Luận án tiến sĩ nghiên cứu biểu hiện gen mã hoá nhân tố phiên mã ZmDREB2A nhằm tăng cường tính chịu hạn ở một số

Gần đây, dựa trên những thành tựu của chương trình nghiên cứu chức năng hệ gen thực vật các nhà khoa học đã phát hiện và chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen mã hóa yếu tố phiên mã

ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ

ZmDREB2A NHẰM TĂNG CƯỜNG TÍNH CHỊU HẠN

Ở MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2020

ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ

ZmDREB2A NHẰM TĂNG CƯỜNG TÍNH CHỊU HẠN

Ở MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS TS Nông Văn Hải

2 TS Bùi Mạnh Cường

HÀ NỘI – 2020

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của các Thầy và sự giúp đỡ tận tình của các đồng nghiệp Viện Nghiên cứu Ngô Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 07 năm 2020

TÁC GIẢ

ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO

Để hoàn thành được cuốn luận án này, trong quá trình nghiên cứu và thực hiện, tôi luôn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các cơ quan, thầy cô, bạn bè đồng nghiệp

và gia đình

Trước tiên, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nông Văn Hải, TS Bùi Mạnh Cường đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu

và thực hiện đề tài luận án

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Lãnh đạo và tập thể cán bộ Ban Đào tạo sau đại học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thiện luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ngô đã tạo điều kiện thuận lợi, về vật chất, tinh thần trong thời gian thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các đồng nghiệp Bộ môn Công nghệ sinh học, Bộ môn Công nghệ gen, Phòng Khoa học HTQT đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen Tôi xin chân thành cảm ơn

sự giúp đỡ quý báu đó

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng tri ân đối với những đồng nghiệp, gia đình và bạn bè

là những điểm tựa tinh thần vững chắc, đã giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn và luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập của mình

Hà Nội, tháng 07 năm 2020

Đoàn Thị Bích Thảo

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Đóng góp mới của luận án 3

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tác động của hạn đến sinh trưởng và phát triển cây ngô 5

1.1.1 Khái niệm hạn 5

1.1.1.1 Hạn không khí 5

1.1.1.2 Hạn đất 6

1.1.1.3 Hạn toàn diện 6

1.1.2 Tác động của hạn đến sinh trưởng và phát triển cây ngô 7

1.2 Ảnh hưởng của hạn đối với sản xuất ngô 7

1.2.1 Ảnh hưởng của hạn đối với sản xuất ngô trên thế giới 7

1.2.2 Ảnh hưởng của hạn đến sản xuất ngô ở Việt Nam 11

1.3 Tình hình nghiên cứu giống ngô chịu hạn 14

1.3.1 Tình hình nghiên cứu, sử dụng giống ngô chịu hạn trên thế giới 14

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngô chịu hạn ở Việt Nam 16

1.4 Cơ chế sinh lý, sinh hóa liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật 17

1.4.1 Cơ chế phân tử trong phản ứng với hạn ở thực vật 17

1.4.2 Vai trò của một số phân tử trong truyền tín hiệu điều hòa biểu hiện gen chịu hạn ở thực vật 19

1.5 Một số nhóm nhân tố phiên mã được quan tâm trong nghiên cứu chịu hạn 21

1.5.1 Nhân tố phiên mã AREB/ABF 22

1.5.2 Nhân tố phiên mã NAC 23

1.5.3 Nhóm nhân tố phiên mã bZIP 24

1.5.4 Nhân tố phiên mã AP2/ERF 25

1.6 Một số nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về nhóm gen mã hóa yếu tố phiên mã

Dreb2A trong phản ứng chịu hạn ở cây trồng 27

1.7 Ứng dụng ngô biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam 33

1.7.1 Tiềm năng ứng dụng ngô biến đổi gen 33

1.7.2 Sử dụng ngô biến đổi gen trên thế giới 34

1.7.3 Nghiên cứu và sản xuất ngô biến đổi gen ở Việt Nam 38

1.8 Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong phân tích cây chuyển gen 42

1.8.1 Chọn lọc thể chuyển gen bằng gen chỉ thị 42

1.8.2 Phân tích cây chuyển gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử 43

1.8.2.1 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 43

1.8.2.2 Phương pháp xác định số bản sao (copy) trong cây chuyển gen 44

1.8.2.3 Phân tích biểu hiện gen 45

1.8.3 Phương pháp phân tích sử dụng trong nhà lưới và đồng ruộng 45

1.8.3.1 Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển 46

1.8.3.2 Phân tích đặc điểm di truyền và nhận biết thể đồng hợp tử của thế hệ sau 46

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48

2.1 Vật liệu 48

2.1.1 Vật liệu thực vật 48

2.1.2 Chủng vi sinh vật 48

2.1.3 Vector và oligonucleotide 48

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 48

2.2 Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 49

2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 49

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 50

2.3 Nội dung nghiên cứu 50

2.4 Phương pháp nghiên cứu 50

2.4.1 Phương pháp xác định dòng ngô có khả năng tái sinh cao 51

2.4.2 Phương pháp theo dõi đặc điểm nông sinh học, chọn tạo dòng làm vật liệu chuyển gen 51 2.4.3 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện gen ZmDREB2A 52

2.4.3.1 Thiết kế vector biểu hiện trong tế bào thực 52

2.4.3.2 Tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen 53

2.4.4.1 Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp 53

2.4.4.2 Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm 53

2.4.4.3 Quy trình biến nạp gen 54

2.4.5 Phân tích và đánh giá sự ổn định các dòng ngô mang gen ZmDREB2A 56

2.4.5.1 Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR 56

2.4.5.2 Đánh giá sự phân ly của gen ZmDREAB2A qua các thế hệ 57

2.4.4.3 Phân tích cây chuyển gen bằng southerm blot 57

2.4.6 Đánh giá sự biểu hiện của gen thông qua RT-PCR 59

2.4.7 Tạo kháng thể đa dòng kháng protein ZmDREB2A tái tổ hợp 60

2.4.7.1 Biểu hiện protein ZmDREB2A trong tế bào vi khuẩn E coli 60

2.4.7.2 Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột 62

2.4.8 Xác định hàm lượng Chlorophyll, proline, cacbonhydrate trong cây chuyển gen 63

2.4.8.1 Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll tổng số 63

2.4.8.2 Phương pháp xác định hàm lượng proline 63

2.4.8.3 Phương pháp xác định hàm lượng cacbohydrate không cấu trúc (NSC) 64

2.4.9 Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen 64

2.4.9.1 Đánh giá khả năng chịu hạn bằng thí nghiệm gây hạn nhân tạo ở giai đoạn cây con theo phương pháp của Camacho 64

2.4.9.2 Đánh giá khả năng chịu hạn bằng thí nghiệm gây hạn nhân tạo ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau theo phương pháp của Zaidi 65

2.4.10 Các kỹ thuật được dùng đánh giá cây chuyển gen 65

2.4.10.1 Tách chiết, định lượng DNA 65

a, Tách chiết DNA plasmid 65

b, Tách chiết DNA tổng số từ lá ngô 66

2.4.10.2 Tách chiết, định lượng RNA từ mô thực vật 67

2.4.10.3 Điện di DNA/RNA trên gel agarose 67

2.4.10.4 Tổng hợp cDNA 68

2.4.10.5 Kỹ thuật PCR khuếch đại gen ZmDREB2A 68

2.4.10.6 Phương pháp giải trình tự và so sánh 68

2.4.10.7 Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen 69

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 70

3.1.1 Đánh giá khả năng tái sinh của một số vật liệu nghiên cứu 70

3.1.2 Đặc điểm nông, sinh học của các dòng có tỷ lệ tái sinh cao 73

3.1.2.1 Thời gian sinh trưởng 73

3.1.2.2 Đặc điểm hình thái 74

3.1.2.3 Khả năng chống chịu 75

3.1.2.4 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất 76

3.2 Thiết kế và biến nạp vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDreb2A vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 79

3.2.1 Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2A 79

3.2.1.1 Phân tích và tổng hợp gen ZmDreb2A 79

3.2.1.2 Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2A 82

3.2.2 Biến nạp cấu trúc vector chứa gen ZmDREB2A-S vào một số dòng ngô Việt Nam thông qua vi khuẩn A tumefaciens 84

3.2.2.1 Chuyển gen ZmDREB2A-S vào các dòng ngô K1, K3, K7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 85

3.2.2.2 Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR đối với các cây chuyển gen ở thế hệ T0 90

3.2.2.3 Kết quả giải trình tự đoạn gen ZmDREB2A 91

3.2.2.4 Đánh giá khả năng hữu thụ của các cây chuyển gen thế hệ T0 93

3.3 Phân tích và đánh giá sự ổn định các dòng ngô mang gen ZmDREB2A ở các thế hệ T1, T2, T3 96

3.3.1 Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T1 bằng phương pháp PCR 96

3.3.2 Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T2 bằng phương pháp PCR 99

3.3.3 Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T3 bằng phương pháp PCR 101

3.3.4 Kết quả giải trình tự cấu trúc biểu hiện Ubi::ZmDREB2A:: 35S trên cây ngô chuyển gen 104

3.3.4.1 Kết quả PCR, giải trình tự promoter Ubiquitin và so sánh với trình tự gốc 104

3.3.4.2 Kết quả PCR, giải trình tự đoạn gen ZmDREB2A và so sánh với trình tự gốc 107

3.3.4.3 Kết quả PCR, giải trình tự terminator 35S và so sánh với trình tự gốc 109

3.3.5.1 Kết quả DNA tổng số được cắt bằng enzyme giới hạn 112

3.3.5.2 Kết quả xác định tín hiệu lai Southern blot 113

3.3.6 Xác định sự có mặt sản phẩm phiên mã của gen chuyển ZmDREB2A trên cây ngô chuyển gen bằng kỹ thuật RT-PCR 115

3.3.6.1 Kết quả PCR khi sử dụng cặp mồi Actin 115

3.3.6.2 Kết quả PCR khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu ZmDREB2A 117

sản phẩm PCR từ cDNA dòng K7-4.12.25 118

3.3.7 Kiểm tra protein ZmDREB2A bằng thẩm tách miễn dịch (Western Blot) 118

3.4 Xác định hàm lượng Chlorophyll, Proline, Cacbonhydrate trong cây chuyển gen và đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng ngô chuyển gen 120

3.4.1 Xác định hàm lượng chlorophyll ở cây chuyển gen ZmDREB2A 120

3.4.2 Xác định hàm lượng proline ở cây chuyển gen ZmDREB2A 123

3.4.3 Xác định hàm lượng carbohydrate không cấu trúc ở cây chuyển gen ZmDREB2A 125

3.4.4 Đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô chuyển gen thế hệ T3 bằng gây hạn nhân tạo 127

