Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người

Mục tiêu của luận án là phân lập và định danh được một số dòng vikhuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus và khảo sát hoạt tính kháng khu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUỲNH VĂN TRƯƠNG

NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH Ở

CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata Thunb.)

CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TRÊN

VI KHUẨN Staphylococcus aureus TỪ

MỤN NHỌT (Furuncle) Ở NGƯỜI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã ngành: 62420201

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUỲNH VĂN TRƯƠNG

NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH Ở

CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata Thunb.)

CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TRÊN

VI KHUẨN Staphylococcus aureus TỪ

MỤN NHỌT (Furuncle) Ở NGƯỜI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã ngành: 62420201

Người hướng dẫn khoa học PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP

2021

XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Luận án này với tựa đề “Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá

(Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người” do nghiên cứu sinh

Huỳnh Văn Trương thực hiện theo sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn HữuHiệp đã báo cáo và được Hội đồng thông qua

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Thầy PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp và cô PGS.TS Đái Thị Xuân Trang

đã dành nhiều thời gian, công sức và tận tình hướng dẫn tôi trong thời gianthực hiện luận án và học tại trường

Thầy cô đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho việcnghiên cứu và học tập tại Viện NC và PT Công nghệ sinh học, các nghiên cứusinh và bạn Trần Chí Linh học viên cao học khóa 25 ngành Công nghệ sinhhọc của trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp cho tôi hoàn thành luận án

Xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu trường Đại họcCần Thơ, trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Ban lãnh đạo Viện NC và PTCông nghệ Sinh học và khoa Sau đại học, trường Đại học Cần Thơ cùng quýthầy cô và các đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi có thểhoàn thành chương trình học tập

Cuối cùng, sự thành công của luận án không thể không kể đến sự đónggóp không nhỏ của các thành viên trong gia đình, vợ Lý Tú Hương và conHuỳnh Gia Bảo, những người luôn ủng hộ, động viên và giúp tôi vượt qua rấtnhiều khó khăn trong thời gian học tập

Many studies using Houttuynia cardata Thunb for disease treatment are based on the fact that Houttuynia cardata Thunb has antibacterial, anti-

inflammatory and anti-oxidant activities However, the study of endophytic

bacteria and extracts of endophytic bacteria in Houttuynia cardata Thunb with antibacterial activity on Staphylococcus aureus from furuncles in humans has

not been studied

The objectives of the research were to isolate and identify some

endophytic bacterial strains of Houttuynia cardata Thunb with antibacterial activity on Staphylococcus aureus and determine antibacterial, anti-

inflammatory and anti-oxidant activities of extracts of endophytic bacteria in

Houttuynia cardata Thunb with high antibacterial activity against Staphylococcus aureus.

The result showed that 231 endophytic bacteria strains that are found in

all parts of Houttuynia cardata Thunb such as leaves, stems and roots of

Houttuynia cardata Thunb grown in various ecological regions such as salt

water, brackish water and fresh water or sea, islands, high mountains andplains in Kien Giang, Soc Trang, An Giang and Can Tho Among 231 strains

65 endophytic bacteria ones in Houttuynia cardata Thunb with antibacterial activity on Staphylococcus aureus isolated from human furuncles Thirteen endophytic bacteria strains in Houttuynia cardata Thunb which had strongest antibacterial activity on Staphylococcus aureus with a sterile ring of 20-33

mm Endophyic bacteria were identified and belonged to Bacillus genus.

The ethyl acetate extract from selected endophytic bacterial culture

(RGT2) determined antibacterial activity on Staphylococcus aureus bacteria

strain with high concentration of minimal inhibitory extract (MIC) fluctuatedfrom 80 to 160 µg/mL The minimum bactericidal concentration (MBC) of the

extract on the Staphylococcus aureus fluctuated from 640 to 1280 µg/mL.

The antioxidant activity of ethyl acetate extract from selectedendophytic bacterial fluid culture (RGT2) was determined through free radicalneutralization methods DPPH, ABTS, RP, TAC and FRAP with EC50

successive values of 57.38 µg/mL; 57.01 µg/mL; 32.00 µg/mL; 94.80 µg/mLand 41.41 µg/mL respectively The anti-inflammatory activity of extracts wasinvestigated based on the inhibitory activity of the denaturation of bovineserum albumin Extraction was capable of 50% inhibition of denaturation at aconcentration of 73.74 µg/mL.

The result of this study showed that endophytic bacteria strain (RGT2)

in Houttuynia cardata Thunb not only has antibacterial activity, but also has

antioxidant and anti-inflammatory activities which are potential in treatment of

human diseases of furuncles and skin infections caused by Staphylococcus

aureus.

Keywords: Antibacterial, Bacillus sp., endophytic bacteria, furuncle,

Houttuynia cordata Thunb.

TÓM TẮT

Nhiều công trình nghiên cứu cây Diếp cá cho việc điều trị bệnh dựatrên cơ sở cây Diếp cá có các hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và khángoxy hóa Tuy nhiên, việc nghiên cứu vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ dịchnuôi tăng sinh của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn

trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người chưa được nghiên

cứu nhiều

Mục tiêu của luận án là phân lập và định danh được một số dòng vikhuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, kháng

oxy hóa của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp

cá có hoạt tính kháng khuẩn cao với vi khuẩn Staphylococcus aureus.

Kết quả nghiên cứu phân lập được 231 dòng vi khuẩn nội sinh, cácdòng vi khuẩn nội sinh phân lập được đều hiện diện ở các bộ phận như lá, thân

và rễ của cây Diếp cá, trồng tại các vùng sinh thái như nước mặn, nước lợ vànước ngọt hay biển đảo, núi cao và đồng bằng thể hiện ở Kiên Giang, SócTrăng, An Giang và Cần Thơ Trong số 231 dòng có 65 dòng vi khuẩn nội sinh

ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ mụn nhọt ở người Mười ba dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá

có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trên dòng vi khuẩn Staphylococcus

aureus với vòng vô khuẩn từ 20 – 33 mm Các dòng vi khuẩn nội sinh được

nhận diện thuộc chi Bacillus.

Cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh(RGT2) được tuyển chọn nghiên cứu, có nồng độ cao chiết ức chế tối thiểu(MIC) dao động từ 80 đến 160 µg/mL Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)

của cao chiết trên dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus dao động từ 640 đến

1280 µg/mL

Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấytăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) được tuyển chọn nghiên cứu, xácđịnh thông qua các phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH, ABTS+, RP, TAC

và FRAP với giá trị EC50 lần lược là 57,38 µg/mL, 57,01 µg/mL, 32,00 µg/mL,

94,80 µg/mL và 41,41 µg/mL Ngoài ra, hoạt tính kháng viêm của cao chiếtđược khảo sát dựa trên hoạt tính ức chế sự biến tính của albumin huyết thanh

bò, có khả năng ức chế 50% sự biến tính ở nồng độ 73,74 µg/mL

Kết quả nghiên cứu chứng tỏ được rằng dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2)

ở cây Diếp cá không chỉ có hoạt tính kháng khuẩn mà còn có khả năng khángoxy hóa, kháng viêm rất có tiềm năng trong lĩnh vực điều trị các bệnh lý cho

con người về mụn nhọt và nhiễm khuẩn da do vi khuẩn Staphylococcus aureus.

