Đồ án tốt nghiệp khảo sát khả năng ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus sp l5 vào bảo quản và xử lí hạt bắp

Các hợp chất sinh ra từ vi khuẩn lactic ngày càng được chú trọng trong bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sinh hợp chất kháng các vi sinh vật có hại.. Cùng với khả năng kháng các loài nấm b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ

MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG DỊCH NUÔI CẤY

VI KHUẨN LACTOBACILLUS sp L5 VÀO BẢO QUẢN

VÀ XỬ LÍ HẠT BẮP

Ngành: Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ HAI

TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

TP Hồ Chí Minh, 2017.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Sinh viên thực hiện luận văn

Nguyễn Xuân Việt

Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương và cô Nguyễn Thị Hai đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em có cơ hội được thực hành, vận dụng những kiến thức đã học vào công việc thực tế và hoàn thành luận văn với kết quả tốt nhất Cuối cùng xin cảm ơn các bạn làm luận văn ở phòng thí nghiệm đã chia sẻ những kinh nghiệm, giúp

đỡ em trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Bài báo cáo được thực hiện trong khoảng thời gian hơn 3 tháng Bước đầu đi vào thực tế, tìm hiểu về lĩnh vực bảo quản hạt nông sản bằng chất bảo quản có nguồn gốc sinh học, tuy nhiên kiến thức của em còn hạn chế Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô để em có kiến thức và kỹ năng tốt hơn cho công việc trong tương lai

Tp Hồ Chí Minh, 6/2017

Nguyễn Xuân Việt

MỤC LỤC

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài: 1

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2

2.1 Ngoài nước 2

2.2 Trong nước 3

3 Mục đích nghiên cứu 3

4 Mục tiêu nghiên cứu 3

5 Nội dung nghiên cứu 3

6 Phương pháp nghiên cứu 4

6.1 Phương pháp luận 4

6.2 Phương pháp xử lí số liệu 4

7 Kết quả đạt được 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan về nấm 6

1.1.1 Giới thiệu chung 6

1.1.2 Phân loại nấm 6

1.1.3 Một số độc tố và tác hại của độc tố nấm mốc 7

1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic 20

1.2.1 Đặc điểm chung 20

1.2.1.1 Hình thái và dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 20

1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 20

1.2.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic 22

1.2.2 Khả sinh sinh các hợp chất kháng khuẩn của các chủng LAB 24

1.2.2.1 Bacteriocin 24

1.2.1.2 Phân loại bacteriocin 25

1.2.3 Khả năng kháng nấm của LAB và ứng dụng 27

1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của LAB 27

1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn LAB 29

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Địa điểm nghiên cứu: 30

2.2 Thời gian thực hiện: 30

2.3 Vật liệu nghiên cứu 30

2.3.1 Vật liệu: 30

2.3.2 Hoá chất và môi trường sử dụng: 30

2.3.2.1 Hoá chất: 30

2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy: 31

2.4 Thiết bị và dụng cụ: 31

2.4.1 Thiết bị: 31

2.4.2 Dụng cụ: 31

2.5 Phương pháp luận: 32

2.5.1 Mục tiêu đồ án: 32

2.5.2 Nội dung: 32

2.6 Phương pháp nghiên cứu: 33

2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu: 33

2.6.2 Khảo sát hình thái vi khuẩn 34

2.6.2.1 Nhuộm Gram 35

2.6.2.2 Nhuộm bào tử 36

2.6.2.3 Thử nghiệm di động 37

2.6.2.4 Thử nghiệm Catalase 38

2.6.2.5 Hàm lượng acid tổng 38

2.6.2.6 Thử nghiệm khả năng lên men đường 39

2.6.2.7 Thử nghiệm Protease 39

2.6.2.8 Thử nghiệm Chitinase: 40

2.6.3 Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn Lactobacillus L5 40

2.6.3.1 Định tính khả năng sinh IAA 40

2.6.3.2 Định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy 40

2.6.4 Khả sát khả năng phát triển của chủng nấm Fusarium sp.: 41

2.6.5 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Fusarium sp.: 43

2.6.6 Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 đến độ khoẻ mầm ở cây bắp45 2.6.7 Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy sau gia nhiệt của chủng Lactobacillus sp L5 với Fusarium sp.: 46

2.6.8 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch buôi cấy chủng Lactobacillus sp L5 đối với sự nảy mầm của hạt 49

2.6.9 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus spp L5 có cảm nhiễm nấm mốc đối với sự nảy mầm của hạt 52

2.3.9 Ứng dụng sử dụng dịch nuôi cấy bảo quản hạt bắp 55

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 57

3.1 Khảo sát sinh lý, sinh hóa và tính thuần của chủng Lactobacillus sp L5 57

3.1.1 Hình thái khuẩn lạc trên đĩa MRS Agar 57

3.1.2 Hình thái tế bào 58

3.1.3 Thử nghiệm Catalase 59

3.1.4 Khả năng di động 59

3.1.5 Hàm lượng acid tổng 61

3.1.6 Khả năng lên men đường 61

3.1.7 Thử nghiệm Chitinase 62

3.1.8 Thử nghiệm Protease 63

3.2 Định tính và định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 64

3.3 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với chủng nấm mốc Fusarium sp.: 67

3.4 Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sau gia nhiệt 69

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 đối với sự phát triển của hạt bắp 72

