Luận văn tốt nghiệp khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập

NGUYỄN THANH HẰNG Tên đề tài: KHẢO SÁT TÌNH HÌNH VI KHUẨN HỌ ĐƯỜNG RUỘT SINH ESBL TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI KHOA VI SINH BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT N

NGUYỄN THANH HẰNG

Tên đề tài:

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH VI KHUẨN HỌ ĐƯỜNG RUỘT SINH ESBL

TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI KHOA VI SINH

BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khóa học : 2016-2020

THÁI NGUYÊN, NĂM 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THANH HẰNG

Tên đề tài:

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH VI KHUẨN HỌ ĐƯỜNG RUỘT SINH ESBL TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI KHOA VI SINH BỆNH

VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2016 - 2020 Người hướng dẫn: TS Bùi Tri Thức

ThS.BS Lương Thị Hồng Nhung

THÁI NGUYÊN, NĂM 2020

LỜI CẢM ƠN

Qua quá trình học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên, được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm em được phân công đến thực tập tại

Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên với đề tài: “Khảo sát tình hình

vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại Khoa

Vi sinh Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên”

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới ThS BS Lương Thị Hồng Nhung

và toàn thể anh, chị kỹ thuật viên làm việc tại Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực tập

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS Bùi Tri Thức - Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho

em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy/Cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập

Với điều kiện thời gian có hạn cũng như kinh nghiệm và kiến thức còn hạn chế nên đề tài của em sẽ không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận đươc

sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy/Cô để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức phục vụ cho việc học tập, công việc sau này

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thanh Hằng

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

chuẩn mực lâm sàng và xét nghiệm)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất sinh hóa của một số loại vi khuẩn đường ruột thường gặp 5

Bảng 1.2 Các nhân cơ bản của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam 10

Bảng 1.3 Các lớp ESBL chính 17

Bảng 3.1 Môi trường nuôi cấy cho từng loại bệnh phẩm 25

Bảng 3.2 Đường kính khoang giấy kháng sinh đồ của họ vi khuẩn đường ruột 35

Bảng 4.1 Tỉ lệ các loại vi khuẩn đường ruột phân lập được (243 chủng) 37

Bảng 4.2 Tỉ lệ các loại vi khuẩn đường ruột phân lập được theo chỉ số 38

Bảng 4.3 Tỉ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặpsinh ESBL 39

Bảng 4.4 Tỉ lệ kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm đường ruộtthường gặp sinh ESBL 40

Bảng 4.5 Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli sinh ESBL 43

Bảng 4.6 Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Klebsiella spp sinh ESBL 45

Bảng 4.7 Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Proteus spp sinh ESBL 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hoạt động phân giải penicillin của penicillinase 14

Hình 1.2 Cơ chế làm thay đổi thụ thể đối với thuốc 14

Hình 1.3 Cơ chế thay thế con đường trao đổi chất 15

Hình 1.4 Cơ chế bơm thuốc ra khỏi tế bào 15

Hình 3.1 API 20E sử dụng trong chuẩn đoán, định danh vi khuẩnGram âm oxydase âm 31

Hình 3.2 API 20NE sử dụng trong chuẩn đoán, định danh họ vi khuẩnGram âm oxydase dương 32

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

MỤC LỤC vi

Phần 1.MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về vi khuẩn 4

2.1.1 Vi khuẩn 4

2.1.2 Vi khuẩn đường ruột 4

2.2 Tổng quan về các kháng sinh thuộc nhóm β - lactam 10

2.2.1 Phân loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam 11

2.2.2 Cơ chế tác dụng 12

2.3 Tổng quan về đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 13

2.3.1 Định nghĩa 13

2.3.2 Phân loại 13

2.3.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh 13

2.3.4 Các biện pháp hạn chế sự gia tăng kháng kháng sinh 15

2.4 Tổng quan về ESBL 16

2.4.1 Nguồn gốc về ESBL 16

2.4.2 Phân loại 16

2.4.3 Phương pháp phát hiện 18

2.4 Tình hình nghiên cứu các họ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL trên thế giới và tại Việt Nam 20

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

2.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 21

Phần 3.ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 22

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.2.1 Địa điểm 22

3.2.2 Thời gian 22

3.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng 22

3.3.1 Dụng cụ, thiết bị 22

3.3.2 Hóa chất 22

3.4 Nội dung nghiên cứu 23

3.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 23

3.6 Xử lý số liệu 23

3.7 Phương pháp nghiên cứu 23

3.7.1 Phương pháp 1: Thu mẫu bệnh phẩm(theo sổ tay hướng dẫn lấy mẫu của khoa gửi tới các khoa cận lâm sàng) 23

3.7.2 Phương pháp 2: Phân lập và định danh 24

3.7.3 Phương pháp 3:Làm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán 34

3.7.4 Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 36

Phần 4.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Kết quả nghiên cứu tỉ lệ các vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên 37

4.2 Kết quả nghiên cứu tổng hợp tỉ lệtheo chỉ số của các loại vi khuẩn đường ruột phân lập được theo nhóm tuổi của bệnh nhân tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên

38

4.3 Tỉ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp sinh ESBL 39

4.4 Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của các vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên 40

4.5 Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của vi khuẩn E colisinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên 43

4.6 Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của vi khuẩn Klebsiella spp sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên 45

4.7 Khảo sát tình hình kháng kháng thuốc của vi khuẩn Proteus spp sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên 47

Phần 5.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

Nhóm trực khuẩn Gram âm, đang là tác nhân hàng đầu gây lên nhiễm khuẩn nặng tại bệnh viện Thường có tỉ lệ gây tử vong cao do cơ chế sinh bệnh khá phức tạp, đồng thời còn khó chọn được kháng sinh thích hợp vì từ ngay ban đầu khả năng

âm kháng thuốc hiện nay, đáng lưu ý nhất là nhóm vi khuẩn họ đường ruột Phổ biến

nhất là Escherichia coli, Klebsiella spp và Proteus spp với sự gia tăng đề kháng qua

các năm

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự đề kháng kháng sinh nhóm Cephalosporins là

do vi khuẩn sinh ra enzyme β-lactamase Đặc biệt, việc sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (Extended - Spectrum - β - lactamase: ESBL) là một cơ chế quan trọng trong việc giúp vi khuẩn chống lại các Penicilin, Cephalosporin thế hệ 3,4 và Monobactam

Vì vậy, sự lựa chọn kháng sinh ban đầu hiện nay là lựa chọn các kháng sinh phổ rộng

đủ mạnh, bao phủ phần lớn các tác nhân gây bệnh Sau khi có kết quả kháng sinh đồ

sẽ điều chỉnh lại cho phù hợp, đảm bảo tính hiệu quả, ít tốn kém và giảm sự phơi nhiễm của các kháng sinh

Tại Việt Nam, tình trạng này đang diễn ra một cách nghiêm trọng hơn khi việc mua thuốc mà không cần có đơn đang được diễn ra một cách dễ dàng tại các quầy thuốc tư nhân Bên cạnh đó, ở một số phòng khám tư đã nắm bắt được tâm lý muốn nhanh khỏi bệnh của bệnh nhân đã kê các kháng sinh liều cao, đắt tiền Bệnh sẽ khỏi nhanh hay là triệu chứng bệnh sẽ giảm nhanh Điều này đã chứng minh rõ vì sao tổ chức Y tế thế giới đã xếp Việt Nam vào những nước có tỉ lệ kháng thuốc kháng sinh cao nhất thế giới

Chính những tác hại do vi khuẩn đường ruột sản sinh ra ESBL gây ra ảnh hưởng rất nhiều đến sức khỏe cộng đồng[24]. Đặc biệt, tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên là một trong số những bệnh viện lớn trong khu vực Phía Đông Bắc Việt Nam, tập trung nhiều bệnh nhân nặng và là tuyến cuối của các bệnh viện cơ sở trong khu vực nên là nơi nghi ngờ sẽ có khả năng kháng thuốc cao

Xuất phát chính từ những tác nhân đó và muốn tìm hiểu sâu hơn về vi khuẩn đường ruột sinh ESBLmà nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài

“Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại Khoa Vi sinh Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên”

1.2 Mục tiêu của đề tài

-Khảo sát tỉ lệ vi khuẩn Gram âm đường ruột sinh ESBL

-Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của các vi khuẩn trên

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

-Đánh giá được thực trạng của vi khuẩn đường ruột kháng thuốc

-Cung cấp tư liệu về vi khuẩn kháng thuốc phục vụ các nghiên cứu sâu hơn về

vi sinh vật kháng thuốc và trong điều trị bệnh liên quan đến vi khuẩn đường ruột

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Xây dựng kháng sinh đồ cho những bệnh nhân cụ thể góp phần xây dựng chế

độ hóa trị liệu liên quan cho bệnh nhân, góp phần hạn chế sự lây lan của của vi khuẩn

Escherichia coli, Klebsiella spp và Proteus spp sinh ESBL ngoài cộng đồng

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về vi khuẩn

2.1.1Vi khuẩn

Vi khuẩn là nhóm các sinh vật đơn bào, kích thước nhỏ, cấu tạo tế bào nhân

sơ (Procaryote), có hình cầu (cầu khuẩn), hình que (trực khuẩn), hình xoắn (xoắn khuẩn)[1].

Vi khuẩn (Bacteria) theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là cái gậy Được hiểu theo nghĩa rộng bao gồm các vi sinh vật thuộc ngành Bacteria Theo nghĩa hẹp thì không

Nhóm trực khuẩn được chia thành hai loại là Gram âm và Gram dương, nhóm Gram âm bao gồm các vi khuẩn thuộc họ đường ruột là phổ biến nhất

2.1.2Vi khuẩn đường ruột

Ở người tập trung rất nhiều loại vi khuẩn họ đường ruột, nhưng đông nhất vẫn

là ở hệ tiêu hóa cụ thể là ở trong ruột người.Căn cứ theo đặc tính gây bệnh của vi

-Nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội đây là nhóm gây bệnh gây khi hệ thống miễn dịch của cơ thểbị suy yếu hoặc hoặc do tăng độc lực của các loài vi khuẩn[2].