3.4.4.1 Đánh giá một số chỉ tiêu liên quan đến khả năng chịu hạn nhân tạo của các dòng đã được chuyển gen ZmDREB2A thời kỳ cây con 127

3.4.4.2 Đánh giá các dòng chuyển gen và dòng nền tương ứng ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau về khả năng chịu hạn nhân tạo 134

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 146

4.1 Kết luận 146

4.2 Đề nghị 147

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 148

TÀI LIỆU THAM KHẢO 149

PHỤ LỤC 165

1 Một số hình ảnh thực hiện thí nghiệm tái sinh và chuyển gen 165

2 Một số hình ảnh gây hạn nhân tạo 169

3 Một số hình ảnh về đặc điểm hình thái các dòng K1, K3, K7 171

Bảng 1.1 Khả năng gặp hạn ở 8 vùng ngô tại Việt Nam 12

Bảng 1.2 Phản ứng của gen DREB với stress khác nhau của môi trường trong cây chuyển gen 28

Bảng 1.3 Diện tích trồng cây chuyển gen trên thế giới, từ 1996 đến 2017 34

Bảng 1.4 Các nước trồng cây biến đổi gen vào năm 2016 và 2017 (Triệu ha) 35

Bảng 2.1 Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu 49

Bảng 2.2 Hệ thống môi trường dùng trong thí nghiệm chuyển gen ngô 55

Bảng 2.3 Thành phần gel polyacrylamide chứa SDS 61

Bảng 3.1 Tỷ lệ tạo cây tái sinh từ phôi non của một số dòng ngô Việt Nam 71

Bảng 3.2 Thời gian sinh trưởng và đặc điểm của các dòng năm 2014 73

Bảng 3.3 Một số đặc điểm sinh trưởng phát triển của các dòng ngô năm 2014 74

Bảng 3.4 Khả năng chống chịu của các dòng ngô năm 2014 75

Bảng 3.5 Các yếu tố cấu thành năng suất của các giống ngô 76

Bảng 3.6 Hình thái bắp, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng thí nghiệm năm 2014 78

Bảng 3.7 Sự hình thành mô sẹo của các dòng ngô thí nghiệm 86

Bảng 3.8 Sự hình thành chồi tái sinh của các dòng ngô thí nghiệm 87

Bảng 3.9 Sự hình thành cây hoàn chỉnh của các dòng ngô thí nghiệm 89

Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra sự có mặt của các gen chuyển và khả năng hữu thụ của các cây chuyển gen thế hệ T0 90

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá khả năng hữu thụ của các cây chuyển gen thế hệ T0 94

Bảng 3.12 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô ở thế hệ T1 96

Bảng 3.13 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô ở thế hệ T2 100

Bảng 3.14 Nguồn gốc cây T2 được chọn đánh giá thế hệ T3 102

Bảng 3.15 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô ở thế hệ T3 102

Bảng 3.16 Kết quả so sánh đoạn trình tự Promoter Ubiquitin và trình tự gốc 106

Bảng 3.17 Kết quả so sánh đoạn trình tự gen ZmDREB2A và trình tự gốc 108

Bảng 3.18 Kết quả so sánh đoạn trình tự 35S terminater của dòng ngô 111

Bảng 3.19 Tỷ lệ cây sống sau phục hồi (%) 129

Bảng 3.20 Các chỉ tiêu thân, lá, rễ tươi của các dòng ngô thí nghiệm trong chậu 131

Bảng 3.21 Các chỉ tiêu thân, rễ khô của các dòng ngô thí nghiệm trong chậu 133

Bảng 3.22 Thời gian sinh trưởng của các dòng ngô trong thí nghiệm 135

Bảng 3.23 So sánh chiều dài bắp và đường kính bắp của các vật liệu ngô ở các thời kỳ hạn khác nhau trong nhà lưới 138

Bảng 3.24 So sánh số hàng hạt và số hạt/hàng của các dòng ngô mang 139

Bảng 3.25 So sánh tỷ lệ hạt/bắp và khối lượng nghìn hạt của các dòng ngô 140

Bảng 3.26 So sánh năng suất cá thể của các dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A ở các thời kỳ hạn khác nhau trong nhà lưới 141

Hình 1.1 Các vùng trồng ngô của Mỹ bị ảnh hưởng của hạn hán 9

Hình 1.2 Năng suất ngô ở cận Sahara Châu Phi, Châu Mĩ Latinh và Nam Phi 10

Hình 1.3 Bản đồ chỉ số rủi ro toàn cầu thế giới 1992 – 2011 11

Hình 1.4 Hệ thống điều khiển phiên mã phụ thuộc và không phụ thuộc của ABA trong điều kiện hạn hán, độ mặn và chống chịu lạnh 18

Hình 1.5 Biểu hiện của gen DREB2A ở Arabidopsis trong điều kiện bình thường và bất thuận 31

Hình 1.6 Cảm ứng lạnh và sự biểu hiện gen DREB1 31

Hình 1.7 (A và B) Diện tích toàn cầu (Triệu ha) trồng cây biến đổi gen, 1996 đến 2017, theo quốc gia, các quốc gia lớn và cho mười quốc gia hàng đầu 36

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào phôi non ngô thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 56

Hình 3.1 Một số hình ảnh các nguồn vật liệu có khả năng tái sinh tốt 72

Hình 3.2 Sự khác biệt giữa ZmDREB2A-L và ZmDREB2A-S 80

Hình 3.3 Trình tự nucleotide và amino axit của gen ZmDREB2A 81

Hình 3.4 So sánh trình tự amino axit của gen ZmDREB2A tổng hợp 81

Hình 3.5 Kiểm tra đoạn gen ZmDREB2A-S trong vector pRTRA7/3 82

Hình 3.6 Kiểm tra cấu trúc ubi:: ZmDREB2A-S ::35S trong vector pCAMBIA1300 83

Hình 3.7 PCR kiểm tra sự có mặt của gen ZmDREB2A-S trong vi khuẩn A tumefaciens 83

Hình 3.8 Sơ đồ, cấu trúc vector pCAMBIA1300 mang gen ZmDREB2A-S 84

Hình 3.9 Phôi non nguồn K1 trên môi trường nuôi ủ CCM 85

Hình 3.10 Mô sẹo nguồn K1 trên môi trường phục hồi ReM 85

Hình 3.11 Mô sẹo nguồn K7 trên 86

Hình 3.12 Mô sẹo nguồn K7 trên môi trường chọn lọc 2 (SeM2) 86

Hình 3.13 Mô sẹo nguồn K7 phôi hoá trên môi trường tái sinh 1 (TS1) 87

Hình 3.14 Mô sẹo phôi hoá nguồn K1 trên môi trường tái sinh 2 (TS2) 87

Hình 3.15 Cây ngô chuyển gen nguồn K3 trên môi trường ra rễ 88

Hình 3.16 Cây chuyển gen T0 được ra ngôi trên giá thể dinh dưỡng 88

Hình 3.17 Cây chuyển gen T0 được trồng ra đất 89

Hình 3.18 Kết quả phân tích PCR sử dụng cặp mồi mồi vắt đặc hiệu cấu trúc chuyển gen Ubi-ZmDReb2A (350bp) của dòng K3 thế hệ T0 trên gel agarose 1% 90

Hình 3.19 Kết quả phân tích PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu ZmDreb2A (948bp) của dòng K3 thế hệ T0 trên gel agarose 1% 90

Hình 3.20 Kết quả so sánh trình tự gen ZmDREB2A từ cây chuyển gen dòng K7 với

trình tự gốc 92

Hình 3.21 Một phần kết quả giải trình tự gen chuyển ZmDREB2A 93

Hình 3.22 Một số dạng cây đột biến 94

Hình 3.23 Một số kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen ZmDReb2A (948 bp) của dòng K3 thế hệ T1 trên gel agarose 1% 98

Hình 3 24 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen ZmDREB2A (948bp) của dòng K7-3.3 thế hệ T2 trên gel agarose 1% 100

Hình 3.25 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen ZmDREB2A(948 bp) 103

thế hệ T3 cây K3-3.1.96(A) và K7-4.12.25(B) trên gel agarose 1% 103

Hình 3.26 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn promoter Ubi (1,4kb) trên gel agarose 1% 105

Hình 3 27 Một phần kết quả giải trình tự đoạn promoter Ubi thuộc nguồn K7-4-12.25 106 Hình 3.28 Kết quả giải trình tự đoạn Promoter Ubiquitin thuộc nguồn K7-4.12.25 106

Hình 3.29 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen đích ZmDREB2A (948bp) trên gel agarose 1% 107

Hình 3.30 Một phần kết quả giải trình tự đoạn gen ZmDREB2A của cây ngô chuyển gen nguồn K7-4.12.25 108

Hình 3.31 Kết quả so sánh trình tự gen ZmDREB2A từ nguồn K7-4.12.25 và trình tự gốc.109 Hình 3.32 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn terminator 35S (256bp) trên gel agarose 1% 110

Hình 3.33 Một phần kết quả giải trình tự đoạn 35S terminator bằng mồi 35S-F cây ngô chuyển gen nguồn K7-4.12.25 110

Hình 3.34 Kết quả so sánh đoạn 35 S terminator nguồn K7-4.12.25 và trình tự gốc 111

Hình 3.35a Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen đích ZmDREB2A 113

Hình 3.35b Điện di DNA tổng số sau khi xử lý với enzyme giới hạn 113

Hình 3.35c Kết quả Lai Southern với các nguồn dòng chuyển gen ZmDREB2A sử dụng mồi probe đặc hiệu PCR đoạn gen đích ZmDREB2A 113

