Đồ án tốt nghiệp thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded rna vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh

Nghiên cứu của Sagi và Ra`anan trong năm 1988 đã chứng minh rằng việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đạt sản lượng cao hơn việc nuôi toàn cái hay đực và cái trong cùng quần thể.. Ý tưởng tạ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỰC NGHIỆM CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP DOUBLE STRANDED RNA VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI

GIỚI TÍNH TÔM CÀNG XANH

Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn : Th.S BÙI THỊ LIÊN HÀ Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM HOÀNG MSSV: 0851110091 Lớp: 08DSH4

TP Hồ Chí Minh, 2012

1

MỞ ĐẦU

Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) là một trong

những loài giáp xác thương mại rất quan trọng, được đánh bắt và nuôi trồng rộng rãi

và phân bố tự nhiên trong các ruộng lúa (New, 2005) Năm 1987, sản lượng M

rosenbergii toàn cầu ước tính đạt khoảng 27000 tấn mỗi năm (New, 1990) Một số

lượng lớn được sản xuất ở Trung Quốc và mở rộng nhanh chóng ra Ấn Độ và Bangladesh (New, 2005) Ngày nay, nó được nuôi rộng rãi ở các nước trên thế giới

Trong thập kỷ qua, sản lượng trung bình mỗi năm của M rosenbergii tăng 9-35,5%

về giá trị Năm 1993, tổng sản lượng là 17,164 tấn, trị giá 116,799,000 USD và năm

2005 đạt 205,033 tấn với trị giá 896,263,000 USD Việc nuôi trồng tôm càng xanh

đóng góp lớn vào ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu, cả về số lượng và giá trị M

rosenbergii được nuôi nhiều ở Châu Á và một số khu vực khác như Châu Phi,

Israel, Trung và Nam Mỹ (Nhan, 2009)

Tại Việt Nam, tôm càng xanh là đối tượng nuôi bản địa được nông dân ưa thích, được nhiều địa phương xác định là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao, đặc biệt là những khu vực nuôi tôm thương mại ở lưu vực sông Mê Kông Do đó nhu cầu về con giống cho việc nuôi đại trà là rất lớn

Tuy nhiên, trong quá trình tăng trưởng, con đực thường lớn nhanh hơn con cái Khi chiều dài cơ thể đạt trung bình 8-14 cm và trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển của con đực và con cái tương đương nhau Nhưng khi chiều dài cơ thể vượt quá 14 cm, con đực thường lớn nhanh hơn con cái (Lê Quang Khôi, 2009) Do ở giai đoạn này con cái ngưng phát triển và tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản (Ra`anan và Cohen, 1984) Tôm đực lớn nhất có thể đạt 110 g, trong khi tôm cái lớn nhất chỉ đạt 50 g sau 7 tháng nuôi (Lê Quang Khôi, 2009) Đây là một vấn đề gây trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm càng xanh thương phẩm vì con có kích thước càng lớn thì giá thành càng cao và sản lượng thu hoạch cũng sẽ tăng cao

Nghiên cứu của Sagi và Ra`anan trong năm 1988 đã chứng minh rằng việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đạt sản lượng cao hơn việc nuôi toàn cái hay đực và cái trong cùng quần thể Khối lượng trung bình của mỗi quần thể lần lượt là 473

2

g/m2, 248 g/m2 và 260 g/m2 Những nhà khoa học Ả Rập Xê Út cũng đã báo cáo những kết quả tương tự khi tiến hành thí nghiệm nuôi tôm toàn đực, toàn cái và hỗn hợp cả đực và cái (Siddiqui, 1997) Điều này thể hiện rằng việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đã làm tăng sản lượng một cách đáng kể và mang lại lợi nhuận cao hơn việc nuôi toàn cái hay hỗn hợp đực và cái Do đó, sự phát triển những kỹ thuật cho việc sản xuất quần thể toàn đực là nhu cầu cần thiết cho việc nuôi tôm càng xanh Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chức năng làm bất hoạt gene của iRNA trong tế bào tôm (Estrada và ctv, 2007) Và đây là một trong những công cụ

có tiềm năng đáp ứng cho việc sản xuất ra tôm càng xanh toàn đực Kỹ thuật bất hoạt RNA (Guo và Kempheus, 1995) đã được sử dụng như một công cụ hiệu quả để làm bất hoạt các sản phẩm gene bằng cách tiêm RNA mạch đôi vào trong cơ thể của nhiều loài giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008) Ý tưởng tạo ra con cái giả bằng cách làm bất hoạt RNA thông tin mã hóa gene tuyến đực insuline-like của tôm càng xanh

(Macrobrachium rosenbergii insuline-like androgenic gland, Mr-IAG) bằng RNA

mạch đôi (dsRNA) đã được thực hiện thành công tại quy mô phòng thí nghiệm (Ventura và ctv, 2009) Kể từ đó, kỹ thuật bất hoạt RNA hứa hẹn như là một hướng tiếp cận mới để tạo ra quần thể tôm toàn đực cho việc nuôi tôm càng xanh thương mại

Xuất phát từ những nhu cầu con giống tôm càng xanh đực từ thị trường thì

đề tài “Thực nghiệm công nghệ tổng hợp double stranded RNA vào nghiên cứu

chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879)” là cần thiết và đang được nhiều mong đợi

Mục tiêu đề tài là ứng dụng dsRNA để tạo ra tôm càng xanh cái giả, từ con cái giả này sẽ sản xuất ra tôm càng xanh toàn đực để đáp ứng nhu cầu cho việc nuôi tôm càng xanh thương phẩm