3.5.1 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới thời gian nảy mầm 72 3.5.2 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới tỉ lệ nảy mầm 74

3.5.3 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới chiều cao 76

3.5.4 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới chiều dài rễ 80

3.5.5 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới sinh khối tươi 84

3.6 Ứng dụng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt 89

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 95

4.1 Kết luận 95

4.2 Kiến nghị 95

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BVTV: Bảo vệ thực vật

KĐKTH: Không đun, không trung hoà

KĐTH: Không đun, trung hoà

KTHCN: Không trung hoà, cảm nhiễm

KTHKCN: Không trung hoà, không cảm nhiễm

LAB: Lactic acid bacteria

MRS: Man De Rogosa and Sharpe

PDA: Potato Dextrose Agar

PDB: Potato Dextrose Broth

THCN: Trung hoà, cảm nhiễm

THKCN: Trung hoà, không cảm nhiễm

VSV: Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số loại nấm và độc tố của chúng 17

Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động 23

Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men 28 Bảng 3.1: Hàm lượng % acid lactic của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 61

Bảng 3.2: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp L5 62

Bảng 3.3: Kết quả biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ IAA 64

Bảng 3.4: Đường kính phát triển của chủng nấm mốc Fusarium sp 66

Bảng 3.5: Tỉ lệ ức chế (%) chủng nấm mốc Fusarium sp của Lactobacillus sp L5 68

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của các mức xử lí nhiệt sau 15 phút đến tỉ lệ ức chế Fusarium sp. 69

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới thời gian nảy mầm 72

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới tỉ lệ nảy mầm 74

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều cao của cây bắp ngày 7 76

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới rễ sau 7 ngày 80

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới sinh khối tươi sau 7 ngày 84

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến độ khoẻ mầm sau 7 ngày 86

Bảng 3 13: Khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 ở các nghiệm thức ứng dụng bảo quản hạt bắp 89

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cấu trúc hoá học của Trichothecennes và Detoxified 13

Hình 3.1: Khuẩn lạc Lactobacillus sp L5 trên đĩa MRS Agar (Trái) và khuẩn lạc quan sát dưới kín hiển vi (phải) 57

Hình 3.2: Vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sau nhuộm Gram 58

Hình 3.3: Vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sau nhuộm bào tử 58

Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính của L5, Đối chứng âm vi khuẩn Lactobacillus sp L5 trong nước cất, Thử nghiệm dương tính đối với Bacillus spp 59

Hình 3.5: Khả năng di động của chủng Lactobacillus sp L5 60

Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp L5 62

Hình 3.7: Thử nghiệm chitinase của chủng Lactobacillus sp L5 62

Hình 3.8: Thử nghiệm protease của chủng Lactobacillus sp L5 63

Hình 3.9: Dịch nuôi cấy sau ly tâm đổi màu khi cho thuốc thử so với ĐC 64

Hình 3.10: Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA (μg/ml) 65

Hình 3.11: Khả năng phát triển của các chủng nấm mốc Fusarium sp trên môi trường MRS Agar cải tiến và PDA sau 3 ngày 66

Hình 3.12: Hình thái sợi nấm và bảo tử nấm mốc Fusarium sp dưới kính hiển vi 67

Hình 3.13: Khả năng ức chế nấm của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5 đối với nấm mốc Fusarium sp 68

Hình 3.14: Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 lên khả năng kháng Fusarium sp 70

Hình 3.15: Khả năng ức chế nấm của chủng Lacotbacillus sp L5 sau khi gia nhiệt 71

Hình 3.16: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy trước và sau gia nhiệt đối với thời gian nảy mầm của hạt bắp 73

Hình 3.17: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới tỉ lệ

nảy mầm 75

Hình 3.18: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới chiều cao cây bắp 77

Hình 3.19: Chiều cao cây NT THKCN sau 7 ngày 78

Hình 3.20: Chiều cao cây NT THCN sau 7 ngày 78

Hình 3.21: Chiều cao cây ở NT KTHKCN sau 7 ngày 79

Hình 3.22: Chiều cao cây ở NT THKCN sau 7 ngày 79

Hình 3.23: Đồ thị thể hiện chiều dài rễ ở các nghiệm thức sau 7 ngày 81

Hình 3.24: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THKCN sau 7 ngày 82

Hình 3.25: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THCN sau 7 ngày 82

Hình 3.26: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTH KCN sau 7 ngày 83

Hình 3.27: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTHCN sau 7 ngày 83

Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện sinh khối tươi của cây ở các NT sau 7 ngày 85

Hình 3.29: Đồ thị biểu thị độ khoẻ của mầm cây bắp sau 7 ngày 87

Hình 3.30: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của các nghiệm thức dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 90

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài:

Các loại hạt nói chung và hạt nông sản nói riêng là một phần quan trọng trong quá trình tồn tại và phát triển của loài ngoài người Cho nên con người ngày nay luôn tìm các tăng sản lượng hạt nông sản lên tối đa trên cùng một đơn vị diện tích Tuy nhiên chỉ tăng sản lượng hạt nông sản phục vụ cho mục đích cuối cùng vẫn chưa đủ Sau khi thu hoạch hạt vẫn rất dễ bị tổn thương trong quá trình bảo quản và chế biến, nó ảnh hưởng nhiều đến giữ giống cho mùa vụ sau hay ảnh hưởng tới chất lượng và giá trị của nông sản Vì vậy ngoài nghiên cứu để nâng cao sản lượng thu hoạch chúng ta cần tiến hành song song quá trình nghiên cứu bảo quản và khả năng nảy mầm của nông sản sau thu hoạch Để làm được điều đó là một công việc không dễ dàng

