Extraction of triterpenoids from ganoderma lucidum by ultrasound assisted extraction method and testing bioactivities of extract

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ---o0o--- NGUYỄN THỊ LINH TRÍCH LY HỢP CHẤT TRITERPENOID TỪ NẤM LINH CHI ĐỎ VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY CÓ HỖ TRỢ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -o0o -

NGUYỄN THỊ LINH

TRÍCH LY HỢP CHẤT TRITERPENOID TỪ NẤM LINH CHI ĐỎ VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY CÓ HỖ TRỢ SIÊU ÂM

VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO TRÍCH

(Extraction of triterpenoids from Ganoderma lucidum by ultrasound-assisted extraction

method and testing bioactivities of extract)

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC

Mã số: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Minh Nam

PGS TS Nguyễn Hữu Hiếu Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Huỳnh Ngọc Oanh

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM, ngày 16 tháng 09 năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 GS.TS Đống Thị Anh Đào - Chủ tịch

2 TS Huỳnh Ngọc Oanh - Ủy viên phản biện 1

3 TS Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long - Ủy viên phản biện 2

4 TS Nguyễn Quốc Thắng - Ủy viên

5 TS Nguyễn Văn Dũng - Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Linh MSHV: 1770451

Ngày, tháng, năm sinh: 27/10/1994 Nơi sinh: Hải Dương

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 60520301

I TÊN ĐỀ TÀI

Tên tiếng Việt: Trích ly hợp chất triterpenoid từ nấm linh chi đỏ Việt Nam bằng phương

pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích

Tên tiếng Anh: Extraction of triterpenoids from Ganoderma lucidum by

ultrasound-assisted extraction method and testing bioactivities of extract

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

2.1 Tổng quan: Nấm Linh chi, triterpenoid, hoạt tính của nấm Linh chi, phương pháp

trích ly hỗ trợ siêu âm, phương pháp định lượng triterpenoid, phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá, kháng ung thư, kháng khuẩn của cao trích, quy hoạch thực nghiệm

2.2 Thực nghiệm

 Trích ly flavonoid từ nấm Linh chi bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm

 Khảo sát ảnh hưởng của từng điều kiện đến hàm lượng triterpenoid bao gồm: Tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, công suất siêu âm, nhiệt độ và thời gian

 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời bốn điều kiện tỷ lệ dung môi:nguyên liệu, công suất siêu âm, nhiệt độ và thời gian đến hàm lượng triterpenoid bằng quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp CCD

 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá, kháng ung thư và kháng khuẩn của cao trích

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/2020

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 09/2020

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS HOÀNG MINH NAM

PGS TS NGUYỄN HỮU HIẾU

TP HCM, ngày 12 tháng 10 năm 2020

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Trưởng PTN TĐ ĐHQG TP.HCM

CNHH & DK

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, đầu tiên tác giả xin trân trọng cảm ơn đến người thân và gia đình đã luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tác giả trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Tác giả xin chân thành cảm ơn thầy TS Hoàng Minh Nam và thầy PGS TS Nguyễn Hữu Hiếu đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến các học viên, nghiên cứu viên và các bạn sinh viên ở Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG TP.HCM Công nghệ Hóa học & Dầu khí (CEPP Lab), Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM đã hỗ trợ tác giả trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tác giả

Nguyễn Thị Linh

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Trong luận văn này, hợp chất triterpenoid được trích ly từ nấm Linh chi đỏ bằng phương pháp sử dụng dung môi etanol có hỗ trợ siêu âm Hàm lượng triterpenoid trong cao trích được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thu phân tử (UV–Vis) Ảnh hưởng của từng điều kiện trích ly như tỷ lệ dung môi: nguyên liệu, công suất siêu âm, nhiệt độ và thời gian đến hàm lượng triterpenoid được khảo sát bằng phương pháp luân phiên từng biến để chọn ra khoảng tác động Sau đó, tiến hành khảo sát đồng thời bốn điều kiện là tỷ lệ dung môi: nguyên liệu, công suất siêu âm, nhiệt độ và thời gian bằng phương pháp phối hợp có tâm (CCD) Số liệu được xử lý bằng phần mềm Design Expert 11.0 để tìm điều kiện trích ly cho hàm lượng triterpenoid cao nhất Đồng thời phương pháp trích ly bằng nước nóng, dung môi etanol không có sự hỗ trợ của siêu

âm và Soxhlet cũng được thực hiện để đối chứng

Cao trích tại điều kiện tối ưu được khảo sát hoạt tính sinh học thông qua khả năng kháng oxy hóa sử dụng phương pháp bắt gốc tự do 1,1–diphenyl–1–picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'–azino–bis(3–ethylbenzthiazoline–6–sulphonic axit (ABTS) và gốc tự do hydroxyl với chất đối chứng dương là axit ascorbic; khả năng gây độc tế bào ung thư sử dụng phương pháp 3–[4,5–dimetylthiazol–2-yl] –2,5–diphenyltetrazol brom (MTT) đối

với dòng tế bào ung thư ung thư biểu mô, ung thư gan, ung thư phổi và ung thư vú

ABSTRACT

In this thesis, active triterpenoid is extracted from Ganoderma lucidum by using

ultrasonic-assisted extraction Crude extracted triterpenoid content was determined by molecular absorption spectroscopy (UV-Vis)

The effects of each extraction conditions such as solvent: material ratio, ultrasonic power, temperature, and time on triterpenoid content were investigated by single - factor method to choose the impact range Then, simultaneously surveyed these four conditions such as solvent : material ratio, ultrasonic power, temperature and time by Central Composite design(CCD) Data were processed by Design Expert 11.0 software to find the extraction conditions for the highest triterpenoid content At the same time, hot water, ethanol and Soxhlet extractions were performed for control samples

Crude extract at optimize conditions was investigated for biological activity through oxidation resistance using the 1.1-diphenyl – 1 – picrylhydrazyl (DPPH), 2,2' – azino – bis free radical capture method (3 – ethylbenzthiazoline – 6 – sulphonic acid (ABTS) and hydroxyl free radical with ascorbic acid as positive control; carcinogenicity using 3– [4,5 – dimethylthiazol – 2-yl] ] –2,5 – diphenyltetrazole bromine (MTT) method for carcinoma, liver, lung, and breast cancer cell lines

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tác giả và được thực hiện dưới sự hướng dẫn của hai thầy TS Hoàng Minh Nam và PGS

TS Nguyễn Hữu Hiếu, Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG TP HCM Công nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP Lab), Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP HCM

Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, chưa từng được công bố trong bất cứ một công trình nào khác trước đây Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn này đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Tác giả

Nguyễn Thị Linh

1 MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

Tổng quan về nấm Linh chi 2

Phân loại khoa học và khu vực phân bố 2

Mô tả thực vật 2

Phân bố, sinh thái 3

Thành phần hoá học 3

1.1.4.1 Polysaccharide 4

1.1.4.2 Adenosine 5

1.1.4.3 Pectit, protein 6

1.1.4.4 Nhóm phenolic 6

1.1.4.5 Saponin 6

Hoạt tính sinh học của triterpenoid 8

Kháng oxy hoá 8

Kháng ung thư 9

Kháng khuẩn 11

1.2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn 11

1.2.3.2 Cơ chế kháng khuẩn của triterpenoid 13

Một số hoạt tính khác 14

Các phương pháp trích ly hoạt chất trong nấm Linh chi 14

Phương pháp trích ly truyền thống 15

Phương pháp trích ly hiện đại 15

1.3.2.1 Hỗ trợ vi sóng 15

1.3.2.2 Enzym 16

1.3.2.3 Lưu chất siêu tới hạn 17

1.3.2.4 Phương pháp siêu âm 18

Phân tích hàm lượng hợp chất trong cao trích bằng quang phổ hấp thu nguyên từ 20

Tình hình nghiên cứu 21

Ngoài nước 21

Trong nước 22

Tính cấp thiết 22

Mục tiêu nghiên cứu 23

Nội dung 23

Phương pháp nghiên cứu 23

1.6.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu 23

1.6.4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của từng yếu tố đến hàm lượng triterpenoid 23