Những nội dung cần thực hiện là:

+ Tổng hợp Mr-IAG RNA mạch đôi cho kỹ thuật bất hoạt RNA

+ Kiểm tra hiệu quả của Mr-IAG RNA mạch đôi đối với việc chuyển đổi giới tính của tôm càng xanh với các nồng độ và tần suất tiêm khác nhau

3

+ Kiểm tra ảnh hưởng của thời gian tiêm Mr-IAG RNA mạch đôi lên

sự tạo thành tôm càng xanh cái giả

Phương pháp nghiên cứu của đề tài là thu thập thông tin từ các bài báo khoa học đã công bố, các nghiên cứu trong và ngoài nước, thu thập các số liệu thực nghiệm và xử lý bằng phần mềm excel

Các kết quả đạt được của đề tài:

+ Tổng hợp thành công dsRNA bằng bộ kit Promega

+ Khảo sát được nồng độ tiêm dsRNA 1,25 µg/g, tần suất tiêm 1 lần/tuần là có thể làm bất hoạt gene mã hóa cho hormone tuyến đực ở tôm PL25 để tạo ra tôm càng xanh cái giả

+ Thời gian tiêm dsRNA phải kéo dài đến khi con cái giả thành thục sinh sản

Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:

+ Chương 1 Tổng quan: giới thiệu sơ lược về tôm càng xanh

Macrobrachium rosenbergii, tổng quan về tuyến đực, cơ chế làm bất hoạt gene của

iRNA

+ Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: vật liệu sinh học là tôm PL25, phương pháp tổng hợp dsRNA theo bộ kit Promega, thí nghiệm tiêm được thực hiện với 3 nồng độ tiêm là 5 µg/g; 2,5 µg/g và 1,25 µg/g và các tần suất tiêm là 3 lần/ tuần, 2 lần/tuần và 1 lần/tuần Thí nghiệm thời gian tiêm được thực hiện trong vào 4 tháng với nồng độ tiêm là 1,25 µg/g và tần suất tiêm là 1 lần/tuần

+ Chương 3 Kết quả và thảo luận: nêu lên các kết quả đạt được là tổng hợp được dsRNA, nồng độ và tần suất tiêm dsRNA tốt nhất, tạo được con cái giả đến tháng thứ 4 của thí nghiệm

+ Chương 4 Kết luận và đề nghị: một số kết quả mà đề tài đã đạt được và đưa ra một số kiến nghị để làm hướng nghiên cứu trong tương lai

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Phân loại (New, 2002)

Tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1897), là loài đầu tiên được biết đến trong giống Macrobrachium và được công nhận lần đầu tiên vào năm

1705 Quá trình đặt tên cho tôm càng xanh cả giống và loài đã gặp khá nhiều khó

khăn trong lịch sử Trong quá khứ tên của giống bao gồm cả Cancer (Astacus) và

Palaemon Trước kia, tên M rosenbergii bao gồm Palaemon carcinus, P dacqueti,

và P rosenbergii và đến năm 1959 tên khoa học Macrobracchium rosenbergii xuất

hiện và được chấp nhận phổ biến ở hầu hết các nước

Loài: M rosenbergii (De Man, 1879)

Tên tiếng anh: Giant freshwater prawn

1.2 Đặc điểm sinh học của tôm càng xanh

1.2.1 Phân bố

Tôm càng xanh M rosenbergii phân bố tự nhiên ở Đông Nam Á, các nước ở

Nam Thái Bình Dương, phía Bắc châu Đại Dương và phía Tây của các đảo Thái Bình Dương (New và Singholka, 1982; New, 2002)

Tôm càng xanh phân bố ở tất cả các thủy vực nước ngọt và các thủy vực nước lợ của nhiều vùng trên thế giới (Nguyễn Việt Thắng, 2003) Môi trường sống

5

của tôm càng xanh đa dạng trong thủy vực nước trong cũng như nước đục Ở Việt Nam, tôm càng xanh phân bố chủ yếu ở các tỉnh Nam Bộ đặc biệt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2002)

1.2.2 Vòng đời và tập tính sống

Vòng đời của tôm càng xanh được chia làm 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu

ấu trùng và tôm trưởng thành Khi tôm đã trưởng thành, chúng thường sống trong môi trường nước ngọt như: sông, rạch, ao, hồ.…Cũng chính nơi đây xảy ra quá trình thành thục, phát dục và giao vĩ đẻ trứng Nhưng khi ôm trứng chúng có xu thế bơi ra vùng nước lợ từ 6-18 0/00, ở đó ấu trùng được nở ra và sống trôi nổi theo kiểu phù du Sau 11 lần lột xác với 12 giai đoạn biến thái ấu trùng (Nauplii) biến thành hậu ấu trùng (Postlarvae-PL) lúc này tôm con di cư về vùng nước ngọt, sống và lớn lên ở đây (Ling và Omerica, 1962; Nguyễn Thanh Phương, 2003)

Ấu trùng có tính hướng quang mạnh, vận động trôi nổi trong nước Sang thời

kỳ hậu ấu trùng và giai đoạn trưởng thành, tôm có tập tính sống ở đáy, bám vào cây cỏ; giá thể…Tôm trưởng thành ít hoạt động và thường ẩn náo vào ban ngày và tích cực hoạt động vào ban đêm Tôm càng xanh có tập tính ăn thịt lẫn nhau, vì vậy việc dùng giá thể tăng chổ ẩn nắp, hạn chế hiện tượng ăn thịt lẫn nhau để nâng cao tỷ lệ sống của tôm (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008)

