Luận văn thạc sĩ tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương ở các vùng núi đá vôi

Đối tượng nghiên cứu Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương được phân lập từ mẫu đất ở một số vùng trong tỉnh Thái Nguyên.. Phát hiện các chủng xạ khuẩn sinh kháng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ THỊ HIỀN

TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH ỨC CHẾ VI KHUẨN GRAM DƯƠNG Ở CÁC VÙNG NÚI ĐÁ VÔI

VÀ KHAI THÁC KHOÁNG SẢN

TẠI THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái nguyên 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ THỊ HIỀN

TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH ỨC CHẾ VI KHUẨN GRAM DƯƠNG Ở CÁC VÙNG NÚI ĐÁ VÔI

VÀ KHAI THÁC KHOÁNG SẢN

TẠI THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu

có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc Kết quả trình bày trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai công

bố trước đây

Thái Nguyên, tháng 3 năm 2019

Tác giả

Đỗ Thị Hiền

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện tại bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện khoa học

Sự sống, Trường Đại học Nông lâm- Đại học Thái Nguyên Để hoàn thành được luận văn này em đã nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá nhân

và tập thể

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Xuân Vũ

và TS Nguyễn Mạnh Tuấn, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn em rất tận tình trong quá trình thực hiện đề tài, giúp em vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Đỗ Bích Duệ cán bộ tại bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Trần Văn Phùng - Viện trưởng Viện Khoa học Sự sống cùng các cán bộ nghiên cứu của viện đã tạo điều kiện cho em được thực tập và hoàn thành đề tài này

Em xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm, các cán bộ trong Trường ĐH Nông Lâm- ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, trang

bị kiến thức và tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập

Cuối cùng em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp

đỡ động viên và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn!

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

DNA : Deoxyribonucleic Acid

RNA : Ribonucleic Acid

ISP : International Streptomyces Project

TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid

SDS : Sodiumdodecyl sulfat

TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid

PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase)

MRSA : Staphylococcus aureus kháng methicillin

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn 25Bảng 3.2 Đặc điểm nuôi cấy của chủng P5-1 trên các loại môi trường nuôi cấy ở

28oC sau 21 ngày 29 Bảng 3.3 Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 31Bảng 3.4 Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn ở nồng độ muối khác nhau 33 Bảng 3.5 Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn P5-1 ở các điều kiện nhiệt độ

khác nhau 33 Bảng 3.6 Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn ở các điều kiện pH khác nhau 34 Bảng 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn của chủng P5-1 trên các môi trường lên men khác

nhau 35 Bảng 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 theo thời gian lên men 37 Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra giá trị MIC 38 Bảng 3.10 Kết quả Search Blast các trình tự tương đồng gen 16S- rRNA của chủng

P5-1 trên GenBank 41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Các dạng khuẩn lạc xạ khuẩn 5 Hình 3.1 Số lượng các chủng xạ khuẩn phân lập ức chế sinh trưởng các chủng vi

khuẩn kiểm định 27 Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập sử dụng phương pháp

cấy chấm điểm 28 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc của chủng P5-1 trên các môi trường 30 Hình 3.4 Xạ khuẩn sinh trưởng trên môi trường bổ sung các nguồn cacbon 32 Hình 3.5 Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn P5-1 ở các điều kiện nhiệt độ

khác nhau 34 Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của chủng P5-1 trên các môi trường lên men khác

nhau 36 Hình 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 trong môi trường Gause I theo thời

gian lên men 37 Hình 3.8 Kháng sinh thô thu được từ dịch lên men chủng P5-1 38 Hình 3.9 Kết quả MIC chủng P5-1 với các chủng vi khuẩn kiểm định 39 Hình 3.10 Kết quả điện di DNA tổng số của chủng xạ khuẩn P5-1 trên gel agarose

1% 40 Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen mã hóa 16S- rRNA

chủng P5-1 trên gel agarose 1% 40 Hình 3.12 Cây phân loại của chủng P5-1 và một số chủng xạ khuẩn 42

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ v

MỤC LỤC vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn 4

1.1.1 Giới thiệu về xạ khuẩn 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 5

1.2 Phân loại xạ khuẩn 7

1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 7

1.2.2 Phân loại theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa 8

1.2.3 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp phân tích tự gene 16S-rRNA 8