1.6.4.3 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố đến hàm lượng triterpenoid 23

1.6.4.4 Định lượng phương pháp phân tích định lượng triterpenoid 25

1.6.4.5 Phân tích thành phần cao chiết bằng phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier 26

1.6.4.6 Phân tích bề mặt vật liệu bằng kính điện tử quét 27

1.6.4.7 Phân tích nhiệt trọng lượng 27

1.6.4.8 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích 28

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 34

Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm thực hiện 34

Nguyên liệu 34

Hoá chất 34

Thiết bị 35

Địa điểm thực hiện luận văn 36

Thí nghiệm 36

Xác định độ ẩm nguyên liệu 36

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trích ly 36

2.2.2.1 Quy trình trích ly triterpenoid 36

2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố đến hàm lượng triterpenoid 37

2.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến hàm lượng triterpenoid 40

2.2.2.4 Định lượng triterpenoid 42

Thí nghiệm so sánh đối chứng 42

Phân tích đặc tính hoá lý của cao trích 43

Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích 43

2.2.5.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá 43

2.2.5.3 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 45

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46

Độ ẩm của nguyên liệu 46

Ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm luợng triterpenoid 46

Ảnh hưởng của từng điều kiện 46

3.2.1.1 Tỷ lệ dung môi: nguyên liệu 46

3.2.1.2 Ảnh hưởng của công suất siêu âm 47

3.2.1.3 Nhiệt độ 47

3.2.1.4 Thời gian 48

Ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố 50

Kiểm chứng mô hình 59

Phân tích thành phần cao chiết 61

Cấu trúc bề mặt của nguyên liệu trước và sau khi trích ly 63

Độ bền nhiệt của cao chiết 64

Hoạt tính sinh học của cao trích 65

Hoạt tính kháng oxy hoá 65

3.3.1.1 Khả năng bắt gốc tự do DPPH 65

3.3.1.2 Khả năng bắt gốc tự do ABTS 66

3.3.1.3 Khả năng bắt gốc tự do hydroxyl 68

Hoạt tính kháng ung thư 69

Hoạt tính kháng khuẩn 70

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

2 DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Nấm Linh chi 3

Hình 1.2: Cấu trúc β-glucan phân lập từ nấm Linh chi [14] 5

Hình 1.3: Adenosine 5

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của ATP 5

Hình 1.5: Khung lanostane 7

Hình 1.6: Cơ chế kháng oxy hóa bằng cách cho điện tử 9

Hình 1.7: Ảnh hưởng của triterpenoid đến quá trình tế bào chết theo chu kì 11

Hình 1.8: Vi khuẩn Staphylococcus aureus 12

Hình 1.9: Vi khuẩn Escherichia coli 12

Hình 1.10: Cơ chế kháng khuẩn của triterpenoid 14

Hình 1.11: Quá trình phá vỡ cấu trúc tế bào của enzym 17

Hình 1.12: Giản đồ áp suất – nhiệt độ của CO2 18

Hình 1.13: Quá trình trích ly hoạt chất có hỗ trợ của siêu âm 19

Hình 1.14: Mô tả hệ thống trích ly bằng sóng siêu âm dạng bể 20

Hình 1.15: Sơ đồ nguyên lý hấp thu tia sáng 21

Hình 1.16: Sơ đồ nguyên lý máy UV-VIS 21

Hình 1.17: Các mô hình thiết kế thí nghiệm 25

Hình 1.18: Cấu tạo thiết bị quang phổ FTIR 26

Hình 1.19: Cấu tạo máy FE-SEM 27

Hình 1.20: Sơ đồ cấu tạo của thiết bị đo TGA 28

Hình 1.21: Phản ứng mất màu của DPPH với chất kháng oxy hoá 29

Hình 1.22: Phản ứng mất màu của ABTS với chất kháng oxy hoá 29

Hình 1.23: Phản ứng mất màu của H2O2với chất kháng oxy hoá 31

Hình 1.24: Nguyên tắc thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư 32

Hình 1.25: Cách đo đường kính vòng kháng khuẩn 33

Hình 2.1: Mẫu nấm Linh chi 34

Hình 2.2: Quy trình trích ly triterpenoid từ nấm Linh chi 37

Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi: nguyên liệu 46

Hình 3.2: Ảnh hưởng của công suất siêu âm 47

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ 48

Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm 49

Hình 3.5: Hàm lượng triterpenoid từ số liệu thực nghiệm và dự đoán 53

Hình 3.6: Ảnh hưởng đồng thời của công suất và tỷ lệ dung môi: nguyên liệu 54

Hình 3.7: Ảnh hưởng đồng thời nhiệt độ trích ly và tỷ lệ dung môi:nguyên liệu 55

Hình 3.8: Ảnh hưởng đồng thời của thời gian trích ly và tỷ lệ dung môi: nguyên liệu 56

Hình 3.9: Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ trích ly và công suất siêu âm 57

Hình 3.10: Ảnh hưởng đồng thời của thời gian trích ly và công suất siêu âm 58

Hình 3.12: Hàm lượng triterpenoid của mẫu tối ưu và các mẫu đối chứng 61

Hình 3.13: Phổ FTIR của chuẩn axit ursolic, dịch chiết và nguyên liệu thô 62

Hình 3.14: Ảnh SEM của mẫu nấm Linh chi trước khi trích ly (a), (b) và sau khi trích ly bằng sóng siêu âm (c), (d) 63

Hình 3.15: Độ bền nhiệt của cao trích nấm Linh chi 64

Hình 3.16: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của axit ascorbic 65

Hình 3.17: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao chiết 66

Hình 3.18: Khả năng bắt gốc tự do ABTS của axit ascorbic 67

Hình 3.19: Khả năng bắt gốc tự do ABTS của cao chiết 67

Hình 3.20: Khả năng bắt gốc tự do hydroxyl của axit ascorbic 68

Hình 3.21: Khả năng bắt gốc tự do hydroxyl của cao chiết 68

Hình 3.22: Hoạt tính kháng ung thư của cao trích nấm Linh chi đối với bốn dòng tế bào ung thư Lu1, Hep-G2, KB và MCF7 69

Hình 3.23: Hoạt tính kháng khuẩn E.coli của cao trích nấm Linh chi 70

Hình 3.24: Hoạt tính kháng khuẩn S aureus của cao trích nấm Linh chi 71

3

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi và công dụng 3

Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng 34

Bảng 2.2: Các dụng cụ và thiết bị sử dụng 35

Bảng 2.3: Các yếu tố khảo sát 38

Bảng 2.4: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi: nguyên liệu 38

Bảng 2.5: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi:nguyên liệu 39

Bảng 2.6: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 39

Bảng 2.7: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 40

Bảng 2.8: Mức thí nghiệm của các biến độc lập của quá trình trích ly triterpenoid 40

Bảng 2.9: Thiết kế thí nghiệm theo mô hình CCD 41

Bảng 2.10: Điều kiện trích ly các mẫu so sánh đối chứng 43

Bảng 3.1: Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mô hình CCD đối với triterpenoid 50