Đặc điểm sinh học

Hình thể:

Vi khuẩn đường ruột có hình thể dạng que, dài khoảng 1-5µm, thường có flagella, không sinh bào tử, oxydase âm tính Hầu hết các loài trong nhóm này có peritrichous type I fimbriae tham gia vào việc bám dính của tế bào vi khuẩn vào

ký chủ[4]

Chỉ có một số ít vi khuẩn họ đường ruột là có lông và có vỏ Về vị trí phân loại thì thuộc giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gramma Proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae[4].Vi khuẩn họ đường ruột có rất nhiều loại

phổ biến gây bệnh trên người, nhưng trong số đó thì phổ biến nhất vẫn là Escherichia

coli, Klebsiella spp., Proteus spp

Tính chất nuôi cấy:

Các vi khuẩn đường ruột đều nuôi cấy dễ trên môi trường thông thường Trong môi trường lỏng có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trường, có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở đáy ống, cũng có thể tạo váng trên bề mặt[3]. Trên môi trường đặc có ba dạng khuẩn lạc là[3]:

+ Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng

+ Dạng R: Mặt khô, xù xì, thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng

+ Dạng M: Khuẩn lạc nhày, kích thước lớn hơn khuẩn lạc dạng S, các khuẩn lạc thường có xu hướng hòa vào nhau Hình thức phát triển này thường gặp ở những

vi khuẩn có khả năng tạo thành vỏ

Tính chất sinh hóa:

Vi khuẩn đường ruột có một số tính chất về sinh hóa như sau: có thể di động hoặc không di động Quá trình lên men một số loại đường có thể xảy ra hoặc không Hai loại đường được xác định dễ thực hiện lên men nhất là glucose và lactose Nếu

vi khuẩn không lên men đường glucose thì không thuộc họ vi khuẩn đường ruột Bên cạnh đó, còn có việc sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường Có hay không

có một số enzyme Ba loại enzyme thường được xác định nhất là: oxydase, urease, tryptophanease (sinh indole) Trong đó nếu oxydase dương tính thì không thuộc họ

vi khuẩn đường ruột Khả năng sinh sulfua hidro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các chất dẫn có lưu huỳnh Phát triển được hay không phát triển được trên một

số môi trường tổng hợp tối thiểu[4]. Trong đó, khả năng sử dụng Citrate là nguồn cung cấp carbon duy nhất có trong môi trường Simmon thường được thử nghiệm nhất[3].Chính vì những tính chất này, đã giúp cho việc xác định vi khuẩn đường ruột được diễn ra một cách dễ dàng hơn

Bảng 1.1 Tính chất sinh hóa của một số loại vi khuẩn đường ruột thường gặp

-Kháng nguyên H: là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn nên chỉ có ở các loài vi khuẩn có lông Kháng nguyên H có bản chất là protein Kháng thể chủ yếu của kháng nguyên H là IgG Yếu tố quyết định trong kháng nguyên H là chức năng của trình tự chuỗi acid amin trong protein flagellar (flagellin)

-Kháng nguyên K: là kháng nguyên vỏ hoặc màng bọc nằm bên ngoài kháng nguyên thân Bản chất hóa học là protein hoặc polisaccharide Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được dưới kính hiển vi quang học thông thường hoặc một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử

Khả năng gây bệnh

Các vi khuẩn đường ruột chủ yếu gây bệnh ở đường tiêu hoá như tiêu chảy, viêm ruột ỉa chảy, viêm đại tràng Mỗi loài vi khuẩn có thể gây bệnh ở các vị trí khác nhau trên đường tiêu hoá và cơ chế gây bệnh cũng khác nhau

2.1.2.1 Escherichia coli

Escherichia coli (viết tắt: E coli) hay trực khuẩn lị là một loài vi khuẩn Gram

âm Ngoài ra, E coli còn được biết đến là vi khuẩn đại tràng Là vi khuẩn sống cộng

sinh, chiếm 80% vi khuẩn ở ruột Vi khuẩn tổng hợp ra một số vitamin B, K, E và giữ cân bằng quần thể vi khuẩn đường ruột[3].

Đặc điểm sinh học:

Hình thể

Vi khuẩn E coli có kích thước trung bình 2- 3µm x 0,5 µm, trong những điều

kiện không thích hợp (ví dụ: môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như

sợi chỉ Rất ít chủng vi khuẩn E coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di

động Về vị trí phân loại, loại vi khuẩn này thuộc họ Enterobacteriaceae, chi

Escherichia và loài E coli[3].