Từ khóa: Bacillus sp., cây Diếp cá, hoạt tính kháng khuẩn, mụn nhọt,

vi khuẩn nội sinh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án “Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá

(Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người” là công trình nghiên

cứu của tôi với sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp Các số liệu vàkết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được ngườikhác công bố trong bất kỳ công trình nào khác

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ ii

ABSTRACT iii

TÓM TẮT v

LỜI CAM ĐOAN vii

MỤC LỤC viii

DANH MỤC BẢNG xv

DANH MỤC HÌNH xvii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xix

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu 1

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 3

1.4 Những đóng góp mới về khoa học 4

1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Đặc điểm thực vật cây Diếp cá 5

2.1.1 Phân loại 6

2.1.2 Thành phần hóa học 6

2.1.2.1 Tinh dầu 6

2.1.2.2 Flavonoid 6

2.1.2.3 Alkaloid 7

2.1.2.4 Acid hữu cơ và acid béo 7

2.1.2.5 Sterol 7

2.1.2.6 Các acid amin 8

2.1.2.7 Các thành phần khác 8

2.1.3 Công dụng của cây Diếp cá 8

2.1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn 8

2.1.3.2 Tác dụng kháng virus 9

2.1.3.4 Tác dụng kháng viêm

2.1.3.5 Tác dụng kháng dị ứng

2.1.3.6 Tác dụng kháng oxy hóa

2.1.3.7 Các tác dụng khác

2.2Sơ lược về vi khuẩn nội sinh thực vật

2.2.1Vi khuẩn nội sinh thực vật

2.2.2Các dòng vi khuẩn nội sinh thực vật thường gặp

2.2.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas sp .

2.2.2.2 Vi khuẩn Burkholderia sp .

2.2.2.3 Vi khuẩn Bacillus sp .

2.3Tổng quan về da người

2.3.1Thượng bì (epidemis)

2.3.2Trung bì (dermis)

2.3.3Hạ bì (hypodermis)

2.3.4Phần phụ của da

2.3.4.1 Thần kinh da

2.3.4.2 Tuyến mồ hôi

2.4Vi khuẩn Staphylococcus aureus

2.5Sơ lược về khuếch tán đĩa thạch (Disk diffusion assay)

2.6Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử

2.6.1Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction

2.6.2Giải trình tự DNA

2.6.3Phần mềm phân tích trình tự DNA

2.7Nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

2.8Phương pháp xác định tác nhân oxy hóa

2.9Sơ lược về viêm

2.9.1Giới thiệu về viêm

2.9.2Phân loại viêm

2.9.3Các tác nhân gây viêm

2.9.4Cơ chế đáp ứng của viêm

2.9.5 Điều trị viêm 36

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

3.1 Phương tiện nghiên cứu 38

3.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 38

3.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu 38

3.1.1.2 Phạm vi nghiên cứu 38

3.1.1.3 Thời gian nghiên cứu 38

3.1.1.4 Địa điểm nghiên cứu 38

3.1.2 Vật liệu 38

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị 39

3.1.4 Hóa chất 40

3.1.5 Công thức môi trường nuôi cấy 41

3.2 Phương pháp nghiên cứu 41

3.2.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu trong nghiên cứu 41

3.2.1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 41

3.2.2 Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá 42

3.2.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá 42

3.2.3 Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn được phân lập 44 3.2.3.1 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc quan sát vi khuẩn trên đĩa thạch môi trường PDA 44

3.2.3.2 Khảo sát khả năng di động 44

3.2.3.3 Khảo sát tế bào vi khuẩn 44

3.2.4 Xác định khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus. 45

3.2.4.1 Tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus. 45

3.2.4.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 46

3.3 Nhận diện những dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 46

3.3.1 Ly trích DNA vi khuẩn 46

3.3.2 Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR 47

3.3.3 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 48

3.4 Khảo sát dịch nội bào, dịch ngoại bào và dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 49

3.5 Điều chế các cao chiết từ dịch nuôi dòng vi khuẩn nội sinh 50

3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethyl acetate từ vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá. 50

3.6.1 Định tính thành phần hóa học trong của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh 50

3.6.1.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm alkaloid 51

3.6.1.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm flavonoid 51

3.6.1.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm steroid – tri terpenoid 52

3.6.1.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm glycoside 52

3.6.1.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm saponin 53

3.6.1.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm tannin 53

3.6.1.8 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm polyphenol 53 3.6.2 Định lượng thành phần hóa học trong cao chiết ly trích từ dịch nuôi dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá 53

3.6.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 54

3.6.3.1 Phương pháp khuếch tán giếng thạch bằng cách xác định đường kính vòng vô khuẩn 54

3.6.3.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 55

3.6.3.3 Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) 56

3.7 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethyl acetate từ dòng vi khuẩn nội sinh in vitro 56

3.7.1 Phương pháp kháng oxy hóa tổng (TAC) 56

3.7.2 Phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS 57

3.7.3 Phương pháp xác định năng lực khử (RP) 57

3.7.4 Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH 58

3.7.5 Phương pháp xác định tiềm năng khử (FRAP) 58

3.8 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của cao chiết ly trích từ vi khuẩn

nội sinh 593.9 Phân tích và xử lý số liệu 59Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 604.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trồng ở KiênGiang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ. 604.1.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn phân lập ở cây Diếp cá tại KiênGiang 604.1.2 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại SócTrăng 614.1.3 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại AnGiang 624.1.4 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại CầnThơ 644.1.5 Kết quả khảo sát các đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm của các dòng vikhuẩn nội sinh ở cây Diếp cá phân lập được trong nghiên cứu 654.1.5.1 Kết quả khảo sát đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nộisinh ở cây Diếp cá 654.1.5.2 Kết quả khảo sát đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh ở câyDiếp cá 674.2 Kết quả khảo sát đặc điểm pH đất trồng cây Diếp cá trong nghiên cứu 694.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp

cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 70

4.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của

dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại tỉnh Kiên Giang 70

4.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của

dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại tỉnh Sóc Trăng 71

4.3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của

dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại tỉnh An Giang 72

4.3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của

dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Cần Thơ 744.3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây

Diếp cá trên vi khuẩn Staphyloccus aureus tại Kiên Giang, Sóc Trăng,

An Giang và Cần Thơ 754.4 Kết quả giải trình tự vùng 16S rRNA của 13 dòng vi khuẩn nội sinh câyDiếp cá tại 13 địa điểm lấy mẫu nghiên cứu 814.5 Cây phả hệ của các dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá có hoạt tính kháng

khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 834.6 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch ngoại bào, dịch nội bào

và dịch nuôi tăng sinh của dòng vi khuẩn RGT2 trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus 864.7 Kết quả điều chế, định tính và định lượng thành phần hóa học cao chiết từdịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 là vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá 89