Bảng 3.2: Kết quả phân tích ANOVA 51

Bảng 3.3: Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 52

Bảng 3.4: Điều kiện hiệu chỉnh từ mô hình 60

Bảng 3.5: Kết quả kiểm chứng mô hình 60

ORAC Oxygen radical absorbance capacity Khả năng hấp thụ gốc tự do

chứa oxy hoạt động

potential

Khả năng bẫy các gốc tự do

khử sắt

Concentration

Nồng độ ức chế 50 %

5 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày này, với sự căng thẳng và áp lực của xã hội hiện đại đã ảnh hưởng không nhỏ đến sức khoẻ của con người Mặc dù những tiến bộ do công nghệ mang lại đã làm cho cuộc sống của con người trở nên dễ dàng hơn, nhưng con người vẫn đang tìm kiếm các giải pháp điều trị bệnh thay thế khác có nguồn gốc từ tự nhiên tốt hơn Điều này đã dẫn đến nhu cầu ngày càng tăng đối với các thảo dược có chứa các hoạt chất có hoạt tính sinh học được sử dụng để nâng cao sức khỏe và hỗ trợ điều trị bệnh Trong đó, nấm Linh chi được biết đến là một trong những dược liệu quý, được trồng và nghiên cứu ở nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt là các nước khu vực Châu Á như: Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc Một số hoạt tính của nấm Linh chi như là chống oxy hóa, giảm đau, kháng nấm, chống viêm, chống khối u, điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan, đã được chứng minh Các thành phần hóa học trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: axit béo, adenosine, triterpenoid, polysaccharides, đã được nghiên cứu là có nhiều tác dụng trong việc tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ gan, kháng oxy hóa và kháng ung thư

Nấm Linh chi thường được trích ly bằng phương pháp truyền thống sử dụng dung môi hữu cơ hoặc nước nóng Nhưng những phương pháp trên có nhiều hạn chế, hiệu quả trích ly thấp, làm biến tính các hoạt chất, tồn tại các dung môi hữu cơ độc trong sản phẩm thu được Quá trình trích ly bằng sóng siêu âm với dung môi là etanol như là một phương án thay thế tuyệt vời cho các quá trình trích ly truyền thống

Phương pháp trích ly bằng sóng siêu âm với dung môi là etanol có giá thành hóa chất

và thiết bị tương đối thấp nhưng cho thời gian trích ly ngắn, hàm lượng trích ly cao, sản phẩm sau khi trích ly có chất lượng tốt, hạn chế được sự hình thành các gốc tự do và thiết bị dễ sử dụng là những ưu điểm nổi trội phương pháp này Do đó có thể được lựa chọn cho quá trình trích ly và phân tách các thành phần hoạt tính từ các cây thuốc quý

Vì vậy, đề tài này được thực hiện với tiêu đề “Trích ly hợp chất triterpenoid từ

nấm Linh chi đỏ Việt Nam bằng phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan về nấm Linh chi

Phân loại khoa học và khu vực phân bố

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Ganodermataceae

Nấm Linh chi thường có tên gọi khác là Lingzi ở Trung Quốc, reishi ở Nhật Bản và yeongji ở Hàn Quốc, còn có ở Việt Nam thường gọi là tiên thảo, nấm trường thọ, phân

bố khắp nơi trên thế giới, chủ yếu là vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như châu Á Nấm Linh chi có phân loại khoa học như sau [1]

cm, dày 0,8 – 3,3 cm Phần đỉnh cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm [2] Hình ảnh thực

tế của nấm Linh chi được thể hiện như 1.1

Hình 1.1: Nấm Linh chi

Phân bố, sinh thái

Nấm Linh chi là loài phân bố khắp nơi trên thế giới Ở Việt Nam, nấm Linh chi có thể tìm thấy ở hầu hết các tỉnh vùng núi, từ Lào Cai đến Lâm Đồng Nấm Linh chủ yếu sinh sản bằng bào tử ở mặt dưới của quả thể Phần có chức năng sinh dưỡng chính là hệ sợi của nấm mọc ẩn trong gỗ mục hoặc đất [3]

Thành phần hoá học

Nấm Linh chi có chứa khoảng 400 hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau có trong loại nấm này Polysaccharide, triterpenoid, germanium hữu cơ, ergosterol, nucleotit, sterol, axit amin, axit béo, protein và các nguyên tố vi lượng là những hợp chất hoạt động chính có các hoạt tính sinh học [4, 5] Bảng 1.1 thể hiện một số hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Bảng 1.1: Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi và công dụng

Hoạt chất Nhóm chất Hoạt tính dược lý

Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giãn cơ, giảm đau

Beta–D–glucan Polysaccharide Chống ung thư, tăng tính miễn dịch

1.1.4.1 Polysaccharide

Các polysaccharide của nấm Linh chi có tác dụng sinh học như kháng viêm, hạ đường huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u và tăng cường khả năng miễn dịch, kháng oxy hóa [6, 7] Có trên 200 loại polysaccharide được phân lập từ nấm Linh chi, trong đó chủ yếu gồm 2 loại chính là galactan và glucan Đặc biệt, glucan có liên kết β (β–glucan) là hoạt chất sinh học có nhiều công dụng quý, có lợi cho con người [8, 9] β–glucan là một chuỗi các phân tử D–glucose liên kết bởi liên kết (1,3) –β hay (1,6) –β Các sản phẩm tự nhiên có chứa β–glucan đã được sử dụng rất lâu, nhưng β–glucan chỉ mới được nghiên cứu trong những năm gần đây Các nghiên cứu cho thấy các tác động kích thích miễn dịch và được sử dụng để điều trị một số bệnh bao gồm ung thư, bệnh truyền nhiễm, bệnh tiểu đường và các bệnh tim mạch [10, 11] Cấu trúc hóa học của hoạt chất β-glucan được trình bày như ở hình 1.2

Một số sáng chế ở Nhật Bản như sản xuất chế phẩm trích ly từ Linh chi có tác dụng kháng carcinogen của công ty Kureha Chemical Industry (1976), sản xuất sản phẩm trích ly từ Linh chi có gốc glucoprotein làm ức chế neoplasm của công ty Teikoko Chemical Industry (1982) và bằng sáng chế Mỹ sản xuất từ Linh chi chất

mucopolysaccharide dùng để kháng ung thư của công ty Kureha Chemical Industry (1976) [12, 13].

Hình 1.2: Cấu trúc β-glucan phân lập từ nấm Linh chi [14]

1.1.4.2 Adenosine

Adenosine là một purine nucleoside được cấu tạo bởi một phân tử adenine gắn với một phân tử đường ribose thông qua liên kết glycoside như thể hiện ở hình 1.3 [15]

Hình 1.3: Adenosine Các dẫn xuất của adenosine được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên, tế bào của cơ thể con người và đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh hóa trong cơ thể, như là nguồn gốc hình thành nên adenosine triphosphate (ATP) – “đồng tiền năng lượng” của

tế bào cũng như dẫn truyền tín hiệu cho sự làm việc của nhiều hệ cơ quan Hình 1.4 thể hiện công thức hoá học của ATP

Adenosine đã được chứng minh là có khả năng ổn định huyết áp, điều trị và phòng ngừa các bệnh về tim mạch, tăng cường quá trình tuần hoàn oxy trong máu, cải thiện khả năng sinh lý, ổn định thần kinh và hỗ trợ hoạt động của hệ thần kinh

1.1.4.3 Pectit, protein

Năm 1989, các tác giả người Nhật đã phân lập từ sợi nấm Linh chi một polypeptit dựa trên sắc ký lọc gel (cột Saphadex G-10) và sắc kí trao đổi ion (cột DEAE Sephadex-25)

Protein trong nấm Linh chi có chứa tất cả các axit amin thiết yếu, rất giàu lysin và leucin Tổng hàm lượng chất béo thấp và tỷ lệ cao các đa axit béo không bão hoà tương đối so với tổng số axit béo của nấm được coi là đóng góp đáng kể cho giá trị của nấm Linh chi [16]