1.3 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn 9

1.3.1 Khái niệm về chất kháng sinh 9

1.3.2 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 10

1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh 13

1.4.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh trên thế giới 13

1.4.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh trong nước 14

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Vật liệu 16

2.3.1 Nguồn xạ khuẩn 16

2.3.2 Vi sinh vật kiểm định 16

2.3.3 Môi trường phân lập và nuôi cấy 17

2.3.4 Hóa chất và thiết bị 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Phân lập và nuôi cấy xạ khuẩn 18

2.4.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh 19

2.4.3 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn 19

2.4.4 Lựa chọn môi trường lên men tối ưu cho sinh tổng hợp kháng sinh cho chủng xạ khuẩn nghiên cứu 20

2.4.5 Phương pháp lên men, tách kháng sinh thô cho chủng xạ khuẩn nghiên cứu 21

2.4.6 Phương pháp xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sinh trưởng vi khuẩn kiểm định (MIC90) 21

2.4.7 Phương pháp định danh và phân loại chủng loại 22

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ mẫu đất 25

3.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn P5-1 28

3.2.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn P5-1 28

3.2.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh lí - sinh hóa 31

3.3 Kết quả nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp kháng sinh cho chủng P5-1 35

3.3.1 Kết quả lựa chọn môi trường lên men thích hợp 35

3.3.2 Kết quả xác định thời gian lên men tối ưu 36

3.4 Kết quả đánh giá nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế 90% vi khuẩn kiểm định (MIC90) 38

3.5 Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn P5-1 bằng phương pháp sinh học phân tử 39

3.5.1 Kết quả tách DNA tổng số 39

3.5.2 Kết quả nhân gene mã hóa 16S-rRNA bằng phản ứng PCR 40

3.5.3 Kết quả giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

1 KẾT LUẬN 43

2 ĐỀ NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC

Ngày nay, với sự xuất hiện của các VSV kháng kháng sinh, chúng là nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp của hàng loạt các bệnh nhiễm khuẩn như viêm phổi, viêm phế quản, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng huyết, nhiễm khuẩn vết mổ Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các kháng sinh mới, cùng với tình trạng sử dụng kháng sinh tự do làm cho chúng ta đang phải đối mặt với hiện tượng "kháng kháng sinh'' Sự xuất hiện các vi khuẩn đa kháng

thuốc (MDR) như Staphylococcus aureus, Enterococcus tạo thành một vấn đề

nghiêm trọng trong môi trường bệnh viện, đòi hỏi phải có kháng sinh mới với hoạt

động phổ rộng [28] Các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do vi khuẩn đã trở nên kháng thuốc kháng sinh thông thường và trở thành một vấn đề lớn trên toàn cầu

trong thế kỷ 21 [20] Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là tác nhân

gây bệnh cho một loạt các bệnh nhiễm trùng như nhọt, viêm phổi, viêm tủy xương, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn huyết, và đã phát triển đề kháng với phần lớn các kháng sinh thông thường [29] Vào năm 2001, theo Tổ chức y tế thế giới (WHO), việc kê đơn và lạm dụng kháng sinh quá mức đã dẫn đến sự kháng thuốc của nhiều mầm bệnh [43] Ngày nay, các chủng kháng thuốc mới xuất hiện nhanh hơn, trong

khi tốc độ phát hiện ra kháng sinh mới đã giảm đáng kể

Hiện nay, nhiều nhà khoa học đang nghiên cứu các loại thuốc mới ức chế sinh trưởng các chủng vi khuẩn gây bệnh, chủ yếu có nguồn gốc xạ khuẩn [43,33]

Streptomyces là một nguồn tiềm năng thuộc nhóm xạ khuẩn, sản sinh đa dạng các

loại kháng sinh khác nhau, với hơn 80% kháng sinh được biết trên thị trường có

nguồn gốc từ chi Streptomyces [27] Xạ khuẩn phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên:

trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác các yếu tố như:

độ ẩm, thành phần của đất, mức độ canh tác, thảm thực vật, độ pH môi trường ảnh hưởng đến hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn

Thái nguyên là một tỉnh có các vùng đất khai thác khoáng sản, vùng núi đá vôi tập chung nhiều loại VSV, trong đó có xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh Ngoài ra các hoạt động khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trường đất, nước và qua đó có thể sẽ ảnh hưởng đến hệ VSV đất ở những khu vực này mà hiện vẫn chưa được nghiên cứu nhiều

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

"Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương ở các vùng núi đá vôi và khai thác khoáng sản tại Thái Nguyên"

2 Mục tiêu nghiên cứu

* Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương

* Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại một số chủng

xạ khuẩn sinh kháng sinh mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng

3 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương được phân lập từ mẫu đất ở một số vùng trong tỉnh Thái Nguyên

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Phát hiện các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương góp phần làm rõ hơn vai trò quan trọng của xạ khuẩn trong việc sinh kháng sinh, định hướng tiếp tục nghiên cứu tìm ra các loại kháng sinh mới; trên cơ sở tạo ra các CKS mới giúp phục vụ cho nghiên cứu và chữa bệnh góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về xạ khuẩn