Công nghệ bảo quản hạt nông sản có nhiều phương pháp khác nhau nhưng cơ bản có 3 phương pháp đó là vật lý, hoá học và sinh học Nhưng ngày nay người ta càng ngày càng chú trọng đến phương pháp bảo quản bằng sinh học do có nhưng ưu điểm vượt trội của nó như an toàn với người sử dụng, không ảnh hưởng đến cảm quan màu sắc, mùi vị của nông sản sau thu hoạch Các hợp chất sinh ra từ vi khuẩn lactic ngày càng được chú trọng trong bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sinh hợp chất kháng các

vi sinh vật có hại Việc chú trọng bảo quản thực phẩm tươi sống như thịt cá trứng sữa, rau của quả là tối cần thiết nhưng việc bảo quản các loại hạt nông sản cũng rất quan trọng trong cuộc sống con người

Hạt bắp là một trong 5 loại hạt ngũ cốc quan trọng của nước ta Do chúng ta chỉ tập trung vào số lượng nên chất lượng chưa thực sự tốt dẫn đến khả năng xuất khẩu của

hạt bắp không cao Hạt bắp rất dễ bị nhiễm các loại nấm như Aspergillus spp làm mốc hạt, hay nấm Fusarium spp làm thối thân thối bắp hay nấm Helminthosporium spp gây bệnh đốm lá trên cây bắp Trong đó loài Fusarium spp không chỉ gây hại cho hạt

bắp ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm do chúng sinh độc tố như Zearelenone, Vomitoxin mà còn ảnh hưởng tới khả năng hô hấp của con người và động vật khi sử

dụng bắp nhiễm Fusarium spp Cùng với khả năng kháng các loài nấm bệnh của các

chủng lactic trên hạt đã và đang được nghiên cứu rộng rãi trong và ngoài nước Nước ta

có các sản phẩm lên men truyền thống và công nghiệp khi sử dụng các chủng vi khuẩn lactic được chứng minh thực tế là an toàn với người sử dụng nên người thực hiện thấy

đây là vấn đề cấp thiết nên đã thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng ứng dụng dịch

nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp L5 vào bảo quản và xử lí hạt bắp”

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1 Ngoài nước

Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm khác nhau như:

 “Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium

in vitro và trong nấu mạch nha lúa mạch” của A Laitila (2002)

 Năm 2004, Cassandra De Muynck nghiên cứu “Khả năng kháng nấm của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm”

 Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic

phân lập từ kim chi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005

 R Munoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của

Aspergillus nomius của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae” năm 2010

 Ghisian và cs (2005) đã nghiên cứu sự sản xuất Fumonissin từ các loài

Fusarium phân lập từ ngũ cốc tươi ở Iran Kết quả phân lập được 3619 chủng Fusarium verticilloides và Fusarium proliferatum từ 92 mẫu ngũ cốc mới thu

hoạch tại 4 vùng địa lí khác nhau của Iran, đồng thời cũng xác định được hàm lượng Fumonissin mà chúng tạo ra trên môi trường ngũ cốc

2.2 Trong nước

Hiện tại nước ta cũng có khá nhiều công trình nghiên cứu vi khuẩn kháng nấm bệnh trên các loại cây và hạt khác nhau tiêu biểu như:

 Chế phẩm Bimix của trung tâm công nghệ sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh

xử lí mùi hôi trong chăn nuôi khi kết hợp xử dụng sản phẩm sau lên men của

3 chủng Bacillus subtillis, Streptomycess sp, Saccharomycess cerevisiae Sản

sinh enzyme ngoại bào để ức chế nấm mốc gây bệnh

3 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu và sản xuất chế phẩm có nguồn gốc sinh học để bảo quản và khả năng nảy mầm của hạt bắp khỏi nấm bệnh gây hại từ vi khuẩn lactic

4 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát khả năng bảo quản hạt của dịch nuôi cấy của chủng Lactobacillus sp L5

trong bảo quản và sự phát triển của hạt bắp

5 Nội dung nghiên cứu

Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 và các chủng nấm Fusarium sp Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5

Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5

Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Fusarium sp

Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy ở sau khi đun ở các nhiệt độ, pH

khác nhau của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Fusarium sp

Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 kích thích sinh trưởng

Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic đối với các nấm gây

hư hỏng hạt ngũ cốc và sinh độc tố, người thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm hạt Sau khi xác định tác nhân gây ức chế là dịch nuôi cấy, sẽ sử dụng trức tiếp để ứng dụng trong bảo quản hạt bắp đã cảm nhiễm nấm mốc Sau đó thử nghiệm khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với khả năng nảy mầm của hạt bắp

Xác định được khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy được đun ở các nhiệt độ