1.1.4.4 Nhóm phenolic

Các hợp chất phenolic là một trong những hợp chất hoạt tính sinh học quan trọng và được chiết xuất phổ biến nhất từ nấm Linh chi Các hợp chất này có thể được phân thành phenol đơn giản và axit phenolic như axit gallic, axit benzoic, axit syringic, axit chlorogenic và polyphenol [17] Flavonoid là một nhóm các hợp chất polyphenol với các đặc tính có lợi cho sức khỏe đã biết bao gồm loại bỏ gốc tự do, ức chế các enzym thủy phân và oxy hóa và hoạt động chống viêm Các hợp chất phenolic có các đặc tính sinh học và dược lý mạnh Cao chiết phenolic của quả thể và sợi nấm có khả năng chống oxy hóa cao hơn so với polysaccharide được trích ly từ nấm Linh chi

1.1.4.5 Saponin

Ssaponin hay saponosid thường được định nghĩa trên cở sở cấu trúc hoá học đó là các triterpen glycosid hay các 27-C steroid glycosid Cấu trúc của saponin gồm hai phần là phần đường và phần aglycon (hay genin) Phần aglycon thường được gọi là sapogenin Sapogenin có cấu trúc triterpen với khung cơ bản 30 cacbon hoặc steroid với 27 cacbon Dựa trên cấu trúc hoá học của phần aglycon có thể chia saponin thành hai nhóm lớn

là saponin triterpenoid và saponin steroid

Cấu trúc phần genin của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi các đơn vị terpen Các saponin này được chia làm hai loại là saponin triterpenoid 5 vòng và saponin triterpenoid 4 vòng Saponin triterpenoid 5 vòng có phần sapogenin với khung 30 cacbon với 5 vòng và 8 nhóm methyl Nhóm này được chia thành 5 nhóm nhỏ là oleanan, ursan,

teraxasteran và hopan Saponin triterpenoid 4 vòng có 4 nhóm dammaran, lanostan, tirucallan và cucurbitan

Triterpenoid

Khoảng 140 loại triterpenoid đã được xác định trong nấm Linh chi, hầu hết triterpenoid loại lanostane Chính các triterpenoid này làm cho nấm Linh chi có vị đắng Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ sáu đơn vị isopren Các triterpenoid

có bộ khung chính từ 30 nguyên tử carbon (C30H48) thường gặp trong thực vật Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một

số nhóm chức như: -OH, -O-, C=O, v.v Đặc tính chung là tan tốt trong etanol, metanol,

ít tan trong nước ngoại trừ khi kết hợp với đường để tạo thành glycosid Các triterpenoid

có độ nhớt vừa phải và tạo vị đắng trong nấm Linh chi [18, 19]

Các triterpenoid đầu tiên được phân lập từ nấm Linh chi là axit ganoderic A và B Đến nay, các nghiên cứu cho thấy đã có hơn 100 triterpenoid Trong số đó, hơn 50 triterpenoid mới được tìm thấy trong Linh chi, chủ yếu là axit ganoderic, lucidenic và những triterpenoid khác như ganoderals và ganoderiols [20, 21]

Phần lớn cấu trúc hóa học của triterpenoid trong nấm Linh chi dựa trên cấu trúc của lanostane là một chất chuyển hóa của lanosterol, tổng hợp dựa trên sự tạo vòng của các squalene [22, 23] Hình 1.5 mô tả cấu trúc của một dạng khung lanostane điển hình

Hình 1.5: Khung lanostane Theo thống kê có hơn một trăm triterpenoid đã được phân lập từ nấm Linh chi Các hợp chất này được chứng minh là có tác dụng tốt đối với sức khỏe Đây là một trong những hợp chất quan trọng đã được nghiên cứu về dược tính trong thành phần của nấm Linh chi Các tác dụng của triterpenoid có thể kể đến như: khả năng kháng oxy hóa, giảm huyết áp, tăng cường chức năng gan, hạn chế khối u và giảm các triệu chứng của ung thư, ức chế giải phóng histamin, ức chế tổng hợp cholesterol, hỗ trợ điều trị bệnh Herpes và hạn chế sự hoạt động của HIV-1 protease [24]

Hoạt tính sinh học của triterpenoid

Kháng oxy hoá

Gốc tự do là các nguyên tử hoặc phân tử có lớp ngoài cùng chứa một điện tử đơn lẻ

Do đó, không cân bằng về điện tử, dễ tạo ra phản ứng chiếm đoạt điện tử bị thiếu từ các nguyên tử hay phân tử khác để trở về trạng thái ổn định Đồng thời, các phân tử bị tấn công và mất electron sẽ trở thành gốc tự do mới, bắt đầu một phản ứng dây chuyền và gây rối loạn hoạt động bình thường của tế bào [25]

Bản chất gốc tự do là nhóm nguyên tử mang electron độc thân như superoxide, hydroxyl, peroxyl, alkoxyl Các gốc tự do này kém bền, hoạt động hóa học cực mạnh theo phản ứng dây chuyền, khi phân tử nào bị chiếm electron phân tử đó sẽ trở thành gốc tự do mới [26]

Các gốc tự do có xu hướng bao phủ lên bề mặt của màng tế bào và oxy hóa màng tế bào Điều này ngăn cản tế bào hấp thu oxy, nên gây ra tình trạng thiếu oxy cho tế bào, đồng thời cũng gây cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào như: cản trở sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường, bột, mỡ, phá hủy các enzym và hormone của cơ thể, v.v Bên cạnh đó, gốc tự do cũng phá vỡ màng tế bào, tấn công các ty thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng làm thất thoát các chất dinh dưỡng và làm suy yếu chức năng của

tế bào, dẫn đến chết tế bào hoặc các tế bào có ADN bị lỗi, đột biến gen Đây là nguyên nhân dẫn đến các tổn thương như: biến đổi cấu trúc protein, thay đổi nội tiết tố, kích thích các mầm bệnh và dẫn đến các chứng bệnh: xơ vữa động mạch, tiểu đường, tai biến

và ung thư Chất kháng oxy hóa hay còn gọi là chất bắt gốc tự do giúp ngăn chặn quá trình oxy hóa diễn ra bằng cách trung hòa các gốc tự do Chất kháng oxy hóa được chia thành hai loại: chất kháng oxy hóa nội sinh (có bản chất enzym) và chất kháng oxy hóa ngoại sinh (không có bản chất enzym) Trong cơ thể sống luôn có một hệ thống các enzym nội bào có thể phân cắt các gốc tự do trở thành các phân tử ít nguy hại: superoxide dismuatase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) với sự kết hợp các nguyên tố kim loại vi lượng như Se, Mn, Cu, Fe và Zn Khi cơ thể mất cân bằng, quá trình oxy hóa diễn ra mạnh hơn quá trình kháng oxy hóa Việc vô hiệu hóa gốc tự do và phục hồi tế bào bị tổn thương bằng các chất kháng oxy hóa sẽ tăng cường hệ thống miễn dịch, ngăn ngừa bệnh tật và làm chậm quá trình lão hóa Các chất kháng oxy hóa có khả năng giải phóng ra những điện tử hoặc proton H+ cho các gốc tự do, vô hiệu hóa khả

năng oxy hóa và ngăn chặn sự tấn công các tế bào khỏe mạnh [27] Hình 1.6 thể hiện cơ chế kháng oxy hóa bằng cách cho điện tử

Hình 1.6: Cơ chế kháng oxy hóa bằng cách cho điện tử

Chất kháng oxy hóa đa số có tính khử, đóng vai trò như những tác nhân thu bắt gốc

tự do từ đó làm chậm tiến trình oxy hóa gây hại Những hoạt chất như tocopherol (vitamin E), axit ascorbic (vitamin C), epigallocatechin-3-gallate (EGCG), axit gallic, tannin, catechin, caroten và glutathione từ lâu đã được chứng minh có khả năng bắt gốc

tự do mạnh nên những chất này thường được sử dụng làm đối chứng khi khảo sát tính kháng oxy hóa của dược liệu, cũng như cần bổ sung các chất này khi cơ thể con người

bị stress [28, 29]