Hình 3.36A Ảnh điện di RT-PCR mồi Actin dòng K3-4.18.32 116

Hình 3.36B Ảnh điện di RT-PCR mồi Actin dòng K7-4.12.25 116

Hình 3.37A Ảnh điện di RT-PCR mồi ZmDREB2A nguồn K3-4.18.32 118

Hình 3.37B Ảnh điện di RT-PCR mồi ZmDREB2A nguồn K7-4.12.25 118

Hình 3.38 Kết quả lai Western blot các cây ngô chuyển gen ZmDREB2A thế hệ T3 119

Hình 3.39 Hàm lượng chlorophyll a ở các cây thí nghiệm 121

Hình 3.40 Hàm lượng chlorophyll b ở các cây thí nghiệm 122

Hình 3.41 Tỉ lệ chlorophyll a/chlorophyll b ở các cây thí nghiệm 122

Hình 3.42 Hàm lượng proline của các cây chuyển gen ZmDREB2A và 124

Hình 3.43 Hàm lượng carbohydrate không cấu trúc của các nhóm cây thí nghiệm 126

Hình 3.44 Cây con trước khi xử lý hạn 128

Hình 3.45 Giai đoạn trước phục hồi 128

Hình 3.46 Giai đoạn sau phục hồi 130

Hình 3.47 Rễ của các dòng ngô sau khi xử lý phục hồi 7 ngày 131

Hình 3.48 Cây ngô K7 và K7-ZmDREB2A trong quá trình gây hạn 137

Hình 3.49 Các thời kỳ gây hạn 137

Hình 3.50 Các bắp ngô K7-ZmDrb2A và K7 ở 4 thời điểm gây hạn 143

Hình 3.51 Các bắp ngô K3-ZmDrb2A và K3 ở 4 thời điểm gây hạn 144

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TT Từ viết tắt Giải thích tiếng Anh Giải thích tiếng Việt

2 A thaliana Arabidopsis thaliana

3 A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

5 ABRE -ACGT ACGT-containing abscisic acid

responseelement

Phản ứng axit abscisic chứa ACGT

FAO Organization of the United

thiogalactopyranoside

29 ISAAA The International Service for the

Acquisition of Agri-biotech Applications

Dịch vụ Quốc tế Ứng dụng Công nghệ Sinh học Nông nghiệp Quốc

tế

cơ bản nuôi cấy vi khuẩn

giai đoạn phát triển muộn của phôi

phân tử

backcross

Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử sử dụng quần thể lai trở lại

indicator regression

Chọn lọc hồi quy nhờ chỉ thị phân tử

trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô

hợp

chỉnh

chain reaction

Phản ứng nhân bản ADN sao chép ngược

electrophoresis

polyacrylamide có chứa SDS

vào thực vật

Phi

D-galactopyranoside

chứa cao nấm men và manitol

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngô (Zea mays L.) là một trong ba loài lương thực quan trọng trên thế giới bên cạnh

lúa mì và lúa nước Mặc dù diện tích gieo trồng ngô chỉ đứng thứ ba trong số các cây ngũ cốc nhưng lại cho sản lượng thu hoạch cao nhất Ngô đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu, đồng thời là nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp như dược phẩm, thực phẩm và sản xuất nhiên liệu sinh học Theo thống kê sản xuất ngũ cốc năm 2018/2019 cho thấy sản lượng ngô đạt 1099.61 triệu tấn, đứng thứ 2 là sản lượng lúa mỳ đạt 734.74 triệu tấn, đứng thứ 3 là sản lượng lúa đạt 495.87 triệu tấn, tiếp sau lần lượt là lúa mạch, cao lương Hoa Kỳ là nước sản xuất gần một nửa lượng ngô của thế giới với sản lượng sản xuất năm 2018/2019 đạt 366.287 triệu tấn, tiếp theo sau là Trung Quốc với sản lượng 257.33 triệu tấn, Brazil 94.5 triệu tấn Sản xuất ngô ở nước ta hiện vẫn chưa tương xứng với tiềm năng, chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước Theo số liệu thống kê, năm 2018 nước ta vẫn phải nhập khẩu 8,436 triệu tấn ngô Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán kéo dài, lượng mưa không đều ở các vùng vào các thời điểm trong năm là một khó khăn lớn cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ Ngoài những tác động trực tiếp lên quá trình canh tác, biến đổi khí hậu còn làm thu hẹp diện tích sản xuất nông nghiệp Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên thường xuyên khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với nhiều loại cây trồng, trong đó có ngô

Hạn là một trong những nhân tố có ảnh hưởng lớn nhất tới năng suất trên phạm vi rộng lớn, có tính chất toàn cầu, cây ngô cũng không nằm ngoài tác động của hạn, nhất

là những vùng trồng ngô nhờ nước trời Có nhiều biện pháp tác động đến sự phát triển ngô trong điều kiện hạn như kỹ thuật canh tác, chọn tạo giống

Để giải quyết vấn đề trên thì chọn tạo giống ngô chịu hạn là một trong những giải pháp được các nhà khoa học đặt lên hàng đầu và có tính khả thi cao Cho đến nay chọn giống cây trồng chịu hạn nói chung và cây ngô nói riêng được thực hiện theo 3 hướng chủ yếu: 1) Chọc lọc trực tiếp trên đồng ruộng; 2) Chọn lọc truyền thống phối hợp chỉ thị phân tử; 3) Chuyển gen chịu hạn

Các giống cây trồng chịu hạn được sử dụng trong sản xuất trước đây hầu hết được lai tạo bằng các phương pháp chọn giống truyền thống, nhược điểm của phương pháp này là rất tốn kém về thời gian và kinh phí, rất ít giống cây trồng chịu hạn được tạo ra bằng phương pháp Công nghệ Sinh học Hiện nay, các phương pháp chọn giống chịu hạn đang được các nhà khoa học quan tâm sử dụng là chọn giống dựa vào chỉ thị phân

tử (MAS), lập bản đồ QTLs và chọn giống chuyển gen Tính trạng chịu hạn là tính trạng

đa gen (do rất nhiều gen quy định), vì vậy định hướng chọn giống phân tử đang gặp khó khăn lớn trong việc quy tụ các tính trạng, gen quan trọng liên quan đến chịu hạn Gần đây, dựa trên những thành tựu của chương trình nghiên cứu chức năng hệ gen thực vật các nhà khoa học đã phát hiện và chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen mã hóa yếu tố phiên mã (Transcription factor) trong việc tăng cường tính chịu hạn ở thực vật Nhóm gen mã hóa yếu tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào phản ứng đáp ứng với điều kiện hạn ở thực vật nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò kích hoạt

sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cường khả năng chịu hạn ở thực vật Phát hiện này đã mở ra một hướng nghiên cứu rất mới cho lĩnh vực chọn giống chuyển gen ở thực vật, đó là chỉ cần chuyển

1 hay 1 vài gen mã hóa yếu tố phiên mã thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cường tính chống chịu bất lợi môi trường của cây trồng

DREB (Dehydration Responsive Binding protein) là gen tăng cường khả năng

chịu hạn được biết đến trong nhóm các nhân tố khởi đầu phiên mã tham gia điều khiển

tính chịu hạn: DREB, AREB, NAC, MYB, MYC, bZIP, WRKY Ngày nay, đã có một số nhà nghiên cứu phân tích đánh giá gen tăng cường khả năng chịu hạn (DREB) trên một

số đối tượng thực vật Arabidopsis, ngô, lúa, đậu tương, bông

Gen ZmDREB2A cũng đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính chi tiết ở ngô Không giống như gen DREB2A của Arabidopsis, gen ZmDREB2A tạo ra hai dạng phiên

mã và qua phân tích RT- PCR thì chỉ có dạng phiên mã có hoạt tính được sinh ra trong điều kiện hạn Ngoài ra, thí nghiệm phân tích hoạt hoá phiên mã (transactivation assay)

ở tế bào trần Arabidopsis đã chứng tỏ ZmDREB2A có hoạt tính hoạt hoá quá trình phiên

mã mạnh hơn nhiều DREB2A Điều này chứng tỏ quá trình sửa đổi sau dịch mã là không

cần thiết trong việc tạo ra protein hoạt tính trong trường hợp gen ZmDREB2A Sự biểu hiện liên tục của ZmDREB2A làm tăng đáng kể khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen Kết quả này cho thấy có sự khác nhau về cơ chế điều khiển tính chịu hạn trong cùng nhóm gen giữa cây mô hình hai lá mầm (Arabidopsis) và cây một lá mầm

Ở Việt Nam, chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào cây ngô đã được tập trung nghiên cứu trong những năm gần đây Tuy nhiên, những nghiên cứu về biểu hiện gen trong các cây chuyển gen chịu hạn còn ít được đề cập đến Xuất phát từ những lý

do trên đề tài “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hoá nhân tố phiên mã ZmDREB2A

nhằm tăng cường tính chịu hạn ở một số dòng ngô Việt Nam” được thực hiện

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tạo được dòng ngô chuyển gen mang cấu trúc gen ZmDREB2A;

- Xác định sự có mặt, sự ổn định qua các thế hệ và biểu hiện của gen ZmDREB2A

trên các vật liệu được chuyển gen ở mức phân tử;

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng cây ngô chuyển gen mang cấu trúc

gen ZmDREB2A ở điều kiện hạn nhân tạo

3 Đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống từ biến nạp cấu trúc vector chứa

gen ZmDREB2A vào ba dòng ngô K1, K3, K7 đến đánh giá biểu hiện gen ZmDREB2A

liên quan đến tính chịu hạn cây ngô Việt Nam;

Ứng dụng kỹ thuật PCR, RT-PCR, southern blot, đánh giá hạn nhân tạo, phân tích sinh lý, sinh hoá…đã đánh giá được sự có mặt, tính ổn định và biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được dòng ngô chuyển gen mang gen

tổ hợp ZmDREB2A và biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển ZmDREB2A trên cây ngô

Kết quả tạo cây ngô chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây ngô ở Việt Nam

Về mặt thực tiễn:

Việc tạo ra các dòng ngô chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn so với dòng đối chứng đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen đối với các loại cây trồng khác nhau nhằm nâng cao tính chịu hạn

Các dòng ngô chuyển gen có khả năng chịu hạn là nguồn vật liệu khởi đầu cho việc tạo các giống ngô chuyển gen chịu hạn trong nước

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tác động của hạn đến sinh trưởng và phát triển cây ngô

1.1.1 Khái niệm hạn

Bất cứ một cây trồng nào cũng cần phải có nước để duy trì sự sống Mức độ cần nhiều hay ít phụ thuộc vào từng loại cây trồng và từng giai đoạn phát triển của chúng Hạn đối với thực vật là khái niệm chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt

cả quá trình sống hay từng giai đoạn, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau: chết, chậm phát triển hay phát triển bình thường Những cây trồng phát triển bình thường trong điều kiện khô hạn gọi là “cây chịu hạn” và khả năng có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là “tính chịu hạn”

Tuy nhiên, khó có thể xác định được thế nào là trạng thái hạn đặc trưng vì mức

độ khô hạn do môi trường gây nên khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng vùng địa

lý và không thể dự đoán trước được Mức độ khô hạn do môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây, nhẹ thì giảm năng suất, nặng thì có thể dẫn đến tình trạng huỷ hoại cây, mùa màng