4.7.1 Điều chế cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 89

4.7.2 Định tính các nhóm hóa học từ cao chiết dịch nuôi dòng vi khuẩnRGT2 894.7.3 Định lượng hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần từ caochiết dịch nuôi dòng vi khuẩn RGT2 904.8 Kết quả khảo sát đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết ly trích từ dịchnuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 và kháng sinh vancomycin trên vi

khuẩn Staphylococcus aureus 924.9 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tốithiểu (MBC) của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn

RGT2 và kháng sinh vancomycin trên vi khuẩn Staphylococcus aureus .97

4.10 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ly trích từ dịchnuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2. 1024.10.1 Kết quả khảo sát hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH 102

4.10.2 Kết quả hiệu quả khảo sát hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS.+ 103

4.10.3 Kết quả tiềm năng kháng oxy hóa tổng (TAC) 105

4.10.4 Kết quả tiềm năng khử (FRAP) của cao chiết ly trích từ dịch nuôi

tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2. 107

4.10.5 Kết quả năng lực khử (RP) của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2. 109

4.10.6 So sánh kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 của các phương pháp trong nghiên cứu 111

4.11 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng viêm của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá. 114

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 118

5.1 Kết luận 118

5.2 Đề xuất 119

TÀI LIỆU THAM KHẢO 120

Phụ lục nghiên cứu 1

-DANH MỤC BẢNG

Bảng 3 1 Thành phần môi trường PDA 41Bảng 3 2 Thành phần môi trường PDA bán đặc 41Bảng 3 3 Thành phần hóa chất của phản ứng PCR 48

Bảng 4 1 Địa điểm nơi lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá

tại Kiên Giang 60Bảng 4 2 Địa điểm lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá tại Sóc

Trăng 61Bảng 4 3 Địa điểm nơi lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá

tại An Giang 63Bảng 4 4 Địa điểm nơi lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá

tại Cần Thơ 64Bảng 4 5 Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập được ở cây Diếp cá

tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ 66Bảng 4 6 Đặc điểm các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Diếp cá

tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ 67Bảng 4 7 Đặc điểm pH đất trồng cây Diếp cá nơi lấy mẫu để phân lập các

dòng vi khuẩn nội sinh 69Bảng 4 8 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp

cá tại Kiên Giang có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus

aureus 70Bảng 4 9 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp

cá tại Sóc Trăng có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus

aureus 72Bảng 4 10 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp

cá tại An Giang có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus

aureus 73

Bảng 4 11 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp

cá tại Cần Thơ có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus

aureus 74Bảng 4 12 Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá

được tuyển chọn tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ82

Bảng 4 13 Kết quả khảo sát đường kính (mm) vòng vô khuẩn của dịch nội

bào, dịch ngoại bào và dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh86

Bảng 4 14 Kết quả khảo sát các nhóm chức có hoạt tính kháng khuẩn của cao

chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 90Bảng 4 15 Kết quả hàm lượng polyphenol và flavonoid của cao chiết 91Bảng 4 16 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn ở các nồng độ của cao chiết và

vancomycin trên Staphylococcus aureus 93Bảng 4 17 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

(MBC) của cao chiết và vancomycin 97Bảng 4 18 Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của cao chiết ethyl acetate từ

dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 103Bảng 4 19 Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ của cao chiết ethyl acetate từ

dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 105Bảng 4 20 Giá trị Absorbance (Abs) và hàm lượng chất kháng oxy hóa tương

đương (µg/mL) của cao chiết 106Bảng 4 21 Giá trị độ hấp thu quang phổ (Abs) và hàm lượng chất kháng oxy

hóa tương đương (µg/mL) của trolox và cao chiết (mg/mL) 108Bảng 4 22 Giá trị Abs của chất chuẩn trolox 109Bảng 4 23 Giá trị Abs và hàm lượng kháng oxy hóa tương đương trolox của

cao chiết 111Bảng 4 24 Nồng độ trung hòa và khử được 50% gốc tự do của cao chiết 112Bảng 4 25 Hoạt tính kháng viêm của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi

khuẩn nội sinh (RGT2) và chất đối chứng Diclofenac 114

Bảng 4 26 Giá trị IC50 của hoạt tính kháng viêm của cao chiết và chất

Diclofenac 116

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1 Cây Diếp cá sử dụng trong nghiên cứu 5

Hình 2 2 Cơ chế xâm nhập của vi khuẩn nội sinh thực vật 13

Hình 2 3 Vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá chụp KHV điện tử quét SEM 15

Hình 2 4 Cấu tạo của da cơ thể người 16

Hình 2 5 Sơ đồ cấu tạo của lông, nang lông và hành lông 18

Hình 2 6 Vi khuẩn Staphylococcus aureus chụp KHV điện tử quét SEM 21

Hình 2 7 Viêm nang lông do tụ cầu 22

Hình 3 1 Cây, thân và rễ cây Diếp cá 42

Hình 3 2 Lá và thân cây Diếp cá sử dụng trong nghiên cứu 42

Hình 3 3 Quy trình phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá 42

Hình 3 4 Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dòng VKNS 45

Hình 3 5 Vòng vô khuẩn khảo sát tính kháng khuẩn của dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trên Staphylococcus aureus 46

Hình 3 6 Quy trình ly trích DNA của vi khuẩn nội sinh 46

Hình 3 7 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 47

Hình 4 1 Cây phả hệ các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus trong nghiên cứu 84

Hình 4 2 Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá dòng RGT2 trên Staphylococcus aureus 88

Hình 4 3 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 và vancomycin trên Staphylococcus aureus 94

Hình 4 4 Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của cao chiết từ dịch nuôi dòng RGT2 và kháng sinh thương mại Vancomycin trên Staphylococcus aureus 95

Hình 4 5 Thử nghiệm cao chiết và kháng sinh vancomycin 98

Hình 4 6 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh 100

Hình 4 7 Hiệu suất trung hòa gốc tự do DPPH của trolox 102

Hình 4 8 Hiệu suất trung hòa gốc tự do ABTS của trolox 104

Hình 4 10 Biểu đồ giá trị độ hấp thu quang phổ (Absorbance) của trolox

Chương 1 GIỚI THIỆU1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu

Từ khi Alexander Flemming phát hiện ra kháng sinh đầu tiên làPenicillin thì kháng sinh đã được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các bệnhnhiễm khuẩn cho người cũng như động vật Tuy nhiên, việc sử dụng khángsinh một cách tùy tiện đã gây ra những tác hại không nhỏ như quen thuốc vàkháng thuốc ngày càng phổ biến Đó là nguyên nhân cần phải tìm ra khángsinh mới để tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trong đó có vi khuẩn

Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) là một vi khuẩn thường gặp trên da hoặc

niêm mạc mũi chiếm 30% những người khỏe mạnh Trong trường hợp này, vikhuẩn thường không gây hại và biểu hiện triệu chứng Khi da bị tổn thương,trầy xước, tụ cầu khuẩn xâm nhập cơ thể và có thể gây ra một loạt các vấn đề

từ nổi mụn nhẹ đến nhiễm khuẩn nặng, đặc biệt là ở trẻ em, người già, vànhững người có hệ miễn dịch yếu Hầu hết các tụ cầu ban đầu nhạy cảm vớikháng sinh nhóm beta-lactam như penicillin, methicillin Vi khuẩn

Staphylococcus aureus đề kháng methicillin (gọi tắt là MRSA), methicillin là

một kháng sinh được coi là mạnh nhất trong nhóm beta-lactam, methicillin làmột penicillin bán tổng hợp kháng lại enzyme beta-lactamase được giới thiệu

vào năm 1959; ngay sau đó, vi khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng với

methicillin đã được báo cáo và sự bùng phát của MRSA xảy ra ở châu Âu vào

đầu những năm 1960 (Dien et al., 2014).