65oC, 80oC, 100oC trong 15 phút, trung hoà pH = 6 và không trung hoà

Xác định được ảnh hưởng của dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn Lactobacillus

sp L5 ở các mức nhiệt độ và các độ pH đối với khả năng nảy mầm của hạt bắp

Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 kích thích sinh trưởng

của hạt bắp

Ứng dụng trong bảo quản hạt bắp, thúc đẩy quá trình nảy mầm của hạt bắp

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nấm

1.1.1 Giới thiệu chung

Nấm (Fungi, Mycota) là một giới trong số năm giới theo hệ thống phân loại của

R H Whittaker (1996) Nấm thuộc ngành nấm (Euphycophyta), là bộ môn nghiên cứu của nấm học (Mycology), là một ngành khoa học độc lập với vi sinh vật Tuy nhiên có một số nhóm nấm (nấm men, nấm mốc) do kích thước nhỏ bé và muốn nghiên cứu phải sử dụng các phương pháp vi sinh vật học nên được coi là đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật học Nấm có nhiều đặc điểm giống với thực vật nhưng khác với thực vật

ở chổ không có sắc tố quang hợp và cơ thể ít phân hóa về mặt hình thái

Nấm tồn tại và phân bố khắp trng tự nhiên như đất, nước, rễ thân lá quả hạt cây Chúng có khả năng sinh độc tố có hại cho con người, động vật và thực vật Tuy nhiên chúng lại có vai trò rất quan trọng trong việc phân giải các hợp chất trong tự nhiên có chứa cellulose, protein, lipid, kitin, pectin,… đảm bảo chu trình khép kín trong tự nhiên

1.1.2 Phân loại nấm

Dựa theo tổ chức hình thái, nấm được chia thành 4 lớp chính:

Lớp Phycomycetes (lớp nấm tảo): Sợi không có vách ngăn ngăn, bào tử gồm 2

lớp phụ: Oomycetes (nấm noãn) và Zygomycetes (nấm tiếp hợp)

Lớp Ascomycetes (lớp nấm túi): Sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính bằng túi

bào tử, sinh sản hữu tính theo kiểu tạo túi (namg) và túi bào tử (ascospore)

Lớp Basidiomycetes (lớp nấm đảm): Sinh sản hữu tính theo kiểu tạo đảm bào tử

(basidiospore) Gập ở các nấm có tai nấm: Nấm rơm, nấm hương

Lớp Deuteromycetes (lớp nấm bất toàn): Không có khả năng sinh sản hữu tính và

có 3 bộ

1.1.3 Một số độc tố và tác hại của độc tố nấm mốc

Theo Nguyễn Thị Hiền (2009) cho biết:

Trong 300 loại độc tố vi nấm đã biết, chỉ có 20 loài ảnh hưởng đến sức khỏe con người, khoảng 15 loài gây ung thư Trong một thời gian dài, người ta ít chú ý đến khả năng gây bệnh trong thực phẩm bị mốc Nhưng vào năm 1960, hơn 100000 con gà tây

ở Anh đã bị chết một cách rất khó hiểu Sau đó, người ta đã phát hiện ra nguyên nhân

là những con gà này đã ăn bột lạc nhiễm Aspergillus flavus, chính nấm mốc này đã tạo

ra những độc tố nguy hiểm Nhờ phát hiện này người ta đã khẳng định rằng con người cũng có thể bị bệnh nếu ăn phải những hạt mốc, kể cả với lương rất nhỏ

Một số độc tố thường gặp như sau:

 Aflatoxin, Ochratoxins do Aspercillus spp

Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 1200oC, phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa Tuy nhiên nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp và độc nhất là aflatoxin B1

Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng được hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hoàn toàn

Theo Bộ môn Dược lý – Vệ sinh an toàn thực phẩm (2011), cho biết:

Aflatoxine liên quan tới các bệnh khác nhau ở gia súc, vật nuôi trong nhà cũng như con người; là loại độc tố nấm mốc được nghiên cứu rộng và sâu nhất trên toàn thế giới

Cần lưu ý rằng aflatoxin có thể sinh ra trong ngũ cốc ngay cả trước khi thu hoạch, trong thu hoạch và sau thu hoạch nếu ngũ cốc không được bảo quản đúng cách hay được sinh ra trong thức ăn chăn nuôi trước khi được sử dụng Nói chung, khi aflatoxin sinh ra, khó có thể làm gì để loại bỏ chúng khỏi ngũ cốc hay thức ăn chăn nuôi Các loại độc tố này có cấu tạo hoá học rất ổn định và không bị phá huỷ bởi nhiệt, ánh sáng, axit, xử lý kiềm, hay kéo dài thời gian lưu trữ

Khi người và động vật ăn phải thực phẩm chứa độc tố nấm mốc Aflatoxin có thể gây đến ngộ độc cấp tính hoặc mãn tính

có hoại tử nhu mô gan và chảy máu

Theo Bộ môn Dược lý – Vệ sinh an toàn thực phẩm (2011), cho biết:

Biểu hiện ngộ độc aflatoxine lâm sàng ở người đã được thống kê khắp nơi trên thế giới Triệu chứng đặc trưng là nôn ọe, đau bụng, phù phổi, hôn mê và chết do phù não và chất béo cuộn vào gan, thận và tim

Ngộ độc mãn tính:

Hiện nay, một loạt các nghiên cứu trên người cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát tăng ở những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với aflatoxin, nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người như thế nào vẫn còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên đã tìm thấy sự gắn kết của aflatoxin B1 với AND của tế bào gan ở những bệnh nhân bị ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn được tìm thấy trong máu ngoại vi, trong máu rau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với aflatoxin B1 Bên cạnh đó còn có sự liên quan giữa phơi nhiễm aflatoxin B1 với sự đột biến gen ở các bệnh nhân này, mà nhiều nhất là sự đột biến gen p53 – một gen kiểm soát sự chết

tế bào theo chương trình, khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên kéo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển thành ác tính