1.1.1 Giới thiệu về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố

rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các VSV khác không sinh trưởng được

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC trong ADN cao hơn 55% Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn [26] Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Theo Waksman, trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9

- 45% tổng số VSV [42] Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo nhiều bào tử

Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ ẩm, thành phần của đất, mức độ canh tác và thảm thực vật Ngoài ra sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính, kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8- 7,5 Xạ khuẩn thường tập chung ở những nơi đất giàu hữu

cơ, khoáng và lớp bề mặt có nhiều mùn Chúng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt

độ 28- 30oC, độ ẩm khoảng 40-55% Những nơi có nồng độ pH kiềm, axit thường ít

xạ khuẩn, đặc biệt nơi đất quá kiềm lại càng ít xạ khuẩn Tuy nhiên nhiều loài xạ

khuẩn đã được phân lập ở các môi trường khắc nghiệt như Arthrobacter ardleyensis

ưa lạnh được phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 00C [22] và

Nocardiopis alkaliphila được phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH

9,5-10 [31]

Một trong những đặc tính quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 60-70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh CKS Cho tới nay khoảng hơn 8000 CKS hiện biết trên thế giới thì có 80% là do xạ khuẩn sinh ra [3]

Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều CKS có giá trị dùng trong

y học như: getamixin, vacomixin

Ngoài ra, xạ khuẩn còn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất nước Dùng để sản xuất nhiều enzym như: proteaza, amylaza, xenluloza, một số axit amin và axit hữu cơ Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người và động vật [6]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

* Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Ở trên môi trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh, đường kính khuẩn lạc trung bình 0,5-2 mm Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn, ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ Do đó mới có tên gọi là xạ khuẩn (Actinomycetes, tiếng Hy Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”) Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng:

đỏ, da cam, vàng, lam, nâu, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng, màu sắc của khuẩn lạc là một trong những đặc điểm phân loại quan trọng [1]

Hình 1.1 Các dạng khuẩn lạc xạ khuẩn [5]

(http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm)

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc, kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý, nuôi cấy Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc

vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính lớn, dễ quan sát bằng mắt thường Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn sinh trưởng thành 2 hướng tạo thành khuẩn ti cơ chất (substrate mycelium) và khuẩn ti khí sinh (aerial mycelium) Khuẩn ti cơ chất (KTCC) sinh trưởng cắm sâu vào trong môi trường với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn Đường kính KTCC thay đổi từ 0,2m-0,3m, khuẩn ti không có vách ngăn và không bị đứt đoạn Tùy vào loại môi trường mà KTCC có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố trong đó có sắc tố hòa tan được trong nước, có sắc tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ KTCC sinh trưởng một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh (KTKS) KTKS có chức năng chính là sinh sản

* Đặc điểm cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp:

Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 - 120A0, khi già có thể đạt tới 150 - 200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0 Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với

N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit khác Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit khác với nấm Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất

và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào

Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính :

Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L

- ADP) và glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm này

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic (m - ADP) và glyxin

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic

Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic, arabinose và galactose

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn

Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol)

Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 - 45% [8]

Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [2]

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau.1.2 Phân loại xạ khuẩn

1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là thông tin quan trọng để phân loại

xạ khuẩn Dựa theo cách phân loại này các chủng xạ khuẩn thường được nuôi

trên các môi trường dinh dưỡng trong điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp, sau đó quan sát các đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn như hình dạng, màu sắc của bào tử, khả năng sinh sắc tố, sinh melanin đồng thời ghi chép kết quả và chụp mẫu

Trước kia, nhiều loại xạ khuẩn được phân chia tùy theo sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy như màu của khuẩn ti cơ chất (KTCC), khuẩn ti khí sinh (KTKS), sắc tố tan; sự có mặt của KTCC, hình dạng và kết cấu mặt bào tử; đặc điểm cuống sinh bào tử và sự phân đốt của khuẩn ti Tuy nhiên, do xạ khuẩn không bền vững về mặt di truyền, trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về mặt hình thái hoặc có những loài khác nhau lại có thể giống nhau về mặt hình thái

Do đó để phân loại chính xác hơn, bổ sung cho việc nghiên cứu phân loại, người ta

sử dụng thêm các phương pháp phân loại bằng sinh lí, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử [15,42]

1.2.2 Phân loại theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Khi phân loại xạ khuẩn người ta thường sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hóa như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nguồn nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng Ngoài ra còn các chỉ tiêu khác cũng được xác định như pH, nhiệt

độ, khả năng chịu muối, tính chất đối kháng và mẫn cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất khác đặc trưng của xạ khuẩn