Trong số vi khuẩn hiếu khí đường tiêu hóa, E coli chiếm tỉ lệ cao nhất (khoảng

80%) và sống nhiều nhất trong ruột già, nó đứng hàng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật

Mức độ kháng thuốc

Vi khuẩnE coli thường sản xuất enzyme β-lactamase thông thường và một số

chủng sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL)

2.1.2.2 Klebsiella spp

Klebsiella spp được phát hiện đầu tiên vào thế kỉ 19 bởi nhà vi sinh vật học

người Đức - Edwin Klebslà một giống trực khuẩn không di động Đây là một mầm bệnh thường trực với con người, các chủng Klebsiella gây ra nhiều chứng bệnh đặc biệt như nhiễm trùng đường nước tiểu,

Đặc điểm sinh học

Hình thể

Các vi khuẩn thuộc giống Klebsiella spp có hình que, kích thước trung bình 0,3

- 1 x 0,6 - 6 µm, thường không có lông nên không di động, có vỏ dày, kích thước có

thể gấp 2-3 lần tế bào vi khuẩn Vỏ của Klebsiella spp.có bản chất là polysaccharide

được cấu tạo bởi nhiều loại monosaccharide như: L - fructose, L - rhamnose, D - mannose, D - glucose, D - galactose, D - glucuromic acid hoặc D- galacturomic acid,

Vị trí phân loại:

Các loài vi khuẩn thuộc chủng này có họ Enterobacteriaceae, thuộc chi Klebsiella

Và bao gồm các loài:Klebsiella pneumoniae, Klebsiella gramanulomatis,

Klebsiella ozaenae, Klebsilla rhinoscleromatis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ornitholytica, Klebsiella planticola, Klebsiella terrigena Trong số các loài của chi

Klebsiella thì Klebsiella pneumoniae có tầm quan trọng nhất và được chọn làm đại

diện điển hình của chi này

Đặc tính sinh hóa

Thực hiện quá trình lên men nhiều loại đường (glucose, lactose, mantose), đồng

âm, Citrat dương, chuyển hóa nitrat thành nitrit, PAD âm[4].

Kháng nguyên

Các loài thuộc giống Klebsiella chỉ có 2 loại kháng nguyên đó là kháng nguyên

Khả năng gây bệnh

Klebsiella có trong hệ vi khuẩn bình thường ở ruột người trưởng thành, ngoài

ra cũng tìm thấy trong hệ hô hấp Chủ yếu gây bệnh cơ hội ở cộng đồng hoặc trong bệnh viện, là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện thường gặp

Trong đó, Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca là hai giống thường gặp nhất

trong các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện Hầu hết các cơ quan đều có thể bị

nhiễm trùng doK pneumoniae là một căn nguyên gây viêm phổi đã được nói đến từ

lâu, bệnh thường gặp ở trẻ sơ sinhtỉ lệ tử vong rất cao nếu không được điều trị sớm Ngoài ra nó còn có khả năng gây nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm nhiễm khuẩn đường tiết niệu, áp xe gan Thời gian nằm viện kéo dài, sử dụng kháng sinh phổ rộng và điều trị tại các khoa chăm sóc đặc biệt là các yếu

tố nguy cơ nhiễm Klebsiella spp.[4].

Mức độ kháng thuốc

Cũng như các loài kháng trong họ đường ruột, Klebsiella spp kháng cao với ngoại cảnh và kháng sinh Hiện nay,Klebsiella spp là một trong những nguyên nhân

quan trọng trong nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn mắc phải trong cộng đồng

vì tính đa kháng thuốc do tiết enzyme ESBL

Là một loại vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Proteus gồm một số loại

vi khuẩn cho chủng Proteus spp.điển hình như:Proteus vulgaris, P mirabillis, P

Vi khuẩnProteus spp.cũng giống như chủng vi khuẩnKlebsiella spp.chỉ có hai

Khả năng gây bệnh

Proteus spp phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có thể phân lập được từ phân của

nhiều loài động vật và từ phân của người bình thường Chúng là vi khuẩn gây bệnh

cơ hội, chủ yếu là gây nhiễm trùng bệnh viện Trong các nhiễm khuẩn do chúng gây

ra, nhiễm trùng đường tiết niệu chiếm tỉ lệ cao nhất Ngoài ra chúng có thể gây viêm tai giữa, nhiễm khuẩn huyết, viêm mủ vết thương[4].

Mức độ kháng thuốc

Proteus spp còn khá nhạy cảm với các kháng sinh thuộc nhóm β-lactamase

2.2 Tổng quan về các kháng sinh thuộc nhóm β - lactam

Các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam là một trong những nhóm kháng sinh quan trọng nhất cả về mặt lịch sử lẫn y học Nhóm kháng sinh này bao gồm các chất chứa vòng β-lactam (vòng amid 4 cạnh) và có cấu trúc nhân cơ bản như trong bảng[9][10].