Từ việc sử dụng tràn lan và lạm dụng các loại thuốc kháng sinh ở cácnước đang phát triển cũng như Việt Nam, ngày có nhiều kháng sinh đề kháng

với vi khuẩn Staphylococcus aureus Chính vì những lý do trên việc nghiên

cứu và tìm ra một biện pháp mang tính hiệu quả từ thiên nhiên có khả năng

kháng với vi khuẩn Staphylococcus aureus thay thế các loại kháng sinh tổng

hợp là cần thiết

Trong thiên nhiên có rất nhiều cây cỏ được y học sử dụng từ rất lâu nhưcây Diếp cá, Hành, Hẹ, Tỏi có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, khángoxy hóa để dùng làm thuốc chữa bệnh ngoài da, mụn nhọt, chóc lở, viêm phế

quản Chính vì vậy, gần đây thế giới y học có xu hướng tìm đến những loạikháng sinh, kháng viêm, kháng oxy hóa từ những cây dược liệu và thực vật.

Trong đó có cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) là một loại rất

quen thuộc trong bữa ăn hàng ngày của người Việt Nam, có vị đắng, tính ôntheo Đông và Tây y, cây Diếp cá còn được biết đến với nhiều công dụng từ

dịch trích của cây như kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa (Choi et

al., 2010), giúp gia tăng số lượng tế bào lympho nhanh chóng, giúp tăng tính

miễn dịch của người (Sriwanthana et al., 2007).

Hiện tại có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh ở cây dược liệu vàthực vật, vi khuẩn nội sinh có khả năng giúp cây tăng trưởng tốt mà còn cókhả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) và kích

thích cây chủ sản xuất ra các hợp chất chuyển hóa trung gian (Hardoim et al.,

2008) Trong đó việc nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có các hoạttính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa chưa được quan tâm nhiều

Vì vậy, luận án với tựa đề “Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá

(Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người” là việc làm có tính

cấp thiết cần được nghiên cứu

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Phân lập và định danh được một số dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá

ở các vùng sinh thái có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus

aureus và xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa từ

cao chiết ly trích của dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá

có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với vi khuẩn Staphylococcus aureus.

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

Phân lập và khảo sát khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus của một số dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá được

trồng tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ tương ứng với bốnvùng sinh thái nước mặn, nước lợ, đồi núi và nước ngọt

Định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có khả năng

kháng khuẩn mạnh nhất với vi khuẩn Staphylococcus aureus.

Nghiên cứu ở mức độ in vitro các hoạt tính kháng oxy hóa và kháng viêm liên quan đến khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus

aureus của dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá được tuyển chọn.

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1 Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn nội sinh có khả

năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus, bao gồm các nội dung sau:

Phân lập và khảo sát đặc điểm những dòng vi khuẩn nội sinh ở câyDiếp cá trồng ở các tỉnh Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Thành phố CầnThơ

Tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng vi khuẩn

Staphylococcus aureus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.

Nội dung 2 Định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính

kháng khuẩn cao trên vi khuẩn Staphylococcus aureus bằng phương pháp giải

trình tự vùng gen 16S rRNA và xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng

vi khuẩn nội sinh

Nội dung 3 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus

của cao chiết ethyl acetate dịch nuôi vi khuẩn, gồm các nội dung sau:

Điều chế cao ethyl acetate của dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nộisinh

Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của cao ethyl

acetate bằng cách xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum InhibitoryConcentration) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC (Minimum BactericidalConcentration)

Nội dung 4 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của cao chiết từ

dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diếp cá được tuyểnchọn

Nội dung 5 Xác định hoạt tính kháng viêm in vitro của cao chiết từ

dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diếp cá được tuyểnchọn

1.4 Những đóng góp mới về khoa học

Nghiên cứu đã phân lập được 231 dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp

cá Trong đó có 65/231 dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn trên

vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người Từ đó 13/65 dòng vi

khuẩn nội sinh có có hoạt tính kháng khuẩn mạnh giải trình tự đều thuộc chi

Bacillus.

Cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh

(RGT2) ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus

aureus, xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dao động khoảng từ 80

đến 160 µg/mL Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết dao độngkhoảng từ 640 đến 1280 µg/mL Cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh

dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá, khảo sát in vitro cho thấy hoạt

tính kháng oxy hóa của cao chiết được xác định thông qua các phương pháptrung hòa gốc tự do DPPH, ABTS, RP, TAC và FRAP với giá trị EC50 lần lược

là 57,38 µg/mL, 57,01 µg/mL, 32,00 µg/mL, 94,80 µg/mL và 41,41 µg/mL

Ngoài ra, khảo sát in vitro hoạt tính kháng viêm của cao chiết cho thấy ức chế

sự biến tính của albumin huyết thanh bò Cao chiết có khả năng ức chế 50% sựbiến tính ở nồng độ 73,74 µg/mL

1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Phân lập, tuyển chọn và nhận diện dòng vi khuẩn có hoạt tính kháng

khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người.

Kết quả của luận án có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo và bổsung giáo trình giảng dạy

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Cung cấp nguồn nguyên liệu ban đầu dòng vi khuẩn nội sinh RGT2, có

hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus cho các nghiên

cứu tiếp theo Kết quả luận án mở ra triển vọng, từ cao chiết ethyl acetate củadòng vi khuẩn nội sinh RGT2 ở cây Diếp cá, có tiềm năng cho việc điều trị

các nhiễm trùng từ mụn nhọt và da ở người do vi khuẩn Staphylococcus

aureus.

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm thực vật cây Diếp cá

Cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) còn có tên là cây Giấp cá,

Ngư tinh thảo (Đỗ Tất Lợi, 1999), rau Giấp cá, Tập thái, cỏ Vảy mèo (Thái),rau Ven, Phắc hoảy (Tày), Cù mua mía (Dao) Tên nước ngoài là Dokudame(Nhật Bản); E-Sung-Cho (Hàn Quốc); Khao-tong hoặc Plu-khao (Thái Lan);

Houttuynia (Pháp) theo (Đỗ Huy Bích, 2004) Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb (Đỗ Tất Lợi, 1999).