 Ochratoxins

Ochratoxins là chất dẫn xuất isocoumarin Nó chủ yếu được sinh ra từ nấm mốc

Aspergillus ochraceus và Penicillium viridicatum, nhưng cũng có khi từ loại nấm mốc

khác Độc tố này xuất hiện trong quá trình lưu kho khi nấm mốc nhiễm vào ngũ cốc và

đỗ, đặc biệt ở thời tiết lạnh và ôn đới Độc tố được sản sinh mạnh nhất và nhiều nhất ở

20 - 25oC Trong số các ochratoxin, ochratoxin A(OTA) có độc tính mạnh nhất

Cơ quan nghiên cứu ung thư đã phân chia OTA thành nhóm 2B carinogen Trong chăn nuôi, thương tổn do nhiễm độc ochratoxin A xuất hiện chủ yếu ở gia cầm và heo Tuy nhiên tất cả các gia súc phòng thí nghiệm đã qua thử nghiệm đều rất dễ bị thương tổn khi ăn thức ăn có độc tố ochratoxins Khi tiêu thụ thức ăn chứa khoảng vài trăm ppb độc tố ochratoxins A dẫn tới chuyển hóa thức ăn kém, tỷ lệ tăng trưởng giảm và phát triển kém, kèm theo là giảm sức đề kháng chống lại các vi khuẩn và virus

Độc tính:

Độc tố này chủ yếu gây bệnh cho đông vật nhất là lợn và các loài dạ dày đơn Đặc điểm nổi bật khi nhiễm độc tố này là tiêu thụ nước tăng và đi tiểu nhiều do sự tổn thương thận Khi mổ thấy thận thường to và màu xám với bề mặt vỏ thận không nhẵn nhụi và xơ vỏ thận

Không ảnh hưởng tới loài nhai lại

Quá trình chế biến: Khi làm tương, xì dầu phải phải chọn thực phẩm tốt và phải chọn mốc đúng chủng loại

Kiểm tra và giám sát chặt chẽ thức ăn cho người và vật nuôi

Xử lý nghiêm túc theo các quy định và luật vệ sinh an toàn thực phẩm

Nghiên cứu, áp dụng các biện pháp xử lý, chế biến thực phẩm để giảm thiểu hàm lượng Aflatoxine và Ochratoxins trong thực phẩm

Độc tố do Fusarium spp gây ra:

 Fumonisins

Fumonisins nhóm bao gồm 6 loại độc tố khác nhau, (FB1, FB2, FB3, FB4, FA1,

FA2) Chúng được sản sinh từ Fusarium moniliforme, Fusarium proliferratum và

Fusarium sp, đặc biệt khi khí hậu ẩm và ôn hòa Fumonisins được thấy chủ yếu trong

ngô và các sản phẩm từ ngô, do vậy đây là vấn đề khó khăn trên toàn thế giới Fumosin B1 là độc tố nhiều nhất và phổ biến nhất trong nhóm

 Độc tính

Fumonisins B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất, gây nên một số triệu chứng như: Gây não bạch cầu hoặc tổn hại gan

Ung thư gan

Ung thư thực quản ở người và tổn thương gan, thận, tim, phổi, thậm chí ức chế sinh trưởng và gây chết

Ngoài ra, người còn bị bệnh bạch hầu do nhiễm độc thực phẩm:

Bệnh bạch hầu do nhiễm độc thực phẩm phát hiện ở những người đã ăn phải hạt ngũ cốc nhiễm mốc hoặc các chế phẩm từ hạt ngũ cốc tích trữ qua mùa đông ở ngoài đồng Độc tố này thường gây tử vong và được gọi bằng nhiều tên khác nhau: Bệnh thiếu máu không tái tạo, bệnh bạch cầu chảy máu, bệnh mất bạch cầu hạt, viêm họng nhiễm trùng, bệnh độc tố thực phẩm, bệnh độc tố gây suy tủy

 Zeatalenone

Zeatalenone( ZON) là sản phẩm duy nhất của loài nấm mốc Fusarium phát triển trong điều kiện độ ẩm cao( ví dụ Fusarium roseum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum) Nó có tác dụng tương tự hoocmone động dục giống cái và gây ra động dục

giả (hiện tượng tương tự động dục) Lợn được coi là loài gia súc nhạy cảm nhất

 Phương pháp loại trừ:

Do Fumonisin và Zeatalenone bền nhiệt chỉ bị phá hủy khi tác động nhiệt độ

>2000oC Các biện pháp thủy phân không làm giảm mà ngược lại làm tăng cường độc tính

Biện pháp hiệu quả nhất là phân loại và lựa chọn nguyên liệu

 Trichothecenes

Trichothecenes thuộc nhóm 150 hợp chất có cấu trúc tương tự được sản sinh chủ yếu từ Fusarium spp, một loại nấm mốc phân bố rộng rãi trong các loại ngũ cốc trên thế giới

Do đặc tính hóa học và sự hình thành nấm mốc, chúng có thể được phân chia làm 4 nhóm căn bản với các loại A và B ảnh hưởng tiêu cực đối với chăn nuôi gia súc