Các yếu tố gây hạn của môi trường như thành phần thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ cao, gió nóng.v.v đã gây nên hiện tượng thiếu nước của cây, nguyên nhân chính do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa cây và môi trường, dẫn đến sự thiếu hụt nước của tế bào Trong trường hợp này, tác động của môi trường bên ngoài rất lớn, gây ảnh hưởng đáng kể lên sự phát triển của cây Thông thường, hạn được phân biệt thành

3 loại là hạn không khí, hạn đất và hạn toàn diện [39]

1.1.1.1 Hạn không khí

Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (39-42oC) và độ ẩm thấp (<65%) Hiện tượng này thường gặp ở những tỉnh miền Trung nước ta vào những đợt gió Lào và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu, đầu đông Hạn không khí còn xuất hiện ở một

số nước trên thế giới như gió Chamsin ở Israel; gió Mistral ở miền nam nước Pháp đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến một số loại cây trồng như phong lan, cam, chanh, đậu tương

Hạn không khí ảnh hưởng trực tiếp lên các bộ phận của cây như hoa, lá, chồi non, nhất là ảnh hưởng đến quá trình tung phấn của cây Đối với thực vật trong đó có cây ngô thì hạn không khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời vì nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, làm cho mức độ thoát hơi nước nhanh vượt qua mức độ bình thường, lúc đó rễ hút nước không đủ để bù lại lượng nước mất, cây lâm vào tình trạng mất cân bằng về nước Nước cũng là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá hoá sinh, là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra [163] Vì vậy, việc cung cấp đủ nước cho cây chính là một biện pháp canh tác quan trọng Hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là một trong những mục tiêu của các nhà chọn tạo giống

Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trình sinh trưởng của cây Thiếu nước nhẹ thì làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, làm tăng quá trình già hoá tế bào Khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào mô bị tổn thương và chết

1.1.1.2 Hạn đất

Mức độ khô hạn của đất tuỳ thuộc vào sự bốc hơi nước trên bề mặt và khả năng giữ nước của đất Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến mức cây không cạnh tranh được nước của đất và làm cho cây không thể lấy nước vào tế bào qua

rễ, vì thế hạn đất có thể gây ra cho cây héo lâu dài Hạn đất tác động trực tiếp đến bộ phận rễ của cây làm ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng Đối với các loại cây trồng cạn, hạn đất cũng ảnh hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn gieo hạt và nảy mầm Lượng nước trong đất không đủ sẽ làm cho mầm héo, nếu thiếu nước nặng sẽ gây thui chột mầm và chết

1.1.1.3 Hạn toàn diện

Hạn toàn diện là hiện tượng hạn đất và hạn không khí xảy ra đồng thời Trong trường hợp này, cùng với sự mất nước do không khí làm cho hàm lượng nước trong lá giảm nhanh dẫn đến nồng độ dịch bào tăng lên, mặc dù sức hút nước từ rễ của cây cũng tăng nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt không đủ cung cấp cho cây Hạn toàn diện thường dẫn đến hiện tượng héo vĩnh viễn, cây không có khả năng phục hồi Ở nước ta hạn toàn diện thường xảy ra ở các tỉnh miền Trung (Nghệ An, Hà Tĩnh), gây nên thiệt hại đáng kể đến năng suất cây trồng trong đó có cây ngô

1.1.2 Tác động của hạn đến sinh trưởng và phát triển cây ngô

Trong môi trường canh tác cây trồng cạn nói chung và cây ngô nói riêng thì hạn

là yếu tố tác động mạnh nhất tới sinh trưởng và phát triển của cây ngô chỉ sau yếu tố dinh dưỡng Hạn tác động lên quá trình sản xuất ngô, làm giảm năng suất trung bình 17%, ở những vùng nhiệt đới thấp có thể giảm tới 40% thậm chí lên tới trên 70% [131]

Trong điều kiện hạn, các tính trạng hình thái, sinh lý của cây ngô bị biến đổi, mức

độ biến đổi phụ thuộc vào vùng sinh thái, cường độ tác động, nguồn vật liệu Cây ngô tương đối mẫn cảm với hạn, bị ảnh hưởng ở mọi giai đoạn sinh trưởng, phát triển Tuy nhiên, giai đoạn trước và sau trỗ bị ảnh hưởng mạnh nhất dẫn tới làm giảm năng suất [116]

Trong điều kiện hạn, phản ứng của cây ngô có một số thay đổi như: i) nẩy mầm chậm và tỷ lệ mọc thấp; ii) giảm kích thước cây, một số bộ phận phát triển không đầy đủ; iii) khí khổng đóng, quá trình quang hợp giảm thậm trí ngừng trệ do hệ thống enzyme

bị phá huỷ; iv) giảm quá trình đồng hoá dinh dưỡng, kéo dài thời gian chênh lệch trong tung phấn phun râu, ngô con phát triển nhưng vô hiệu, giảm năng suất; v) trong điều kiện hạn nhẹ sẽ tăng tỷ lệ rễ/chồi, trong điều kiện hạn nặng, hệ rễ kém phát triển, quá trình hấp thụ dinh dưỡng trở nên khó khăn, quá trình vận chuyển ở thân bị ngừng trệ, tích luỹ dinh dưỡng ở hạt kém [116]

Các nhà khoa học trên thế giới đã đánh giá khả năng chịu hạn trên cây ngô đều cho rằng, nếu bị hạn trước khi trỗ cờ năng suất giảm 25%, còn bị hạn ở giai đoạn trỗ cờ thì năng suất giảm 50% và sau trỗ cờ là 21% Các tính trạng bị ảnh hưởng nhiều là chiều cao cây, kích thước lá, năng suất sinh học, số hạt trên bắp, kích thước bắp và khối lượng

1000 hạt Các tính trạng tương quan nghịch với năng suất trong điều kiện hạn là: cao cây, năng suất sinh học, khoảng cách tung phấn – phun râu (ASI: Anthesis-Silking Interval), chiều dài bắp, số hạt trên hàng, số bắp trên cây Dẫn liệu trên cho thấy hạn là yếu tố phi sinh học có tác động mạnh tới năng suất cây ngô [116] Tóm lại, hạn ảnh hưởng tới toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của cây ngô dẫn đến năng suất giảm

1.2 Ảnh hưởng của hạn đối với sản xuất ngô

1.2.1 Ảnh hưởng của hạn đối với sản xuất ngô trên thế giới

Biến đổi khí hậu đã diễn ra trên toàn cầu, ngày càng phức tạp và khó dự đoán hơn Các hiện tượng thời tiết cực đoan ngày càng tăng cả về cường độ và quy mô [152],

dự báo ảnh hưởng nghiêm trọng đến toàn cầu 70% lượng nước ngọt trên toàn cầu hiện nay được sử dụng cho nông nghiệp và điều này làm ảnh hưởng đến nguồn nước trong tương lai, khi dân số tăng lên 30% tương đương 9 tỷ người vào năm 2050 [60]

Theo Tổ chức Quản lý Hạn - NDMP (2011), khi tổng hợp các điều kiện khí hậu,

dự báo sẽ xuất hiện những hiện tượng thời tiết cực đoan như rất lạnh trong mùa đông, rất nóng ở nhiều vùng vào mùa hè, hay thay đổi về cường độ cũng như phân bổ lượng mưa trên nhiều vùng của thế giới, phổ biến là biểu hiện của sự hạn chế về nước Theo Matthew và cộng sự [114], dự báo đến năm 2050, tình trạng thiếu nước nghiêm trọng ở ngũ cốc sẽ tăng từ 18 - 25% Điều này cũng được Ngân hàng Phát triển Châu Á (ADB) báo cáo, nếu xu hướng biến đổi khí hậu đến năm 2050 sẽ ảnh hưởng đến sản lượng của những cây trồng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, đặc biệt Nam Á: ngô giảm 17%, lúa mì giảm 12%, gạo giảm 10% do biến đổi khí hậu gây ra bởi thời tiết cực đoan

Theo CIMMYT, bất thuận phi sinh học gây suy giảm năng suất, trong đó hạn là một trong những yếu tố chính Theo thống kê, thiệt hại hàng năm của sản lượng ngô thế giới bởi hạn là lớn, năm 1992 thiệt hại 19,0 triệu tấn ngô (15%) năm 1997 thiệt hại 20,4 triệu tấn (17%), năm 2002 thiệt hại 24 triệu tấn [53] Theo ISAAA, năm 2012 tổng sản lượng ngô giảm 15%, năng suất giảm 21% bởi hạn gây ra, tương đương với 120 triệu tấn ngũ cốc, hạn gây thiệt hại bình quân 8%/năm tổng sản lượng ngô thế giới trong 20 năm (từ năm 1985 - 2005) [58], [83] Dự báo đến năm 2025, những vùng bán khô hạn

và khô hạn sẽ chịu ảnh hưởng nhiều hơn của biến đổi khí hậu, cả về thời gian, không gian, sẽ thường xuyên phải đối mặt với khô hạn trầm trọng hơn; nhiều diện tích đất bị khô hạn mới sẽ xuất hiện, hay mở rộng thêm trên khắp các châu lục, trong đó phần lớn tập trung ở châu Phi và châu Á

Các tác động trước mắt và lâu dài của biến đổi khí hậu đang đe dọa đến hầu hết

160 triệu ha ngô trên toàn cầu [58] Hạn ảnh hưởng đến sản xuất ngô ở một số nước, như ở Mỹ năm 1934 hạn xảy ra trên diện rộng bao phủ gần 80% diện tích Năm 2012 ảnh hưởng của hạn được cho là cao hơn nhiều và tồi tệ nhất trong 50 năm qua, tác động đến 26 trong 52 tiểu bang, chiếm ít nhất 55% diện tích [83] Do hạn hán nên sản lượng

ngô của Mỹ năm 2012 chỉ đạt 273,8 triệu tấn, giảm 13% so với năm 2011 (313,9 triệu tấn) Cũng trong niên vụ năm 2011/2012, sản lượng ngô của Argentina đạt 21,4 triệu tấn, giảm 23,0 triệu tấn, Brazil đạt 59,2 triệu tấn ngô, giảm 4,3% Niên vụ 2013/14 hạn xảy ra trên diện rộng tại Nam Mỹ, gây thiệt hại lên đến 19,8 triệu tấn, đặc biệt Argentina khoảng 0,7 triệu ha đã bị ảnh hưởng nặng nề [166]

Nguồn: [166]

Hình 1.1 Các vùng trồng ngô của Mỹ bị ảnh hưởng của hạn hán

Khoảng 50% diện tích trồng ngô ở Đông Nam Á bị ảnh hưởng xấu bởi hạn [53]