Tuy nhiên, do xạ khuẩn thường xuất hiện nhiều biến dị nên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường có giá trị thấp về mặt phân loại

1.2.3 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp phân tích tự gene 16S-rRNA

Tất cả các loài VSV trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp protein nhờ các ribosome Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hoá rRNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 phương pháp chính

đó là lai giữa DNA- DNA, lai giữa RNA- RNA và phân tích trình tự gene mã hóa 16S-rRNA

Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rRNA có mặt trong tất cả các

sinh vật, thực hiện cùng một chức năng là cấu thành nên ribosome, bộ máy tổng hợp protein của tế bào Có kích thước vừa phải (1500 bp) để tiến hành các nghiên cứu phả hệ Là một trong những cao phân tử xuất hiện sớm nhất trong lịch sử tiến hóa Cấu trúc của rRNA thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói cách khác các gen mã hoá cho chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá Mặc dù mang tính bảo thủ cao, các gen mã hóa cho rRNA cũng chứa những vùng có mức độ bảo thủ thấp hơn, dễ có sự sai khác giữa các loài sinh vật khác nhau Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho rRNA, các nhà khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng

để có thể khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, bao gồm cả các vùng biến đổi So sánh sự khác biệt giữa các vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi

Trong các loại rRNA, thì 16S-rRNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn, vì gene mã hóa 16S-rRNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho các nghiên cứu phân loại, gene mã hóa 5S-rRNA có kích thước khoảng 120 bp,

dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại, gene mã hóa rRNA cũng là một gene tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gene này tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn [30]

23S-Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S-rRNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S-rRNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [34]

1.3 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn

1.3.1 Khái niệm về chất kháng sinh

Chất kháng sinh (Antibiotic) là những chất được chiết xuất từ các vi sinh vật, nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm

sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu CKS là một chất hóa học có hoạt tính kháng lại các VSV như: vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật; nấm gây bệnh ở

động vật và thực vật Các VSV mẫn cảm với CKS ở những mức độ khác nhau, đa số các vi khuẩn gram dương mẫn cảm với chất kháng sinh hơn các vi khuẩn gram âm

1.3.2 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

1.3.2.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS Cho tới nay khoảng hơn 8000 CKS hiện biết trên thế giới thì có 80% là

do xạ khuẩn sinh ra [3] Trong quá trình tiến hóa, tính đối kháng là cơ chế bảo vệ trong đấu tranh sinh tồn của loài Riêng đối với xạ khuẩn tính đối kháng thể hiện khá rõ rệt Đa số các CKS có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng rộng, kìm hãm và ức chế được nhiều loại VSV khác nhau Xạ khuẩn thường tạo ra các sản phẩm trao đổi chất của mình để ức chế hoặc tạo điều kiện không thuận lợi cho sự sinh trưởng của VSV khác Thông thường các CKS có thể hình thành theo các cơ chế sau:

CKS được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như CKS cloramphenicol, các CKS thuộc nhóm nucleozit)

CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau (như các CKS lincomicin, novobiocin)

Đối với kháng sinh được tạo ra bằng con đường polime hóa bao gồm:

+ Các chất là dẫn xuất của polipeptid, được tạo thành bằng cách trùng hợp các axit amin: bacitracin, polymycin Mạch polipeptid được tạo thành có thể được biến đổi trong các phản ứng tiếp theo

+ Các chất được tạo thành từ đơn vị acetat và propionat thì theo con đường tổng hợp axit béo: CKS nhóm macrolit, tetracilin, rifamicin

+ CKS được hình thành theo con đường tổng hợp các hợp chất izopreonit từ các đơn vị acetat…

+ Đối với các chất aminoglucozid thì tạo thành bằng con đường trùng hợp các phân tử đường, axit amin và các rượu amin mạch vòng

Có rất nhiều CKS hiện nay đang sử dụng được sinh ra bởi xạ khuẩn như:

Streptomycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces griseus có khả năng kháng các

vi khuẩn Gram âm khá mạnh, được sử dụng để diều trị các bệnh dịch hạch, ho gà và quan trọng hơn cả là bệnh lao [9]

Neomycin: Được tách từ xạ khuẩn Streptomyces fradiae vào năm 1949, có

khả năng chống cả các vi khuẩn gram dương và gram âm Đặc biệt chống lại được nhiều loài vi khuẩn kháng lại penixilin và streptomycin [9]

Tetracyclin: Là kháng sinh được tách chiết từ một số chủng xạ khuẩn thuộc

chi Streptomyces Loại kháng sinh này có phổ rộng, chống lại cả vi khuẩn Gram âm

lẫn vi khuẩn Gram dương, ricketsia và một vài loài vi rút lớn Ngoài sử dụng trong

y học, tetracyclin còn được sử dụng trong chăn nuôi - thú y [9, 2]