Bảng 1.2 Các nhân cơ bản của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam

học chung

Kháng sinh đại diện

bán tổng hợp

Ampicillin Amoxcillin Penicillin V

Nhân Clavam

Các penicillin kháng lactamase

β-Sulbactam Tazobactam Nhân Cephem

cephamycin

Cefadroxil Cefaclor Cephalexin Cefixim Ceftibulen Nhân

hợp

imipenem, meropenem Nhân

monobactam

hay β-lactam

Aztreonam

2.2.1 Phân loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam

Theo cấu trúc hóa học của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam được chia thành

4 loại:Penicillin, Cephalosporin, Carbapenem, Monobactam

2.2.1.1 Penicillin

Nhóm kháng sinh này gồm có cấu tạo gồm 2 vòng β-lactam nối với vòng thiazolidin chỉ khác nhau ở gốc R của mạch ngang

Đối với các Penicillin kháng β-lactamase:

Điển hình ở đây là Acid clavulanic - một kháng sinh phổ rộng có hoạt tính kháng β-lactamase, tác dụng lên nhiều loại vi khuẩn cả Gram dương và Gram âm, đặc biệt có tác dụng ức chế mạnh β-lactamase truyền qua plasmid gây kháng penicillin và cephalosporin Do đó, acid calvulanic thường được sử dụng kết hợp với các loại kháng sinh khác để tăng hiệu quả trong việc chống lại các vi khuẩn sinh β-lactamase mạnh Đặc biệt là chống lại các vi khuẩn kháng penicillin và cephalosporin

Sulbactam và tazobactam tương tự cũng là những chất kháng sinh được dùng kết hợp với các kháng sinh khác trong việc chống lại các vi khuẩn kháng thuốc[5].

2.2.1.2 Cephalosporin

Nhóm kháng sinh Cephalosporin là nhóm thuốc quan trọng nhất trong các thuốc kháng sinh hiện nay Nhóm này đứng thứ 7 trong số 10 loại thuốc được sử dụng nhiều nhất để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn[5].Cephalosporin và cephamycin có cấu trúc gồm vòng β-lactam liên kết với dị vòng dihyrothiazin (nhân cephem) Các

2.2.1.3 Carbapenem

Nhóm Carbapenem là loại kháng sinh có cấu trúc vòng β-lactam có hoạt động kháng khuẩn rộng đặc biệt chống lại hầu hết các β-lactamase Carbapenem được phát

triển từ thienamycin được phát hiện ở Streptomyces cattleya vào năm 1976 Do đó,

carbapenem được coi là kháng sinh cuối cùng trong các loại thuốc chống lại các vi khuẩn kháng thuốc Carbepenem có cấu trúc gần giống penicilline nhưng thay thế carbon cho phân tử lưu huỳnh ở vị trí số1 [5].

2.2.1.4 Monobactam

Monobactam cũng là chất kháng sinh có cấu trúc vòng β-lactam mà không có vòng thứ hai thiazolidine 5 cạnh của nhóm Penicillin, hay vòng 6 cạnh dihydrothiazine của cephalosporin Monobactam chỉ có tác dụng với các loại vi khuẩn Gram âm Được dùng rộng rãi hiện nay với tên aztreonam (Azactam)

2.2.2 Cơ chế tác dụng

Cơ chế tác dụng chung của nhóm kháng sinh này là tác động lên thành tế bào của vi khuẩn Khác với tế bào nhân thực, tế bào vi khuẩn có áp suất thẩm thấu bên trong tế bào cao hơn nên chúng có thành bao bọc bên ngoài tế bào Thành tế bào có cấu tạo là peptidoglycan (mucopeptit, murein) gồm nhiều chuỗi polysaccharide thẳng dọc và những đoạn ngang penta - peptide Polysaccharide gồm nhiều phân tử đường chứa gốc amin: N - acetyl - glucosamine và N - acetyl - muramic

Các β-lactam ức chế có chọn lọc sự tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn từ đó

ức chế sự phát triển của vi khuẩn Đầu tiên β-lactam bám vào các thụ thể PBPs (Penicillin biding proteins) Có khoảng 3 đến 6 PBPs, một trong số đó là các enzyme transpeptidase Sau khi các β-lactam gắn vào một hay nhiều thụ thể thì làm cho quá trình transpeptidation bị ức chế và ngăn chặn việc tổng hợp peptidoglycan, một thành phần quan trọng của thành tế bào[6].

Khi thiếu sự tạo thành peptidoglycan một cách chính xác thì tế bào vi khuẩn đang sinh trưởng sẽ có một thành tế bào yếu ớt, kém đề kháng với áp suất thẩm thấu Màng tế bào bị phồng ra ở các phần bị yếu đi khi nước chuyển vào tế bào và cuối cùng tế bào bị vỡ ra.

Giai đoạn này có liên quan tới việc hoạt hóa các enzyme tự tiêu (autolytic enzyme) gây ra sự ly giải của tế bào ở môi trường đẳng trương Trong môi trường ưu trương những tế bào bị biến đổi thành protoblast hay spheroblast chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào nên rất dễ vỡ

Tuy nhiên, các loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam chỉ ngăn cản vi khuẩn tăng số lượng nguyên liệu thành tế bào song không có tác dụng lên phần peptidoglycan có sẵn, nên chúng chỉ tác động lên các tế bào đang sinh trưởng hoặc

sinh sản, các tế bào nghỉ không bị ảnh hưởng Dĩ nhiên, chúng không ảnh hưởng lên

tế bào động vật và thực vật vì các loại tế bào này không mang thành tế bào chứa peptidoglycan.