Ở nhiều vùng ngô tại Trung Quốc, 9,3 - 35,1% tổng diện tích trồng bị ảnh hưởng bởi hạn Năm 2009 mặc dù diện tích tăng 2,3 triệu ha so với năm 2008, nhưng sản lượng giảm 1,9 triệu tấn, mà nguyên nhân chính là hạn xảy ra trên 22,7 triệu ha ngô [169] Ở Bắc Triều Tiên, hạn nghiêm trọng đã tác động trên 17 % tổng diện tích Ở Nam và Đông Nam Á, 80% diện tích bị ảnh hưởng do ngô được trồng ở điều kiện nước trời Trong báo cáo của Ngân hàng Phát triển Châu Á (2012), vùng Nam Á đã bị ảnh hưởng nặng nề bởi các hiệu ứng biến đổi khí hậu, sản lượng ngô giảm 6 - 23% [53]

Hạn ở châu Phi gây thiệt hại 15% sản lượng ngô, như năm 1992 - 1993 hạn gây thiệt hại 12,5 - 23,5 triệu tấn Tính riêng Nam Phi là vùng sản xuất nhiều ngô song cũng chịu ảnh hưởng của hạn thiệt hại lên tới khoảng 14% (tương đương 11,5 triệu tấn) [58]

Dự đoán hạn làm giảm khoảng 10% sản lượng ngô đến năm 2050 ở các tiểu vùng Sahara châu Phi và Mỹ Latinh [158]

Nguồn: [175]

Hình 1.2 Năng suất ngô ở cận Sahara Châu Phi, Châu Mĩ Latinh và Nam Phi

bị ảnh hưởng bởi hạn, giai đoạn 1960 - 2010

Có ba khu vực năng suất ngô phụ thuộc vào nước trời: tiểu vùng Sahara châu Phi, Nam Á và Mỹ La tinh, năng suất chênh lệch đáng kể giữa các vùng, tương ứng 1,2 tấn/ha, 2,1 tấn/ha và 3,2 tấn/ha (Hình 1.2) [175] Ở Châu Âu từ năm 2009-2011 năng suất trung bình giảm 12,5% do nhiệt độ tăng cao và hạn [58] Theo Ủy ban châu Âu, hạn ở Nam và Đông Âu đã làm suy giảm 1,6% năng suất ngô trong 5 năm (2001-2006), đặc biệt là sản xuất ngô ở Bulgaria giảm 40% trong vụ mùa niên vụ 2006/2007 Năm 2012, Ủy ban Nghiên cứu chiến lược ngũ cốc báo cáo, sản lượng ngô hạt đạt 58,1 triệu tấn (giảm 13%)

so với năm 2011 Sven đã nhận định, có 10 quốc gia trên thế giới chịu ảnh hưởng biến đổi khí hậu nhiều nhất bao gồm: Honduras, Myanmar, Nicaragoa, Bangladesh, Haiti, Việt Nam, Triều Tiên, Pakistan, Thái Lan, Cộng hòa Dominica và nhiều vùng rộng lớn khác thường xuyên bị hạn hay ngập úng (Hình 1.3) [152]

Nguồn: [152]

Hình 1.3 Bản đồ chỉ số rủi ro toàn cầu thế giới 1992 – 2011

Như vậy, hạn đã ảnh hưởng, gây thiệt hại đến năng suất và sản lượng ngô trên toàn thế giới Do đó, nhu cầu giống ngô chịu hạn có tiềm năng năng suất cao cho vùng nước trời và những vùng không thuận lợi tưới tiêu là một đòi hỏi cấp thiết nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng nước, ổn định sản xuất, tăng sản lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng lớn

về ngô

1.2.2 Ảnh hưởng của hạn đến sản xuất ngô ở Việt Nam

Ở Việt Nam có khoảng 0,3 triệu ha ngô dễ có nguy cơ thiếu nước vào thời kỳ tung phấn phun râu, có thể bị thiệt hại tới 0,5 - 0,7 triệu tấn ngô hạt Cơ cấu mùa vụ của mỗi vùng cũng cho thấy sự khác nhau, đặc biệt là phía Bắc và Bắc Trung Bộ, khoảng 80% được trồng trong điều kiện phụ thuộc nước trời [5] Hạn là yếu tố chính ảnh hưởng đến sản xuất ngô ở Việt Nam, đặc biệt 80% ngô được trồng phụ thuộc vào nước trời, trong

đó 60% chủ yếu ở khu vực miền núi, nơi có nguy cơ gặp hạn rất cao Hàng năm thiệt hại do hạn khoảng 30% đặc biệt là những vùng thường xuyên bị hạn nặng bao như BắcTrung Bộ, Duyên Hải Nam Trung Bộ, Tây Nguyên Các vùng nguy cơ gặp hạn là ở vùng Tây Bắc, Đông Bắc, Tây Nam Bộ và Đồng bằng Sông Cửu Long

Diện tích Tác động bất thuận

TT Vùng

Thời vụ (Thời gian gieo trồng)

1.000 ha (năm 2015)

Giai đoạn cây con

Giai đoạn trước và trong khi thụ phấn

Sau thụ phấn, đến thu hoạch

4 Bắc Trung Bộ Xuân (tháng 1 - 2)

91,3

134,6

Úng Úng Hạn-Lạnh Úng Hạn Hạn-Lạnh

Hạn Nóng Đất quá

ẩm Đông (tháng 10) Đủ

đặc biệt quan tâm Khả năng xảy ra hạn ở cả 8 vùng miền (Bảng 1.1) [22]:

+ Hạn nặng và thường xuyên diễn ra ở 3 vùng (Bắc Trung Bộ, Duyên Hải Nam Trung Bộ, Tây Nguyên)

+ Hạn nhiều ở 4 vùng (Tây Bắc, Đông Bắc, Tây Nam Bộ và Đồng bằng Sông Cửu Long), hạn nhẹ ở vùng Đồng bằng Sông Hồng [156]

Diễn biến hạn ở mỗi vùng, trong mỗi mùa vụ là khác nhau và khó dự báo Theo thống kê, từ năm 1960 - 2010 có 36 năm hạn với mức độ khác nhau, chiếm 75%, trong

đó, có 13 năm với hạn xảy ra vào mùa Xuân, 11 năm với hạn xảy ra vào mùa Thu và 11 năm với hạn xảy ra trong mùa Đông, 12 năm với hạn xảy ra trong mùa Hè Trong 55 năm qua, hạn trên diện rộng vào vụ Đông Xuân chiếm 22%; vụ Hè Thu chiếm 12%, trong đó trên 60 % hạn vụ Đông Xuân và trên 80% hạn vụ Hè Thu có liên quan đến El-nino, đặc biệt các vụ Đông Xuân 1962-1963, 1976-1977, 1982-1983, 1997-1998 và các vụ Hè Thu

1963, 1977, 1983, và 1998 là các năm có El-nino gây hạn nặng

Mặc dù nước ta có nguồn tài nguyên nước phong phú, nhưng khoảng 63% nguồn nước lại bắt nguồn từ ngoài lãnh thổ và mùa khô kéo dài 6 – 7 tháng, nên nhiều vùng không chủ động về nước hoặc thiếu nước nghiêm trọng Từ năm 1960 đến 2006, có tới 34/46 năm bị hạn, đặc biệt tình hình hạn ngày càng trầm trọng hơn Cũng theo kết quả thống kê năm 1990 đến 2010, khí hậu Việt Nam có nhiều biến đổi,mùa khô được là khô hơn vào các tháng 2 - 4, lượng mưa giảm nhiều hơn đặc biệt ở phía Nam, phần lớn lượng mưa giảm trong tháng 7 - 8, trong khi đó nhu cầu về nước năm 2010 tăng 11-12 % so với năm 2000, dự tính đến năm 2020 tăng 12 % so với năm 2010 Việt Nam là một trong năm quốc gia bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi biến đổi khí hậu [156], [152] Hiện tượng El- nino xảy ra năm 2015 được ghi nhận là mạnh nhất kể từ năm 1998 và có thể nằm trong

số 3 đợt mạnh nhất trong lịch sử và đã diễn biến đến hết tháng 6 năm 2016 Hạn đã xảy

ra và ảnh hưởng nghiêm trọng, gần 40.000 ha đất nông nghiệp phải dừng sản xuất do thiếu nước, diện tích cây trồng bị hạn lên tới 122.000 ha Nguyên nhân là lượng mưa khu vực Nam Trung Bộ thiếu hụt 30-50% so với trung bình nhiều năm, khu vực Tây Nguyên và Đông Nam Bộ thiếu hụt 10-20%, về lượng dòng chảy, ở Bắc Bộ thấp hơn trung bình nhiều năm từ 20-70%, ở Trung Bộ và Tây Nguyên thiếu hụt 20-60%, có nơi đến hơn 80% như Nghệ An và Khánh Hòa [22]

Xu thế khí hậu ở Việt Nam trong những năm tới: 1) Tăng lượng mưa trong mùa mưa và thấp hơn vào mùa khô; 2) Hạn sẽ phát sinh hàng năm ở hầu hết các khu vực của Việt Nam; 3) Ngày mưa phùn mùa xuân giảm đáng kể; 4) Lũ đặc biệt lớn có thể xảy ra thường xuyên hơn ở các khu vực miền Trung và miền Nam; 5) Số ngày nóng nhiều hơn

và nhiệt độ cao hơn; 6) Đặc biệt là mưa trái mùa và lượng mưa bất thường xảy ra nhiều hơn Theo dự báo, tổng lượng nước vào năm 2025 chỉ bằng khoảng 96% so với hiện nay, đến năm 2030 các nguồn nước có dòng chảy sẽ giảm (2,4% ở thượng nguồn; 2,9% vùng đồng bằng; 1,9% lưu vực Sông Hồng) và 50 năm nữa sẽ bị thiếu nước trầm trọng

Do đó, công tác tạo giống cần được trú trọng và tập trung chủ yếu chọn tạo những giống ngô lai có khả năng chịu hạn, năng suất cao, ổn định là một trong những trọng tâm có tính quyết định giữ vững và nâng cao sản lượng ngô Việt Nam

1.3 Tình hình nghiên cứu giống ngô chịu hạn

1.3.1 Tình hình nghiên cứu, sử dụng giống ngô chịu hạn trên thế giới

Một số nhà khoa học đã tổng kết trong quá trình tạo giống chịu hạn từ năm 2008, khi so sánh một số phương pháp chọn tạo giống với năng suất thí nghiệm khởi điểm là

