho ăn với độ nhạy cao Bào tử chỉ cho ăn 2-3 g thức ăn một lần trong ngày đầu tiên, sau đó, bể nuôi tôm được duy trì các điều kiện nuôi tôm trong 7 ngày để theo dõi được sự thay đổi mức độ nảy mầm của chính bào tử lưu trú trong ruột tôm Tiến hành

thu mẫu tại các thời điểm xác định để đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B

aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng sử dụng chỉ thị sinh học phân tử là gen BaqA-SH6, gen mã hóa cho enzyme α-amylase là enzyme không biểu hiện ở giai đoạn

bào tử của vi khuẩn, do vậy có khả năng đặc trưng cho sự nảy mầm của bào tử B

aquimaris SH6 Tuy nhiên, thông tin về gen mã hóa cho enzyme α-amylase trên đối

tượng là B aquimaris còn rất hạn chế Đặc biệt, B aquimaris SH6 là loài mới nên hoàn

toàn không có thông tin về trình tự gen này Do vậy, nghiên cứu này tiến hành xác định

chính xác trình tự gen BaqA-SH6 để làm nguyên liệu xây dựng phản ứng

Realtime-PCR đánh giá mức độ biểu hiện gen BaqA-SH6, cụ thể như sau:

2.2.5.1 Thiết kế mồi đặc hiệu nhân đoạn gen α-amylase ở B aquimaris SH6

(BaqA-SH6)

Dựa vào đoạn trình tự gen BaqA (mã hóa enzyme α-amylase) của B aquimaris

MKSC 6.2 (Mã: JN797599.1) do Puspasari và cộng sự công bố năm 2013 [59], chúng

tôi sử dụng các trình tự gen BaqA của Anoxybacillus và phần mềm SnapGene để xác định đoạn trình tự tương đồng nhất (Hình 2.6) Anoxybacillus spp thuộc họ GH13 được biết đến là các chủng Bacillus sp có nhiều sự tương đồng về hệ gen với B

aquimaris [14]

Hình 2.6: Trình tự tương đồng đoạn gen BaqA giữa chủng B aquimaris MKSC

6.2 và một số chúng Anoxybacillus spp

Trình tự tương đồng này là cơ sở để thiết kế cặp mồi suy biến nhân đoạn gen

BaqA ở B aquimaris SH6 (do vẫn còn một số nucleotide không đặc hiệu ở hai đầu

đoạn trình tự tương đồng) Để đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi suy biến, phản ứng PCR được sử dụng với các bước được thể hiện trong Bảng 2.1

Bảng 2.1: Điều kiện của PCR nhân đoạn gen BaqA

35 chu kỳ

Để xác định chính xác mồi BaqA đặc hiệu cho chủng B aquimaris SH6 SH6), sản phẩm PCR từ chủng B aquimaris SH6 được chèn vào vector nhân dòng p-

(BaqA-TOP TA V2 (Enzynomics, Hàn Quốc) (Hình 2.7) Vector tái tổ hợp chứa đoạn gen

BaqA-SH6 được biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5-α, nuôi tăng sinh trong môi