2.3 Tổng quan về đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

2.3.1 Định nghĩa

Kháng sinh có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn nhưng trong môi trường

có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh[7].

Ví dụ: E coli không chịu tác dụng của Erythomycin,

được trên 200 loại lactamase khác nhau Các gen quy định chúng thường nằm trên plasmid R[9][10].

Hình 1.1 Hoạt động phân giải penicillin của penicillinase [24].

Các tác nhân gây bệnh khi mà có sự đề kháng sẽ làm chậm hoặc là ngăn chặn hoàn toàn sự xâm nhập của kháng sinh vào bên trong tế bào Cơ chế này thường có liên quan đến những sự thay đổi trong cấu trúc hoặc điện tích của các protein màng

tế bào chất tạo nên các kênh hay các lỗ Các protein này nằm trong màng ngoài của

vi khuẩn Gram âm gọi là các porin.Các protein porin bị thay đổi bắt nguồn từ những thay đổi trong các gen nhiễm sắc thể Các tác nhân gây bệnh khi mà cósự đề kháng,

có thể làm thay đổi thụ thể đối với thuốc do vậy nó không thể gắn vào hoặc liên kết một cách hiệu quả tới đích của nó Dạng đề kháng này thường gặp trong trường hợp chống lại các chất kháng trao đổi chất (như sunfonamit) và kháng lại các thuốc (như erythromycin) cản trở sự dịch mã[9][10].

Hình 1.2 Cơ chế làm thay đổi thụ thể đối với thuốc [24].

Vi khuẩn thay đổi đường chuyển hóa làm cho thuốc kháng sinh không tác dụng được vào quá trình chuyển hóa của vi khuẩn Chẳng hạn, một tế bào có thể trở thành

đề kháng với một loại thuốc nhờ sinh ra nhiều phân tử enizim hơn đối với con đường trao đổi chất bị tác động Một cách khác, các tế bào trở nên đề kháng với các

sunfonamit bằng cách từ bỏ sự tổng hợp axid folic, thay vào đó chúng hấp thụ acid này từ ngoài môi trường[9][10]

Hình 1.3 Cơ chế thay thế con đường trao đổi chất [24].

Các tế bào đề kháng có thể bơm thuốc ra khỏi tế bào trước khi thuốc có thể gây tác dụng[9][10].

Hình 1.4 Cơ chế bơm thuốc ra khỏi tế bào [24].

2.3.4 Các biện pháp hạn chế sự gia tăng kháng kháng sinh

Một số biện pháp đã được đưa ra nhằm hạn chế sự gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh như sau:

-Chỉ dùng kháng sinh để điều trị những bệnh truyền nhiễm

-Chọn kháng sinh theo kết quả của kháng sinh đồ (lưu ý: nên ưu tiên các loại kháng sinh có tác dụng đặc hiệu trên vi khuẩn gây bệnh và có sự khuếch tán tốt nhất đến vi khuẩn)

-Dùng kháng sinh với một liều lượng vừa đủ và trong thời gian phù hợp (áp dụng cho một đợt điều trị)

-Duy trì thường xuyên việc giám sát sự phát triển đề kháng kháng sinh của vi khuẩn để từ đó sẽ đưa ra được chiến lược phù hợp nhất

2.4 Tổng quan về ESBL

2.4.1 Nguồn gốc về ESBL

ESBLlà loại enzyme do vi khuẩn sản xuất ra nhằm chống lại sự càn quét của các loại thuốc kháng sinh trị bệnh, có nguồn gốc từ đột biến của β-lactamase do cephalosporins thế hệ 3 cảm ứng tạo thành Những đột biến này do sự thay đổi ở một nhóm khoảng từ 1 đến 7 acid amin nằm gần trung tâm hoạt động của enzyme Những thay đổi trên đã tạo ra trung tâm hoạt động của enzyme linh hoạt hơn, tiến hóa hơn

Vì thế tăng ái lực và tăng hoạt động thủy phân đối với cephalosporins thế hệ 3 (như ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone, ) và monobactams (aztreonam)

2.4.2Phân loại

Hầu hết ESBL bắt nguồn từ enzyme TEM và SHV.Hiện nay đã có hơn 90 loại

enzyme loại TEM và 25 enzyme loại SHV TEM và SHV thường được tìm thấy ở E

coli và K pneumoniae

Tuy nhiên, chúng cũng có thể được tìm thấy ở Proteus spp và các chủng vi

khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae[25]

TEM: TEM-1 là loại β-lactamase thường gặp ở vi khuẩn Gram âm Hơn 90

chủng E coli kháng lại với ampicillin là nhờ có TEM-1

TEM-1 có khả năng thủy phân penicillin và các cephalosporins thế hệ 1 như cephalothin và cephaloridine TEM-2 là dẫn xuất đầu tiên của TEM-1, có sự thay thế

1 acid amin so với β-lactamase nguyên thủy TEM-3 được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1989, là loại TEM - β-lactamase đầu tiên bộc lộ kiểu hình của ESBL[28]