3 tấn/ha cho thấy: Nếu theo phương pháp truyền thống thì năng suất cải thiện 50kg/ha/năm (tương ứng 1,4%/năm); nếu chọn giống có sự hỗ trợ của chọn lọc chỉ thị phân tử (MAS) thì năng suất cải thiện thêm 20kg/ha/năm (tương ứng 0,6%); phương pháp chuyển gen chịu hạn cải thiện 30kg/ha/năm (tương ứng 0,7%/năm) Dự đoán trong hai thập kỷ tới, kỳ vọng cải thiện năng suất ngô chịu hạn theo phương pháp truyền thống

là 1,4%, kết hợp phương pháp truyền thống với MAS là 2%, kết hợp phương pháp truyền thống với MAS và chuyển gen chịu hạn là 2,7%, tuy nhiên biểu hiện chính xác của kiểu hình ở đồng ruộng là rất cần thiết cho những tiến bộ di truyền [58].Việc cải thiện và phát triển các phương pháp lựa chọn vật liệu phù hợp với điều kiện bất thuận là rất quan trọng Vì vậy, để cải thiện khả năng chịu bất thuận phi sinh học của giống cây trồng (hạn, nhiệt độ cao, độ mặn, ngập nước) phải có sự hợp tác giữa các nhà tạo giống và các nhà khoa học khác trong lĩnh vực sinh lý học, khoa học đất, sinh học phân tử Từ đó có

sự hiểu rõ cơ chế kháng/chịu bất thuận và những yếu tố quyết định kháng bền vững của cây trồng là căn cứ để chọn tạo những giống cây trồng có năng suất ổn định hơn giữa các vùng

Một số nghiên cứu cho thấy sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử trong phương pháp lai trở lại (hồi giao) của QTL từ một dòng chịu hạn đã cải thiện khả năng chịu hạn cho một số vật liệu khác nhau [131] Từ 2005, CIMMYT thực hiện các dự án DTMA và WEMA đã tạo ra một cơ sở dữ liệu bao gồm 5.000 dòng từ 27 quần thể liên quan với nhau cung cấp một nền tảng vững chắc cho các nghiên cứu di truyền về khả năng chịu hạn ở ngô nhiệt đới phục vụ cho chọn tạo những cặp lai chịu hạn trong những năm tới [58]

Nghiên cứu khoa học và ứng dụng vào sản xuất ngô, trong đó ứng dụng công nghệ sinh học cho chọn tạo giống ngô chịu hạn đã đạt được nhiều thành tựu Bằng hỗ trợ chọn lọc chỉ thị phân tử hồi quy (MASR) và chọn lọc chỉ thị phân tử trong hồi giao

(MASBC) đã xác định sự có mặt một số gen quy định khả năng chịu hạn (gen C4-PEPC,

NPK1, betA, ZmNF-YB2, cspB, ZmPLC1 và TsVP) có mặt trong hai dòng ngô CML247

và CML176, sau đó các con lai từ 2 dòng này đã được cải tạo khả năng chịu hạn và đang được phát triển tại Châu Phi Một số nhà khoa học ở Đông Phi đã sử dụng 10 dòng tham gia tạo giống lai chịu hạn, kết quả có 04 giống ngô chịu hạn (UH5354, UH 5355, WE

2114 và WE 2115) đã được phát triển ở Uganda, ba giống ở Kenya, trong đó ba giống đang phổ biến ở Tanzania Dự án "Ngô chịu hạn cho Châu Phi" [53], đã khai thác, phát triển phổ biến 34 giống ngô chịu hạn mới cho nông dân ở 13 quốc tham gia dự án bao gồm: Angola, Benin, Ethiopia, Ghana, Kenya, Malawi, Mali, Mozambique, Nigeria, Tanzania, Uganda, Zambia, Zimbabuwe Kết quả cho thấy, có khoảng 2 triệu hộ nông dân đang sử dụng các giống ngô chịu hạn và thu được năng suất cao hơn và đã cải thiện

an ninh lương thực, tăng thu nhập Những kết quả đó, có sự đóng góp quan trọng của tiến bộ về công nghệ sinh học

Gần đây, các chuyên gia nghiên cứu ngô cho rằng sự kết hợp công nghệ đơn bội kép (DH) để tạo dòng thuần dòng thuần và hệ genome (GWAS) có liên quan đến độ chính xác dựa trên kiểu hình ở điều kiện đồng ruộng, có thể tăng lợi ích di truyền về năng suất và khả năng chịu hạn [58] Những kỹ thuật này sẽ được sử dụng rộng rãi hơn nữa trong tương lai bởi dễ thực hiện hơn, rút ngắn thời gian, chi phí rẻ và hệ thống đánh giá chính xác kiểu hình đã đạt được tiến bộ đáng kể [106], [179] Nghiên cứu đặc tính của gen chức năng hoặc các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen liên quan đến tính chịu hạn là một bước quan trọng ứng dụng chọn lọc kiểu gen trong cải tiến giống cây trồng

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngô chịu hạn ở Việt Nam

Nghiên cứu chọn tạo giống ngô chịu hạn ở Việt Nam đã có những chuyển biến thực

sự từ năm 1990 đến nay Thời gian đầu, một số tác giả tập trung nghiên cứu tính chịu hạn của các vật liệu giống ngô thụ phấn tự do và nhận định: Có sự biến động về tính chịu hạn giữa các vật liệu giống thụ phấn tự do Một số phương pháp xác định tính chịu hạn đã được tiến hành trong phòng thí nghiệm (nồng độ diệp lục, hàm lượng nước trong lá, khả năng phục hồi thân lá và bộ rễ); chỉ số tương đối về chịu hạn đã được trình bày trên đồ thị hình lá

Giai đoạn sau (1988-1998), một số nghiên cứu về tính chịu hạn được nghiên cứu toàn diện hơn từ giai đoạn cây con cho đến sau trỗ, đánh giá dòng ở mật độ cao, chênh lệch thời gian tung phấn – phun râu (ASI), số lá xanh của các giống lai Một số nghiên cứu đánh giá tính chịu hạn về một số dòng ngô cho thấy hạn gây héo lá ở thời kỳ 3 lá, 5

lá, chiều dài đuôi chuột và chênh lệch tung phấn phun râu nên làm giảm năng suất, các đặc điểm bộ rễ như thể tích bộ rễ, chiều dài bộ rễ, trọng lượng tươi - khô bộ rễ có tương quan đến năng suất [5] Nghiên cứu chịu hạn ở ngô thực phẩm (ngô nếp) gần đây cũng được quan tâm, kết quả nghiên cứu trên 6 dòng ngô nếp và 15 tổ hợp lai cho thấy hạn ở thời kỳ trước trỗ (giai đoạn 7 - 9 lá) ảnh hưởng nhiều đến năng suất, chất lượng, trong khi hạn ở giai đoạn chín sáp là ít ảnh hưởng [3] Đã có một số công trình nghiên cứu gen

tham gia quy định tính chịu hạn - gen dehydrin (Dhn) ở ngô, kết quả đã phân lập, xác định trình tự và tinh sạch protein dehydrin 1 từ dòng ngô chịu hạn H36 của gen Dhn1

[55] Nhờ ứng dụng của công nghệ sinh học đã xác định được một số chỉ thị phân tử đặc trưng cho tính chịu hạn như chỉ thị Csu20 trên nhiễm sắc thể (NST) số 1 và chỉ thị Bnl

6, 29c trên NST số 2 1iên kết với gen quy định tính trạng chênh lệch thời gian tung phấn – phun râu Tính trạng chiều dài bắp đã được xác định bởi chỉ thị M16 trên NST số 1 và chỉ thị M28 trên NST số 2 [21] Liên tục từ năm 2013 đến nay, Việt Nam tham gia dự

án phát triển ngô thích ứng với biến đổi khí hậu cho vùng Đông Nam Á Qua đó Việt Nam đã tiếp cận và thực hiện phương pháp nghiên cứu tính chịu hạn của ngô trên đồng ruộng Cho đến nay, một số giống ngô chịu hạn tốt đã được đưa vào sản xuất như: VN8960, LVN145 (AG59), LVN885, LVN092, LCH9, VS36

Như vậy, nghiên cứu về khả năng chịu hạn của ngô ở Việt Nam từ 1990 đã đạt được kết quả quan trọng, từ đánh giá kiểu hình, sinh lý, sinh hóa Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học đã góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu về khả năng chịu hạn, gia tăng những vật liệu ưu tú để phục vụ chọn tạo giống ngô Từ đó, cho thấy sự kết hợp phương pháp truyền thống và công nghệ sinh học là cơ sở vững trắc trong nghiên cứu chọn tạo giống ngô chịu hạn ở nước ta

1.4 Cơ chế sinh lý, sinh hóa liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật

1.4.1 Cơ chế phân tử trong phản ứng với hạn ở thực vật

Ở thực vật, nước chiếm đến 80-95 % sinh khối Nước là trung tâm của tất cả các quá trình sinh lý trong thực vật Ở mức tế bào nước là phương tiện vận chuyển, chuyển hóa các chất và dinh dưỡng Vì vậy, khi tình trạng nước bị mất cân bằng, các quá trình trao đổi chất trong tế bào bị ảnh hưởng tác động tiêu cực đến sự tăng trưởng và phát triển của thực vật Trong nông nghiệp việc mất cân bằng này được gọi là hạn đã làm ảnh hưởng rất nhiều đến việc sản xuất nông nghiệp khi làm giảm một cách đáng kể năng suất cây trồng

Có rất nhiều nghiên cứu về cơ chế phân tử liên quan đến đáp ứng điều kiện hạn

ở thực vật Đó là phản ứng phân tử với sự mất nước, từ sự cảm nhận và báo hiệu đến việc điều tiết biểu hiện gen nhằm đáp ứng với điều kiện hạn Sự mất nước kích hoạt một loạt các phản ứng ở tế bào nhằm bảo vệ ngăn ngừa hoặc sửa chữa các hư hỏng gây ra do mất nước Sự chuyển động của các phân tử nước phụ thuộc vào gradient nồng độ Do

đó bị ảnh hưởng bởi nồng độ của các phân tử chất tan ở trong và ngoài tế bào thực vật

Sự thay đổi lượng nước ngoại bào tạo ra việc vận chuyển nước qua màng cùng với các chất hòa tan làm thay đổi cấu trúc tế bào, thay đổi thành phần tế bào chất và điều chỉnh hoạt động của tế bào [124]