Cây Diếp cá là một loại cây thân thảo, được trồng chổ ẩm ướt có thân rễmọc ngầm dưới đất Thân đứng màu lục hoặc tím đỏ Rễ nhỏ mọc ở các đốt,thân mọc đứng cao khoảng 40 cm, có lông hoặc ít lông Lá mọc cách, hình tim,đầu lá hơi nhọn hay nhọn hẳn, mặt trên màu lục, mặt dưới màu tím (PhạmHoàng Hộ, 2003.) Hoa nhỏ màu vàng nhạt, không có bao hoa, mọc thànhbông, có 4 lá bắc màu trắng; nhìn toàn bộ bề ngoài của cụm hoa và lá bắc giốngnhư một cây hoa đơn độc, toàn cây vò có mùi tanh như cá Hoa nở về mùa hạvào các tháng từ tháng 5 đến tháng 8 (Đỗ Tất Lợi, 1999; Đỗ Huy Bích, 2004)

Hình 2 1 Cây Diếp cá sử dụng trong nghiên cứu

[Chụp ngày 18/6/2017 tại Cần Thơ]

2.1.1 Phân loại

Cây Diếp cá phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á,

từ Nhật Bản, Trung Quốc đến Việt Nam, Lào, Ấn Độ và các nước Đông Nam

Á khác Ở Việt Nam, cây mọc hoang ở khắp nơi ẩm thấp, cây thường đượctrồng ở nhiều nơi để làm rau và làm thuốc Toàn cây về dùng tươi hay phơikhô hoặc sấy khô (Đỗ Tất Lợi, 1999)

Cây Diếp cá được phân loại theo (Đỗ Tất Lợi, 1999)

Chi Diếp cá (Houttuynia)

Loài Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.)

2.1.2 Thành phần hóa học

2.1.2.1 Tinh dầu

Có rất nhiều tinh dầu được trích từ toàn thân của cây Diếp cá, chủ yếucấu tạo từ terpenoid (27,0%), hydrocarbon (16,8%), ester (11,9%), ketone(7,2%), andehyde (4,9%), acid (3,8%), phenol (1,7 %), ether (0,9%) và cáchợp chất hỗn hợp (14,2%) Các tinh dầu được tìm thấy trong toàn bộ cây Diếp

cá theo nghiên cứu (Mei et al., 2013).

2.1.2.2 Flavonoid

Một số flavonoid đã được phân lập và xác định từ cây Diếp cá là

quercitrin là flavonoid đầu tiên được chiết xuất từ lá và thân của cây Diếp cá

có chứa thành phần flavonoid hết sức phong phú Các flavonoid đáng chú ýtrong cây Diếp cá có thể kể đến như quercetin, quercitrin, isoquercitrin

(phloridzin), quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid (avicularin) và quercetin- β-D-galactopyranosid (hyperin) (Jiangang et al., 2013).

3-O-2.1.2.3 Alkaloid

Nhiều loại alkaloid được phân tách từ cây Diếp cá bao gồm aporphine,

pyridine và các loại khác (Jiangang et al., 2013) Những alkaloid đã được tìm

thấy ở cây Diếp cá là aristolactam B, piperolactam A, aristolactam A,norcepharadione B, cepharadione B và splendidine Theo phân tách 7-chloro-6-demethyl-cepharadione, alkaloid chuỗi dài được thay thế 3,5-didecanoyl-pyridine, 2-nonyl-5-decanoylpyridine rất hiếm trong tự nhiên và N-methyl-5-methoxy-pyrrolidin-2-one từ cây Diếp cá (Jong and Jean, 1993)

2.1.2.4 Acid hữu cơ và acid béo

Acid palmitic, acid stearic, acid heptanoic, acid nonanoic, acidundecanoic, acid octanoic, acid hexanoic, acid lauric, acid capric, acidheptadecanoic, acid tetradecanoic, acid tridecanoic, acid pentadecanoic, acidoctadecenoic, acid hexadecenoic, acid octadecadienoic, acid aspartic, acidglutamic, acid capric, acid lauric và acid palmitic trong cây Diếp cá đã được

xác định bằng sắc ký khí (Bauer et al., 1996).

Ngoài ra, acid chlorogenic, acid crytochlorogenic, acid neochlorogenic

và acid caffeic được xác định bằng khối phổ và các mẫu phân mảnh

(Nuengchamnong et al., 2009) Chiết xuất acid chlorogenic, phát hiện acid

palmitic, acid linoleic, acid oleic và acid stearic trong phân đoạn benzene

(Ishiguro et al., 1987) Acid linolenic, linoleic, oleic, palmitic và acid stearic bằng cách kiểm tra công thức hóa học (Bauer et al., 1996).

2.1.2.5 Sterol

Một số lượng sterol đã được phân tách từ cây Diếp cá là 3-one, 3β-hydroxystigmast-5-en- 7-one, 5α-stigmastane-3,6-dione và stigmast-4-ene-3,6-dione, Stigmast-3,6- dione, sitoindoside I và daucosterol đã đượcphân lập và tinh chế từ thân rễ khô của cây Diếp cá bằng cách chiết xuất dungmôi, silicagel và cột sắc ký Sephadex LH-20 β-Sitosterol, β-sitosterolglucoside, brassicasterol, stigmasterol, spinasterol, stigmast-4-ene-3,6-dione

Stigmast-4-en-cũng được tìm thấy ở cây Diếp cá (Jiangang et al., 2013).

2.1.2.6 Các acid amin

Cây Diếp cá có hơn 20 acid amin, trong đó có alanin, valin, glutamic,aspartic, isoleucine, proline, leucine, glycine, serine, lysine, cystine, tyrosine,methionine, phenylalanine, histidine, threonine, tryptophane, arginine,hydroxyproline và citrulline Các thành phần chính là alanin, valin, acidglutamic, acid aspartic, isoleucine, leucine proline Trong số tất cả các acidamin, hàm lượng acid glutamic là cao nhất, tiếp theo leucine và acid aspartic

(Lai et al., 2010).