TEM-3 có khả năng phân giải cephalosporin phổ rộng Sau đó, hơn 130

Mặc dù β-lactamase là loại TEM thường tìm thấy nhiều nhất ở chủngE coli vàK pneumoniae, nhưng chúng cũng được tìm thấy ở những chủng vi khuẩn Gram

âm khác và tần số này ngày càng gia tăng

SHV: SHV - 1 thường được tìm thấy ởK pneumoniae, và chính nó đã gây ra hơn

20% sựđề kháng ampicillin qua trung gian plasmid ở chủng này.Không như TEM-1,

SHV-1 chỉ có vài dẫn xuất Phần lớn các SHV khác nhau mang kiểu hình ESBL được đặc trưng

bởi sự thay đổi acid amin tại vị trí 238, thay serine bằng glycine[28].

Trên 40, trong 5 phân

lớp

biết từ lâu là penicillinase

có nguồn ngốc không rõ

1

OXA-11, 14, 15, 16, 17

(D)

Đột biến OXA - 10 (=PSE

- 2), được biết từ lâu là penicillinase có nguồn ngốc không rõ

thấy ở chủng K pneumoniae

CTX-M: Đây là loại enzyme qua trung gian plasmid và có khả năng phân giải

mạnh cefotaxim Enzyme này chủ yếu được tìm thấy ở E coli, nhưng cũng được mô

tả ở những chủng khác của họ Enterobacteriaceae

Sự mở rộng hoạt tính của CTX-M.ESBL đề kháng với cephalosporin phổ rộng không liên quan đến việc thay đổi một vài acid amin như TEM hay SHV Mà là do phần còn lại của serine ở vị trí 237, hiện diện ở tất cả các CTX-M Năm 2006 phát

hiện CTX-M-15 phổ biến ở chủng E coli ở Anh và lan rộng khắp thế giới.Hiện nay,

Xét nghiệm sàng lọc: Chọn lựa cephalosporin(s) chỉ điểm Mục đích là khảo

sát sự đề kháng hay giảm nhạy cảm trong những xét nghiệm sàng lọc với cephalosporin(s) chỉ điểm, nhờ đó phát hiện các chủng có thể có ESBL[11].Do đó, nếu càng sử dụng nhiều cephalosporin thì càng có nhiều cơ hội phát hiện những kiểu kháng thuốc ít gặp Các kháng sinh được khuyên dùng để thử nghiệm các chủng thuộc

họ Enterobacteriaceae là cefpdoxime, ceftazidime, aztreonam, cefotaxim và ceftriaxone Nếu đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn hoặc bằng điểm gãy (BP: Breakpoint) của một trong những kháng sinh ở trên thì có thể chỉ điểm chủng vi khuẩn sinh ESBL Khi đó, sẽ làm tiếp bước 2

Xét nghiệm xác định: Xét nghiệm xác định ESBL dựa vào tìm kiếm sự cộng

hưởng giữa oxymino-cephalosporin và clavulanate Nhờ đó phân biệt các chủng

ESBL (cộng hưởng dương) khỏi các chủng kháng thuốc vì nhiều lý do khác (cộng hưởng âm), vì clavulanate có tác dụng ức chế ESBL Nhiều phương pháp phát hiện ESBL được

đề nghị dựa trên nguyên tắc đĩa khuyếch tác của Kirby - Bauer Hiện nay, các phương pháp cộng hưởng đang được sử dụng rộng rãi là: Phương pháp đĩa đôi, phương pháp đĩa kết hợp và phương pháp E - test

-Phương pháp đĩa đôi: Phương pháp này được mô tả bởi Jarlier và cộng sự (1988).Dựa trên nguyên tắc clavulanic acid ức chế ESBL nên làm giảm mức độ đề kháng của cephalosporins và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporins khi đặt gần một đĩa kháng sinh chứa clavulanic acid[11].

Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch Mueller - Hinton Đặt đĩa cephalosporin (30µg) với đĩa amoxicillin-clavulanate (20µg) cách nhau 20 - 25mm trên mặt thạch Trước đây,khoảng cách yêu cầu là 30mmnhưng hiện naykhoảng cách được giảm xuống để tăng độ nhảy cảm của phương pháp Có cộng hưởng khi có sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin ở vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanate Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện Nhưng khuyết điểm là có thể bỏ sót một

số chủng vi khuẩn có ESBL

lần đầu tiên vào năm 1999 Bằng cách sử dụng hai loại đĩa kháng sinh là cephalosporins thế hệ 3 và cephalosporins thế hệ 3 tương ứng phối hợp với clavulanic acid Vi khuẩn tiết ESBL khi hiệu số đường kính vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporins có phối hợp với clavulanic acid so đĩa cephalosporins ≥5mm Các loại đĩa kháng sinh được sử dụng là cefotaxime (30µg)/cefotaxime - clavulanic acid (30/10µg),ceftazidime (30µg)/ceftazidimeclavulanic acid (30/10µg), cefpodoxime (10 µg)/cefpodoxime (10/10 µg)