Chloramphenicol: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezuelae, được

phát hiện vào năm 1947, có khả năng chống lại nhiều vi khuẩn Gram dương và Gram âm Ngoài ra, CKS này được dùng trong chăn nuôi- thú y và thủy sản [16]

Gentamycin: Có nguồn gốc từ Micromonospora purpurea, có phổ hoạt tính

rộng, có tác dụng chống lại vi khuẩn Gram dương như tụ cầu, phế cầu đã kháng lại penicillin và Gram âm như màng não cầu, lậu cầu Trong y học hiện nay

Gentamycin chủ yếu dùng điều trị các bệnh Pseudomonas [9]

Erythromycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces erythreus, là CKS có

hoạt phổ rộng với các vi khuẩn Gram dương, được sử dụng trong điều trị bệnh viêm

phổi do mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [16, 7]

Novobicin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces spheroides và Streptomyces niveus, có hoạt tính mạnh đối với vi khuẩn Gram dương Có khả năng

chống lại các tụ cầu đã kháng với penicilin và một số CKS khác [15]

Vancomycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces orientaliss, sử dụng

trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là liên cầu,

tụ cầu và phế cầu [16]

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Quá trình sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như pH, nhiệt độ, thành phần môi trường lên men… Để xạ khuẩn sinh trưởng tốt và hình thành các sản phẩm tối ưu, cần đảm bảo trong môi trường lên men có đầy đủ

các nguồn cacbon, nitơ, các nguyên tố vi lượng và các thông số về điều kiện nuôi cấy thích hợp

* Điều kiện nuôi cấy:

Nhiệt độ: Phần lớn xạ khuẩn sinh trưởng tốt ở 28–30oC Nhiệt độ tối ưu cho tổng hợp CKS thường nằm trong khoảng 18–28oC [18]

pH môi trường: Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc rất lớn vào pH môi trường

pH thích hợp cho tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit thường ức chế quá trình sinh tổng hợp CKS Tuy nhiên dải pH cho chủng VSV sinh trưởng thường dài hơn pH tối ưu cho sinh tổng hợp kháng sinh

Độ thông khí: Xạ khuẩn là vi khuẩn hiếu khí có nhu cầu thông khí cao hơn

so với các sinh vật khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ 6 – 12 giờ nuôi) Nồng độ thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2-8% O2 trong dịch lên men [7]

Lượng giống và tuổi giống: Qúa trình sinh tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Thông thường, lượng giống cấy truyền vào môi trường lên men để hiệu quả nhất là từ 2 – 10%, tuổi giống thường là 24 giờ

* Thành phần môi trường lên men:

Nguồn cacbon: Các hợp chất cacbon có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS Đối với nhiều chủng xạ khuẩn có hoạt tính amylase, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng chủng mà chọn nguồn cacbon thích hợp như các loại đường đơn glucose, fructose, galactose hay các loại đường đôi như maltose, saccarose, lactose…; các loại đường đa như tinh bột, destrose…; các loại thành phần không xác định như rỉ đường, đại mạch…; cũng có thể là các axit hữu cơ và chất béo làm nguồn cacbon [15]

Nguồn nitơ: Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ Trong đó, nguồn nitơ vô cơ thường cho khả năng sinh CKS không cao Nguồn nitơ hữu hiệu nhất thường là các sản phẩm từ thực vật như bột đậu tương, bột đậu xanh, cao ngô…

Nguồn photphat vô cơ: Vai trò của photphat vô cơ như yếu tố điều chỉnh sinh tổng hợp CKS Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp phần lớn CKS không

quá 10 mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axit nucleic trong khuẩn ti, làm kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến làm giảm hoặc ngừng quá trình sinh tổng hợp CKS Sự thừa photphat cũng ức chế tổng hợp các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp làm giảm khả năng tổng hợp CKS [15]

1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh

1.4.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh trên thế giới

Trong những năm gần đây, nghiên cứu về xạ khuẩn là đề tài quan trọng trong nhiều nghiên cứu mới về VSV ở nhiều nước trên thế giới; đặc biệt là các đề tài tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học từ VSV như các chất kháng khuẩn, kháng virus, kháng tế bào ung thư, kháng nấm, chống đông máu hoặc là kháng trùng sốt rét… Những hợp chất này sẽ trở thành nguồn dược phẩm quan trọng để chữa bệnh trong tương lai