1.2.3 Hình thái và tăng trưởng

Dựa vào hình dạng và màu sắc để phân biệt giữa tôm càng và các nhóm tôm khác Tôm càng xanh có cơ thể thon dài, đối xứng 2 bên Con trưởng thành thường

có màu xanh dễ nhận, đôi khi có màu nâu nhạt (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008)

Tôm càng xanh ở nước ta có trọng lượng cá thể khá lớn, con đực đạt tới 450 g/cá thể, thân tương đối tròn, cá thể trưởng thành có màu xanh dương đậm Chủy phát triển nhọn và cong lên ½ bề dài tận cùng của chủy, phía trên mắt chủy có 11-

15 răng và 3-4 răng sau hốc mắt Mặt dưới thường có 12-15 răng Chiều dài chủy của con cái khi trưởng thành thường bằng hoặc ngắn hơn vỏ đầu ngực, còn chủy của con đực dài hơn chiều dài ở đầu ngực (Lê Quang Khôi, 2009)

6

Hình 1.1 Tôm càng xanh M rosenbergii

Chân thứ 2 luôn phát triển hơn các chân khác, nhất là con đực trưởng thành, đôi chân bò thứ 2 có hình dạng và kích thước giống nhau ở 2 phía (trái và phải); (Lê Quang Khôi, 2009)

Đặc điểm về kích cỡ, hình dạng, màu sắc và các gai trên đôi càng sẽ thay đổi theo giai đoạn thành thục của tôm, nhất là ở tôm đực Khi tôm còn nhỏ, đôi càng có màu trong, sau chuyển thành vàng cam (còn gọi là càng lửa), chưa có gai hay có gai rất mịn trên càng, chưa có hay rất ít lông tơ Khi tôm lớn, đôi càng có màu xanh đậm, xuất hiện nhiều gai nhọn và lông tơ trên càng Quá trình thay đổi trên được thể hiện qua các giai đoạn như: tôm nhỏ, tôm càng lửa nhạt, tôm càng lửa đậm, tôm càng lửa đậm chuyển tiếp càng xanh, tôm càng xanh nhạt, tôm càng xanh đậm và tôm già (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009)

Trong quá trình tăng trưởng, con đực thường lớn nhanh hơn con cái Khi chiều dài cơ thể đạt trung bình 8-14 cm và trọng lượng 10-20 g, tốc độ phát triển

7

của con đực và con cái tương đương nhau Nhưng khi chiều dài cơ thể vượt quá 14

cm, con đực thường lớn nhanh hơn con cái (Lê Quang Khôi, 2009)

1.3 Đặc điểm sinh sản của tôm càng xanh

1.3.1 Phân biệt tôm đực và tôm cái

Tôm càng xanh trưởng thành không những dễ dàng phân biệt đực và cái qua đôi chân bò thứ 2 (càng) mà còn qua cơ quan sinh dục như lỗ sinh dục đực nằm ở gốc chân bò thứ 5, lỗ sinh dục cái nằm ở gốc chân bò thứ 3 (Nguyễn Việt Thắng, 1993)

Tôm đực có kích cỡ lớn hơn tôm cái cùng tuổi Đầu ngực tôm đực to hơn và khoang bụng hẹp hơn tôm cái Đôi càng thứ 2 to, dài và thô Cơ quan sinh dục trong của con đực gồm một đôi tinh sào, một đôi ống dẫn tinh và đầu mút Đôi tinh sào ngoằn ngèo nằm giữa mặt lưng của giáp đầu ngực nối với ống dẫn tinh chạy từ trước tim dọc sang 2 bên viềng sau của giáp đầu ngực và đổ vào đầu mút nằm ở đốt gốc của chân ngực thứ năm Túi tinh hình thành trong quá trình phóng tinh Túi tinh chứa khối tinh trùng không di động

Ở con cái, buồng trứng nằm trên mặt lưng của phần đầu ngực, giữa dạ dày và gan tụy Khi buồng trứng thành thục sẽ có màu vàng có thể nhìn thấy qua giáp đầu ngực, trải dài từ sau mắt đến đốt đầu của phần bụng Ống dẫn trứng nối từ buồng trứng ở trước tim chạy dọc 2 bên về phía bụng đổ về túi chứa tinh ở đốt gốc của chân ngực thứ ba (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009)

8

Bảng 1.1 Tóm tắt đặc điểm của tôm đực và tôm cái

Kích cỡ Lớn hơn và đầu ngực to

hơn tôm cái

Nhỏ hơn và đầu ngực nhỏ hơn tôm đực

Càng Đôi càng thứ 2 rất to, ghồ

ghề, nhiều gai

Nhỏ hơn và nhẵn hơn càng của tôm đực

Lỗ sinh dục Hiện diện dưới gốc của

chân ngực thứ năm và có nắp đậy

Hiện diện dưới gốc của chân ngực thứ ba, có màng mỏng bao phủ Bụng Mặt bụng có đốt thứ nhất

có điểm cứng ở giữa

Tôm cái thành thục có tấm bụng thứ nhất, thứ 2, thứ ba dài và nở rộng, hình thành buồng ấp trứng

Lông tơ sinh dục Không có Xuất hiện nhiều trên chân

ngực và chân bụng của tôm trưởng thành Tuyến androgenic Dãy tế bào dính vào vùng

cuối của ống dẫn tinh

Không có

Chiều dài và kích cỡ thành

thục

Chiều dài 17,5 cm, trọng lượng trung bình 35 g

Chiều dài 15 cm, trọng lượng trung bình 25 g Phụ bộ giao vĩ Xuất hiện những nhánh

trong và nhánh phụ trong của chân bụng thứ 2

Không có

(Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2009)