2.1.2.7 Các thành phần khác

Cây Diếp cá tươi có nước chiếm 91,5%, protid khoảng 2,9%, glucidkhoảng 2,7%, lipid khoảng 0,5%, cellulose khoảng 1,8%, canxi khoảng 0,3 mg,Kali khoảng 0,1 mg, tiền vitamin A khoảng 1,26 mg, vitamin C khoảng 68 mgtrong 100 g theo (Đỗ Tất Lợi, 1999) N-phenethyl-benzamide, glyceryllinoleate và n-butyl-α-D-fructopyranoside được tách và tinh sạch từ thân rễ khôcủa cây Diếp cá bằng cách chiết xuất dung môi, silicagel và cột sắc kýSephadex LH-20 Vomifoliol, Sesamin và 1,3,5-tridecanoylbenzene được tách

từ các bộ phận ở trên của cây Diếp cá

Cây Diếp cá qua phân tích bởi NMR cũng cho thấy có các hợp chất làN-1-hydroxymethyl-2-phenylethyl benzamide; N-4-hydroxyphenylthylbenzamide; 4-hydroxybenzamide; 4-hydroxy-3-methoxybenzamide; (1H)-quynolinone; acid indole-3-carboxylic; dihydrovomifoliol,; reseoside; benzyl-

β-D-glucopyranoside và các carotenoid (Mingliang, 2004)

2.1.3 Công dụng của cây Diếp cá

2.1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn

Tinh dầu cây Diếp cá có tác dụng kháng khuẩn trên vi khuẩn

Stapphylococcus areus và vi khuẩn Sarcina ureae (Lu et al., 2006; Shan et al.,

2007) Dịch chiết cây Diếp cá cho thấy tính kháng khuẩn trên các vi khuẩn

Bacillus cereus và vi khuẩn Staphylococcus aureus (Ebrahimi et al., 2010).

Dịch chiết của cây Diếp cá cho thấy khả năng kháng khuẩn kháng lại vi

khuẩn Salmonella và vi khuẩn Salmonella typhimurium (Kumar et al., 2014).

Hợp chất β-dicarbonyl được báo cáo là thành phần chính trong tinh dầu của

cây Diếp cá có tác dụng kháng khuẩn (Duan et al., 2008) Houttuynin sodium

bisulphate (HSB), α-hydroxyl-capryl-ethyl-sodium-sulphonate là một sảnphẩm được tạo thành bởi phản ứng giữa sodium bisulphate với houttuynin, thu

được từ cây Diếp cá có khả năng ức chế hoạt động vi khuẩn Escherichia coli

và vi khuẩn Staphylococcus aureus (Kokoska and Rada, 2001).

Dịch chiết cây Diếp cá có khả năng diệt được vi khuẩn Gonococcus sp gây bệnh lậu mủ và ngăn cản sự phát triển của các siêu vi cảm cúm (Duan et

al., 2008; Zhang et al., 2008) Dịch chiết cây Diếp cá còn có tác dụng ngăn cản

sự sinh sản của các vi khuẩn Streptococcus pneumoniae gây viêm phổi và

Staphylococcus aureus gây mụn nhọt có mủ (Choi et al., 2010), Dịch chiết cây

Diếp cá có tác dụng trên vi khuẩn Shigella sp., Salmonella sp và E coli gây bệnh kiết lỵ và tiêu chảy (Kim et al., 2008).

2.1.3.2 Tác dụng kháng virus

Một số sản phẩm của cây Diếp cá cho thấy hoạt tính kháng lại virus HIV

(Hayashi et al., 1995) Cây Diếp cá có khả năng kháng lại virus Herpes type I

và II (Chiang et al., 2003), trong đó khả năng kháng lại virus Herpes type II

mạnh hơn so với type I Quercetin 3-rhamnoside (Q3R) từ dịch chiết cây Diếp

cá có tác dụng ức chế mạnh sự nhân lên của virus cúm A (Choi et al., 2009).

Dịch chiết của cây Diếp cá có hoạt tính kháng virus dengue serotype 2 2) và dịch chiết cây Diếp cá cũng cho thấy tác dụng ức chế đáng kể đối với

(DEN-virus SARS (Lau et al., 2008).

Đặc biệt, quercetin 7-rhamnoside (Q7R), một flavonoid của dịch chiếtcây Diếp cá đã được báo cáo là có hoạt tính kháng lại virus PEDV, virus gây

tiêu chảy cấp ở heo (Choi et al., 2009) Quercetin 7-rhamnoside (Q7R) cũng

cho thấy hoạt tính kháng virus kháng lại rotavirus và rhinovirus

2.1.3.3 Tác dụng hoạt tính tế bào ung thư

Một số hợp chất chiết xuất từ cây Diếp cá và một số công thức y học cổtruyền Trung Quốc có thành phần của cây Diếp cá đã được báo cáo là có tác

dụng chống ung thư (Rajivgandhi et al., 2018) Một công thức y học cổ truyền

Trung Quốc có thành phần của cây Diếp cá đã được sử dụng để điều trị ungthư phổi và cải thiện khả năng miễn dịch của con người còn có những ưu điểm

về hiệu quả chữa bệnh tốt, không có tác dụng độc hại hoặc tác dụng phụ, quátrình sản xuất đơn giản và chi phí thấp.

Theo Lai et al., (2010) cây Diếp cá làm cho các tế bào tự hủy trong các

tế bào ung thư trực tràng sơ cấp qua đường truyền tín hiệu phụ thuộc ty thể.Sáu alkaloid có hoạt tính sinh học là aristolactam B, piperolactam A,aristolactam A, norcepharadione B, cepharadione B và splendidine đã đượcphân lập bằng cách phân đoạn dịch trích methanol của các phần phía trên củacây Diếp cá Sáu alkaloid này gây ức chế chống lại 5 dòng tế bào ung thư ở

người là A-549, SK-OV-3, SKMEL-2, XF-498 và HCT-15 đã được kiểm tra in

vitro (Kim et al., 2001).

2.1.3.4 Tác dụng kháng viêm

Nhiều loại sản phẩm chiết xuất từ cây Diếp cá cho thấy hoạt tính khángviêm Các viêm nhiễm gây ra trong mẫu tai của chuột bị phù đã được dùng đểnghiên cứu các hoạt động kháng viêm của dịch chiết chloroform, chiết xuấtnước, chiết xuất ethanol và chiết xuất n-butanol Tất cả các dạng cho thấy hoạttính kháng viêm tốt và chiết xuất nước có hoạt tính dược lý tốt hơn so với chiếtxuất ethanol Trong khi chiết xuất dịch của cây Diếp cá tươi có hoạt tính dược

lý tốt hơn so với loại khô (Gong and Cheng, 2004) Tinh dầu của cây Diếp cáđược báo cáo là có hoạt tính kháng viêm do cơ chế tương tự như thuốc kháng

viêm không steroid (NSAIDs) (Lai et al., 2010) Dịch chiết của cây Diếp cá

cũng có tác dụng kháng viêm ức chế hoạt tính của acid Lipoteichoic (LTA) gây

ra bởi viêm nhiễm ở nguyên bào sợi của da (Choi et al., 2010).

2.1.3.5 Tác dụng kháng dị ứng

Cao chiết xuất từ nước của cây Diếp cá cho thấy hiệu quả đáng kể đốivới tế bào trung gian của phản ứng phản vệ, phản ứng này có trong nhiều bệnh

dị ứng như hen suyễn và viêm mũi dị ứng (Lai et al., 2010) Dịch chiết xuất từ

ethanol của cây Diếp cá cho thấy hiệu quả điều trị đối với các rối loạn hoặc dị

ứng da (Lee et al., 2008).