Tiêu chuẩn CLSI yêu cầu mới phương pháp này cần phải thực hiện đồng thời trên cả hau hệ thống là: cefotaxime (30µg)/cefotaxime - clavulanic acid (30/10µg); ceftazidime (30µg)/ceftazidime-clavulanic acid (30/10µg) Phương pháp này dễ thực hiện và ít tốn kém nhưng yêu cầu phòng thí nghiệm phải có đĩa kháng sinh cefotaxime

- clavulanic acid và ceftazidime-clavulanic acid Một số trường hợp cho kết quả

dương tính giả do một số vi khuẩn sinh AmpC cũng xuất hiện sự gia tăng đường kính vòng vô khuẩn khi có clavulanic acid

-Phương pháp E - test: Dùng que E - test (AB Biodisk, Solna, Sweden), một đầu là dãy chứa nồng độ của cephalosporin và đầu đối diện là dãy nồng độ của cephalosporin/clavulanic acid Khi đầu chứa clavulanic acid cho MIC giảm ≥ 8 lần

so với đầu còn lại thì suy ra được rằng vi khuẩn có sinh ESBL Phương pháp này cho kết quả chính xác nhưng giá thành khá cao

2.4 Tình hình nghiên cứu các họ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL trên thế giới

và tại Việt Nam

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới kể từ khi hiện tượng ESBL bắt đầu xuất hiện ở Tây Âu cho đến nay đã được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới như Mỹ, Châu Á Tần suất xuất hiện

vi khuẩn sinh ESBL thay đổi tùy theo quốc gia, viện nghiên cứu

Vấn đề kháng thuốc kháng sinh đã trở thành vấn đề đáng báo động trên toàn cầu Gánh nặng về chi phí điều trị do kháng kháng sinh gây ra khá là lớn, do việc thay thế cá kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền

Ở Mỹ, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL thay đổi từ 0 - 25% tùy theo từng viện nghiên cứu, với tỉ lệ quốc gia chung là khoảng 3% Một nghiên cứu của SENTRY

đã chỉ ra rằng, tỉ lệ K pneumoniae ở Mỹ sinh ESBL là 7,6 % so với 4,9% ở Canada

Tỉ lệ E coli sinh ESBL là 4,2% ở Mỹ và 3,3% ở Canada Một nghiên cứu của Moland

và các cộng sự vào năm 2001 - 2002 trên khắp nước Mỹ đã chỉ ra rằng tỉ lệ sinh ESBL

ở K pneumoniae là 11,3% và ởE coli là 2,6%[28].

Ở Châu Âu, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL cũng thay đổi theo từng quốc gia Tại Hà Lan, một nghiên cứu trên 11 phòng thí nghiệm vào năm 1999 cho thấy

<1% E coli và K pneumoniae có sinh ESBL[31] Tuy nhiên, các nghiên cứu ở Pháp

lại chỉ ra rằng, có đến 40% các chủng K pneumoniae phân lập được kháng

ceftazidime[29]. Trên khắp Châu Âu, tỉ lệ K pneumoniae kháng ceftazidime là 20% ở

các cơ sở điều trị thông thường và 42% ở các cơ sở chăm sóc đặc biệt [25]

Ở Châu Á, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL vẫn còn thấp, ở mức < 0,1%

đối với E coli và 0,3% đối với K pneumoniae trong các nghiên cứu trên khắp Nhật

Bản Ở Hàn Quốc, tỉ lệ này là 4,8%, trong khi đó, ở Đài Loan là 8,5% và 12% tại Hồng Kông Tại Ả Rập Xêut, nghiên cứu trên 3231 vi khuẩn Gram âm cho thấy tỉ lệ sinh ESBL là 4,8%, tại Ấn Độ là 26,6% [29].

2.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỉ lệ khá cao các vi

khuẩn E coli, K pneumoniae và Poteus spp sinh ESBL

Theo tác giả Hoàng Thị Phương Dung thực hiện nghiên cứu từ 7-12/2008 tại bệnh viện Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, tỉ lệ sinh ESBL là 32,4% (66/204 chủng)

Trong đó, tỉ lệ sinh ESBL cao nhất là E coli với 71,2% (47/66 chủng), tiếp đến là K

Công trình nghiên cứu tổng kết tình hình đề kháng các kháng sinh đã ghi nhận

pneumoniae tiết ESBL là rất đáng báo động tại nhiều bệnh viện như Chợ Rẫy (49%

và 58%), Việt Đức (57% và 49%), Nhiệt đới Quốc Gia (55% và 73%), Bình Định (36% và 54%)

Tại các khoa hồi sức tích cực, vấn đề này còn nan giải hơn, do nơi đây tập trung những bệnh nhân nặng nhất, qua nhiều khoa điều trị, đặc biệt là các vi khuẩn

Hiện nay, theo báo cáo của WHO giai đoạn 2011 - 2014, Việt Nam nằm trong

các nước có tỉ lệ vi khuẩn E coli sinh ESBL cao nhất trên thế giới với tỉ lệ trên

60%[31]