Trichothecenes loại A (sản sinh chủ yếu từ Fusanum sporotrichioides) bao gồm các

loại độc tố khác nhau T-2 toxin, HT-2 toxin, neosolaniol (NEO) và diacetoxyscirpenol

(DAS) Trichothecenes loại B( sản sinh chủ yếu từ Fusariltm culmorum và F graminearum) gồm các loại deoxymvalenol và 3-acetyl cùng với 15 chất dẫn xuất của

nó

Độc tính:

- T- 2 toxin ức chế sự tổng hợp protein và làm suy yếu sự hoàn thiện của tế bào máu trong tủy xương và ngăn chặn hệ miễn dịch

Rối loạn chức năng ribosom, ức chế sự tổng hợp protein ở ty thể

Gây nên thương tổn cho tuyến nhày của dạ dày và ruột dẫn tới hậu quả là xuất huyết diện rộng và viêm toàn bộ niêm mạc dạ dày

Nếu ăn phải lượng lớn độc tố trong thực phẩm sẽ gây nôn ọe, bỏ ăn

Hình 1.1: Cấu trúc hoá học của Trichothecennes và Detoxified

 Phương pháp hạn chế ngộ độc do Trichothecenes:

Trichothecenes rất với các tác động môi trường và bền với nhiệt, không bị phân giải ở nhiệt độ dưới 2300oC, độc tố này bền vững trong không khí và ánh sáng hàng tuần lễ

Có thể xử lý hoàn toàn Trichothecenes ở 6000oC trong 10 phút trong dung dịch NaOH

Trichothecenes có thể dễ dàng loại bỏ phần lớn bằng nước

Trichothecenes mất hoạt tính khi kết hợp với một số tác nhân như bentonit và đất sét trắng

Trichothecenes bị vô hoạt trong dung dịch NaHSO3 3- 5%

Do trong đề tài sử dụng nấm chủng nấm Fusarium spp nên sẽ mô tả khá đầy đủ

về chủng nấm này:

Đặc điểm của nấm Fusarium spp

Fusarium spp là chi lớn nhất trong họ Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc kí

sinh trên nhiều loại hạt rễ thân cây trồng khác nhau, Chúng cạnh tranh dinh dưỡng, phát triển tơ nấm phủ kín mô mạch trong thân cây hay tiết độc tố vào mạch dẫn khiến ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt hay làm héo rũ cây

Chi Fusarium bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây như héo do tắc mạch, thối

rễ, thân và bắp, thối cổ rễ cây con Một số loài gây bệnh cũng sản sinh độc tố nấm lẫn tạp trong hạt ngũ cốc

Fusarium spp là một loại nấm gặp phố biến trong đất đôi khi là ở hạt và thân

cây trồng và cũng gặp trên các vật liệu cellulose

Nhiệt độ phát triển thích hợp của Fusarium spp là 25 – 30oC

Nấm Fusarium cũng như các loại nấm khác phát triển khá mạnh trên môi trường

PDA ở nhiệt độ 25oC Mặt trên của tản nấm có thể màu trắng, vàng, cam đỏ tím Mặt dưới tản nấm có thể không màu, vàng nhạt hạy nâu

Các nghiên cứu về Fusarium bắt đầu từ năm 1809 nhưng việc xác định số lượng

loài lại gặp rất nhiều khó khắn do số lượng loài rất lớn Có khoảng hơn 70 loài và hơn

55 giống theo Gerlach và Nirenberg (1982)

Độc tố của nấm:

Một số nhóm độc tố quan trọng do nấm Fusarium sản sinh ra là Fumonisins

(Fumonisin B1, Fumonisin B2, Fumonisin B3) Trong kết quả nghiên cứu của các tác giả Marasas WFO, Miller JD, Riley RT, Visconti A (2001b); Nelson PE Desjardins

AE, plattner RD (1993) chúng đã được chứng minh là có khả năng gây bệnh Equine leucoencephalomalacia cho ngựa, ung thư gan ở chuột, và hội chứng sưng phổi ở lợn Một số nghiên cứu dịch tễ học của nhóm tác giả Marasas WFO, Nelson PE, Toussoun

TA (1984) cũng phát hiện ra rằng Fumonisins có liên quan đến bệnh ung thư thực quản

ở người

Một số loại độc tố như: Fusaric acid, 5-(butyl)-2-pyridinecarboxylic acid là một

trong những độc tố phổ biến nhất do một số loài nấm Fusarium sản sinh ra như: Fusarium verticiloides (Sacc.) Nirenberg, Fusarium subglutinans (Matsush) Nirenberg, Fusarium oxysporum, Fusarium protiferatum (Matsush) Nirenberg Fusaric acid có tác

động hóa học rất lớn đối với hệ thần kinh và có thể ảnh hưởng đến hệ sinh sản, sự sinh trưởng và các hoạt động của động vật