1.3.2 Thành thục, giao vĩ, đẻ trứng và ấp trứng của tôm càng xanh

Trong tự nhiên cũng như trong điều kiện nhân tạo, tôm thành thục và giao vĩ xảy ra hầu như quanh năm Mùa đẻ rộ của tôm càng xanh ở đồng bằng Nam Bộ tập trung từ tháng 4-6 và từ tháng 8-10 (Nguyễn Việt Thắng, 1993; Nguyễn Thị Thanh

Trong quá trình ấp trứng, tôm cái thường dùng chân bụng quạt nước, tạo dòng nước, cung cấp dưỡng khí cho trứng Thời gian ấp trứng đến trứng nở có thể

từ 15-23 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ nước (Nguyễn Thị Hồng Hạnh, 2008)

1.4 Tổng quan về tuyến đực

Hệ thống nội tiết của nhóm giáp xác gồm một phần của tuyến sinus và

cơ quan X nằm trong cuống mắt Cơ quan X sản xuất gonal-inhibiting hormone (GIH) và molt-inhibiting hormone được giữ trong tuyến sinus trước khi được lưu thông trong cơ thể Ở giáp xác cơ quan Y nằm trong trung tâm phần đầu ngực và sản xuất ra gonal-stimulating hormone (GSH) và ecdysone GIH và GSH tác động trực tiếp vào buồng trứng và gián tiếp vào tinh hoàn thông qua sự tiết hormone từ tuyến androgenic (AGH) Giáp xác có các cơ quan thuộc hàm dưới, các cơ quan neurohemal, đây là những vị trí tổng hợp và tiết ra methyl farnosoate, một loại hormone có vai trò quan trọng trong sự trưởng thành sinh dục ở con đực và con cái, phát triển hệ thống sinh sản rõ

Hình 1.2 Chân bơi thứ 2 của tôm càng xanh đực (Chung Quang Trí, 2006)

1.4.2 Tuyến đực

Những tế bào thuộc tuyến đực được quan sát đầu tiên bởi Faxon (1884) trong

tôm nước ngọt Cambarus montanus Tuyến hormone đã được xác định sau đó ở giáp xác Orchestia gammarellus vào 1953, và mô đó được gọi là tuyến đực

(Charniaux - Cotton, 1953) Những nghiên cứu sau này đã cho thấy rõ hơn về tuyến đực, nó là một lớp mô mỏng gắn ở phần cuối ống dẫn tinh của tôm nước ngọt

Procambarus blandingii, P viae - viridis, Camb bartonni và Camb diogenees, có

chiều dài vài milimet Những cấu trúc tương tự cũng đã được quan sát ở cua

Callinectes sapidus (King, 1964)

Theo Sagi (2001) “Ở giáp xác, tinh sào là nơi tạo tinh trùng còn cơ quan tạo hormone là tuyến đực Nếu ở con đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục đực (tinh sào) có 2 chức năng căn bản là tạo tinh trùng và nội tiết như testosterone thì ở

11

tôm càng xanh 2 chức năng này thực hiện bởi 2 cơ quan riêng lẻ Tinh sào ở tôm càng xanh chuyên tạo tinh, còn tuyến đực (androgenic gland) - một cơ quan biệt lập khác có chức năng tiết ra hormone, tham gia vào sự biệt hóa giới tính và phát triển những đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước và sự tăng trưởng”

Ở những tôm lớn người ta có thể thấy được tuyến đực tương đối rõ Đó là một khối tế bào có hình kim tự tháp, dính với phần sau ống phóng tinh (Chung Quang Trí, 2006)

1.4.3 Hormone tuyến đực

Hormone tuyến đực đã được tìm ra trên nhóm giáp xác chân đều

Armadilidium vulgare là một protein gồm có 3 chuổi peptide A (chứa 29 aa), B (44

aa), và C (45 aa), ngoài ra trên chuổi A ở aa thứ 18 còn có thêm một nhóm carboxyl (Martin và ctv, 1999)

1.5 Hoạt động của tuyến AG (Androgenic gland)

Tuyến androgenic có nhiều nhất là ở tôm đực càng xanh, chứa trong mạng lưới nội chất sần sùi của tế bào chất Hoạt động của tuyến androgenic đóng vai trò

kiểm soát hoạt động phát dục của M rosenbergii (Okumura và Hara, 2004)

Tuyến androgenic là hormone tuyến đực được xác định đầu tiên ở cua

Callinectes sapidus bởi Cronin (1947) Ở giáp xác 10 chân tuyến androgenic nằm ở

tận cùng của ống dẫn tinh Các tế bào được sắp xếp thành các lớp mỏng, song song

và nối nhau hay ở cấu trúc dạng thùy Ở M rosenbergii tuyến androgenic là sự kết

hợp của 2 cấu trúc trên (Sagi, 1995) Tuyến androgenic có vai trò trong điều khiển giới tính của giáp xác bộ mười chân Nó làm xuất hiện những đặc điểm hình thể bên ngoài của con đực (Taketomi và ctv, 1990)

Tuyến androgenic cũng là hormone chịu trách nhiệm biệt hóa giới tính đực ở giáp xác (Charniaux-Cotton và Payen, 1985; Katakura, 1989) Gần đây hormone tuyến androgenic đã được xác định là hormone peptide và trình tự cDNA của nó đã

được phát hiện ở Armadillidium vulgare (Martin và ctv, 1999; Okuno và ctv, 1999)