Phản ứng chống chịu hạn của thực vật được thực hiện thông qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp Sự cảm ứng này cho phép các tế bào có sự phản ứng và thích nghi với

sự thay đổi về lượng nước của môi trường bằng cách thay đổi việc vận chuyển các chất, kích hoạt phiên mã, dịch mã tổng hợp các enzym tổng hợp các chất tan thích hợp, các chất chống oxi hóa, các protein bảo vệ Hai con đường chính thực vật sử dụng để thích nghi với hạn đó là: tổng hợp các phân tử bảo vệ trong giai đoạn hạn để ngăn ngừa thiệt

hại hoặc kích hoạt các cơ chế sửa chữa sau giai đoạn này làm trung hòa thiệt hại phát sinh Tuy nhiên, tổng hợp các phân tử bảo vệ trong giai đoạn hạn được thực vật ưa chuộng hơn [124]

Quá trình truyền tín hiệu phức tạp và có thể dẫn đến theo con đường phụ thuộc ABA hoặc không phụ thuộc ABA Mặc dù có hai con đường khác nhau, phản ứng của thực vật đều hướng tới việc biểu hiện hàng loạt enzym và protein cần thiết cho việc đáp ứng chịu hạn của tế bào Nghiên cứu gần đây đã làm rõ chức năng của các phân tử truyền tín hiệu, các nhân tố phiên mã và các gen chống chịu trong cơ chế đáp ứng chịu hạn ở thực vật [140]

Các nhân tố phiên mã điều khiển các gen chịu hạn được phân loại dựa vào trình

tự DNA đặc hiệu mà chúng liên kết Vùng khởi động (promoter) của hầu hết các gen liên quan đến tính chịu hạn thường chứa một hoặc nhiều trình tự DNA đặc hiệu phổ biến là: ABRE (ABA responsive element - yếu tố đáp ứng ABA) và DREB/CRT (Dehydration responsive element/C repeat - yếu tố/đoạn C lặp lại đáp ứng hạn), NAC, MYB với chức năng tương ứng là điểm bám của các protein điều khiển quá trình phiên

mã biểu hiện phụ thuộc và không phụ thuộc vào nồng độ ABA (Hình 1.4)

Hình 1.4 Hệ thống điều khiển phiên mã phụ thuộc và không phụ thuộc của ABA

trong điều kiện hạn hán, độ mặn và chống chịu lạnh

1.4.2 Vai trò của một số phân tử trong truyền tín hiệu điều hòa biểu hiện gen chịu hạn ở thực vật

Abscisic acid (ABA): ABAđóng vai trò quan trọng trong việc đáp ứng chịu hạn

ở thực vật, sự gia tăng nồng độ của ABA trong điều kiện hạn có thể kích thích sự biểu hiện nhiều gen chống chịu đáp ứng với điều kiện hạn Ngoài ra, ABA kiểm soát việc đóng mở của khí khổng, do đó giảm sự mất nước qua sự thoát hơi nước ở lá [140]

Ở Arabidopsis, sự mất nước cảm ứng tổng hợp ABA một cách nhanh chóng Sự

tổng hợp ABA bắt đầu xuất hiện sau 2 giờ và đạt cực đại sau 10 giờ khi cây ở trong điều kiện hạn Con đường tổng hợp ABA là một nhánh phụ của con đường tổng hợp carotenoid, nhiều enzyme sử dụng tổng hợp ABA cũng được điều hòa hoạt động qua cơ chế cảm ứng

sự mất nước ở thực vật [140] Các nghiên cứu đã sử dụng ABA như một phương pháp nhằm gia tăng khả năng chịu hạn ở thực vật qua việc tạo ra đột biến tổng hợp ABA, các đột biến mẫn cảm với ABA [62] Tuy nhiên, ABA không phải phân tử duy nhất liên quan đến việc truyền tín hiệu chống chịu hạn ở thực vật Một con đường điều hòa biểu hiện gen độc lập với ABA cũng được xác định [66]

Histidine kinases: là một nhóm các phân tử đã được nghiên cứu có khả năng

cảm ứng với việc thay đổi áp suất thẩm thấu ở tế bào, được phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn Khi có sự thay đổi môi trường, những histidine này có thể cảm nhận và hiện tượng tự

phosphoryl hóa histidine sẽ xảy ra Sau đó gốc phophate này được chuyển qua một acid

amin aspartic ở phân tử truyền tín hiệu tiếp theo Qua đó, cấu hình không gian của phân

tử nhận bị thay đổi dẫn đến nó có khả năng tương tác với phân tử khác hoặc liên kết với DNA Ở thực vật, histidine kinase đóng vai trò là các thụ thể cho các hormone thực vật

như ethylene và cytokinine [73] Ngoài ra, gen AtHKI mã hóa cho một histidine kinase được tìm thấy ở Arabidopsis có vai trò quan trọng trong quá trình chống chịu với sự mất nước [165] AtHKI có sự tương đồng rất lớn với Sln1 ở nấm men Việc biểu hiện AtHKI

trong nấm men ở môi trường có độ muối cao cho thấy protein này có khả năng kích hoạt

các MAP kinase ở nấm men Điều này cho thấy cơ chế tương tự có thể tồn tại ở

Arabidopsis

Calcium signalling: Ở thực vật, việc gia tăng nồng độ Ca2+ nội bào có vai trò quan trọng trong con đường điều hòa biểu hiện các gen chống chịu sinh học và phi sinh

học khác nhau.Việc thay đổi cấu trúc của màng tế bào có thể làm thay đổi hoạt động của các kênh Ca2+ dẫn tới sự thay đổi nồng độ Ca2+ nội bào Sự gia tăng nồng độ Ca2+ nội bào đã được chứng minh là một trong những phản ứng sớm của thực vật đối với sự mất nước Đối với quá trình cân bằng nước ở thực vật, quá trình thay đổi Ca2+ nội bào đã được nghiên cứu kỹ lưỡng trong các tế bào bảo vệ [139], [87] Hiệu quả tác động của sự thay đổi Ca2+ nội bào phụ thuộc vào vị trí các kênh Ca2+ di động trên màng tế bào, biến đổi động lực học của Ca2+và sự có mặt của các con đường truyền dẫn tín hiệu tại thời điểm mà sự thay đổi trong Ca2+xảy ra Các nghiên cứu gần đây về quá trình đóng mở của khí khổng cho thấy các dao động của nồng độ Ca2+nội bào quyết định sự thay đổi đóng hoặc mở của khí khổng (Allen và cs, 2001) [28]

Heterotrimeric G-proteins: Các nghiên cứu đã chỉ ra có sự tham gia của các G-

protein trong chuỗi truyền tín hiệu trong tế bào thực vật Các G-protein có cấu trúc bao gồm ba tiểu đơn vị, Gα, Gβ, và Gγ G-protein tương tác với một receptor trong tế bào chất, thúc đẩy việc phân hủy GTP thành GDP trên tiểu đơn vị alpha của G-protein G- Protein sau đó phân tách thành tiểu đơn phân tử α và dimer βγ Hai tiểu phần có khả năng hoạt hóa các phân tử khác như phospholipase C hoặc phospholipase D Sự hoạt động đồng thời của G-protein và sự hoạt hóa quá trình Phospholipases đã được quan sát thấy ở thực vật, nhưng sự liên kết với của chúng vẫn chưa được xác định [84] Ở động vật, đã có hơn 41 các tiểu đơn vị khác nhau được biết đến Tuy nhiên, ở thực vật chỉ có

bốn tiểu đơn vị G-protein, một đơn phân Gα và Gβ và dimer Gγ

Trong các tế bào bảo vệ, quá trình đáp ứng với ABA đã được chứng minh là cần

có sự liên kết với một G-protein Ở cây Arabidopsis mang một allele đột biến của gen

Gα GPA1, ABA không có khả năng kiểm soát việc đóng cửa của khí khổng [173]

Phospholipid signalling: Việc kích hoạt các tín hiệu photpholipid để đáp ứng lại

các tác nhân bất thuận bao gồm tác nhân gây hạn đã được tìm thấy ở thực vật Hoạt động của phospholipase tạo ra phosphatidic acid, đóng vai trò như một chất dẫn truyền thứ cấp trong chuỗi truyền tín hiệu Tín hiệu acid phosphatidic được tạo ra bởi hai đường đi liên quan đến phospholipase C (PLC) và phospholipase D (PLD) PLD loại bỏ phospholipids ở đầu phân cực và ở các acid phosphatidic Phân tích bộ gen của

A.thaliana đã xác định được 12 gen PLD, có thể được phân thành 5 nhóm: α, β, γ, δ, và

ζ [127] Hai gen PLD: PLD1 và PLD2 đã được phân lập từ C plantagineum

Ở cả A thaliana và C plantagineum, quá trình thiếu hụt nước dẫn đến phản ứng

ở mức độ đó là: hoạt động của enzyme PLD và sự phiên mã của PLD Việc kích hoạt enzyme xảy ra trong vòng vài phút sau sự mất nước xảy ra trong A Thaliana [86] Quá trình phiên mã gen PLDδ từ A thaliana và PLD2 từ C plantagineum được diễn ra một vài giờ sau khi được kích hoạt bởi sự mất nước Trong khi gen PLDα từ A thaliana và

PLD1 từ C plantagineum được biểu hiện ngay lập tức Điều này cho thấy rằng PLD2 ở

A thaliana có sự tương đồng với gen PLDδ ở C plantagineum, mặc dù các phân tích

phát sinh loài cho thấy cả tất cả các gen PLD ở C plantagineum nằm trong nhóm PLDα

Ở cây A thaliana biểu hiện PLDδ ở dạng antisense, sự tổng hoạt động PLD đã giảm

đáng kể trong những giờ đầu tiên khi stress hạn xảy ra [137]

Con đường tín hiệu phospholipid thứ hai là con đường phospholipase C (PLC) PLC

chuyển phosphatidylinositol 4,5-biphosphate thành inositol 1,4,5-triphosphate và

diacylglycerol (DAG) Inositol 1,4,5-triphosphate có vai trò giải phóng canxi vào nội bào

Trong khi DAG được chuyển thành axít phosphatidic PLC dường như giải thích vì sao phần lớn acid phophatidic được tạo ra khi gặp stress sinh lý [117]

Giống như PLD, PLC có thể được kích hoạt ở hai mức độ: hoạt động enzyme và

mức độ phiên mã do stress Ở Arabidopsis, Gen AtPLC1 được kích hoạt bởi một loạt các stress, bao gồm stress hạn Một gen PLC khác cũng được phát hiện là AtPLC2 Sự biểu hiện các gen PLC được kích hoạt nhanh chóng khi mất nước [153]