Nhờ cơ chế khử các gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm

xạ mà các cơ quan bị tổn thương được phục hồi và ngăn chặn sự tấn công các tế bào gây

ra sự lão hóa cơ thể Ngoài ra, triterpenoid là tiền thân của steroid, một loại hợp chất tham gia cấu tạo nên các màng tế bào, do đó triterpenoid còn giúp trẻ hóa các tế bào trong cơ thể [30]

Ngoài những lợi ích trên, triterpenoid trong nấm Linh chi còn tham gia vào quá trình truyền xung thần kinh lên não, từ đó giúp hỗ trợ tăng cường sức mạnh hệ thần kinh, kiểm soát và duy trì sự hoạt động ổn định của cả hệ thống cơ thể [31]

chống viêm và kháng nguyên lại các khối u Ngoài ra, triterpenoid còn có thể điều chỉnh

và kích hoạt hệ thống miễn dịch giúp tăng cường chức năng miễn dịch cơ thể và tăng khả năng tự vệ chống lại ung thư [32, 33]

Các triterpenoid tác động đến các tế bào ung thư thông qua 3 tác động chính là kìm hãm tế bào, ngăn tế bào chết và chống di căn Các hợp chất này kích thích tế bào ung thư chết theo chu trình Apoptosis Apoptosis hay còn gọi là tế bào chết theo chu trình là một hiện tượng đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý xảy ra trong cơ thể con người Cơ thể con người có khoảng 60 nghìn tỷ tế bào và mỗi tế bào đều được quy định tuổi thọ tối đa Chúng được lập trình để tự tái tạo sau khoảng thời gian hoạt động nhất định Tuy nhiên, tế bào ung thư lại có khả năng sống “bất tử” trong cơ thể, hơn nữa còn liên tiếp nhân đôi mất kiểm soát Các saponin triterpenoid giúp thúc đẩy quá trình

tự chết của tế bào ung thư, buộc các tế bào ung thư phải tuân theo quá trình tự chết như bình thường, từ đó ức chế sự tăng trưởng và phát triển của ung thư Triterpenoid Rh2 gây giảm điện thế màng ty thể và giải phóng cytochrome c từ ty thể, dẫn đến kích hoạt caspase 3 và 9 Cytochrome c được phóng thích khỏi ti thể, các cytochrome c được phóng bám vào các nhân tố kích hoạt protease chết rụng -1 (apoptotic protease activating factor - 1, Apaf-1) và ATP khiến chúng trải qua quá trình oligomer hóa và trở thành một phức hợp mang tên thể chết rụng (apoptosome) như thể hiện ở hình 1.7 [34]

Hình 1.7: Ảnh hưởng của triterpenoid đến quá trình tế bào chết theo chu kì

Kháng khuẩn

1.2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn

Vi khuẩn có thể được phân biệt Gram âm và Gram dương do sự khác nhau cấu tạo và tính chất của màng tế bào Vi khuẩn Gram dương và Gram âm có sự khác biệt về cấu tạo hình thái Vi khuẩn Gram dương có màng peptidoglycan dày, không có màng ngoài

tế bào, giữ lại màu tím thuốc nhuộm [35] Trong khi đó, vi khuẩn Gram âm có màng peptidoglycan mỏng kẹp giữa lớp màng tế bào bên trong và bên ngoài của vi khuẩn, không thể giữ lại màu thuốc nhuộm sau bước khử màu Do đó, trong đề tài này, tiến hành nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của cao chiết triterpenoid trong nấm Linh chi

a Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S aureus) còn gọi là tụ cầu vàng, là những cầu khuẩn Gram

dương có đường kính từ 0,8 – 1,0 µm, không có lông và nha bào, thường không có vỏ như thể hiện ở hình 1.8

Hình 1.8: Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10 – 45 °C và nồng độ muối cao tới 10% thích nghi trong môi trường hiếu khí và kị khí Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc đường kính 1 – 2 mm, nhẵn Sau 24 giờ ở 37

°C, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh

Khi ăn uống phải độc tố của khuẩn tụ cầu vàng hoặc số lượng khuẩn tụ cầu vàng trong ruột tăng lên đáng kể về số lượng có thể gây ra ngộ độc cấp tính Sau khi ăn phải thức

ăn nhiễm độc tố tụ cầu từ 2 – 8 giờ, bệnh nhân nôn và tiêu chảy nặng, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước [36]

b Vi khuẩn Escherichia coli

Escherichia coli (E coli) hay trực khuẩn lị là một loài vi khuẩn Gram âm,

kích thước trung bình từ 2 – 3 µm; trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ

trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ Rất ít chủng E coli

có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động như thể hiện ở hình 1.9

Hình 1.9: Vi khuẩn Escherichia coli

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trưởng nuôi cấy thông thường Một số có thể

phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Có thể phát triển ở nhiệt

độ từ 5 – 40 °C Nhiệt độ thích hợp xung quanh 37 °C Trong điều kiện thích hợp E coli

phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 – 30 phút

Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 – 10 giờ, dùng kính lúp đã có thể quan sát được khuẩn lạc Sau 24 giờ khuẩn lạc khoảng 1,5 mm Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng cũng có thể gặp dạng R, hoặc M Trên môi trường phân lập, tuỳ theo chất

chỉ thị màu, E coli có khuẩn lạc màu vàng (như trên thạch lactose) hoặc màu đỏ (như

trên thạch MacConkey) [37]

E coli là thành viên thuộc vi hệ bình thường của đường tiêu hoá, chiếm tỷ lệ cao nhất

trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80 %) Tuy nhiên, E coli cũng là một vi khuẩn

gây bệnh, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu và viêm đường mật

Ngày nay, thức ăn bị nhiễm khuẩn gây ngộ độc thực phẩm cấp tính và thường được chữa bằng các loại kháng sinh Tuy nhiên, việc dùng kháng sinh như vậy sẽ gây ra hiện tượng kháng kháng sinh Trong đề tài này, tác giả nghiên cứu trích ly hoạt chất triterpenoid từ nấm Linh chi để thử nghiệm khả năng kháng các loại vi khuẩn trên của cao trích, góp phần tìm ra các hoạt chất có khả năng kháng các loại vi khuẩn gây hại đến sức khỏe con người cũng như tiêu diệt chúng thay vì dùng kháng sinh trong điều trị ngộ độc thực phẩm

Trong đề tài này, hai vi khuẩn là Staphylococcus aureus và E coli được chọn để thử

nghiệm hoạt tính kháng khuẩn vì đại diện cho hai chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương

1.2.3.2 Cơ chế kháng khuẩn của triterpenoid

Các triterpenoid ở trạng thái không phân ly (không ion hóa, ưa béo hơn) xuyên qua màng bán thấm của thành tế bào vi khuẩn và đi vào tế bào chất Như thể hiện trong hình 1.10, ở môi trường pH bên trong của vi khuẩn (~ 7,0), các triterpenoid không phân ly sẽ phân ly, giải phóng H + và anion, pH bên trong của vi khuẩn giảm Các vi khuẩn nhạy cảm với pH không thể chịu được sự chênh lệch pH bên trong và bên ngoài Việc hạ thấp

độ pH trong tế bào làm giảm hoạt động của enzym pyruvate decarboxylase, enzym cơ bản để chuyển hóa năng lượng Để khắc phục vi khuẩn buộc phải sử dụng năng lượng

để đẩy proton ra ngoài qua màng Hiện tượng này tiêu tốn năng lượng và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn hoặc giết chết vi khuẩn Ngoài ra, pH giảm cũng ngăn chặn các

Hình 1.10: Cơ chế kháng khuẩn của triterpenoid

Một số hoạt tính khác

Bên cạnh những hoạt tính tốt đã được nghiên cứu như kháng oxy hóa, kháng ung thư Các hợp chất triterpenoid trong nấm Linh chi còn được sử dụng để khảo sát khả năng kháng HIV, loại virus được nhân lên thông qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T Nghiên cứu trích ly triterpenoid của nấm Linh chi quả thể bằng metanol, kết quả cho thấy hoạt chất thu được có tác dụng ức chế sự nhân lên của virus HIV trên tế bào lympho T của người nhiễm HIV-1 Những nghiên cứu tiếp theo khi thay thế metanol trong quá trình trích ly bằng các dung môi khác như: n-hexan, etyl acetat cũng đều cho thấy sự sinh sản của virus HIV đã bị ức chế [39, 40]