Tuyến androgenic có chức năng điều khiển giới tính đực khác nhau, tuyến

sinh dục khác nhau và sự phát triển của các phần phụ sinh dục ở tôm càng xanh M

12

rosenbergii (Nagamine và ctv, 1980) Sự phát triển của mạng lưới nội chất sần sùi

trong tế bào chất của tuyến androgenic có liên quan đến hoạt động sinh sản của con đực ở một vài loài giáp xác mười chân (King, 1964; Taketomi và ctv, 1990)

Ở tôm đực M rosenbergii, phân biệt 3 kiểu hình thái nhờ vào màu sắc và

chiều dài càng và hoạt động sinh sản: con đực nhỏ, con đực càng vàng và con đực càng xanh (Ra’anan và Sagi, 1985; Kuris và ctv, 1987) Mỗi kiểu hình thái được mô

tả để phân biệt hoạt động sinh sản khác nhau Con đực nhỏ có đôi càng ngắn, chưa

có hoạt động giao phối và phát triển thành con đực càng cam Con đực càng cam cơ thể phát triển nhanh chóng và không giao phối Con đực càng cam phát triển thành con đực càng xanh, con đực càng xanh có hoạt động giao phối với con cái trưởng thành Hoạt động sinh tinh thay đổi theo hình thái khác nhau; cao ở con đực nhỏ và con đực càng cam, nhưng thấp ở con đực càng xanh, tinh hoàn tôm đực càng xanh thì đầy tinh trùng chín và được sử dụng để dự trữ (Sagi và ctv, 1988) Sự khác biệt của các kiểu hình thái này chịu tác động kiểm soát của tuyến androgenic, đây là nền tảng cho thí nghiệm cắt bỏ tuyến androgenic (Sagi và ctv, 1990)

Theo Fingerman (1997), AGH là hormone điều khiển biệt hóa giới tính thành con đực và phát triển các đặc điểm sinh dục đực thứ cấp Sự tiết GSH và GIH được cho là do quy định của một số chất dẫn truyền thần kinh và tác động trực tiếp vào buồng trứng của con cái Ở con đực, GIH tác động lên tinh hoàn gián tiếp bởi sự điều khiển AG và sau đó giảm tiết AGH Hormone kích thích tuyến sinh dục là cần thiết để có sự sinh tinh xảy ra trong tinh hoàn

AG tham gia vào quá trình biệt hóa giới tính ở con đực thông qua việc tiết hormone AGH là tín hiệu ban đầu của tất cả các bước cần thiết trong quá trình biệt hóa giới tính và phát triển đặc điểm của con đực (Ohs và ctv, 2006) Nếu không có

AG hoặc sự tiết AGH không đủ thì tuyến sinh dục sẽ biệt hóa thành tuyến sinh dục cái (Sagi và ctv, 1995) Việc loại bỏ tuyến androgenic trong giai đoạn sớm của sự phát triển dẫn đến sự phát triển ngược thành con cái (Malecha và ctv, 1992)

1.6 Bất hoạt gene bằng iRNA (RNA interference)

1.6.1 Sơ lược về iRNA

iRNA là một hệ thống bên trong các tế bào sống, giúp kiểm soát được các gene đang hoạt động Đó là những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của các gene có trình tự tương đồng với nó Các phân tử iRNA này có thể gây nên các hiệu ứng: ức chế quá trình dịch mã của mRNA, ức chế sự phiên mã của gene ở trong nhân, phân giải mRNA

Quá trình iRNA xảy ra ở mức độ sau phiên mã và được kích hoạt bởi các đoạn dsRNA-còn được gọi là siRNA, đây là những đoạn được tạo ra từ các dsRNA dài nhờ sự phân cắt của enzyme RNase III Dicer hoặc được đưa vào từ bên ngoài Sau khi được đưa vào phức hợp RNA-inducing silencing (RISC) trong tế bào chất, siRNA sẽ làm mất các trình tự đặc hiệu tương đồng với trình tự mRNA của nó iRNA được khám phá đầu tiên bởi Andrew Fire và Craig Mello ở tuyến trùng

Caenorhabditis elegans và sau đó được tìm thấy trong các loài sinh vật khác, bao

gồm cả động vật có vú (Fire và ctv, 1998)

1.6.2 Lịch sử nghiên cứu iRNA

Đến những năm đầu thập niên 1990 một số nhà khoa học công bố kết quả nghiên cứu iRNA trên các tạp chí quốc tế (Napoli và ctv, 1990)

Năm 1992, Romano và Macino đã phát hiện ra hiện tượng bất hoạt gene hậu

phiên mã (PTGS) ở nấm men Neurospora crassa (Romano và Macino, 1992)

Năm 1995 trên tạp chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và Kemphues

đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng: Phân

tử sense RNA cũng gây ra sự ức chế gene (Guo và Kemphues, 1995)

14

Đến năm 1998, nhóm nghiên cứu Fire đã giải thích được điều nghịch lý này

bằng những thí nghiệm trên tuyến trùng C elegans (Fire và Mello, 1998)

Năm 2000, Zamore PD và ctv đã công bố việc phát hiện hiện tượng dsRNA dài bị phân cắt thành các đoạn ngắn khoảng 21-23 nucleotide bởi Rnase III (Dicer)

trên ruồi giấm Drosophila (Zamore PD và ctv, 2000)

Năm 2001, lần đầu tiên iRNA được mô tả trong các tế bào động vật có vú (Tuschl và ctv, 2001)

Năm 2006 giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho việc phát hiện cơ chế iRNA của 2 nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (Đại học Stanford) và Craig Mello (Đại học Massachusetts) (Won Noble Prize, 2006)