Những thành tựu tách chiết kháng sinh từ xạ khuẩn có minh chứng qua một

số patent (bản quyền) số 3968204 Hamill, 1976 tách chiết kháng sinh A-2315 từ

Actinoplanesp philippinensis NRRL ; patent số 4331658 Hamill, 1982 tách chiết

kháng sinh A-32887 từ Streptomyces albus NRRL 11109; patent số 4537770 Michel, 1985 tách chiết kháng sinh A41030 từ Streptomyces virginiae NRRL

12525; patent số 4637981 Hershberger, 1987 tách chiết kháng sinh A-4696G từ

Actinoplanes missouriensis; patent số 4659660 Hamill, 1987 tách chiết kháng sinh

A47934 từ Streptomyces toyocaensis NRRL 15009; patent số 5229362 Kirst, 1993 tách chiết kháng sinh A10255 từ Streptomyces gardneri Đó là những patent của

Mỹ, Mỹ cũng là một trong những nước sản xuất kháng sinh hàng đầu trên thế giới, bên cạnh các nước phát triển công nghiệp kháng sinh thì Hàn Quốc cũng đã có nền công nghiệp sản xuất kháng sinh, ngoài những kháng sinh tinh khiết dùng điều trị bệnh còn có kháng sinh dưới dạng chế phẩm sinh học như Biocontrol dưới dạng

lỏng có thành phần bao gồm một số chủng Streptomyces sp.; Trung Quốc cũng là nước hết sức chú trọng phát triển công nghiệp kháng sinh, các nhà máy kháng sinh

được xây dựng ở Tứ Xuyên, Thượng Hải, Trường Sa, Hắc Long Giang, Quảng Châu để sản xuất các nguyên liệu và các thành phẩm kháng sinh từ VSV

M Krishnaraj và N Mathivanan (Ấn Độ - 2009) đã phân lập được 137 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật từ 40 địa điểm khác nhau ở vịnh Bengal Trong tất cả 137 chủng xạ khuẩn đều có khả năng kháng các vi khuẩn gây

bệnh ở người như S aureus, P aeruginosa, Bacillus spp và 10 chủng có khả năng kháng nấm Rhizoctonia solani và Fuzarium oxysporum gây bệnh ở thực vật [35]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh trong nước

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh còn hạn chế Tuy nhiên chúng ta cũng đã có nhiều cố gắng trong việc tìm kiếm và sản xuất chất kháng sinh phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh, tách chiết cũng như nỗ lực hợp tác với nước ngoài để sản xuất kháng sinh mặc dù kết quả chưa đáp ứng được so với nhu cầu thực tế

Đỗ Thu Hà (2004), nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam - Đà Nẵng đã phân lập được 2 chủng xạ khuẩn là

Streptomyces nashvillensis QN-23 và Streptomyces globosus QN-24 có khả năng

kháng các loại nấm kiểm định là A niger, P oryzae, F oxysporum Bùi Thị Việt Hà

(2006) nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, đã ứng dụng phân loại xạ khuẩn đến mức phân tử để xác định được các chủng

xạ khuẩn là Streptomyces antimycoticus chống nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh mốc trắng ở cà chua, Streptomyces diastatochromogenes có hiệu quả tốt trong phòng chống bệnh lở cổ rễ và thối bắp do Rhizoctonia solani gây ra trên bắp cải,

Streptomyces hygroscopicus có hiệu quả tốt đối với việc phòng chống bệnh khô vằn

(Rhizoctonia solani) ở lúa với hiệu lực gần xấp xỉ validacin Bùi Thị Hà (2008), từ các mẫu đất khác nhau đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ khuẩn thuộc

chi Streptomyces, trong số đó có 30 chủng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên

chè ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5% Đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh nhất trong số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, kháng được cả 2 chủng nấm gây bệnh trên chè là CT–2E và CT– 5X, đồng thời cũng có khả năng kháng các nấm kiểm định

Một số nghiên cứu về xạ khuẩn như : nghiên cứu tập trung vào các đặc điểm sinh học [18]; tối ưu hóa môi trường nuôi cấy [16]; khả năng sinh kháng sinh kháng các VSV gây bệnh thực vật (Như nấm thực vật, nấm đạo ôn, vi khuẩn héo lá ) [10,11,15] Ngoài ra còn có các công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần nhằm nâng cao hiệu quả sinh kháng sinh của xạ khuẩn [3]; nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh

Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu tập trung đánh giá hoạt tính sinh kháng sinh của xạ khuẩn tại các vùng có điều kiện môi trường khó khăn, như vùng núi đá vôi, vùng đất khô cằn kháng lại các VSV gây bệnh

Với tình hình như trên cho thấy rất cần những công trình nghiên cứu và tiến tới sử dụng các chủng VSV trong đó đặc biệt là xạ khuẩn để sản xuất các kháng sinh dùng cho nhu cầu rất lớn đặt ra hiện nay