1.5 Một số nhóm nhân tố phiên mã được quan tâm trong nghiên cứu chịu hạn

Một trong những bước quan trọng trong con đường đáp ứng chịu hạn ở thực vật là

sự kích hoạt biểu hiện của các yếu tố phiên mã phụ trách điều hòa biểu hiện của hàng loạt gen chức năng có nhiệm vụ tổng hợp các phân tử bảo vệ Hầu hết sự biểu hiện các yếu tố phiên mã này có biểu hiện đặc biệt trong các mô khác nhau Các nghiên cứu gần đây bằng các phương pháp sử dụng kỹ thuật di truyền đã tìm ra vai trò nhiều nhân tố phiên mã liên quan đến việc đáp ứng chịu hạn ở thực vật [146]

Hàng loạt các họ nhân tố phiên mã có liên quan đến đáp ứng chịu hạn đã được công bố gần đây [31] Các nhân tố phiên mã điều hòa biểu hiện các gen đặc hiệu qua

tương tác với các yếu tố điều hòa đặc trưng Cis nằm trên promoter của gen mà chúng điều hòa Ở thực vật, các gen mã hóa nhân tố phiên mã chiếm một tỉ lệ rất lớn trong genome lên đến 10% Các nhân tố phiên mã này được chia thành các họ gen nhân tố phiên mã khác nhau như AREB, bZIP, MYB, WRKY, NAC và họ nhân tố phiên mã AP2/ERF với hai nhóm nhân tố phiên mã chính DREB1 và DREB2 Việc phân loại dựa

trên trình tự chủ yếu đố điều đặc trưng mà chúng tương tác [68] Ở Arabidopsis gần 6%

các gen trong genome mã hóa các nhân tố phiên mã Các họ gen nhân tố phiên mã được kích thích theo hai con đường: con đường phụ thuộc ABA và con đường không phụ thuộc ABA, một vài họ gen có liêu quan đến cả hai con đường trên

1.5.1 Nhân tố phiên mã AREB/ABF

Nhiều nghiên cứu về cơ chế đáp ứng chịu hạn ở thực vật ở mức độ phân tử đã tìm ra: dưới điều kiện stress sinh lý, họ gen nhân tố phiên mã AREB/ABF (abscisic acid- responsive element binding /ABRE binding factor) có khả năng hoạt hóa phiên mã điều khiển sự biểu hiện của gen chống chịu trong con đường phụ thuộc ABA [111] Các gen được kiểm soát biểu hiện bởi họ nhân tố phiên mã AREB/ABF tồn tại yếu tố điều hòa đặc trưng cis-element ABRE có trình tự lõi (PyACGTGG /TC) thuộc vùng promoter của các gen này

Các nghiên cứu khác cũng cho thấy vai quan trọng của một số yếu tố ABRE và

sự kết hợp của nó với các yếu tố ghép nối (CE) trong quá trình biểu hiện gen phụ thuộc ABA [119] Về mặt cấu trúc, AREB/ABF bao gồm vị trí phosphoryl hoá SnRK2 giúp điều chỉnh biểu hiện gen phụ thuộc ABA [67] Người ta cũng phát hiện thấy các tế bào

mô mạch đặc biệt có thể tạo ra ABA và chuyển chúng cho các tế bào đích [90]

Ở cây Arabidopsis, có năm gen được biết là mã cho enzyme NCED (9-cis-epoxy

carotenoid dioxygenase), một enzyme chính trong quá trình sinh tổng hợp và biểu hiện của ABA Trong số này, gen NCED3 cho thấy sự biểu hiện cao hơn trong quá trình mất nước Một yếu tố điều hòa đặc trưng AG-box đã được tìm thấy nằm ở vị trí 2248 bp phía trên vị trí đến bắt đầu phiên mã của gen NCED3 [35] ABA được cảm nhận bởi các phức hợp thụ thể PYL/PYR /RCARs kết hợp với PP2Cs, sau đó SnRK2s được giải phóng [119] Khi SnRKs được phosphoryl hóa ở các nhân tố phiên mã AREB /ABF Các nhân

tố phiên mã này sẽ có khả năng tương tác với yếu tố cis ABRE (PyACGTGG /TC) [164]

Sự biểu hiện nhân tố phiên mã AREB1 ở Arabidopsis, lúa và đậu nành đều cho thấy nâng cao khả năng chịu hạn [182] Gần đây, người ta đã chỉ ra rằng khi biểu hiện yếu

tố phiên TaAREB3 được phân lập từ lúa mì trên cây Arabidopsis đã nâng cao độ nhạy cảm

với ABA và khả năng chịu hạn [170] Ở các loài nguyên sinh, nhóm PP2C của nhóm A

đã phát triển thành các chất điều tiết thiết yếu cho khả năng chịu được áp lực thẩm thấu

1.5.2 Nhân tố phiên mã NAC

Nhân tố phiên mã NAC được biết đến là họ nhân tố phiên mã lớn nhất ở thực vật

Từ viết tắt NAC có nguồn gốc từ ba protein NAM từ cây thuốc lá và ATAF1/2, CUC2

từ Arabidopsis [141] Cấu trúc một nhân tố phiên mã NAC bao gồm một một vùng trình

tự liên kết với DNA (DNA-Binding domain, DBD) nằm ở đầu N-terminus,vùng trình tự này khá bảo thủ bao gồm 150-160 axit amin và được chia thành 5 vùng phụ ở các nhân tố

phiên mã họ NAC Ngược lại, vùng trình tự đầu C-terminus lại rất đa dạng và nó có vai

trò trong việc điều hòa của các nhân tố phiên mã NAC ở các mức độ khác nhau

Ở lúa, các nhân tố phiên mã SNAS1 được báo cáo làm nâng cao tính chịu hạn thông qua việc điều hòa biểu hiện các gen OsPP18, PP2C thuộc con đường không phụ

thuộc ABA [184] Cho đến nay, một số loài đã xác định được đầy đủ toàn bộ các gen

thuộc họ nhân tố phiên mã NAC như cây cải xanh có 204 gen, đậu tương 152 gen, ngô

có 152 gen, lúa có 151 gen,ở Arabidopsis là 117 gen và 74 gen ở cây nho [141] Ở lúa, một số gen NAC được báo cáo có vai trò quan trọng trọng việc đáp ứng chống chịu sớm

đối với điều kiện stress hạn và mặn [71]

Vai trò của nhân tố phiên mã NAC trong việc đáp ứng chống chịu stress hạn tiếp tục được phân tích dựa trên các gen mà chúng hoạt hóa biểu hiện trong các loại cây trồng

khác nhau; Ví dụ như 40 gen NAC trong lúa [141], 38 gen NAC trong đậu nành [94] Những gen được điều hòa bởi nhân tố phiên mã NAC cho thấy các sự biểu hiện khác

nhau ở mô cụ thể, trong các giai đoạn phát triển cụ thể hoặc đặc hiệu với từng loại stress

khác nhau Do đó, họ nhân tố phiên mã NAC cho thấy vai trò tích cực của nó vào các

con đường truyền tín hiệu phức tạp trong quá trình phản stress ở thực vật

Ở cây Arabidopsis, khả năng chịu hạn đã tăng lên có sự biểu hiện của các gen

ANACO19, ANACO55, ANACO72 Tương tự, sự tăng cường biểu hiện của các gen SNAC1 ở lúa giúp nâng cao sự chống chịu với hạn hán ở giai đoạn sinh sản mà không có

sự thay đổi nào về hình thái và năng suất [101] Trong một vài nghiên cứu khác cho thấy

rằng khi gặp stress hạn, các gen SNAC1 được hoạt hóa biểu hiện trong các tế bào bảo vệ

và sự tăng cường biểu hiện của nó đã làm giảm mất nước bằng cách tăng cường việc đóng

khí khổng Tầm quan trọng của các gen SNAC1 được chú ý hơn khi việc đánh giá biến đổi di truyền của nó ở các giống lúa hoang dại của Ấn độ đã tìm ra bốn haplotypes có liên

quan đến chống chịu hạn hán và có tiềm năng ứng dụng để tạ ra giống lúa chịu hạn [146]

1.5.3 Nhóm nhân tố phiên mã bZIP

Họ nhân tố phiên mã bZIP (Basic leucine zipper) có chứa một vùng trình tự bảo thủ bZIP, bao gồm vùng trình tự cơ bản và vùng trình tự liên kết với DNA nằm tại đầu N-terminus Một vùng trình tự giàu leucin để hình thành dimer tại đầu C-terminus [174]

Bên cạnh việc điều chỉnh sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng, các nhân tố phiên mãcòn có vai tròrất quan trọng đối với các phản ứng bất thuận phi sinh học như

hạn hán [105] Thành viên của họ nhân tố phiên mã bZIP đã được phân lập và đặc trưng

ở các sinh vật nhân chuẩn 55 gen ở nho [102], 75 gen ở Arabidopsis [82], 89 gen ở lúa mạch [122], 96 gen ở Brachypodium distachyon [104], 125 gen ở ngô [176], và 131 gen

ở đậu nành [98] Mặc dù vai trò sinh lý của các nhân tố phiên mã bZIP cùng với các zinc

finger vẫn còn chưa rõ ràng Nhưng nghiên cứu về phản ứng đáp ứng chống chịu stress

phi sinh họ đã xác nhận các nhân tố phiên mã bZIP được cảm ứng bởi ABA và có vai

trò điều hòa biểu hiện các gen chống chịu theo con đường phụ thuôc vào ABA thông qua việc tương tác với các yếu tố điều hòa ABREnằm trên promoter của các gen này

Các cây lúa tăng cường biểu hiện OsbZIP23 có sự cảm ứng ABA lớn hơn ở cả

giai đoạn nảy mầm và sau nảy mầm cùng với sự gia tăng khả năng chịu hạn hán và chống chịu mặn Phân tích Microarray cho thấy biểu hiện khác biệt của một số gen bao gồm các gen mã hóa nhân tố phiên mã đáp ứng stress, kinase protein, dehydrins và

protein LEA OsbZIP46 cũng thuộc về phân họ của OsbZIP23 và dạng hoạt động của

nó là OsbZIP46CA1 được tạo ra do đột biến tại vùng trình tự D ở protein OsbZIP46 Ở Lúa, tăng cường biểu hiện gen OsbZIP46CA1 cho thấy tăng cường khả năng chịu hạn hán Các gen được điều kiển bởi OsbZIP46CA1 và OsbZIP23 đã được phát hiện thông

qua phân tích vi mô, do đó có thể nói tồn tại một cơ chế điều tiết độc lập giữa

OsbZIP46CA1 và OsbZIP23 Ngược lại, sự tăng trưởng của cây lúa tăng cường biểu