Năm 2010, lần đầu tiên chứng minh được rằng siRNA có thể sản xuất các gene ức chế đặc hiệu (giảm mRNA và protein) ở người hoạt động theo cơ chế iRNA (Davis ME và ctv, 2010)

1.6.3 Vai trò của iRNA trong điều khiển hoạt hóa gene, (Fire và Mello, 1998)

Chỉ có RNA sợi kép (dsRNA) có khả năng bất hoạt gene một cách hiệu quả, RNA sợi đơn (sense hoặc antisense) chỉ có khả năng gây bất hoạt yếu hoặc không

có khả năng gây bất hoạt gene

dsRNA gây bất hoạt một cách rất đặc thù, nó chỉ phân hủy một phân tử mRNA có các trình tự tương đồng với nó, các phân tử mRNA khác không bị ảnh hưởng

Các sợi dsRNA chỉ có khả năng gây bất hoạt gene khi có trình tự tương đồng với mRNA đã trưởng thành (mature RNA) (tức là mRNA đã ở ngoài tế bào chất và không còn mang các trình tự intron); Các trình tự tương đồng với intron hoặc promoter đều không có tác dụng Điều này cho thấy dsRNA gây bất hoạt gene ở giai đoạn sau phiên mã (post transcriptional gene silencing - PTGS) và xảy ra ở tế bào chất

Chỉ cần vài phân tử dsRNA trong một tế bào là đủ để hoàn thành quá trình phân hủy mRNA Điều này chứng tỏ dsRNA đã được nhân bản và tác dụng như một tác nhân xúc tác

15

Tác động của dsRNA có thể được lan rộng từ mô này sang mô khác và di chuyển giữa các tế bào

1.6.4 Cơ chế hoạt động của iRNA

Nghiên cứu hóa sinh iRNA ở ruồi giấm cho thấy RNA sợi kép (dsRNA) đã được phân cắt thành các đoạn dsRNA ngắn gồm 21-23 nucleotide (Tuschl và ctv, 1999) Họ cho rằng các phân tử dsRNA ngắn (siRNA-small interference RNA) đóng vai trò phân hủy mRNA Sau đó nhóm Fire và Mello đã xác định rằng dsRNA dài đã được cắt thành đoạn RNA ngắn (khoảng 25 nucleotide) và tiếp theo siRNA gây ra sự phân hủy mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA (Parrish và ctv, 2000)

16

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của iRNA

D Các siRNA được kết hợp vào các phức hợp RISC, bao gồm protein Argonaute (Ago) như là thành phần chính Ago tách ra và loại bỏ các thành phần không có tác dụng (sense) của siRNA có ảnh hưởng đến hoạt động của RISC

E và F Các sợi antisense của siRNA vẫn tồn tại và đóng vai trò như là sợi dẫn đường để các RISC tác động vào các mRNA tương đồng với nó, dẫn đến sự phân cắt các endonucleotide của mRNA đích (Fire và ctv, 1998)

1.6.5 Ứng dụng của iRNA trên động vật thủy sản

Cơ chế của iRNA là làm bất hoạt gene sau phiên mã, chức năng này của nó trong tự nhiên chịu trách nhiệm chống lại sự nhiễm trùng virut ở đa số loài Kết quả

là làm bất hoạt gene của Dicer-1 của virut trong tôm sú (Penaeus mondon) làm tăng

tỷ lệ chết của virut, cơ chế iRNA hoạt động mạnh mẽ và có chức năng miễn dịch tốt trên tôm Mức cao hơn là các Dicer ở tế bào bạch cầu nó đóng vai trò làm miễn dịch

tự nhiên ở trong tôm (Kitagishi, 2012)

Ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Dicer-2 bao gồm các miễn

dịch không đặc hiệu chống lại virut Dicer-2 góp phần vào chức năng miễn dịch không đặc hiệu ở tôm bằng cách nâng cao hiệu lực của iRNA (Kitagishi, 2012)

Làm bất hoạt gene đích và có hiệu lực cao, miễn dịch đặc hiệu chống lại virut đốm trắng (WSSV) hoặc virut Taura ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương

(Penaeus vannamei) bằng cách tiêm dsRNAs sợi dài có trình tự mã hóa cấu trúc

protein của virut Sử dụng dsRNA tác động vào gene mục tiêu của virut đầu vàng (YHV) sẽ thu được hiệu quả miễn dịch đặc hiệu giống như ở virut trên tôm sú

Penaeus monodon (Sarathi, 2010)

18

dsRNA can thiệp gián tiếp vào hầu hết các quá trình phiên mã gene, làm bất hoạt gene Chức năng của gene có thể được nghiên cứu trong các sinh vật dưới nước bằng cách sử dụng iRNA Kỹ thuật iRNA đã được ứng dụng trong 2 sinh vật ở

dưới nước: cá ngựa vằn (Danio rerio) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus schimitti)

Đại Tây Dương Kết quả đã chứng minh iRNA được sử dụng như là công cụ để nghiên cứu chức năng sinh học của các gene có liên quan đến sự phát triển của cá ngựa vằn Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hữu ích của dsRNA trong cơ thể tôm trưởng thành Hơn nữa, khả năng dsRNA ức chế chức năng của hormone hyperglycemic (CHH) trong tôm Đại Tây Dương cũng đã được nghiên cứu (Estrada

và ctv, 2007)

Ảnh hưởng iRNA trong tôm được giải thích bằng các thí nghiệm in vivo

bằng cách tiêm dsRNA có trình tự tương đồng với gene mã hóa gonal inhibiting

hormone (GIH) trong tôm cát Metapenaeus ensis dsRNA làm giảm sự biểu hiện

của GIH (Guan và ctv, 2004)