Triterpenoid giúp làm tăng tốc độ trao đổi chất của các loại thuốc và tăng cường khả năng thải chất độc trong gan Trong đó, lucidone A và lucidenol là hai hoạt chất chính trong nhóm triterpenoid của nấm Linh chi có thể bảo vệ gan khỏi bị hư hại bởi các yếu tố sinh lý và sinh học Một số hoạt chất khác như ganodermadiol, axit ganoderic B, D, F, H, K và Y có trong nấm Linh chi là những hoạt chất có khả năng làm hạ huyết áp

Triterpenoid trong nấm Linh chi có nhiều hoạt tính quý nên cần có những phương pháp trích ly phù hợp

Các phương pháp trích ly hoạt chất trong nấm Linh chi

Ngày nay, các hoạt chất có hoạt tính sinh học được trích ly bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, cơ bản được chia thành hai loại là phương pháp truyền thống và phương pháp hiện đại, mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm khác nhau

Tăng tính thâm của màng

Thành tế bào vi

khuẩn

DNA

Phương pháp trích ly truyền thống

Trong phương pháp truyền thống, nguyên liệu được ngâm vào trong dung môi thích hợp để hòa tan các hợp chất mong muốn, có sử dụng kết hợp với nhiệt độ hoặc khuấy trộn Trích ngâm, trích ngấm kiệt và trích Soxhlet là những phương pháp trích ly truyền thống Nhìn chung, phương pháp trích ly truyền thống đơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên, tốn nhiều thời gian và hàm lượng triterpenoid trích ly thấp

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật, các phương pháp trích ly truyền thống

này đang dần được thay thế bởi các thiết bị hiện đại hơn

Phương pháp trích ly hiện đại

Các phương pháp hiện đại đã và đang phổ biến hiện nay như trích ly hỗ trợ vi sóng, enzym, lưu chất siêu tới hạn và đặc biệt là siêu âm

Sự đun nóng của vi sóng là do sự quay lưỡng cực và sự dẫn truyền ion Nhiệt được sinh ra do sự dẫn truyền ion là kết quả của sự tăng trở kháng của môi trường chống lại

sự dịch chuyển của các ion trong điện trường Sự quay lưỡng cực là quá trình thay đổi hướng của một phân tử phân cực theo chiều của điện trường Các phân tử phân cực có

xu hướng sắp xếp theo chiều điện trường Tuy nhiên, điện trường xoay chiều có tần số cao (MHz) gây ra sự ma sát với vận tốc xoay rất lớn giữa các phân tử, làm cho vật chất nóng lên [43]

Những hợp chất càng phân cực thì dưới tác động của vi sóng sẽ nóng càng nhanh Trong đó, nước có độ phân cực mạnh và cấu trúc bất đối xứng, do đó, nước là một chất rất dễ đun nóng bằng vi sóng

Phương pháp trích ly có hỗ trợ của vi sóng có hàm lượng triterpenoid cao hơn so với các phương pháp thông thường, sản phẩm trích ly có chất lượng tốt, thời gian chiết nhanh, thiết bị dễ sử dụng, thân thiện với môi trường, không có quán tính nhiệt và có tác dụng đặc biệt với các phân tử phân cực Do đó, phương pháp này có hạn chế với các phân tử không phân cực, khó áp dụng quy mô công nghiệp vì chi phí tốn kém để xây dựng, một số dung môi đạt nhiệt độ sôi nhanh có thể gây nổ.

Ưu điểm:

₋ Không có quán tính nhiệt độ;

₋ Hiệu suất trích ly cao hơn một số phương pháp thông thường;

₋ Thiết bị dễ sử dụng, an toàn và bảo vệ môi trường với nguồn năng lượng sạch;

₋ Thời gian trích ly nhanh;

₋ Có tác dụng đặc biệt với các phân tử phân cực

Nhược điểm:

₋ Không áp dụng cho các hợp chất không phân cực;

₋ Quy mô thử nghiệm nhỏ;

₋ Nhiệt độ sôi các dung môi đạt được rất nhanh, có thể gây nổ

1.3.2.2 Enzym

Hiện nay, enzym cũng đang được sử dụng trong việc tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học Trích ly các hợp chất có hoạt tính bằng enzym mang lại hiệu quả cao và được xem như là công nghệ “xanh”, thân thiện với môi trường Các loại chế phẩm enzym thông dụng như pectinase, cellulase, viscozyme và lactase

Khi enzym kết hợp với cơ chất, cấu trúc và hình thái của các phân tử enzym biến đổi sao cho phù hợp với tương tác giữa enzym và cơ chất, làm trương nở và bẻ gãy các liên kết của cơ chất Từ đó, phản ứng thủy phân phá vỡ thành tế bào được xúc tiến cũng như

sự phá vỡ cấu trúc toàn vẹn của tế bào thực vật, chất cần trích ly hòa tan vào môi chất trích ly Quá trình phá vỡ cấu trúc tế bào của enzym giúp hoạt chất phân tán vào dung môi dễ dàng hơn được thể hiện ở hình 1.11

Hình 1.11:Quá trình phá vỡ cấu trúc tế bào của enzym

Ưu điểm: Phá vỡ cấu trúc thành tế bào, tăng thẩm thấu, hiệu suất trích ly cao và hạn

chế sử dụng dung môi hữu cơ [36]

Nhược điểm: Cần biết về cấu trúc và thành phần thành tế bào của nguyên liệu Các

enzym có thể tham gia thủy phân một số nhóm hoạt chất

1.3.2.3 Lưu chất siêu tới hạn

Phương pháp trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn cũng được áp dụng để trích ly các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên Trong điều kiện áp suất bình thường, khi nâng nhiệt

độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một áp suất nhất định nào đó sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng siêu tới hạn Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng [44]

Phương pháp này đang được sử dụng để trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học

và lưu chất thường được sử dụng là cacbon đioxit (CO2) CO2 có nhiệt độ, áp suất tới hạn thấp và rẻ tiền, dễ kiếm (TCr = 31 oC, PCr = 73,8 atm) Giản đồ áp suất – nhiệt độ của CO2 được mô tả ở hình 1.12

Sản phẩm

Cơ chất

Phức hợp enzym/cơ chất

Phức hợp enzym/sản phẩm

enzym

enzym

Hình 1.12: Giản đồ áp suất – nhiệt độ của CO2

CO2 siêu tới hạn thân thiện với môi trường, tỉ trọng xấp xỉ chất lỏng, độ nhớt và sức căng bề mặt thấp và độ linh động cao Những tính chất trên cho thấy, đây là dung môi đặc biệt hiệu có hiệu quả trong việc hòa tan và thâm nhập sâu vào trong nguyên liệu trích ly Trong quá trình trích ly bằng CO2 siêu tới hạn, nhiệt độ tương đối thấp và loại

bỏ được hết dung môi, cho nên quá trình phân hủy các hoạt chất không xảy ra, hàm lượng đạt cao hơn

Tuy vậy, việc trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn đòi hỏi máy móc thiết bị đắt tiền, việc kiểm soát các thông số nhiệt độ, áp suất, thời gian và tốc độ lưu lượng CO2 là cần

thiết để thu được hàm lượng triterpenoid trích ly tối ưu

1.3.2.4 Phương pháp siêu âm

Sóng siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn ngưỡng con người nghe thấy được (20 kHz đến 100 MHz) [45] Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc hay sóng nén, nghĩa

là trong trường siêu âm các phần tử dao động theo cùng phương với phương truyền sóng [46, 47]