2.1.3.6 Tác dụng kháng oxy hóa

Diếp cá là nguồn nguyên liệu tiềm năng của chất kháng oxy hóa tựnhiên có hoạt động trung hòa gốc tự do và có thể được sử dụng để giảm stress

trong bệnh đái tháo đường (Lee et al., 2008) Mặc dù dịch chiết từ nước cây

Diếp cá có tác dụng trung hòa gốc tự do và tác dụng ức chế oxy hoá xanthinyếu hơn vitamin E nhưng không có hoạt tính ức chế quá trình peroxid hoá lipid

tế bào gan ở thí nghiệm trên chuột

Cây Diếp cá có chứa các hợp chất flavonoid như phloretin

-2’-0-pD-glucopyranosid, quercetin-3-0-pD-galactopyranosid có tác dụng đối với sựperoxy hóa lipid màng tế bào gan bằng cách hạn chế quá trình peroxy gópphần bảo vệ tế bào và duy trì sự hoạt động bình thường của tế bào (Võ VănChi, 1997)

2.1.3.7 Các tác dụng khác

Hai hợp chất, cis và trans-N- (4-hydroxystyryl) benzamide, được phânlập từ chiết xuất chloroform của cây Diếp cá được chứng minh là chất ức chế

mạnh kết tập tiểu cầu (Nishiya et al., 1988) Cao chiết xuất methanol phục hồi

các hoạt động epoxide hydrolase đã bị giảm đáng kể bởi bromobenzen vàđóng một vai trò quan trọng trong việc phòng chống nhiễm độc gan do giảmaminopyrine N-demethylase và hoạt động anilin hydroxylase cũng như tăng

cường các hoạt động enzyme epoxide hydrolase (Park et al., 2000).

2.2 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh thực vật

2.2.1 Vi khuẩn nội sinh thực vật

Vi khuẩn nội sinh có thể được tìm thấy ở hầu hết các cây đã đượcnghiên cứu, vi khuẩn nội sinh bên trong mô của các cây chủ và có thể tạo

thành nhiều mối quan hệ khác nhau bao gồm cộng sinh, hội sinh (Ryan et al.,

2008) Vi khuẩn nội sinh thực vật có thể được định nghĩa là những vi khuẩn cưtrú trong nội mô của thực vật, không có biểu hiện ra bên ngoài và không gây

tác động xấu đến thực vật mà chúng nội sinh (Athukorala et al., 2009).

Hầu hết các dạng nội sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt

lá Tuy nhiên, một số loại có thể nội sinh trên hạt, vi khuẩn nội sinh thực vậtthúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò quan trọng là tácnhân điều hòa sinh học Vi khuẩn nội sinh thực vật sản xuất các sản phẩm tựnhiên có lợi cho thực vật ký chủ từ đó có thể khai thác để ứng dụng trong yhọc, nông nghiệp hay công nghiệp Ngoài ra, vi khuẩn nội sinh còn có tiềm

năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng cường khả năngkhử độc trên thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ thông qua chu trìnhphosphat và cố định đạm Ngày càng có nhiều quan tâm trong việc phát triểncác ứng dụng tiềm năng công nghệ sinh học của vi khuẩn nội sinh thực vật, đểphát triển các giống cây trồng có khả năng khử độc đồng thời có khả năng sản

xuất sinh khối và nhiên liệu sinh học (Ryan et al., 2008).

Vi khuẩn nội sinh để tự bảo vệ mình trước những tác động của môitrường tạo thành những ổ vi khuẩn, xâm chiếm vào cây chủ thực vật Những vikhuẩn này thường xâm chiếm vào vùng không gian ở giữa các tế bào và chúng

có thể được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây bao gồm cả hạt giống

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời sống bên trong

cây trồng (Agbagwa et al., 2017) Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực

vật Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, nơi lắng đọng các chấthữu cơ và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khácnhau cho các vi sinh vật đất Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ

sự hấp thu các chất dinh dưỡng, độ ẩm, oxy từ vùng rễ và các chất do rễ tiết ra.Ngược lại, vi sinh vật vùng rễ có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây

do sự tác động đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình tháicủa rễ

Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trungtại vị trí xâm nhập hay di chuyển khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong,

vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002).

Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến động, phụ thuộc chủ yếu vàoloài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, nhưng cũng phụ thuộc vào giaiđoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay and Nowak,1997) thể hiện Hình 2.2

Hình 2 2 Cơ chế xâm nhập của vi khuẩn nội sinh thực vật

[Plant Interactions with Endophytic bacteria, Hallman 1997]

Vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái lại

có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kíchthích sự sinh trưởng thực vật Hơn nữa, một số vi khuẩn nội sinh có thể giúp

cây chủ kháng lại mầm bệnh (Benhamou et al., 1996) và kích thích cây trồng chống chịu với nhân tố vô sinh và hữu sinh (Hallmann et al., 1997).

2.2.2 Các dòng vi khuẩn nội sinh thực vật thường gặp

Vi khuẩn nội sinh thực vật thường gặp như Pseudomonas sp.,

Burkholderia sp và Bacillus sp (Lodewyckx et al., 2002).

2.2.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas sp.

Đặc điểm hình thái học dòng Pseudomonas sp là Gram âm, tế bào hình

que, di động nhờ chiên mao ở đầu và không có bào tử Đặc điểm sinh lý là dịdưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố

định nitơ Một số dòng Pseudomonas sp có ảnh hưởng quan trọng trong sự

sinh trưởng và phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thựcvật như auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng

khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số dòng như Pseudomonas

putida, Pseudomonas fluorescens và Pseudomonas syringae (Xie et al., 1996;

Suzuki et al., 2003).

Pseudomonas fluorescens được chú ý nghiên cứu nhiều hơn hết, vì

ngoài khả năng đối kháng với các loại mầm bệnh phát sinh từ đất, còn có khả

năng kích thích sự phát triển của cây Pseudomonas fluorescens và một số

dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy làm chất nhận điện tích cuốicùng trong quá trình hô hấp tế bào Cơ chế trao đổi chất cực kỳ linh hoạt giúpchúng sống được cả trong đất và trong nước, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển

của Pseudomonas fluorescens là 25–37°C.

2.2.2.2 Vi khuẩn Burkholderia sp.

Vi khuẩn Burkholderia sp là vi khuẩn Gram âm với một lớp vỏ bên ngoài chủ yếu bao gồm các lipopolysaccharide Vi khuẩn Burkholderia sp.