Công nghệ iRNA đã được nghiên cứu trên động vật thân mềm 2 mảnh, nó

quyết định chức năng của gene ở sò Crassostrea gigas Việc tiêm dsRNA tương

ứng với gene Oyster vasa-like gene (Oyvlg) vào trong tuyến sinh dục sẽ làm ức chế

quá trình giảm phân và làm bất hoạt sự sản sinh các tế bào phôi ở sò Crassostrea

gigas (Fabioux và ctv, 2009)

iRNA có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo cơ ở các tua khác nhau trên loài bạch

tuộc Sepia oficinalis (Grimaldi và ctv, 2004)

1.7 Các phương pháp chuyển đổi giới tính tôm càng xanh

1.7.1 Cơ sở lý thuyết

Cặp nhiễm sắc thể giới tính ở tôm càng xanh đực là đồng giao tử (ZZ) và con cái là dị giao tử (WZ) Để tạo dòng đơn tính toàn đực (100% tôm đực ZZ) thì cần có tôm bố và tôm mẹ có cùng NST ZZ Sơ đồ tạo dòng đơn tính đực:

1.7.2 Kỹ thuật chuyển giới tính

Sử dụng hormone đực hóa trộn vào thức ăn cho tôm ăn, hoặc hòa tan thành dịch để ngâm, tắm tôm trong những khoảng thời gian nhất định Đàn tôm toàn đực được tạo ra gồm các cá thể tôm đực có kiểu di truyền ZZ và tôm đực có kiểu di truyền WZ chuyển giới tính Kết quả sử dụng hormone chuyển giới tính tôm phụ thuộc vào một số yếu tố như loại hormone, thời gian, liều lượng sử dụng, giai đoạn phát triển của tôm khi đưa vào xử lý (Phạm Anh Tuấn, 2002)

1.7.3 Tạo tôm cái giả ZZ bằng hormone

Hiện nay, steroid được sử dụng để thay đổi kiểu hình giới tính cá khi ngâm hoặc tiêm hoặc qua chế độ ăn trước khi biệt hóa giới tính Điều này mang lại hy vọng trong việc sử dụng hormone để điều khiển giới tính ở động vật giáp xác Điều khiển chế độ ăn chứa hormone được xem là phương pháp thiết thực nhất trong quy

mô thương mại Tuy nhiên, phương pháp này mang lại những thách thức do khả năng mất các hormone do sự rò rỉ từ các viên thức ăn hoặc từ sự cố tiêu hóa, đặc biệt là mất do sự thay đổi của thức ăn chế biến trước khi tiêu thụ (Ohs và ctv, 2006) Năm 2006, Dewi và ctv đã dùng hormone 17β-estradiol bổ sung vào thức ăn

để điều khiển giới tính tôm càng xanh Kết quả thu được là 17β-estradiol không ảnh hưởng đến tỷ lệ đực cái ở tôm càng xanh (Dewi và ctv, 2006)

Năm 2004, Baghel và ctv đã nghiên cứu ảnh hưởng chuyển đổi giới tính khi cho ấu trùng tôm càng xanh ăn artemia đã làm giàu với 17α-methyltestosterone, dạng steroid của động vật có xương sống, kết quả cho thấy 17α-methyltestosterone

có tác dụng chuyển đổi giới tính của tôm càng xanh từ cái thành đực Nhưng năm

2006, Ohs và ctv dùng 17α-methyltestosterone bổ sung vào thức ăn để chuyển giới tính tôm càng xanh, tuy nhiên kết quả lại cho thấy 17α-methyltestosterone không có

20

tác dụng trong việc chuyển đổi giới tính tôm càng xanh (Ohs và ctv, 2006) Như vậy, 17α-methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính ở tôm càng xanh là chưa xác định

Năm 2006, Ohs và ctv cho hậu ấu trùng của tôm càng xanh thường (50 % đực, 50 % cái) ăn thức ăn có bổ sung dopamine với 3 nồng độ 0,15; 1,5; và 15 ppm trong vòng 60 ngày Kết quả ở nhóm đối chứng có tỷ lệ tôm cái là 62,6 %, trong khi

đó 3 nghiệm thức cho tôm ăn thức ăn bổ sung dopamine với nồng độ 0,15; 1,5 và 15 mg/kg có tỷ lệ tôm cái lần lượt là: 80,9 %; 88 %; và 71 % Kết quả cho thấy có sự chênh lệch đáng kể giữa nhóm không và có cho ăn thức ăn có bổ sung dopamine Thử nghiệm đã tạo ra một tiềm năng sử dụng dopamine để tạo ra tôm càng xanh toàn đực phục vụ cho sản xuất

1.7.4 Kỹ thuật cắt tuyến androgenic tạo tôm cái giả ZZ

Việc cắt bỏ tuyến hormone androgenic trong tôm M rosenbergii (nằm ở

phần sau của ống phóng tinh) sẽ ảnh hưởng lên các đặc điểm giới tính chính và phụ của con đực tạo nên sự chuyển giới để sản xuất ra “con cái giả”, dẫn đến sự tạo trứng, sự phát triển của vòi trứng và lỗ sinh sản của con cái trong con đực đã chuyển giới trong giai đoạn phát triển còn non nhất Sự tạo trứng chỉ bắt đầu khi trong con đực đã được chuyển giới trong thời kỳ phát triển rất non, nếu tác động vào các con đực trong giai đoạn phát triển muộn hơn thì nó chỉ chuyển giới không hoàn toàn hoặc không hề chuyển giới (Nagamine và ctv, 1980)