Nguyên lý tác động của sóng siêu âm dựa trên hiện tượng xâm thực khí và hiện tượng

vi xoáy

Hiện tượng xâm khí thực: khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng,

các chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành Trong điều kiện bình thường, các

phân tử chất lỏng ở rất gần nhau nhờ liên kết hóa học Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén các phân tử ở gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa Bọt khí xuất hiện trở thành hạt nhân của hiện tượng xâm thực khí, bao gồm bọt khí ổn định và bọt khí tạm thời Qua các chu trình kéo và nén liên tục, các bọt khí này tăng lên về kích thước và khi đạt đến kích thước tối đa chúng nổ tung dữ dội Khi đó, các phân tử va chạm vào nhau mãnh liệt, kết quả là hình thành những điểm có nhiệt độ và áp suất rất cao với vận tốc rất nhanh Hiện tượng này giúp thúc đẩy các phản ứng hóa học do tăng khả năng trộn lẫn các chất phản ứng với nhau, tạo ra các gốc tự do, tăng hiệu suất đồng hóa, hỗ trợ trích ly các chất tan như enzym từ tế bào

Hiện tượng vi xoáy: sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong lòng chất lỏng sẽ

gây nên sự kích thích mãnh liệt Tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha lỏng/rắn hay khí/rắn, sóng siêu âm gây nên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy Hiện tượng này làm giảm ranh giới giữa các pha, tăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy sự khuếch tán mà ở khuấy trộn thông thường không thực hiện được

Sóng siêu âm truyền trong dung dịch chất lỏng, theo trình tự với tốc độ rung cao làm cho dung môi có hiện tượng sủi bọt Khi những bọt bong bóng này vỡ sẽ làm cho thành

tế bào bị phá vỡ và dung môi khuếch tán vào bên trong tế bào, các thành phần hoạt chất

sẽ được giải phóng [48] Hình 1.13 và 1.14 mô tả quá trình trích ly hoạt chất có hỗ trợ của siêu âm và mô tả hệ thống trích ly bằng bể siêu âm [49]

Hình 1.13: Quá trình trích ly hoạt chất có hỗ trợ của siêu âm

Hình 1.14: Mô tả hệ thống trích ly bằng sóng siêu âm dạng bể

Ưu điểm:

- Thiết bị dễ sử dụng;

- Bảo quản và vận hành đơn giản, không quá đắt tiền;

- Thời gian trích ly ngắn, hiệu suất trích ly cao;

- Giảm được nhiệt độ và áp suất, ưu điểm này được ưu tiên áp dụng để trích ly cho

các hoạt chất không bền với nhiệt;

- Tăng tốc độ hòa tan và tăng khả năng khuếch tán của các chất vào trong dung

môi, lượng hóa chất sử dụng ít;

- Tăng được khối lượng cao trích và rút ngắn được thời gian trích ly, tiết kiệm năng

lượng đầu vào

Nhược điểm:

- Quá trình làm nóng cục bộ do sóng siêu âm tạo ra có thể phân huỷ các chất nhạy

cảm với nhiệt độ;

- Tạo ra các gốc tự do làm phân huỷ hợp chất nếu dung môi trích ly là nước;

So với phương pháp trích ly thông thường thì trích ly hỗ trợ siêu âm mang lại những hiệu quả tốt hơn như thời gian trích ly ngắn, hàm lượng trích ly cao hơn, sản phẩm sau khi trích ly có chất lượng tốt, thiết bị dễ sử dụng, tăng độ hòa tan và tăng khả năng khuếch tán của các chất vào trong dung môi, lượng hóa chất sử dụng ít Do đó, trong luận văn này, phương pháp trích ly hỗ trợ siêu âm được sử dụng để trích ly hoạt chất triterpenoid từ nấm Linh chi

Phân tích hàm lượng hợp chất trong cao trích bằng quang phổ hấp thu nguyên

từ

Bộ điều khiển

Bể siêu âm

Bộ tạo sóng Bình tam giác chứa mẫu

Phương pháp dựa trên định luật Lambert-Beer Mỗi chất đều có một bước sóng hấp thu cực đại đặc trưng Khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc với bước sóng xác định đi qua dung dịch thì cường độ của tia sáng ban đầu Io sẽ bị giảm đi chỉ còn là I Sơ đồ nguyên lý về hấp thu tia sáng được thể hiện ở hình 1.15 và sơ đồ nguyên lý máy UV-Vis được thể hiện ở hình 1.16 Độ hấp thu tia sáng phụ thuộc vào nồng độ của chất nghiên cứu trong dung dịch Từ đó, có thể xác định được nồng độ chất trong dung dịch

Hình 1.15: Sơ đồ nguyên lý hấp thu tia sáng

Hình 1.16: Sơ đồ nguyên lý máy UV-VIS

Đây là phương pháp phân tích hiện đại có độ nhạy cao, phát hiện lượng vết µg/mL (ppm) nên áp dụng cho phương pháp phân tích triterpenoid là phù hợp

Tình hình nghiên cứu

Ngoài nước

Từ nhiều năm nay, nấm Linh chi đã được sử dụng phổ biến ở Á Đông Đến nay, Linh chi vẫn là một trong những đề tài nghiên cứu và ứng dụng đang được quan tâm của

các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi Điển hình là nghiên cứu lần đầu tiên Nishitiba

đã chứng minh axit ganoderic C là chất mới trong tự nhiên vào những năm 1984 – 1987 Đến năm 1986, Morigiwa tìm ra thêm axit ganoderic B Năm 1994, Kim đã tiến hành nghiên cứu trích ly triterpenoid bằng metanol của nấm Linh chi quả thể, có tác dụng ức chế sự nhân lên của virus HIV–1 [22]

Năm 1999, Zhu và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của nấm Linh chi bằng các thử nghiệm in vitro Nấm Linh chi được trích ly bằng nước sôi, dịch chiết chứa terpene và polysaccharide Cả hai phần đều được phân tích về khả năng chống oxy hóa Kết quả của nghiên cứu đã chứng minh rằng thành phần terpene có khả năng chống oxy hóa cao nhất [50]

Năm 2007, khoa Khoa Học Tự Nhiên và Kỹ Thuật, Trường Đại học Ljubljanab đã nghiên cứu dược tính của các hoạt chất có trong nấm Linh chi Kết quả đã chỉ ra rằng Linh chi là một loài nấm gỗ có rất nhiều tác dụng dược lý Các thành phần có hoạt tính dược lý quan trọng đó là polysaccharide và triterpenoid Triterpenoid có tác dụng chống tăng huyết áp, ảnh hưởng của cholesterol và chống ung thư [51]

Trong nước

Hiện nay, các nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm

Linh chi đã trở nên phổ biến Nghiên cứu “Trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi”

đã ứng dụng được phương pháp trích ly có sử dụng enzym Novozyme 342 (hỗn hợp của

enzym cellulase và hemicellulase) trong công nghệ sản xuất rượu, đạt hiệu suất cao nhất (10,2 %) ở điều kiện nhiệt độ 60 °C, nồng độ enzym 0,21 % trong 120 phút Hiệu suất này cao hơn so với trích lần 1 bằng etanol 96°, trích lần 2 bằng etanol 70° và lần 3 bằng etanol 45° là 8,8 % [52]

Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Tính cấp thiết

Một trong những vấn đề quan trọng hàng đầu đặt ra đối với các nhà khoa học trong quá trình nghiên cứu là tổng hợp ra những hợp chất được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả

ở các lĩnh vực đời sống, nâng cao chất lượng cuộc sống của con người Với đề tài “Trích

ly triterpenoid từ nấm Linh chi đỏ Việt Nam bằng phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích” là một hướng nghiên cứu

tương đối mới tại Việt Nam vừa có tính ứng dụng và hiệu quả cao vừa thân thiện với môi trường Các công bố trên thế giới cho thấy trích ly bằng sóng siêu âm thu được hàm

lượng của triterpenoid cao hơn và có hoạt tính tốt hơn so với các phương pháp như: vi sóng, Soxhlet và truyền thống Với những ưu điểm vượt trội như vậy thì đây được coi

là một trong những hướng nghiên cứu khả thi

Mục tiêu nghiên cứu

Đưa ra quy trình trích ly thành công hoạt chất triterpenoid từ nấm Linh chi bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm với đầy đủ các thông số và kết luận về hoạt tính kháng oxy

hoá, kháng ung thư và kháng khuẩn của cao trích

Nội dung

Nội dung 1: Khảo sát điều kiện trích ly triterpenoid từ nấm Linh chi

Nội dung 2: Khảo sát đặc tính hoá lý của cao trích

Nội dung 3: Thử nghiệm hoạt tính sinh học của các loại cao trích thông qua đánh giá

khả năng kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư

Phương pháp nghiên cứu

1.6.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu

Độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp khối lượng theo TCVN 10788:2015

Nghiền mẫu để thu được dạng bột mịn Sấy phần mẫu thử ở nhiệt độ từ 105 oC ± 5

oC trong thời gian 3 giờ ± 5 phút (đảm bảo thu được khối lượng không đổi) ( 1.1)

𝜑 (%)= 𝑚đầ𝑢− 𝑚đầ𝑢

trong đó: 𝜑 độ ẩm của nguyên liệu, mđầu là khối lượng nguyên liệu ban đầu (g); msau là khối lượng nguyên liệu sau sấy (g)

1.6.4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của từng yếu tố đến hàm lượng triterpenoid

Nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát 4 yếu tố có khả năng ảnh đến quá trình trích ly,

đó là tỉ lệ nguyên liệu: dung môi, công suất siêu âm, nhiệt độ và thời gian Khảo sát được thực hiện theo phương pháp luân phiên từng biến và mỗi yếu tố được khảo sát theo

5 mức với hàm mục tiêu là hàm lượng triterpenoid tổng, mỗi mức được thực hiện ba lần lấy giá trị trung bình

Sau quá trình khảo sát, các yếu tố ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng triterpenoid được chọn lọc và xác định khoảng biến thiên của các yếu tố để thực hiện khảo sát ảnh hưởng đồng thời

Sau khi phân tích và xác định được khoảng biến thiên phù hợp của bốn yếu tố là tỉ lệ nguyên liệu: dung môi, công suất siêu âm, nhiệt độ và thời gian; tiến hành khảo sát ảnh hưởng đồng thời của bốn yếu tố bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology – RSM) Phương pháp RSM bao gồm các kĩ thuật toán học và thống kê dùng để khảo sát mối quan hệ giữa hàm mục tiêu và các yếu tố ảnh hưởng dựa trên sự phù hợp của mô hình thiết kế và dữ liệu thực nghiệm Phương pháp này được áp dụng sau khi đã xác định các yếu tố quan trọng có thể kiểm soát được và xác định giá trị các yếu tố để có kết quả tối ưu Phương pháp RSM với ưu điểm khối lượng thí nghiệm ít, mọi hệ số hồi quy được xác định độc lập với nhau, tìm các điều kiện tiến hành thỏa mãn các đặc điểm của quá trình và xác định được điểm cực trị Phương pháp tìm cực trị được phát triển từ thực nghiệm mô phỏng, nhiệm vụ là xây dựng mô hình tính toán thực nghiệm, theo đó xác định bộ kết hợp giá trị các điều kiện mà tại đó hàm mục tiêu đạt giá trị lớn nhất

Phương trình hồi quy của RSM có dạng tổng quát như thể hiện ở phương trình (1.2)

hệ số hồi quy bậc một mô tả ảnh hưởng đồng thời của ba nhân tố xi, xj, xk; bii là hệ số hồi quy bậc hai, mô tả ảnh hưởng bậc hai của nhân tố xi lên kết quả thực nghiệm Các mô hình thiết kế theo phương pháp RSM đã được nghiên cứu bao gồm Box – Behnken và trực giao tâm xoay (central composite designs – CCD) như trình bày ở hình 1.17

Mô hình Box-Behnken Mô hình CCD

Hình 1.17: Các mô hình thiết kế thí nghiệm

Mô hình CCD sử dụng thêm các thí nghiệm tại các vị trí điểm giao và tâm, giúp gia tăng số yếu tố khảo sát, số thí nghiệm không tăng cao và giúp xác định ảnh hưởng giữa các yếu tố và hàm mục tiêu Trong luận văn này, ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến hàm lượng triterpenoid được khảo sát bằng phương pháp RSM với mô hình thiết kế CCD

Số thí nghiệm thiết kế theo mô hình CCD với k yếu tố được xác định thông qua công thức 1.3

trong đó: 𝑁 là số thí nghiệm, 𝑘 là số điều kiện độc lập ảnh hưởng tới hàm lượng triterpenoid trích ly, 𝑛0 là số thí nghiệm lặp ở tâm mô hình giúp kiểm tra ý nghĩa của các hệ số hồi quy [53]

Đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa giữa các thí nghiệm bằng phương pháp xử lý thống kê ANOVA với mức độ tin cậy 95%, sử dụng phần mềm Design – Expert 11.0 Sau khi tìm được điều kiện trích ly phù hợp, tiến hành thực hiện quy trình trích ly theo mô hình và so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả dự đoán của mô hình

1.6.4.4 Định lượng phương pháp phân tích định lượng triterpenoid

Cao trích được định lượng triterpenoid bằng phương pháp vanilin–HClO4 [54] Cao trích triterpenoid được đo độ hấp thu (A) ở bước sóng đặc trưng bằng máy đo UV – Vis

Từ kết quả độ hấp thu của các mẫu phân tích, thay vào phương trình đường chuẩn

y = ax + b (y: độ hấp thu, x: nồng độ) suy ra nồng độ C Từ C tính được lượng triterpenoid

có trong cao trích Dựa vào lượng triterpenoid có trong cao trích và khối lượng nguyên

liệu nấm Linh chi ban đầu sử dụng, xác định được hàm lượng triterpenoid thông qua công thức (1.4)

trong đó: H làm hàm lượng triterpenoid (mg axit urolic/g); C (mg/L) là nồng độ triterpenoid trong cao trích; V (mL) là thể tích cao trích đem phân tích; n là hệ số pha loãng; m (g) là khối lượng nguyên liệu thô ban đầu; 𝜑 độ ẩm nguyên liệu (%)

1.6.4.5 Phân tích thành phần cao chiết bằng phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier

Phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier (Fourier – transform infrared spectroscopy – FTIR) sử dụng các bức xạ điện tử với bước sóng 4000 – 400 cm-1 để xác định các nhóm chức, các liên kết trong cấu trúc vật liệu Cấu tạo thiết bị quang phổ FTIR được thể hiện như hình 1.18

Hình 1.18: Cấu tạo thiết bị quang phổ FTIR

Nguyên lý: Chùm tia hồng ngoại có bước sóng phát ra từ nguồn được tách ra hai

phần, một phần đi qua mẫu và một phần đi qua môi trường đo và chuyển đến đầu dò Đầu dò sẽ so sánh cường độ hai chùm tia và chuyển thành tín hiệu điện có cường độ tỉ

lệ với phần bức xạ đã bị hấp thu bởi mẫu Dòng điện này có cường độ rất nhỏ nên phải nhờ bộ khuếch đại tăng lên nhiều lần trước khi chuyển sang bộ phận tự ghi vẽ lên bản phổ hoặc đưa vào máy tính xử lý số liệu Kết quả được biểu diễn bằng đồ thị của hàm năng lượng sóng điện tử đi qua với trục hoành là số sóng (cm-1), trục tung là độ truyền

qua (%) [55]