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương được phân

lập từ 2 địa điểm Núi Pháo - Đại Từ và Mỏ Sắt - Trại Cau, tỉnh Thái Nguyên Quá

trình nghiên cứu được thực hiện tại Viện Khoa học Sự sống- Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập các chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất thu thập tại một số vùng trong tỉnh Thái Nguyên

2 Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn kiểm định Gram dương

3 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn tuyển chọn:

a Đặc điểm hình thái: Màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ti cơ chất (KTCC), khả năng sinh sắc tố melanin

b Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Khả năng đồng hóa nguồn cacbon, khả năng chịu nhiệt, chịu muối, chịu nồng độ pH khác nhau

4 Tách và tinh sạch kháng sinh thô

5 Đánh giá hoạt tính của kháng sinh thô

6 Định danh và phân loại chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh tiềm năng

Các VSV được sử dụng cho việc chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh

kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương là Staphylococcus epidermidis ATCC

14990, Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Bacillus subtilis ATCC 6051A và

Bacillus anthracis KEMB 211-146. Các VSV kiểm định được cung cấp bởi ngân hàng bảo quản chủng trên thế giới: ATCC = American Type Culture Collection (Mỹ), KEMB: Korea Environmental Microorganisms Bank (Hàn Quốc)

2.3.3 Môi trường phân lập và nuôi cấy

Môi trường Nutrient agar (NA): Lab-Lemco powder, 1g; yeast extract, 2g; peptone, 5g; NaCl, 5g; agar, 20g; nước cất 1L; pH=7,4 [36]

Môi trường Starch casein broth (SCB): CaCO3, 0,02g; KNO3, 2g; K2HPO4, 2g; NaCl 2g; tinh bột, 10g; casein, 0,3g; FeSO4.7H2O, 0,01g; MgSO4.7H2O, 0,05g; nước cất 1L; pH= 7 [32]

Môi trường 7 (MT7): tinh bột, 10g; glucose, 5g; peptone, 6g; (NH4)2SO4, 2,5g; CaCO3, 2g; nước cất 1L; pH= 6,5-7 [24]

Môi trường 301: tinh bột, 24g; glucose, 1g; peptone, 3g; cao thịt, 3g; CaCO3, 4g; nước cất 1L; pH=7 [21]

Môi trường Gause I: tinh bột, 20g; KNO3, 1g; NaCl, 0,5g; K2HPO4, 0,5g; MgSO4.7H2O, 0,5g; FeSO4.7H2O, 0,01g, nước cất 1L; pH=7,4 [37]

Môi trường Gause II: cao thịt, 4g; peptone, 5g; glucose, 10g; agar, 20g; nước cất 1L; pH=7,4 [37]

Môi trường (International Streptomyces Project-1)ISP-1: Tryptone, 5g; cao nấm men, 3g; agar ,20g; pH =7; nước cất 1L [37]

Môi trường ISP-4: Tinh bột, 10g; K2HPO4, 1g; MgSO4.7H2O, 1g; NaCl, 1g; (NH4)2SO4, 2g; CaCO3, 2g;dung dịch muối vi lượng 1.0 ml, Agar 20g; pH =7, nước cẩt 1L [36]

Môi trường ISP-5: L-asparagin 1g; glyxerin 10g; K2HPO4 1g; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; agar 20g, pH = 7,0; nước 1L [37]

Môi trường ISP-6 : Peptone 10g; cao nấm men 1g; xitrat sắt 0,5g; agar 20g;

2.3.4 Hóa chất và thiết bị

2.3.4.1 Hóa chất

Các loại đường: glucose, saccarose, lactose, mannitol, xenllulose, tinh bột Các loại muối: CaCO3; K2HPO4.3H2O; KH2PO4; FeSO4.7H2O; (NH4)2SO4; NaCl CuSO4.5H2O; ZnSO4

Các loại cao : Cao thịt, cao nấm men, peptone,

Các loại hóa chất cần thiết khác

Dung môi: etylen acetat

2.3.4.2 Thiết bị

Biosystem, Mỹ Kính hiển vi

Đức

Máy ly tâm lạnh Sorvall RC5B,

Mỹ Máy lắc ổn nhiệt New Jersey, Mỹ

máy soi gel Bio-Rad, Mỹ

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập và nuôi cấy xạ khuẩn [4]

Các mẫu được thu nhận từ các lớp đất cách bề mặt khoảng 5-10 cm với các dụng cụ đã tiệt trùng Mẫu được đựng riêng lẻ trong các túi nilon và được hong khô trong không khí 3-5 ngày, loại bỏ sinh khối thực vật và đá, sau đó được cất giữ trong ngăn mát tủ lạnh cho đến khi được sử dụng cho quá trình phân lập xạ khuẩn Cân 1g mẫu đất cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý 0,9% (w/v), lắc