được tìm thấy trong các mẫu môi trường như nước thải, đất hoặc nước ngầm ở

khắp nơi Vi khuẩn Burkholderia sp có hình que, đường kính khoảng 1 µm, chúng có thể di chuyển bằng các chiên mao ở đầu Vi khuẩn Burkholderia sp.

sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí nhưng trong môitrường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển trong môi trường nuôicấy, tạo khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính từ 2-4 mm (Suzuki etal., 2003)

2.2.2.3 Vi khuẩn Bacillus sp.

Vi khuẩn Bacillus sp là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình oval, có khuynh hướng phình ra ở một đầu Vi khuẩn Bacillus sp được phân

biệt với các dòng vi khuẩn nội sinh khác bằng dạng tế bào hình que, sinh

trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc (Sushma et al., 2018) Vi khuẩn Bacillus sp có thể đơn hoặc chuỗi và di động bằng chiên mao Nhờ khả năng sinh bào tử nên dòng vi khuẩn Bacillus sp có thể tồn tại trong

thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiênnên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển,thể hiện Hình 2.3

Tất cả các dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng

và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin,

acid hữu cơ một vài dòng có thể lên men carbohydrate tạo thành glycerol và

butanediol; một vài dòng như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ

để sinh trưởng, một vài dòng khác thì cần acid amin, vitamin B Hầu hết, dòng

Bacillus sp đều là dòng ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30–45°C,

nhưng cũng có nhiều dòng ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65°C (Sushma et al.,

2018)

Hình 2 3 Vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá chụp KHV điện tử quét SEM

(Scanning Electron Microscope, thường viết tắt là SEM) [Chụp ở phòng thí nghiệm chuyên sâu trường Đại học Cần Thơ]

Đa số các dòng Bacillus sp sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với

pH = 9–10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp pH=2-6 như

Bacillus acidocaldrius.

Vi khuẩn Bacillus sp có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào như

amylase, protease Do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp,trong bảo vệ môi trường…

2.3 Tổng quan về da người

Da là một trong những cơ quan lớn nhất trong cơ thể Một số chức năngquan trọng của da là bảo vệ cơ thể tránh tổn thương từ bên ngoài, kiểm soátcân bằng dịch và điện giải, kiểm soát nhiệt độ, hệ thần kinh và hệ miễn dịch,hấp thụ và phản ứng với tia cực tím bằng cách tổng hợp vitamin D và tổng hợplipid (Nguyễn Trí Dũng, 2010) Ngoài ra, da còn có chức năng thẩm mỹ quantrọng

Da gồm 3 lớp: thượng bì (biểu bì), trung bì (bì), hạ bì (dưới bì) và cácphần phụ của da được trình bày Hình 2.4

2.3.1 Thượng bì (epidemis)

Trên các lát cắt mô học của da bình thường, ranh giới giữa thượng bì vàtrung bì không bằng phẳng mà lồi lõm do có nhiều nhú của thượng bì nhưnhững ngón tay ăn sâu vào trung bì Những chỗ lồi lên của trung bì giữa cácnhú thượng bì gọi là nhú trung bì

Thượng bì gồm 5 lớp: lớp đáy, lớp gai, lớp hạt, lớp sáng và lớp sừng

Hình 2 4 Cấu tạo của da cơ thể người

[Junqueiras Basic Histology: Text and Atlas 15 th , McGraw Hill]

nó giống sợi tạo keo (Bộ môn Mô học, 2010)

Chất cơ bản là một màng nhầy gồm trytophan, tyrosin Nó bị phá huỷbởi tryosin.

Tế bào gồm tế bào xơ hình thoi hoặc hình amip, có tác dụng làm da lênsẹo Tổ chức tế bào hình thoi hoặc hình sao, nó có thể biến thành đại thực bàođóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể Bào tương tham gia quá trìnhchuyển hoá heparin, histamin

Ngoài các thành phần trên ở trung bì còn có những động mạch, tĩnhmạch, hệ thống bạch huyết và hệ thống thần kinh da

2.3.3 Hạ bì (hypodermis)

Hạ bì là tổ chức đệm biệt hoá thành tổ chức mỡ, có nhiều ô ngăn cáchbởi những vách nối liền với trung bì, trong mỗi ô có mạch máu, thần kinh, tếbào mỡ, tế bào tròn, tế bào sáng

2.3.4 Phần phụ của da

Gồm có thần kinh da, tuyến mồ hôi, tuyến bã, nang lông và móng

2.3.4.1 Thần kinh da

Thần kinh da được chia làm 2 loại: có bao myelin (thần kinh não tuỷ)

và không có bao myelin (thần kinh giao cảm), mạch máu, thần kinh, tế bào

mỡ, tế bào tròn, tế bào sáng

Có 5 loại tiểu thể

Tiểu thể Water Pacini có nhiều lòng ngón tay cho biết cảm giác sờ mó,tiểu thể Golgi-Mazzoni giống loại trên nhưng nhỏ hơn, tiểu thể Ruffini chobiết cảm giác nóng, đĩa Meckel-Ranvier và tiểu thể Meisser cho cảm giác tiếpxúc và tiểu thể Krause cho cảm giác lạnh (Bộ môn Mô học, 2010)

2.3.4.2 Tuyến mồ hôi

Gồm có 3 phần

Cầu bài tiết hình tròn khu trú ở trung bì sâu hoặc hạ bì, có 2 lớp tế bàogiữa là những tế bào bài tiết, chung quanh có lớp tế bào dẹt bao bọc, ống dẫnđoạn qua trung bì có cấu trúc như phần cầu nhưng ít bài tiết và ống dẫn đoạnqua thượng bì có đoạn xoắn ốc, càng ra ngoài càng xoắn nhiều, gồm một lớp

tế bào có nhiễm hạt sừng

2.3.4.3 Tuyến bã

Là tuyến nằm cạnh bao lông và thông với nang lông bằng ống tiết Mỗituyến bã có nhiều thuỳ Mỗi thuỳ gồm nhiều lớp tế bào ngoài cùng là những tếbào nhỏ giống tế bào lớp cơ bản, đến lớp tế bào to chứa những hạt mỡ, trongcùng có những lớp tế bào chứa đầy mỡ làm căng vỡ tế bào, chảy ra ngoàithành chất bã (sebum) Ống tiết được cấu tạo bởi tế bào sừng (Bộ môn Môhọc, 2010)

2.3.4.4 Nang lông

Nang lông là phần lõm sâu xuống của thượng bì chứa sợi lông và tiếpcận với tuyến bã Nang lông ở rải rác khắp da trừ lòng bàn tay và lòng bànchân Mỗi nang lông có 3 phần là miệng nang lông thông với mặt da, cổ nangphần này bé lại và bao lông là phần dài nhất ăn sâu xuống hạ bì

Viêm nang lông là viêm do nhiễm khuẩn ở nang lông Có thể chỉ cómột vài nang lông bị viêm nhưng cũng có khi nhiều nang lông cùng bị viêm.Viêm nang lông có thể xảy ra ở mọi vùng da có lông trên cơ thể Biểu hiện làcác sẩn, mụn mủ, các vết chợt và vẩy tiết ở cổ nang lông Nhiễm khuẩn có thểlan sâu hơn toàn bộ nang lông Khi nang lông bị áp xe (mụn mủ) thì đã là biếnchứng thành nhọt, nặng hơn là nhọt cụm, hoặc viêm mô dưới da

Hình 2 5 Sơ đồ cấu tạo của lông, nang lông và hành lông

[Essentials of Human Anatomy and Physiology 12th, Pearson]

Các tác nhân gây viêm nang lông có nhiều loại Đa số trường hợp viêm nang