Một loại độc tố khác là moniliformin là loại độc tố có tính độc rất cao do một số

loài nấm Fusarium sản sinh ra như Fusarium oxysporum, Fusarium protiferatum, Fusarium semitectum, Fusarium subglutinans Độc tố này có thể tìm thấy trong tự

nhiên, thấy cả trong thức ăn và trên cả các sản phẩm dùng làm thức ăn gia Kết quả nghiên cứu khác của nhóm tác giả Marasas WFO, Miller JD, Riley RT, Visconti A (2001) cho thấy độc tố Deoxynivalenol được sản sinh ra từ một số loài nấm gây hại

trên ngũ cốc như: Fusarium graminearum và Fusarium culmorum và một số loài khác,

là một loại độc tố có ảnh hưởng mạnh nhất khi tiếp xúc với cơ thể con người

Zearalenon là một loại độc tố khác của nấm Fusarium có thể gây ra hiện tượng vô sinh

cho động vật đã được phát hiện trên nhiều cây trồng nông nghiệp Zearalenon do các

loài nấm F graminearum, F culmorum, F equiseti và F crookwellens sản sinh ra

Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà phê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa Chỉ tính riêng cà phê, Việt Nam hiện có năng suất cao trên thế giới khoảng 8 - 10 tấn/ha Để đạt được năng suất ấy, người nông dân phải

sử dụng đến 2 tấn urê/1 ha cùng với rất nhiều phân bón hóa chất khác và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá nghiêm trọng Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa học khuyến khích sử dụng vì chúng

có những ưu điểm sau:

 Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất

 Cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung

 Không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất

 Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông phẩm

 Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại

thuốc BVTV có nguồn gốc hóa chất Tác dụng của chế phẩm sinh học tác động từ từ chứ không nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu

 Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường

 Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng

Clavines (Argroclavine) Axit lysergic

Amids lysergic acid (Ergin) Ergopeptines (Ergotamine, Ergovaline)

Fusarium spp

F verticillioides (Syn F

moniliforme)

F proliferatum

Fumonisin (B 1, B 2, B 3) Axit fusaric

F graminearum

F avenaceum

F culmorum

Loại A Trichothecenes T-2 toxin, HT-2 độc tố, diacetoxyscirpenol

deoxynivalenol fusarenon-X

N lolii

Cây roi nhỏ độc tố cao: Lolitrems, peramine, ergot alkaloid

(ergovaline)

Pithomyces spp P chartarum Sporidesmin

1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.2.1 Đặc điểm chung

1.2.1.1 Hình thái và dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria – LAB) là vi khuẩn Gram dương, chịu acid, không hình thành bào tử, không có khả năng di động, hình que hoặc hình cầu Vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất với pH 5,5 – 5,8 và có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, vitamin, khoang, acid béo và carbonhydrate

LAB được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm lên men như sữa chua, pho mát,… Ngoài ra chúng còn sản sinh ra một số hợp chất thú cấp có tính kháng khuẩn như bateriocin, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm bằng cách ứng chế sư phát triển của vi khuẩn có hại

Các giống LAB thường gặp chủ yếu là Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Camobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic

thành dạng hình cầu và hình que, đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 – 1,5

μm Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào vi khuẩn lactic từ 1 – 8μm Chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay nhóm với nhau

1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau:

 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide (glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin)

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic

 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ: Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone soy,

 Nhu cầu về vitamin: Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin

 Nhu cầu các chất hữu cơ khác: Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các base nitơ hay các acid hữu cơ Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

 Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ,

vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan Đặc biệt là magie

và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

 Nhu cầu dinh dưỡng oxy: Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môi trường có oxy hay không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối

vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí

1.2.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được chia thành 2 nhóm dựa vào khả năng lên men:

 Lên men đồng hình: Sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose

Dưới điều kiện dư glucose và hạn chế oxygen, LAB biến đổi phân tử glucose theo con đường EmBden – Meyerhof – Parnas thành 2 phân tử pyruvate Dưới điều kiện dư glucose và hạn chế oxygen, LAB biến đổi một phân tử glucose theo con đường Embden–Meyerhof–Parnas thành hai phân tử pyruvate Cân bằng oxy hoá khử nội bào được duy trì trong suốt quá trình oxi hoá NADH, đồng thời với sự khử pyruvate thành acid lactic Quá trình này sinh 2 phân tử ATP cho mỗi

glucose được tiêu thụ Đại diện cho kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus và Lactobacillus nhóm I

 Lên men dị hinh: Sản xuất chỉ 50% acid lactic và một lượng ethanol, acid acetic

LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, và Lactobacillus spp nhóm III

Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động

Sản phẩm chuyển hoá Phương thức hoạt động

1.Carbon dioxide Ngăn cản sự khử nhóm carboxyl,

giảm tính thấm của màng

3 Hydrogen peroxide/ Lactoperoxidase Oxy hoá các protein cơ bản

4 Acid lactic

Acid lactic bị phân ly đi xuyên qua màng, làm thấp pH nội bào Nó gây trở ngại quá trình chuyển hoá như oxi hoá khử phosphor

protein và DNA

1.2.2 Khả sinh sinh các hợp chất kháng khuẩn của các chủng LAB

1.2.2.1 Bacteriocin

Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học do vi khuẩn tiết ra, có thể tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác có quan hệ họ hàng với chúng Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc gene (Klaenhamme, 1993)

Bacteriocin có bản chất là peptide kháng khuẩn sinh ra để chống lại vi khuẩn khác, vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin

đó Các tế bào sản xuất thì miễn dịch với hoạt tính bacteriocin (TS Vũ Thị Lâm An, 2013) Bacteriocin được sinh ra ở cả vi khuẩn Gram dương và âm, nhưng bacteriocin

từ vi khuẩn lactic được nghiên cứu nhiều nhất do tính hiệu quả, mức độ an toàn và khả năng ứng dụng làm chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên trong công nghiệp thực phẩm