Việc loại bỏ AG ở con đực, làm mất AGH gây nên hiện tượng: con đực thành con cái mang NST ZZ Kỹ thuật vi phẫu loại bỏ tuyến androgenic được thực hiện lần đầu tiên bởi Sagi và ctv năm 1990 Ở Việt Nam kỹ thuật vi phẫu đã được thực hiện và thành công năm 2004 (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2004)

Sagi và Cohen vào năm 1990 đã cho biết “Khi cho những con cái chuyển giới khoẻ mạnh lai với con đực thông thường sẽ cho ra một dòng con toàn đực Điều này mở ra tiềm năng của công nghệ tạo con cái để có thể sản xuất ra quần thể

hoàn toàn đơn tính đực đối với tôm càng xanh M rosenbergii Hiện nay, Israel và

vi phẫu thành tôm cái giả có thể sinh sản được thì không ổn định Vì vậy, cần tìm ra các phương pháp mới để cải thiện các hạn chế của kỹ thuật vi phẫu nhằm tạo nguồn tôm toàn đực để tăng sản lượng cho người nuôi

1.7.5 Cấy tuyến đực vào tôm cái

Trong một thí nghiệm người ta đã cấy mô tuyến đực từ tôm càng xanh đực trưởng thành cho những tôm giả định là cái còn non Những con cái với kích thước

vỏ đầu ngực 6,5-7,5 mm đã chuyển đổi giới tính thành đực gần như 100 % Người

ta đã phối giống những con đực chuyển giới từ cái với những con cái bình thường Kết quả thu được 1 đực/3,2 cái, phù hợp với giả thuyết cơ chế NST định đoạt giới

tính ở tôm càng xanh là ZW (Malecha và ctv, 1992)

22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm

Thí nghiệm được thực hiện từ ngày 01 tháng 02 năm 2012 đến ngày 21 tháng

07 năm 2012 tại phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2 (116 Nguyễn Đình Chiểu, phường Đakao, quận 01, Thành Phố Hồ Chí Minh)

23

- Thang DNA ladder

2.2.2.2 Dụng cụ thí nghiệm

- Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml

- Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow)

- Micropipet các loại (Bio - rad)

- Đầu tip các loại

- Máy luân nhiệt iCycle (Bio - rad)

- Máy điện di (Bio - rad)

- Máy chụp ảnh điện di GeldocX (Bio - rad)

- Bồn ủ nhiệt

- Block nhiệt

- Lò viba (Electrolux - Thụy Điển)

- Tủ mát, tủ âm (Sanyo - Nhật)

- Kính hiển vi CH40:OLYMPUS (Japan)

- Kim tiêm Exmire Microsyringe (Fuji, Japan)

- Hệ thống tuần hoàn nước

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Quy trình tổng hợp Mr-IAG dsRNA ở phòng thí nghiệm

Mr-IAG dsRNA được tổng hợp bằng bộ kit Promega

Vector tái tổ hợp pGEM-Mr-IAG được sử dụng từ phần nghiên cứu “Phát

triển phương pháp tạo tôm càng xanh cái giả Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1897) bằng phương pháp bất hoạt gene” của nghiên cứu viên tập sự Lê

Chính, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2

Trong phương pháp tổng hợp này cDNA mạch khuôn sẽ mang T7 promoter

ở 2 đầu mạch bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu có T7 promoter ở đầu 5’ (Ongvarrasopone và ctv, 2007) dsRNA sẽ được tổng hợp trực tiếp từ cDNA mạch khuôn mang T7 promoter ở 2 đầu sau phản ứng PCR khuếch đại DNA

Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại đoạn mạch khuôn mang T7 ở 2 đầu, chuẩn bị 2 hỗn hợp phản ứng PCR dùng để tổng hợp và một hỗn hợp dùng để làm

mang T7 promoter ở 2 đầu

25

Thực hiện phản ứng PCR với chu trình nhiệt như sau:

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR để tổng hợp cDNA mạch khuôn mang

T7 promoter ở 2 đầu Khi phản ứng PCR kết thúc, tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 % chứa sẵn gel red (5 µl gel red/100 ml) Chạy điện di trong dung dịch đệm TBE 0,5X, 100 V trong thời gian 45 phút Sau thời gian điện

di gel được chuyển vào máy GeldocX, chỉnh gel ngay ngắn và đóng cửa an toàn, sau đó bật đèn UV Camera sẽ tự động chụp ảnh và hiển thị sản phẩm trên màn hình máy tính

Sản phẩm PCR được dùng làm mạch khuôn để tổng hợp dsRNA bằng cách

sử dụng T7 Express RiboMax RNAi system kit (Promega, Mỹ)

Đầu tiên, pha hỗn hợp phản ứng để tổng hợp dsRNA gồm: 10 μl RiboMAXTM Express T7 2X Buffer, 4 μl Nuclease-free water, 4 μl cDNA mạch khuôn có T7 promoter ở 2 đầu và 2 μl Enzyme Mix T7 Express Sau đó ủ trong bể ủ nhiệt ở 370C, qua đêm Sau khi ủ, chuyển eppendorf tổng hợp dsRNA vào heater ở

700C trong vòng 10 phút để lai các mạch ssRNA lại với nhau Cho vào tủ lạnh để làm mát dung dịch (40C) Tiếp theo, thêm 1 μl TURBO DNase để phân hủy cDNA mạch khuôn, ủ 370C trong 15 phút Làm sạch sản phẩm Mr-IAG dsRNA bằng RNase A có nồng độ 10 ng/μl để loại bỏ hết những RNA mạch đơn nếu được tạo ra