đều, tiếp đến 1 ml dịch huyền phù được pha loãng sang ống nghiệm mới chứa đựng

9 ml nước muối sinh lý, thu được nồng độ pha loãng 10-2 Qúa trình pha loãng được tiếp tục tiến hành đến nồng độ pha loãng 10-6 Sau đó, 100 µl mỗi nồng độ dịch pha loãng (10-2 đến 10-6 ) được cấy trải đồng thời lên trường thạch đĩa NA và ISP-4 Các đĩa này được nuôi ở 28 oC trong 3 tuần Các chủng xạ khuẩn được tinh sạch đến khi thu nhận được khuẩn lạc tinh khiết được bảo quản trong glycerol với nồng độ cuối cùng 20%(v/v) ở -80 oC cho các thí nghiệm tiếp theo

2.4.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh

Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập được kiểm tra khả năng sinh kháng sinh bằng phương pháp cấy chấm điểm của Crawford, 1993 [25]

Chủng xạ khuẩn sau khi tinh sạch được thử hoạt tính sinh kháng sinh bằng cách sử dụng que cấy vô trùng cấy từng khuẩn lạc lên trên đĩa thạch đã được cấy trải các vi khuẩn điểm định Các đĩa này được nuôi ở 28 0C trong 48h Đọc kết quả dựa vào khoảng cách vòng vô khuẩn Chọn và giữ các chủng có vòng kháng khuẩn

để nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại

2.4.3 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn

Để quan sát các đặc điểm hình thái như hình dáng khuẩn lạc, màu sắc KTKS, KTCC, sắc tố tan, sự hình thành melanin, các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Gause I, Gause II, ISP- 1, ISP- 4, ISP- 5, ISP- 6, ở nhiệt độ 28-30

oC Sau 7-14 ngày quan sát màu sắc KTKS, KTCC và sắc tố tan trên môi trường theo phương pháp của Shirling và Gottlieb và sử dụng bảng màu của Tresner và Barkus (1963)

Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của chủng được mô tả dựa vào khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, khả năng ức chế các VSV, khả năng mẫn cảm với các CKS và sự sinh trưởng của xạ khuẩn ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau (pH, nhiệt độ, muối )

2.4.3.1 Đặc điểm hình thái

Màu sắc khuẩn lạc (KTKS): Màu sắc của KTKS được so với 7 nhóm màu

của Tresner và Backus (1963): xanh da trời, sẫm, xám, xanh lá, đỏ, tím, trắng, vàng

Màu sắc của KTCC: chia vào 5 nhóm vàng- nâu (gồm cả các loại không tiết

sắc tố); xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

Khả năng sinh sắc tố tan: khả năng sinh sắc tố tan được xác định trên môi

trường ISP- 5 Sắc tố tan được xếp vào 5 nhóm giống màu của KTKS và KTCC

vàng nâu, xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin, nuôi

cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP- 1, ISP- 6 ở nhiệt độ thích hợp Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ vàng nhạt

sang nâu, đen [39]

2.4.3.2 Các đặc điểm sinh lí

Khả năng sử dụng nguồn cacbon

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP9 bổ sung nguồn cacbon (0,1%) Kết quả sinh trưởng được xác định sau 14 ngày, so sánh với ống đối chứng âm và đối

chứng dương (môi trường có D-glucose)

Khả năng sinh trưởng ở nồng độ muối, pH

Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường lỏng NB có bổ sung nồng độ muối (0-10%), bổ sung nồng độ pH (3-10) Nuôi ở nhiệt độ 30oC và đọc kết quả sau 7 ngày

Khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ khác nhau

Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường thạch NA ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau từ 10oC, 14oC, 30oC, 40oC, 45oC Mục đích là tìm giới hạn nhiệt độ mà chủng có khả năng sinh trưởng Đọc kết quả sau 7 ngày nuôi cấy

2.4.4 Lựa chọn môi trường lên men tối ưu cho sinh tổng hợp kháng sinh cho chủng xạ khuẩn nghiên cứu

2.4.4.1 Phương pháp lựa chọn môi trường tối ưu cho chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh

Dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn (1%, v/v) được cấy chuyển đến các bình 250ml chứa 100ml các môi trường khác nhau (Gause I, SCB, NB, 301, MT7), nuôi lắc 7 ngày ở 150v/p, 28oC Dịch lên men được tiến hành ly tâm ở 13,000 v/p, 4oC để loại bỏ sinh khối tế bào, sau đó 60 µl dịch ly tâm được nhỏ vào khoanh giấy (đường