Bacteriocin không phải thuốc kháng sinh; do chúng là các peptide được tổng hợp bởi ribosome vi khuẩn, không phải chất chuyển hóa thứ cấp nên nhanh chóng bị phân cắt bởi protease trong hệ thống tiêu hóa của người Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ rất thấp Tuy nhiên, bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh Khác với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và không có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn Trên thế giới bacteriocin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic

1.2.1.2 Phân loại bacteriocin

Hiện nay, đã có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại chúng vẫn chưa được xác định rõ ràng Bacteriocin được phân loại với nhiều tiêu chí khác nhau như họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và trình tự amino acide Bacteriocin được chia làm 4 nhóm, trong đó nhóm 1 và nhóm 2 rất phong phú, có tiềm năng thương mại lớn

4 nhóm gồm:

Nhóm 1: (Lantibiotic) là những phân tử nhỏ (<5kDa) Lantibiotic chứa những amino acid hiếm (Ví dụ: lanthionine và 3 – methyllanthionine) và một số amino acid khử nước Lantibiotic có thể được chia thành hai phân lớp dựa vào những đặc điểm cấu trúc và chức năng:

• Lớp 1a: Là những phân tử peptide tích điện dương, dài 34 amino acid Những peptide này chủ yếu hoạt động phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màng tế bào đích Có thể chia lantibiotic thành 2 phân nhóm dựa trên kích thước, điện tích và trình tự peptide dẫn (leader peptide)

• Lớp 1b: Là những phân tử peptide hình cầu, có thể chứa đến 19 amino acid Hoạt động của chúng chủ yếu là phá vỡ chức năng của các enzyme

Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader peptide ở đầu

N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích phân tử peptide hoạt hoá

Nhóm 2: Là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa) thường gồm những phân

tử peptide hoạt động ở màng tế bào, khong chứa lanthionine và bền nhiệt Bacteriocin nhóm 2 có phổ kháng khuẩn hẹp Lớp 2 có thể chia thành 3 phân lớp:

• Lớp 2a: Bacteriocin lớp này rất đa dạng, điểm đặc trưng là trình tự bảo tồn (YGNGVXC) ở đầu N và hoạt tính kháng Listeria

• Lớp 2b: Những bacteriocin này cần có sự kết hợp của hai hoặc nhiều peptide trong hoạt động để có hoạt tính kháng khuẩn hoàn chỉnh Trong hầu hết các trường hợp, các peptide rời cũng biểu hiện hoạt tính bacteriocin, nhưng hoạt tính sẽ cao khi có

sự hiện diện của peptide thứ hai

• Lớp 2c: Bacteriocin phụ thuộc nhân tố sec Phân tử bacteriocin lớp 2c được được đưa ra ngoài tế bào xuyên qua màng tế bào chất bằng con đường tiết phụ thuộc nhân tố sec

Bacteriocin lớp 2a có tiềm năng ứng dụng trong quy mô công nghiệp do khả năng kháng Listeria mạnh, thậm chí chúng còn được quan tâm nhiều hơn các Bacteriocin nhóm 1 (Nisin), do chúng có phổ kháng khuẩn không rộng mà không tiêu diệt các chủng khơi động Pediocin PA – 1 là một ví dụ điển hình và được nghiên cứu phổ biến nhất trong số các bacteriocin lớp 2a

Nhóm 3: Bacteriocin lớp 3 là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt Lớp này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của bacteriocin Bacteriocin nhóm 3 được thu nhân từ một số giống Lactobacillus Chỉ một vài bacteriocin thuộc lớp này được định danh (ví dụ: Helveticin, helveticin V) (Parada J L và cs, 2007)

Nhóm 4: Là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein con có thêm thành phần lipid và carbonhydrate Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch Bacteriocin nhóm 4 là kết quả của sự tương tác tính kỵ nước và tích điện

dương của bacteriocin với các phân tử khác trong dịch thô Lớp này bao gồm cả glycoprotein hoặc lipoprotein (Klaenhammer 1988, 1993)

 Ứng dụng bacteriocin

Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là vi khuẩn lactic – LAB: Lactic acide bacteria) để tạo bacteriocin Trong trường hợp này, khả năng LAB sinh trưởng và tạo bacteriocin trong sản phẩm là quyết định

Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm

Sử dụng bán thành phẩm lên men trước đó với một chủng sinh bacteriocin như

là một thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm

Một lựa chọn mới hiện nay trên cơ sở dạng thứ hai là dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm

1.2.3 Khả năng kháng nấm của LAB và ứng dụng

1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của LAB

Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995) Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã được tìm thấy và công nhận trong nhiều nghiên cứu Hoạt động kháng nấm

của L coryniformis ổn định khi bị ở nhiệt độ cao và độ pH 3 – 4,5 (Magnusson và

Schnurer, 2001)

Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một

loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L plantarum và L sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng

nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998) Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - Nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Gardiner và cộng sự, 2000; Corcoran và cộng sự, 2004.)

Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và

Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính axit và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh Đa số các chất kháng nấm được xác

định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl

1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn LAB

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:

 Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ

xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007)

 Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic, đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau

 Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá…

 Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm

Fusarium spp., chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm